专题15 基因工程（3年汇编）（全国通用）2024-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程核心考点，汇编2024-2026年多省高考真题，以真实科研情境（如质粒构建、PCR技术、基因编辑）为载体，强化实验设计与结果分析能力考查。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|约30题|基因工程工具（限制酶、载体）、PCR技术、基因编辑|结合电泳结果分析酶切位点，如2025福建题考查质粒酶切产物判断| |非选择题|约25题|基因表达载体构建、目的基因检测、蛋白质工程应用|以农业抗虫、疾病治疗为情境，如2026湖南题设计转基因鱼生长激素基因表达实验|

专题15 基因工程 考点分类 考情示例 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025福建(1题)、2025江苏(1题)、2024湖南(1题) ·情境设置：以质粒构建、基因突变检测和限制酶切实验为主要背景。 ·考查重点：限制酶识别序列与切点、切割结果、末端类型、酶切位点分析及异常原因。 ·命题趋势：由单纯识图转向结合序列信息进行实验设计、结果推断和操作纠错。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026全国(1题)、2026北京(1题)、2026湖北(1题)、2026江西(1题)、2025课标卷(1题)、2025广东(1题)、2025河南(1题)、2025河北(1题)、2025安徽(1题)、2024北京(1题)、2024湖南(1题)、2024浙江(1题)、2024山东(1题) ·情境设置：围绕基因克隆、蛋白表达、遗传诊断、测序、探针制备等真实科研任务设题。 ·考查重点：引物设计、PCR条件与原理、DNA聚合酶作用、测序及扩增产物分析。 ·命题趋势：突出实验方案设计、结果判断和问题诊断，强化PCR与基因工程综合应用。 考点3 基因工程综合 2026甘肃(1题)、2026全国(1题)、2026贵州(1题)、2026湖北(1题)、2026湖南(2题)、2026四川(1题)、2026广东(2题)、2026河北(1题)、2026山东(1题)、2026黑吉辽蒙(2题)、2026河南(1题)、2026陕晋青宁(1题)、2026云南(1题)、2026安徽(1题)、2026浙江(2题)、2025上海(1题)、2025海南(1题)、2025天津(1题)、2025福建(1题)、2025广西(1题)、2025贵州(1题)、2025江西(2题)、2025重庆(1题)、2025甘肃(1题)、2025四川(1题)、2025云南(1题)、2025湖南(1题)、2025广东(1题)、2025河南(1题)、2025湖北(1题)、2025山东(1题)、2025河北(1题)、2025陕西&山西(1题)、2025黑龙江&吉林(1题)、2025安徽(1题)、2024广西(1题)、2024天津(1题)、2024福建(1题)、2024海南(1题)、2024江苏(1题)、2024重庆(2题)、2024贵州(1题)、2024江西(1题)、2024北京(1题)、2024湖南(1题)、2024甘肃(1题)、2024安徽(1题)、2024广东(1题)、2024河北(1题)、2024山东(1题)、2024全国甲卷(1题)、2024黑龙江(1题)、2024山西&河南(1题) · 情境设置：农业育种、疾病治疗、工业生产和环境治理等真实问题。 · 考查重点：目的基因获取、载体构建、导入与筛选，启动子调控、基因编辑及表达产物定位。 · 命题趋势：突出基因工程与细胞工程、发酵工程及遗传规律综合，强化实验设计和机制分析。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 2026甘肃(1题)、2026北京(1题)、2026湖北(1题)、2026江西(1题)、2026河南(1题)、2026云南(1题)、2025福建(1题)、2025课标卷(1题)、2024天津(1题) · 情境设置：医药研发、农业生产、工业酶制剂和生物材料开发。 · 考查重点：外源基因表达、代谢途径改造、蛋白质结构与功能关系及定向改造。 · 命题趋势：关注精准改造、产物性能优化和产业化应用，强化蛋白质工程与基因工程的综合分析。 考点1 基因工程的基本工具 1.（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（       ） A. DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B. 可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C. 泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D. 泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 2.（2025·江苏·高考真题）（多选）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ，下列相关叙述正确的有（       ） A. 基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B. 用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C. 用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D. 产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 3.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 限制酶失活，更换新的限制酶 B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2026·全国·高考真题）为构建含目的基因的重组质粒，某同学用限制酶X分别切割质粒P和含有目的基因的DNA片段，用连接酶连接后导入大肠杆菌，挑选在抗性平板上长出的菌落，提取质粒进行分析。目的基因(1.5 kb，1 kb=103 bp)及质粒P(2.4 kb)中的限制酶(X、Y、Z)切割位点、各片段长度等信息如图所示。下列叙述错误的是（　　） A. 在抗性平板上挑选不到含2.4 kb质粒的大肠杆菌菌落 B. 若提取的质粒为3.9 kb，提示其中可能含有目的基因 C. 重组质粒用Y和Z双酶切可得3.2 kb和0.7 kb的片段 D. 重组质粒用Y和Z双酶切可得2.5 kb和1.4 kb的片段 2.（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（        ） A. F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B. F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C. F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D. F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 3.（2026·江西·高考真题）（多选）研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A. 需在72℃条件下培养基因工程菌 B. 添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C. 可根据电泳结果初步评价T的纯度 D. 可根据PCR产物的多少计算T的活性 4.（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（       ） A. 1'-碱基 B. 2'-氢 C. 3'-羟基 D. 5'-磷酸基团 5.（2025·河北·高考真题）（多选）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（       ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A. 该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B. 用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C. 与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D. 利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 6.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（       ） A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 7.（2024·湖南·高考真题）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G （2024·浙江·高考真题）（多选）阅读下列材料，完成下面小题。疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。     8.下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（       ） A. F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B. F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段 9.为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。     1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（       ） A. 1号和6号 B. 2号和4号 C. 3号和5号 D. 1号、2号、4号和6号 10.（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①                  5'-GCCGATCTTTATA-3'3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'            3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④ 11.（2026·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。合成生物学助力尿酸代谢平衡尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体（见下图），右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加（如下图）。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 （1）表达载体中　　　　　　　　　　的功能是驱动目的基因的转录。 （2）由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者　　　　　　　　　　结合蛋白。 （3）为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码　　　　　　　　　　的U酶。 （4）对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是　　　　　　　　　　。 （5）利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找　　　　　　　　　　。 12.（2025·课标卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题： （1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是　　　　　　　　，而PCR过程中解开双链的方法是　　　　　　　　。 （2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有　　　　　　　　。 （3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：　　　　　　　　；②无扩增产物，原因是　　　　　　　　；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是　　　　　　　　。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 （4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果　　　　　　　　。 13.（2025·河南·高考真题）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型：紧凑株型=3：1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题： （1）该紧凑株型性状由　　　　　　（填“A”或“a”）基因控制。 （2）在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是　　　　　　　　　　　　。 （3）研究人员设计了3条引物（P1~P3），位置如图1（→表示引物5´→3´方向）。以3个F2单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B（不考虑PCR结果异常）。 ①图2-A中使用的引物组合是　　　　　　；丙单株无扩增条带的原因是　　　　　　　　　　。 ②结合图2-A的扩增结果，在图2-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑）　　　　　　　　　　。 ③使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型=　　　　　　。 14.（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 （1）嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生　　　　　　　　　　　，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的　　　　　　　　　　　将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 （2）初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于　　　　　　　　　　　序列所编码的蛋白区段。 （3）为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由　　　　　　　　　　　组成。 （4）在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因　　　　　　。 考点3 基因工程综合 1.（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（        ） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 2.（2026·浙江·高考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A. 将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B. 不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C. 转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D. 转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 3.（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 A. 水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B. 在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C. 农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D. 愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 4.（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（       ）         A. 上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B. E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C. E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 5.（2026·甘肃·高考真题）甜醅是西北地区的传统小吃，可由燕麦发酵而成。燕麦经清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后，加入酒曲（含酵母菌等微生物）发酵，即可制成甜醅。回答下列问题。 （1）燕麦中的淀粉被淀粉酶水解成还原糖，为酵母菌提供　　　　　　　　　　。 （2）甜醅制作时，蒸煮原料的操作属于无菌技术中的　　　　　　　　　　；加入酒曲前摊凉是为了避免原料温度过高导致　　　　　　　　　　 （3）发酵初期，需要将温度控制在28℃左右是因为　　　　　　　　　　；发酵后期，密封发酵容器可促进酵母菌的　　　　　　　　　　，使乙醇含量　　　　　　　　　　。 （4）为了推动甜醅的工业化生产，研发人员利用基因工程技术从甜醅中克隆了α-淀粉酶基因，构建了表达载体。实验所用载体结构、引物设计图和限制酶识别序列及酶切位点如下。 ①在设计α-淀粉酶引物序列时，为了将目的基因正确插入表达载体，引物1的5′端引入了BamH Ⅰ识别序列，引物2的5′端需引入　　　　　　　　　　酶的识别序列。 ②构建成功的重组质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切　　　　　　　　　　（填“可以”或“不可以”）切割出完整的α-淀粉酶基因。理由是　　　　　　　　　　。 6.（2026·全国·高考真题）研究人员利用基因工程和动物细胞工程技术对某品种奶牛进行改良，以使奶牛的乳腺表达并分泌蛋白B，技术路线如图所示。回答下列问题。 （1）在获取目的基因的过程中，步骤①和步骤②所用的酶分别是　　　　　　　　　　　。 （2）完成基因导入后，需要鉴定牛胚胎成纤维细胞染色体DNA上是否成功插入B基因，可使用的检测技术有　　　　　　　　　　　(答出1点即可)等。 （3）牛卵母细胞去核时，所使用的卵母细胞应处于　　　　　　　(填“减数分裂Ⅰ中期”“减数分裂Ⅱ中期”或“有丝分裂中期”)。 （4）步骤③将2种细胞融合常用的方法有　　　　　　　(答出1点即可)等。步骤④胚胎移植前，需要对重构胚进行　　　　　　　　　　　　　　　　　处理，以使重构胚完成细胞分裂和发育进程。 （5）设计实验，鉴定成年转基因母牛的乳腺是否分泌了蛋白B，简要写出实验思路。 7.（2026·贵州·高考真题）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的　　　　　对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为　　　　　　　　　的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为　　　　　bp。                                W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                         Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是　　　　　　　　　　试剂；a和b两片段长度相差　　　　　个核苷酸；启动子的该序列从端到端第　　　　　位核苷酸发生了甲基化。 8.（2026·湖北·高考真题）蛋白激酶CaMKIIδ过度活化可导致某些心血管疾病。该酶过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸（Met）有关。可通过向导RNA引导，将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）精确定位至基因的待编辑位置，使基因相关位点①和②（如图1）的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，从而抑制CaMKIIδ的过度活化。科研人员设计两种向导RNA—sgRNA1和sgRNA6，以此构建了两种ABE，两者在机体心肌细胞中编辑CaMKIIδ基因的效率如图2。 回答下列问题： （1）CaMKIIδ的化学本质是　　　　　　　　。 （2）实验中使用心肌特异性启动子来驱动ABE发挥作用，目的是　　　　　　　　　　　　　　。 （3）图1中sgRNA1序列为________（填标号）。 A. 5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3' B. 5'-GTCTGTGCATCATGGAAGC-3' C. 5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3' D. 5'-CGAAGGUACUACGUGUCUG-3' （4）由图2可知，以　　　　　　　　为向导RNA的ABE编辑效果更好，理由是　　　　　　　　　　　　　　。 （5）镰状细胞贫血是一种遗传病，导致该病的根本原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　；理论上，若用上述技术，需将碱基编辑器导入　　　　　　　　（填细胞名称），从而实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 9.（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的　　　　　　　　（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是　　　　　　　　　　。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A. 24 h检测细胞内 B. 24 h检测细胞外 C. 0 h和24 h检测细胞内 D. 0 h和24 h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射　　　　　　　　　　　　　；该实验结论是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 10.（2026·四川·高考真题）肿瘤的快速增殖使其内部缺氧，有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌（E.coli），构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果，部分操作如图1。回答下列问题。 （1）DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成　　　　　　　　键，连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达，目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效，有人开展了相关实验，结果如图2，请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）色谱分析可区分不同的小分子，同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白，反应后的色谱分析结果如图3。FP蛋白的反应底物是　　　　　　　　　　。 （4）有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉，证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析，用His标签抗体杂交，检测到的组1是　　　　　　　　　　（填“E.coli”或“E.coli-fp”）；兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖，原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 11.（2026·广东·高考真题）疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因（MM-CP）按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题： （1）构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于　　　　　　　　　　　　　　。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的　　　　　　　　　　　　与mRNA上的密码子互补配对，将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 （2）研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为　　　　　　　　　　　　　。从基因传递的角度分析，选用该类启动子的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为降低抗菌肽对按蚊的不利影响，运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊（如图）。与非驱动型相比，驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加，其原因是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然后　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，使更多配子携带MM-CP。 （4）若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 12.（2026·广东·高考真题）玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因VA和VW可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异（图a），且在胚乳发育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如下研究。 回答下列问题： （1）将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为　　　　　　　　　　性状。 （2）根据这对基因的序列设计了3种引物（图a），便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶（延伸速度约为1000 bp/min）、缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核苷酸和　　　　　　　　　　，反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①～⑤（图c）中泳道　　　　　　　　　　　　　　　的带型。 （3）基于品系W构建了针对VW基因的RNAi（可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达）转基因植株。鉴定转基因植株中VW基因表达是否受到影响，应提取植株　　　　　　　　　　　　　　　进行PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果（胚乳由极核和精子结合后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同）： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为　　　　　　　　　　　　　　　　　； ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推测研究人员提出的假设。最合理的是：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　是产生品系A粉质胚乳的原因。 13.（2026·河北·高考真题）黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。回答下列问题： （1）黑曲霉菌种的分离纯化应选用　　　　　　　　　（填“固体”或“液体”）培养基。 （2）细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照　　　　　　　　　原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的　　　　　　　　　端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是　　　　　　　　　。 （3）构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有　　　　　　　　　基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用　　　　　　　　　培养基筛选出转基因成功的菌株。 （4）构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图2）表明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） （5）传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） 14.（2026·山东·高考真题）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是　　　　　　　，载体上与其能自我复制相关的结构是　　　　　　　。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为　　　　　　　　　　　。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，该过程中　　　　　　　　　　　（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 15.（2026·黑吉辽蒙·高考真题）我国科学家在半矮秆水稻性状改良研究领域中取得了突破性进展。 （1）已知水稻高秆和半矮秆性状受一对等位基因SD1/sd1控制。SD1基因编码有功能的赤霉素20-氧化酶，催化底物产生赤霉素，控制高秆性状；sd1基因不能产生有功能的酶，控制半矮秆性状。杂交结果说明高秆对半矮秆为显性，从基因型和基因产物功能的角度，对此结论的解释是　　　　　　　　。 （2）半矮秆稻抗倒伏，但高氮肥下才能高产。为使其在低氮肥下高产，科学家找到一种名为“千粒稻”的高秆水稻，该水稻具有低氮肥下高产的相关基因。为寻找该基因，将千粒稻与半矮秆稻杂交，筛选　　　　　　　　性状的半矮秆子代，再与　　　　　　　　杂交。重复以上操作，得到一系列只包含一小段千粒稻染色质但低氮肥高产的杂交品系（C系）。上述过程是为了尽可能避免　　　　　　　　流入C系，以缩小筛选范围。 （3）从C系中筛选到一段DNA序列，命名为qINCA2.qINCA2与半矮秆稻的同源序列INCA2只有一个核苷酸差异，均不编码蛋白质。在低氮肥条件下，INCA2导致局部染色质成为稳定的环，把RCN2基因“锁”在其中（下图b），而qINCA2没有使染色质成环能力（下图c）。 qINCA2控制低氮肥高产性状的分子水平解释为　　　　　　　　。 （4）基于以上机制欲用基因组编辑技术（可以精准快速改变DNA序列）改造另一种氮肥依赖型半矮秆稻品种，培育低氮肥高产型纯合子。合理的方案是先编辑该半矮秆稻的　　　　　　　　，筛选得到低氮肥高产型第一代基因组编辑水稻。由于该水稻可能是　　　　　　　　，需再让其进行　　　　　　　　，然后从中筛选获得目标水稻。 16.（2026·黑吉辽蒙·高考真题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是　　　　　　　　。实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用　　　　　　　　（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在　　　　　　　　。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是　　　　　　　　和　　　　　　　　。A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb       B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kbC．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb       D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的　　　　　　　　上。为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是　　　　　　　　。A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′       B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′       D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数（次/小时） 停留时间（分钟/小时） 2小时感染率（%） LT50（天） 第7天死亡率（%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是　　　　　　　　。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的　　　　　　　　评价，符合标准后方可推广。 17.（2026·河南·高考真题）4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为　　　　　　　　。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有　　　　　　　　，作用为　　　　　　　　。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是　　　　　　　　，限制酶2是　　　　　　　　。 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带　　　　　　　　（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是　　　　　　　　。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是　　　　　　　　（答出一点即可）。 18.（2026·陕晋青宁·高考真题）研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 （1）当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的　　　　　　　　　　　性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是　　　　　　　　　　　(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 （2）为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于　　　　　　　　　　　型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的　　　　　　　　　　　酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是　　　　　　　　　　　。 （3）已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是　　　　　　　　　　　或　　　　　　　　　　　两种组合，原因是　　　　　　　　　　　。 （4）为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是　　　　　　　　　　　。可利用　　　　　　　　　　　法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，　　　　　　　　　　　(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 19.（2026·云南·高考真题）UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。回答下列问题：第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 （1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和　　　　　　　　三步。 （2）构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是　　　　　　　　（答出2点）。第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 （3）我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是　　　　　　　　。 （4）要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加　　　　　　　　　，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是　　　　　　　　；在第二次筛选培养基中添加　　　　　　　　。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是　　　　　　　　（填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并　　　　　　　　。 20.（2026·安徽·高考真题）肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 （1）培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液　　　　　　异常；乳腺癌细胞培养时　　　　　　（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是　　　　　　。 （2）P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为　　　　　　（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是　　　　　　。 （3）S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因　　　　　　S基因的转录，　　　　　　（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。 21.（2026·浙江·高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因回答下列问题： （1）表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备　　　　　　　　，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经　　　　　　　　限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 （2）假丝酵母重组菌株的获得：在　　　　　　　　中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用　　　　　　　　方法接种在固体培养基上培养，适时挑选　　　　　　　　再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有　　　　　　　　的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 （3）重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是　　　　　　　　。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或　　　　　　　　，导致甘油合成代谢受阻。 22.（2025·上海·高考真题）I.野生型大肠杆菌质膜上有一种转运葡萄糖的S蛋白，转运时需耗能。研究人员欲将另一种膜蛋白H改造为∆H蛋白，来替代S蛋白转运葡萄糖，形成一种不耗能的转运方式。图1是技术路线图，图2为构建的含有∆H基因的表达载体，其中 ①～ ④表示载体中的相应位置，PstⅠ和BamHⅠ表示相应限制性内切核酸酶的酶切位点。 1. 图1过程Ⅰ～Ⅳ中，获取目的基因发生在___________。(单选) A. Ⅰ B. Ⅱ C. Ⅲ D. Ⅳ 2. 图1过程Ⅱ中，需要使用的酶有___________。(多选) A. PstⅠ B. DNA连接酶 C. BamHⅠ D. DNA聚合酶 3. 图2中，∆H基因的启动子的位置和转录方向最可能是___________。(单选) A. ①，逆时针 B. ②，逆时针 C. ③，顺时针 D. ④，顺时针 4. 为确定表达载体是否含有∆H基因，可以采用的方法有___________。(多选) A. 对表达载体进行基因测序 B. 对表达载体上的特定片段进行PCR C. 酶切表达载体后检测DNA片段长度 D. 观察导入了表达载体的菌株的氨苄抗性 II.如同源染色体联会时发生的交叉互换，两个DNA分子若含有相同序列，可发生重组。在过程Ⅲ中，欲用DNA2中的片段⑦替换野生型大肠杆菌基因组(DNA1)中的S基因，图3中①～⑦代替相应DNA片段，且序列均不相同、无相互包含关系。S基因和替换片段⑦约3000bp(碱基对)，片段①～⑥约为15～25bp。 5. 以DNA2为模板，采用PCR获得含有替换片段 ⑦的PCR产物。若要用该PCR产物与DNA1重组，以完成对S基因的准确替换，则在该PCR产物中，除⑦外还包含①～⑥中的　　　　　　　　　　　；PCR引物的设计应依据的片段是①～⑥中的　　　　　　　　　　　。(编号选填)下表是野生型菌株和∆H菌株在仅碳源含量不同的培养基中的增殖情况，M值越大，反映菌株增殖越快。 培养基中碳源含量 M值 野生型菌株 ∆H菌株 50g/L 0.137 0.157 100g/L 0.127 0.228 6. 根据研究目的，培养基中的碳源应该选择___________。(单选) A. 葡萄糖 B. 葡萄糖和淀粉 C. 淀粉 D. 琼脂 7. 据表中数据，比较∆H菌株和野生型菌株的增殖情况，并分析两者产生差异的原因。 23.（2025·海南·高考真题）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 （1）质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是　　　　　和　　　　　。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG （2）细胞X是一种贴壁细胞，可用　　　　　（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是　　　　　。 （3）将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有　　　　　作用，且随导入时间推移，增殖速率　　　　　。 （4）siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将　　　　　导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的　　　　　对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：　　　　　。 24.（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。 （1）获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌　　　　　的功能，导致该细胞器不能产生ATP。 （2）获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株 ①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。 ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向　　　　　。 ③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。 （3）采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择　　　　　。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的　　　　　。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供　　　　　，大肠杆菌为酵母菌提供　　　　　，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：　　　　　。 25.（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 回答下列问题： （1）大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素　　　　　的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是　　　　　色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。 （2）Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子　　　　　对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子　　　　　用于该系统。 （3）含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌　　　　　（填选项）。A．含质粒1和质粒2     B．只含质粒1     C．只含质粒2       D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：　　　　　。 26.（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是　　　　　　。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是　　　　　　。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有　　　　　　，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有　　　　　　（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及　　　　　　。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中 ①是　　　　　　， ②是　　　　　　， ③是　　　　　　， ④是　　　　　　。 27.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： （1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的　　　　　　拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是　　　　　　。 （2）拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的　　　　　　（填下图字母）处。理由是　　　　　　。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为　　　　　　。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的　　　　　　中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是　　　　　　。 28.（2025·江西·高考真题）流行病学调查在传染病防治中具有重要意义。AB基因编码的AB蛋白是致病菌W的一种特异性分泌蛋白。为构建快速检测致病菌W感染的血清学诊断技术(一种抗原抗体特异性反应技术)，研究人员从致病菌W中克隆AB基因，构建表达载体，导入原核宿主E，诱导后，分析表达情况(如表)。 细胞 AB基因的mRNA AB蛋白 致病菌W 十 十 宿主E — — 工程菌 十 — 注：“十”表示有检出，“—”表示未检出回答下列问题： （1）根据中心法则，结合表中数据判断，AB基因在工程菌中能进行　　　　　　　　　　　，但不能进行有效的　　　　　　　　　　　。 （2）分析发现，致病菌W合成AB蛋白时，某些氨基酸使用的部分密码子在宿主E中的使用频率低(称为该物种的稀有密码子，如表中密码子CGG在宿主E中为稀有密码子)。从蛋白质合成条件的角度分析，形成这一现象的原因是宿主E中缺乏　　　　　　　　　　　。 精氨酸的密码子 密码子使用频率(10-3) 致病菌W 宿主E CGA 7.2 4.3 CGC 28.5 26.0 CGG 24.7 4.1 CGU 8.5 21.1 AGA 1.3 1.4 AGG 3.2 1.6 （3）进一步分析发现，宿主E缺乏高效表达GC含量过高的外源基因所需要的机制。已知AB基因的GC含量较高，为在宿主E中实现AB蛋白的高效表达，可将精氨酸密码子CGG的使用进行优化，从第 (2)题表中选择最佳密码子为　　　　　　　　　　　。 （4）现有一位体内未检测到致病菌W的人。为了解此人是否有致病菌W感染史，设计一个直接利用AB蛋白的血清学诊断实验。 ①简要写出实验思路：　　　　　　　　　　　； ②预测实验结果：　　　　　　　　　　　； ③分析实验结果：　　　　　　　　　　　。 29.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 （1）研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ①　　　　　　　　； ②将　　　　　　　分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定　　　　　　　，明确蛋白之间的差异。 （2）树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是　　　　　　　　。 （3）树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是　　　　　　　　。 30.（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 （1）CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过　　　　　　　　　　（方法）将该质粒转入植物细胞，并将　　　　　　　　　　整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加　　　　　　　　　　。 （2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为　　　　　　　　　　，对其消毒时需依次使用酒精和　　　　　　　　　　处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是　　　　　　　　　　。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用　　　　　　　　　　技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较　　　　　　　　　　来验证抗病性。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为　　　　　　　　　　。 31.（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。     注： ①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。 ②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 （1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用　　　　　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是　　　　　　　　。 （2）采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　　　　　　条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是　　　　　　　　。 （3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带　　　　　　　　（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致　　　　　　　　，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是　　　　　　　　。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有　　　　　　　　（答出1点即可）。 32.（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。 在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。 回答下列问题： （1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）绘制图乙需统计活菌数，常用方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　，开始发挥作用的时间是　　　　　　　　　　　　　　　　　　，判断理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量　　　　　　　　　（填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 33.（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： （1）制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　　　等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物　　　　　　对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为　　　　　　bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是　　　　　　（答出两点即可）。 （2）制备抗蛋白A单克隆抗体用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有　　　　　　（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　　　，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 34.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： （1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及　　　　　　检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有　　　　　　（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是　　　　　　　　。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是　　　　　　　　。 （3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为　　　　　　　　。 （4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：　　　　　　。 35.（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： （1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是　　　　　　。将培养后的菌液混匀并充分　　　　　　，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有　　　　　　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是　　　　　　。     限制酶的识别序列和切割位点如下： （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是　　　　　　，随后在含　　　　　　和　　　　　　　　　　的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第　　　　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是　　　　　　。     36.（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA.该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题： （1）要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是　　　　　　　　　。 （2）体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内　　　　　　　　　（填细胞结构名称）的改变。 （3）这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 　　　　　　　　　。 （4）该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入　　　　　　　　　序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。 （5）用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是：　　　　　　　　　。 （6）采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是：　　　　　　　。 37.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和　　　　　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　　　　　bp，则一定为正向重组质粒。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　　　　　（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　　　　　（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 38.（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是　　　　　和　　　　　。模板与引物在PCR反应的　　　　　阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为　　　　　。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加　　　　　（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成　　　　　键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为　　　　　，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量　　　　　，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是　　　　　。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是　　　　　。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是　　　　　和　　　　　。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 39.（2025·陕西&山西·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 （1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　　　　　步骤中起作用。 （2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的　　　　　　　　（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-　　　　　　　　-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　　，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 （3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到　　　　　　　　，抗性基因　　　　　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　　　　形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 40.（2025·黑龙江&吉林·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。     （1）可从　　　　　　　　中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　　　　　和　　　　　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用　　　　　　　　连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有　　　　　　　　的污染。初步判断实验组　　　　　　　　（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是　　　　　　　　。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有　　　　　　　　。a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'd：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' （4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　　　　　　含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 41.（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 （1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用　　　　　　　　（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是　　　　　　　　。 （2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的　　　　　　　　。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落　　　　　　　　（填序号），出现菌落 ④的可能原因是　　　　　　　　。 （3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路　　　　　　　　。 42.（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： （1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物　　　　　　（选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是　　　　　　；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是　　　　　　。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行　　　　　　。 （2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是　　　　　　（至少答2方面）。 （3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为　　　　　　实验模型小鼠。 （4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是　　　　　　。 43.（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 （1）Sa产生抗药性可遗传变异的来源有　　　　　　（至少答出2点）。 （2）推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。     ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：　　　　　　，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含　　　　　　的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含　　　　　　的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含　　　　　　　　　　　　的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是　　　　　　。     44.（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： （1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是　　　　　　。 （2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是　　　　　　。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用　　　　　　限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其　　　　　　。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是　　　　　　。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是　　　　　　。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是　　　　　　。 45.（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： （1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于　　　　　微生物，在无氧条件下能进行　　　　　发酵，可用于制作果酒等。 （2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是　　　　　。 （3）工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有　　　　　和　　　　　。 （4）菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是　　　，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为　　　　　。 （5）菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路　　　　　。 46.（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：     （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是　　　　　　　　。 （2）步骤②转化时，科研人员常用　　　　　　　　处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有　　　　　　　　的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是　　　　　　　　。 （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与　　　　　　　　结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是　　　　　　　　（从图2的“A~D”中选填）。     （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。     （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是　　　　　　　　。（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是　　　　　　　　。（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有　　　　　　　　。 47.（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） （1）以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是　　　　　　　　　　　　　。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是　　　　　　　　　　　　　。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是　　　　　　　　　　　　　。 （2）部分小鼠的基因型鉴定结果如图2， ③的基因型为　　　　　　　　　　　　　。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是　　　　　　　　　　　　　（填序号）。 （3）某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是　　　　　　　　　　　　　（“甲”或“乙”），原因是　　　　　　　　　　　　　。 48.（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 （1）基因S启动子的基本组成单位是　　　　　　　　　　　　。 （2）通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是　　　　　　　　　　　　；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是　　　　　　　　　　　　。 （3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有　　　　　　　　　　　　　　。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是　　　　　　　　　　　　　　。 （4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是　　　　　　　　　　　　　　　。 49.（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 （1）据表可推测　　　　　　　　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　　　　　　　　　　　。检测NV酶活性时，需测定的指标是　　　　　　　　　　　（答出1点即可）。 （2）表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与　　　　　　　　　　　（选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　　　　　　　　　（选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是　　　　　　　　　　　。 （3）为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　　　　　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是　　　　　　　　　　　。 50.（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 （1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生　　　　　　　　　　　的过程称为细胞分化，分化是基因　　　　　　　　　　　的结果。 （2）对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A. 增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B. 增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C. 一个增强子只能作用于一个基本启动子 D. 很多增强子在不同组织中的活性不同 （3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测　　　　　　　　　　　。 （4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称　　　　　（略）。 51.（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： （1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用　　　　　　　（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 （2）单倍体育种。常用　　　　　　　　的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是　　　　　　　　。 （3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用　　　　　　　酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中　　　　　　　　的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路　　　　　　　　。 52.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。     （1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是　　　　　　。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了　　　　　　。 （2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　　　。 （3）过程⑤在基因工程中称为　　　　　　，该过程需要的主要酶有　　　　　　。 （4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种　　　　　　的生理状态。 （5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是　　　　　　（答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 53.（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 （1）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。、 （3）研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置　　　　　　（填数字）组实验（重复组不计算在内）。 （4）大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （5）发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，最终获得发酵产品。 54.（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： （1）研究者优化了培养基的　　　　　　　（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 （2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为　　　　　　　　，理由是　　　　　　　　　　　。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是　　　　　。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路　　　　　　。 55.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： （1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　　　　　和　　　　　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）利用　　　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　　　　　　，通过　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为　　　　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　　　　　免疫和　　　　　　　　免疫。 （5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点即可） 56.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　　　（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有　　　　　　种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　　　　-3'和5'-　　　　　　-3'。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株 ①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　　　（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 57.（2024·全国甲卷·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 （1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是　　　　　　　　　　　　　　　　，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是　　　　　　　　。 （2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在　　　　　　　　（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是　　　　　　　　。 （3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是　　　　　　　　；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 58.（2024·黑龙江·高考真题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是　　　　　　。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是　　　　　　。 （2）本操作中获取目的基因的方法是　　　　　　和　　　　　　。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是　　　　　　，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是　　　　　　。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用　　　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是　　　　　　和　　　　　　。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 59.（2024·山西&河南·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 （1）限制酶切割的化学键是　　　　　　　　。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是　　　　　　　　。 （2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和　　　　　　　　。 （3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是　　　　　　　　；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是　　　　　　　　。 （4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是　　　　　　　　（答出2点即可）。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2026·甘肃·高考真题）科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish。为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是（        ） A. 步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B. 处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C. 步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D. 新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 2.（2026·北京·高考真题）MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（        ） A. 温度和pH会影响MT的催化活性 B. 第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C. 为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D. 对MT结构的改造属于蛋白质工程 3.（2026·湖北·高考真题）将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是（        ） A. 选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B. 为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C. 工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 D. 树突状细胞将肿瘤新抗原加工后呈递给辅助性T细胞，激活特异性免疫 4.（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A. 第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B. 将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C. 判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D. 甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 5.（2026·河南·高考真题）胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是（　　） A. 甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B. 胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C. 第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D. 由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 6.（2026·云南·高考真题）内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A. 构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B. 内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C. 不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D. 为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 7.（2025·福建·高考真题）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（       ） A. 农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞 B. 紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C. 紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D. 该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 8.（2025·课标卷·高考真题）蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（       ） A. 二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B. 改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C. 用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D. 利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 9.（2024·天津·高考真题）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物生产等历程。有关叙述错误的是（       ） A. 动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞 B. 氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C. 用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子 D. 利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】C 2.【答案】BD 3.【答案】B 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】A 2.【答案】B 3.【答案】AB 4.【答案】C 5.【答案】AB 6.【答案】C 7.【答案】AC 8.【答案】D 9.【答案】B 10.【答案】D 11.【答案】（1）启动子     （2）竞争性     （3）分泌型     （4）减少 cH 的数目     （5）能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列      12.【答案】（1）① 解旋酶    ② 高温变性     （2）引物、脱氧核苷三磷酸     （3）① 作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染）    ② P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列    ③ 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段     （4）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性      13.【答案】（1）a     （2）插入序列后，a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译     （3）① P2和P3    ② 丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物    ③     ④ 2∶1      14.【答案】（1）① 兴奋/动作电位/神经冲动    ② 突触     （2）非保守     （3）长度相同但非保守序列不同的DNA片段     （4）少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知      考点3 基因工程综合 1.【答案】B 2.【答案】D 3.【答案】B 4.【答案】A 5.【答案】（1）碳源/碳源和能源物质     （2）① 消毒    ② 酒曲中的微生物失活     （3）① 28℃是酵母菌的最适生长温度，有利于酵母菌快速增殖，扩大菌种数量    ② 无氧呼吸/酒精发酵    ③ 升高     （4）① Mfe Ⅰ    ② 不可以    ③ α-淀粉酶基因的序列内部存在EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ酶切后目的基因会断裂      6.【答案】（1）逆转录酶、DNA聚合酶     （2）PCR     （3）减数分裂Ⅱ中期     （4）① 电融合法    ② 激活     （5）取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验      7.【答案】（1）Bcl I和Xba I     （2）① 3+6    ② 2500     （3）① X    ② 4    ③ 3和9      8.【答案】（1）蛋白质     （2）使ABE基因仅在心肌细胞中表达，避免影响其他细胞的正常生理功能     （3）C     （4）① sgRNA6    ② 只有基因位点① 和② 的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，才能抑制CaMKⅡδ的过度活化，以sgRNA6为向导的ABE对位点① 和② 均有较高的编辑效率，而以sgRNA1为向导的ABE仅对位点① 有较高编辑效率，对位点② 编辑效率极低     （5）① 控制血红蛋白合成的基因发生了基因突变    ② 造血干细胞      9.【答案】（1）① 抗体    ② 使其在星形胶质细胞中特异性表达    ③ KpnⅠ和BamHⅠ     （2）C     （3）① 携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒    ② 在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。      10.【答案】（1）① 磷酸二酯    ② His标签可被抗体识别，便于FP蛋白的筛选     （2）FP蛋白、PD-1抗体单独使用 时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著     （3）ATP     （4）① E.coli-fp    ② 大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖    ③ 基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果      11.【答案】（1）① 基因重组    ② 反密码子     （2）① 诱导型启动子    ② 使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代    ③ 从预期改造后抗菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响）出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽     （3）以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复     （4）基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险      12.【答案】（1）显性     （2）① 模板DNA/玉米基因组DNA    ② ①     （3）① （胚乳的）RNA    ② 粉质    ③ 粉质：硬质=3：1     （4）VA基因表达量低，编码的催化酶合成不足，无法有效催化非极性胡萝卜素转化为下游产物；非极性胡萝卜素积累，导致形成粉质胚乳      13.【答案】（1）固体      （2）① 碱基互补配对    ② 5′    ③ Sac Ⅰ      （3）① 标记    ② 选择     （4）① 抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；② 抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力     （5）① 省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；② 酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高      14.【答案】（1）① 启动子    ② 复制原点     （2）Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ      （3）① DNA聚合酶、DNA连接酶    ② 不需要    ③ 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始     （4）抗原-抗体杂交      15.【答案】（1）杂合子基因型为SD1sd1，其中SD1可编码产生有功能的赤霉素20-氧化酶，合成赤霉素，表现为高秆，因此高秆对半矮秆为显性     （2）① 低氮肥高产    ② 半矮秆稻    ③ 千粒稻其余染色质（DNA）     （3）qINCA2没有使染色质成环的能力，无法将RCN2基因锁定，RCN2基因可以正常转录、翻译（正常表达），合成RCN2蛋白，因此水稻在低氮肥条件下表现高产     （4）① INCA2基因    ② 杂合子    ③ 自交      16.【答案】（1）① 人工合成法（化学合成法）    ② T4    ③ 未插入目的基因的pPK2空质粒    ④ A    ⑤ D    ⑥ 染色体DNA    ⑦ B     （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高      （3）安全性      17.【答案】（1）① 复制原点    ② 终止子    ③ 终止目的基因的转录     （2）① XhoⅠ    ② NcoⅠ     （3）① b    ② 重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因     （4）工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高      18.【答案】（1）① 简并性    ② ③     （2）① 诱导    ② RNA聚合    ③ 引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育     （3）① EcoR I和Kpn I    ② EcoR I和SaI I    ③ 从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变）     （4）① 增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触    ② 农杆菌转化法    ③ 抑制      19.【答案】（1）延伸     （2）防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接     （3）防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染     （4）① 庆大霉素    ② pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长    ③ 蔗糖    ④ ②    ⑤ 电泳检测      20.【答案】（1）① pH    ② 不会    ③ 胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞     （2）① ① ④ 或③ ④    ② 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞     （3）① 抑制    ② 促进      21.【答案】（1）① 感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌    ② EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ     （2）① 超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台    ② （平板）划线法/稀释涂布平板法    ③ 单菌落    ④ 腐草霉素     （3）① 提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间    ② T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异      1.【答案】A 2.【答案】ABC 3.【答案】C 4.【答案】ABC 6.【答案】A 23.【答案】（1）① EcoR Ⅰ    ② Xho Ⅰ     （2）① 液体    ② 使贴壁细胞分散为单个细胞，37℃是胰蛋白酶的最适温度     （3）① 促进    ② 增加     （4）① 无靶向的siRNA    ② 表达减少    ③ a、提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用；b、提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用）      24.【答案】（1）线粒体     （2）     （3）① PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）    ② 细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）    ③ 维生素B1    ④ ATP    ⑤ 葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活      25.【答案】（1）① 卡那霉素和四环素    ② 白     （2）① C    ② A     （3）① B    ② 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌      26.【答案】（1）EcoR Ⅰ、Not Ⅰ     （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落     （3）① 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养    ② 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等     （4）① 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达    ② CAR序列    ③ 终止子    ④ 溶解酶1基因序列    ⑤ 溶解酶2基因序列      27.【答案】（1）① DNA序列    ② COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化     （2）① B    ② B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录     （3）① 外植体    ② 染色体DNA    ③ 生长素和细胞分裂素      28.【答案】（1）① 转录    ② 翻译     （2）稀有密码子所对应的tRNA     （3）CGU     （4）① 取此人血清，与AB蛋白混合， 观察是否发生抗原-抗体反应（或是否出现沉淀现象）    ② 阳性或阴性    ③ 若此人有致病菌W感染史，血清中存在AB蛋白的相应抗体，AB蛋白能与抗体反应形成沉淀。若此人无致病菌W感染史，或致病菌W感染后经过较长时间，体内抗体被降解，血清中不存在AB蛋白的相应抗体，不会形成沉淀      29.【答案】（1）① 克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因    ② 目的基因与载体    ③ 氨基酸序列     （2）利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。     （3）树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择      30.【答案】（1）① 农杆菌转化法    ② Ti质粒上的T - DNA    ③ 潮霉素     （2）① 外植体    ② 次氯酸钠    ③ 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素     （3）① PCR - 测序    ② 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）     （4）对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。      31.【答案】（1）① F2、F4    ② 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制     （2）① 2    ② 验证重组质粒是否构建成功     （3）① 苯丙氨酸或phe    ② 翻译受阻     （4）① 目的基因发生突变     ② 发酵条件优化      32.【答案】（1）目的基因、终止子、标记基因、复制原点     （2）① 稀释涂布平板法    ② 抑制工程菌IR3C增殖    ③ 15h    ④ 在15h时，IR3C数量下降，而MCS数量上升     （3）① 高于    ② IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。      33.【答案】（1）① 终止子（复制原点）    ② P1 和 P3    ③ 782    ④ 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失     （2）① 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法）    ② 抗体检测      34.【答案】（1）mKate2蛋白或荧光     （2）① 细菌计数板计数法    ② 作为mKate2蛋白的荧光对照    ③ PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解     （3）快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强     （4）先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒① 中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒② 中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中      35.【答案】（1）① 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大    ② 稀释     （2）① BamHI    ② SmaI和EcoRV切割后均产生平末端，Spe1和Xba1切割后产生的粘性末端相同，两种情况均会导致部分cg反向链接，新的序列无法被原有酶识别     （3）① 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态    ② 卡拉胶    ③ 四环素     （4）① 44    ② 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小      36.【答案】（1）电子显微镜      （2）细胞骨架     （3）防止细胞凋亡，有利于病毒的繁殖     （4）大肠杆菌复制原点 DNA     （5）哺乳动物细胞的 RNA 聚合酶无法识别该病毒基因的启动子     （6）溶解该病毒的包膜，使病毒无法与宿主细胞膜上的受体结合      37.【答案】（1）① 复制原点    ② XbaI    ③ DNA聚合酶    ④ SmaI和SpeI    ⑤ 550bp     （2）① 4    ② 环化    ③ 测序和序列比对     （3）不能      38.【答案】（1）① 脱氧核苷酸    ② 引物    ③ 复性    ④ PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。     （2）① SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ    ② 磷酸二酯键     （3）① 细胞表面发出黄色荧光    ② 高     （4）① 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用    ② 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用     （5）① ①    ② ③      39.【答案】（1）① 4种脱氧核苷酸    ② 延伸     （2）① 5'端    ② AGATCT    ③ BamHⅠ、EcoRⅠ     （3）① 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上    ② 2    ③ 再分化      40.【答案】（1）① 序列数据库    ② Xho Ⅰ    ③ Xba Ⅰ    ④ DNA 连接酶     （2）① 外源DNA    ② 1    ③ 目的基因N大小为2.3kb     （3）GCC     （4）香树脂醇      41.【答案】（1）① 稀释涂布平板法    ② 分离能对该致病菌有抑制作用的内生放线菌     （2）① 指数级扩增    ② ②    ③ 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中     （3）设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测      42.【答案】（1）① 5′端    ② 两端包含loxP序列的终止子    ③ 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列    ④ 电泳     （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压     （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM     （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。      43.【答案】（1）基因突变、基因重组、表观遗传等     （2）① 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切    ② 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）    ③ 脱水四环素    ④ 头孢霉素    ⑤ D      44.【答案】（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合     （2）① EcoRⅠ和NotI    ② AgeⅠ和HindⅢ     （3）① 超数排卵    ② 桑葚胚易于在小鼠子宫着床     （4）排除PCR体系中外源DNA的污染     （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染      45.【答案】（1）① 异养兼性厌氧    ② 酒精     （2）新鲜水果表皮附着酵母菌     （3）① 平板划线法    ② 稀释涂布平板法     （4）① 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响    ② 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D     （5）从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。      46.【答案】（1）EcoR I、Hind Ⅲ     （2）① CaCl2    ② 卡那霉素    ③ S-F和P-R     （3）① 启动子    ② C     （4）① SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多    ② 高温使蛋白变性    ③ 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持      47.【答案】（1）① HhG+G-    ② 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加    ③ 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上     （2）① HhG+G+、HhG+G-    ② ④     （3）① 乙    ② 乙的H基因敲除与表达受TM试剂调控      48.【答案】（1）脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）     （2）① EcoRⅠ    ② 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接（可能会反向链接）     （3）① 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段            ② PCR     （4）品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大      49.【答案】（1）① 蔗糖    ② 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖    ③ 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等）     （2）① NV 基因    ② >    ③ T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列     （3）① 突变体    ② 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞      50.【答案】（1）① 稳定性差异    ② 选择性表达      （2）C     （3）各组织器官中G和H的mRNA     （4）      51.【答案】（1）① 纤维素酶和果胶酶    ② 生长素和细胞分裂素     （2）① 花药离体培养    ② 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目     （3）① HindⅢ、BamHⅠ    ② 交链格孢    ③ 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL      52.【答案】（1）① 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖    ② 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关     （2）耐高温的DNA聚合酶     （3）① 基因表达载体的构建    ② 限制酶、DNA连接酶     （4）① 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等    ② 能吸收周围环境中DNA分子     （5）生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同      53.【答案】（1）在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性     （2）在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成     （3）① 乳酸或有机酸    ② 9     （4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量     （5）提取、分离、纯化      54.【答案】（1）碳源、氮源、无机盐     （2）① PT7、PBAD 和PBAD    ② 启动子② 和③ 选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达     （3）杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌     （4）蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达     （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)      55.【答案】（1）① 胚乳特异表达基因的     ② 终止转录    ③ HindIII    ④ EcoRI     （2）① 农杆菌转化    ② r2HN是否转录    ③ 抗原抗体杂交     （3）① 1/4    ② 纯合体自交后代不发生性状分离     （4）① 体液    ② 细胞     （5）生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）      56.【答案】（1）① 低    ② 256    ③ 5'-CAAT-3'    ④ 5'-GTTT-3'      （2）① 卡那霉素    ② Sac Ⅰ    ③ ④     （3）1/4      57.【答案】（1）① 变性    ② 氢键     （2）① 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化    ② T4DNA连接酶     （3）① 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态    ② 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒     （4）甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸      58.【答案】（1）① 除去蛋白质杂质    ② 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA     （2）① PCR技术扩增    ② 人工合成     （3）① RNA聚合酶识别并结合的部位    ② 提高目的基因转录效率     （4）HygBR     （5）① F3    ② R2     （6）D      59.【答案】（1）① 磷酸二酯键    ② 片段甲含有启动子和终止子     （2）A-T、U-A     （3）① 菌株B2的基因组DNA    ② 无扩增产物     （4）实现废物利用，减少环境污染      考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】B 2.【答案】B 3.【答案】C 4.【答案】D 5.【答案】D 6.【答案】C 7.【答案】A 8.【答案】A 9.【答案】C 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点分类 考情示例 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025福建(1题)、2025江苏(1题)、2024湖南(1题) ·情境设置：以质粒构建、基因突变检测和限制酶切实验为主要背景。 ·考查重点：限制酶识别序列与切点、切割结果、末端类型、酶切位点分析及异常原因。 ·命题趋势：由单纯识图转向结合序列信息进行实验设计、结果推断和操作纠错。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026全国(1题)、2026北京(1题)、2026湖北(1题)、2026江西(1题)、2025课标卷(1题)、2025广东(1题)、2025河南(1题)、2025河北(1题)、2025安徽(1题)、2024北京(1题)、2024湖南(1题)、2024浙江(1题)、2024山东(1题) ·情境设置：围绕基因克隆、蛋白表达、遗传诊断、测序、探针制备等真实科研任务设题。 ·考查重点：引物设计、PCR条件与原理、DNA聚合酶作用、测序及扩增产物分析。 ·命题趋势：突出实验方案设计、结果判断和问题诊断，强化PCR与基因工程综合应用。 考点3 基因工程综合 2026甘肃(1题)、2026全国(1题)、2026贵州(1题)、2026湖北(1题)、2026湖南(2题)、2026四川(1题)、2026广东(2题)、2026河北(1题)、2026山东(1题)、2026黑吉辽蒙(2题)、2026河南(1题)、2026陕晋青宁(1题)、2026云南(1题)、2026安徽(1题)、2026浙江(2题)、2025上海(1题)、2025海南(1题)、2025天津(1题)、2025福建(1题)、2025广西(1题)、2025贵州(1题)、2025江西(2题)、2025重庆(1题)、2025甘肃(1题)、2025四川(1题)、2025云南(1题)、2025湖南(1题)、2025广东(1题)、2025河南(1题)、2025湖北(1题)、2025山东(1题)、2025河北(1题)、2025陕西&山西(1题)、2025黑龙江&吉林(1题)、2025安徽(1题)、2024广西(1题)、2024天津(1题)、2024福建(1题)、2024海南(1题)、2024江苏(1题)、2024重庆(2题)、2024贵州(1题)、2024江西(1题)、2024北京(1题)、2024湖南(1题)、2024甘肃(1题)、2024安徽(1题)、2024广东(1题)、2024河北(1题)、2024山东(1题)、2024全国甲卷(1题)、2024黑龙江(1题)、2024山西&河南(1题) · 情境设置：农业育种、疾病治疗、工业生产和环境治理等真实问题。 · 考查重点：目的基因获取、载体构建、导入与筛选，启动子调控、基因编辑及表达产物定位。 · 命题趋势：突出基因工程与细胞工程、发酵工程及遗传规律综合，强化实验设计和机制分析。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 2026甘肃(1题)、2026北京(1题)、2026湖北(1题)、2026江西(1题)、2026河南(1题)、2026云南(1题)、2025福建(1题)、2025课标卷(1题)、2024天津(1题) · 情境设置：医药研发、农业生产、工业酶制剂和生物材料开发。 · 考查重点：外源基因表达、代谢途径改造、蛋白质结构与功能关系及定向改造。 · 命题趋势：关注精准改造、产物性能优化和产业化应用，强化蛋白质工程与基因工程的综合分析。 考点1 基因工程的基本工具 1.（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（       ） A. DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B. 可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C. 泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D. 泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 【答案】C 【解析】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误；B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③ 条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道② 条带和泳道④ 条带位置一致，无法区分泳道② 条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误；C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确；D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。故选C。 2.（2025·江苏·高考真题）（多选）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ，下列相关叙述正确的有（       ） A. 基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B. 用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C. 用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D. 产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【解析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误；B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误；D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。故选BD。 3.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 限制酶失活，更换新的限制酶 B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【解析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。故选B。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2026·全国·高考真题）为构建含目的基因的重组质粒，某同学用限制酶X分别切割质粒P和含有目的基因的DNA片段，用连接酶连接后导入大肠杆菌，挑选在抗性平板上长出的菌落，提取质粒进行分析。目的基因(1.5 kb，1 kb=103 bp)及质粒P(2.4 kb)中的限制酶(X、Y、Z)切割位点、各片段长度等信息如图所示。下列叙述错误的是（　　） A. 在抗性平板上挑选不到含2.4 kb质粒的大肠杆菌菌落 B. 若提取的质粒为3.9 kb，提示其中可能含有目的基因 C. 重组质粒用Y和Z双酶切可得3.2 kb和0.7 kb的片段 D. 重组质粒用Y和Z双酶切可得2.5 kb和1.4 kb的片段 【答案】A 【解析】A、用限制酶X切割质粒时，存在部分质粒未被切割，或切割后自身环化的情况，这类质粒仍为2.4kb的环状结构，抗性基因完整，可在抗性平板上生长，因此能挑选到含2.4kb质粒的大肠杆菌菌落，A错误；B、原质粒长度为2.4kb，目的基因长度为1.5kb，二者连接后得到的重组质粒总长度为2.4+1.5=3.9kb，因此提取到3.9kb的质粒提示其中可能含有目的基因，B正确；C．目的基因两端均为X酶的黏性末端，插入时存在两种方向：若目的基因上0.4kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+0.4=0.7kb，2.1+1.1=3.2kb，C正确；D．若目的基因反向插入，即1.1kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+1.1=1.4kb，2.1+0.4=2.5kb，D正确。 2.（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（        ） A. F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B. F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C. F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D. F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 【答案】B 【解析】A、XhoⅠ的酶切位点在基因A内部，不能选择，否则会破坏基因A，A错误；B、F1位于基因A的下游，要让基因A正向插入质粒，F1的5'端需要带有HindⅢ的酶切位点，对应质粒上靠近β-半乳糖苷酶基因的酶切位点； F2位于基因A的上游，其5'端需要带有XbaⅠ的酶切位点，对应质粒上靠近启动子的酶切位点。 这样切割后，基因A的两端就能和质粒切割后的黏性末端互补连接，且保证基因A的转录方向和质粒上的启动子方向一致，B正确；C、F1位于基因A的下游， F2位于基因A的上游，若F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点，会导致基因与质粒反接，C错误；D、PvuⅠ、ScaⅠ的酶切位点位于Ampr抗性基因内部，切割会破坏抗性标记基因，无法后续筛选重组质粒，D错误。 3.（2026·江西·高考真题）（多选）研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A. 需在72℃条件下培养基因工程菌 B. 添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C. 可根据电泳结果初步评价T的纯度 D. 可根据PCR产物的多少计算T的活性 【答案】AB 【解析】A、该基因工程菌为大肠杆菌，培养大肠杆菌的适宜温度为37℃左右；72℃是该DNA聚合酶T催化PCR反应延伸时的适宜温度，不是培养工程菌的温度，72℃条件下大肠杆菌无法存活，A错误；B、诱导物浓度并非越高越好，高浓度诱导物通常会对工程菌的生长产生毒害，反而会抑制目的蛋白的表达，降低T酶的产量，B错误；C、蛋白质电泳可根据条带数目初步判断蛋白质的纯度：若仅出现目的条带说明纯度高，出现多条杂带说明杂质多，C正确；D、T酶的活性是其催化PCR合成DNA的能力，相同反应条件下，T酶活性越高，单位时间内扩增得到的PCR产物量越多，因此可以根据PCR产物的多少计算T酶的活性，D正确。 4.（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（       ） A. 1'-碱基 B. 2'-氢 C. 3'-羟基 D. 5'-磷酸基团 【答案】C 【解析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。故选C。 5.（2025·河北·高考真题）（多选）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（       ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A. 该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B. 用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C. 与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D. 利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 【答案】AB 【解析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A错误；B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误；C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确；D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。故选AB。 6.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（       ） A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 【答案】C 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。 故选C。 7.（2024·湖南·高考真题）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【解析】1、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：① 高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③ 中温延伸：合成子链。2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误；C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确；D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。故选AC。 （2024·浙江·高考真题）（多选）阅读下列材料，完成下面小题。疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。     8.下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（       ） A. F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B. F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段 9.为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。     1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（       ） A. 1号和6号 B. 2号和4号 C. 3号和5号 D. 1号、2号、4号和6号 【答案】8.D　9.B 【解析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。8.A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。9.根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 故选B。 10.（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①                  5'-GCCGATCTTTATA-3'3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'            3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④ 【答案】D 【解析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。分析反应管① ～④ 中分别加入的适量单链DNA可知，① 中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；② 中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③ 中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④ 中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③ ④ 。故选D。 11.（2026·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。合成生物学助力尿酸代谢平衡尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体（见下图），右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加（如下图）。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 （1）表达载体中　　　　　　　　　　的功能是驱动目的基因的转录。 （2）由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者　　　　　　　　　　结合蛋白。 （3）为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码　　　　　　　　　　的U酶。 （4）对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是　　　　　　　　　　。 （5）利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找　　　　　　　　　　。 【答案】（1）启动子     （2）竞争性     （3）分泌型     （4）减少 cH 的数目     （5）能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列      【解析】(1) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，功能就是驱动下游目的基因的转录，表达载体中启动子的功能是驱动目的基因的转录。(2) R蛋白既可以和尿酸可逆结合，也可以和cH序列可逆结合，尿酸浓度低时R更多结合cH，尿酸浓度高时R更多结合尿酸、从cH上脱离，说明尿酸和cH序列会竞争结合R蛋白。(3) 实验目的是降解血液中的尿酸而非细胞内的尿酸，因此改造后的sU基因编码的U酶需要被分泌到细胞外，才能进入血液发挥降解尿酸的作用。(4) “相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少”，现在要进一步降低小鼠血液尿酸浓度，就需要让sU（U酶）的表达量更高，因此可以减少sU表达载体上串联的cH序列的数量，降低R蛋白对sU转录的抑制作用，提升U酶的合成量，增强尿酸降解效果。(5) 该尿酸调控系统的核心是“能响应目标代谢物（尿酸）、同时可结合对应调控DNA序列的双功能R蛋白+R蛋白的结合靶序列cH”，要复助力血糖稳态的维持，关键是寻找能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列。 12.（2025·课标卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题： （1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是　　　　　　　　，而PCR过程中解开双链的方法是　　　　　　　　。 （2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有　　　　　　　　。 （3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：　　　　　　　　；②无扩增产物，原因是　　　　　　　　；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是　　　　　　　　。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 （4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果　　　　　　　　。 【答案】（1）① 解旋酶    ② 高温变性     （2）引物、脱氧核苷三磷酸     （3）① 作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染）    ② P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列    ③ 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段     （4）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性      【解析】PCR（聚合酶链式反应）技术扩增基因的原理是DNA 半保留复制 。 在适宜的温度、引物、DNA 聚合酶、脱氧核苷酸等条件下，以目的基因的两条链为模板，按照碱基互补配对原则（A - T、G - C 配对），通过变性（高温使 DNA 双链解开）、退火（低温使引物与模板结合）、延伸（中温下 DNA 聚合酶催化脱氧核苷酸连接到引物上延伸成新链 ）三个步骤循环往复，实现目的基因的大量扩增，每一轮循环后 DNA 分子数量呈指数增长 。(1) 在细胞中，DNA 复制时解开双链的酶是解旋酶。而在 PCR 过程中，是通过高温变性（加热至 90 - 95℃）的方法使 DNA 双链解开。(2) PCR 过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和 dNTP（脱氧核苷三磷酸）。引物用于引导 DNA 聚合酶合成新的 DNA 链，dNTP 脱去两分子磷酸，产生dAMP，进而为合成新的 DNA 链提供原料。(3) 实验中① 和④ 的作用是作为对照。① 无模板且引物对与② ③ 相同，④ 无模板且引物对与⑤ ⑥ 相同，可对比说明模板对扩增的影响。② 之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③ 以Px为模板，引物1和引物2扩增出的是含目的基因的 DNA 片段；⑤ 以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段 DNA 片段；⑥ 以Px为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的 DNA 片段。(4) 实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系（作为对照），在适宜条件下，加入酶X的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。 预期结果：含有酶X的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。 13.（2025·河南·高考真题）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型：紧凑株型=3：1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题： （1）该紧凑株型性状由　　　　　　（填“A”或“a”）基因控制。 （2）在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是　　　　　　　　　　　　。 （3）研究人员设计了3条引物（P1~P3），位置如图1（→表示引物5´→3´方向）。以3个F2单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B（不考虑PCR结果异常）。 ①图2-A中使用的引物组合是　　　　　　；丙单株无扩增条带的原因是　　　　　　　　　　。 ②结合图2-A的扩增结果，在图2-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑）　　　　　　　　　　。 ③使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型=　　　　　　。 【答案】（1）a     （2）插入序列后，a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译     （3）① P2和P3    ② 丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物    ③     ④ 2∶1      【解析】基因分离定律的实质：杂合体内，等位基因在减数分裂形成配子时随同源染色体的分开而分离，进入两个不同的配子，独立的随配子遗传给后代。(1) 根据题意可知，研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型=3∶1，说明紧凑株型为隐性性状，由a基因控制。(2) 在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，说明终止密码子提前出现，因此推测可能是A基因内部插入一段序列后，使a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译。(3) ① 子二代中的基因型为AA、Aa、aa，根据图示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则A基因和a基因均能扩增出相应产物，只是a基因扩增的产物长度要大于A基因扩增的产物，即AA的个体扩增产物的电泳条带与aa的个体扩增产物的电泳条带不同，且Aa的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图A不符，若选择引物P3和P2进行扩增，则只有Aa和aa的个体中因含有a基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，而AA的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图2-A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。② 图A是利用引物P3和P2扩增后电泳的结果，则图B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，因此AA（松散株型）、aa（紧凑株型）基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，且aa基因的个体扩增的产物电泳时形成的电泳条带距离点样孔近，而Aa（松散株型）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带，故乙与丙的电泳条带为 。③ 使用图2-A中的引物组合（P3和P2）扩增F2全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A-为松散株型，而子二代中Aa∶AA=2∶1，所以使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型（Aa）∶无扩增条带松散株型（AA）=2∶1。 14.（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 （1）嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生　　　　　　　　　　　，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的　　　　　　　　　　　将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 （2）初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于　　　　　　　　　　　序列所编码的蛋白区段。 （3）为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由　　　　　　　　　　　组成。 （4）在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因　　　　　　。 【答案】（1）① 兴奋/动作电位/神经冲动    ② 突触     （2）非保守     （3）长度相同但非保守序列不同的DNA片段     （4）少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证(1) 气味分子刺激感受器产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端、神经元间隙与下一个神经元组成突触，包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。(2) 不同气味受体能特异性识别相应气味分子的关键在于蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。(3) 由图可知，PCR产物含保守序列和非保守序列，若非保守序列不同，酶切产物的长度可能不同，导致酶切片段长度之和大于PCR产物长度，因此PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。(4) 由图丙可知，少量的气体分子通过活化G蛋白使得C酶活化，在C酶的催化下，由ATP合成大量的cAMP ，促使Na+通道打开，Na+内流，导致神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知。 题干关键信息 所学知识 信息加工 感受器 接受刺激并产生兴奋 感受器接受刺激后产生兴奋，兴奋通过传入神经将兴奋传到神经中枢，在大脑皮层产生相应的感觉 PCR产物含保守序列和非保守序列 蛋白质功能不同，说明其结构不同 关键在于非保守序列所编码的蛋白区段 不同气味受体能特异识别相应气味分子 说明不同气味受体的蛋白质结构不同 考点3 基因工程综合 1.（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（        ） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 【答案】B 【解析】A、所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确；B、重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误；C、外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确；D、启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 2.（2026·浙江·高考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A. 将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B. 不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C. 转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D. 转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 【答案】D 【解析】A、水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化（不需要再次脱分化）。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误；B、转基因过程中，外源基因（P1基因）插入水稻染色体的位置是随机的（位置效应），不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误；C、水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误；D、题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。故选D。 3.（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 A. 水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B. 在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C. 农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D. 愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 【答案】B 【解析】A、将T - DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状。那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误；B、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， B正确； C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T - DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中 ，通常情况下，若D基因能表达，那么T - DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T - DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T - DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错误；D、 检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株， D错误。故选B。 4.（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（       ）         A. 上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B. E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C. E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【答案】A 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法；（4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 A、图示表明，可以从酿酒酵母S中通过PCR分离得到目的基因gadB，A正确。B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；C、E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误；D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用其他酶代替，D错误。故选A。 5.（2026·甘肃·高考真题）甜醅是西北地区的传统小吃，可由燕麦发酵而成。燕麦经清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后，加入酒曲（含酵母菌等微生物）发酵，即可制成甜醅。回答下列问题。 （1）燕麦中的淀粉被淀粉酶水解成还原糖，为酵母菌提供　　　　　　　　　　。 （2）甜醅制作时，蒸煮原料的操作属于无菌技术中的　　　　　　　　　　；加入酒曲前摊凉是为了避免原料温度过高导致　　　　　　　　　　 （3）发酵初期，需要将温度控制在28℃左右是因为　　　　　　　　　　；发酵后期，密封发酵容器可促进酵母菌的　　　　　　　　　　，使乙醇含量　　　　　　　　　　。 （4）为了推动甜醅的工业化生产，研发人员利用基因工程技术从甜醅中克隆了α-淀粉酶基因，构建了表达载体。实验所用载体结构、引物设计图和限制酶识别序列及酶切位点如下。 ①在设计α-淀粉酶引物序列时，为了将目的基因正确插入表达载体，引物1的5′端引入了BamH Ⅰ识别序列，引物2的5′端需引入　　　　　　　　　　酶的识别序列。 ②构建成功的重组质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切　　　　　　　　　　（填“可以”或“不可以”）切割出完整的α-淀粉酶基因。理由是　　　　　　　　　　。 【答案】（1）碳源/碳源和能源物质     （2）① 消毒    ② 酒曲中的微生物失活     （3）① 28℃是酵母菌的最适生长温度，有利于酵母菌快速增殖，扩大菌种数量    ② 无氧呼吸/酒精发酵    ③ 升高     （4）① Mfe Ⅰ    ② 不可以    ③ α-淀粉酶基因的序列内部存在EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ酶切后目的基因会断裂      【解析】(1) 淀粉属于多糖，水解产生的还原糖含有碳元素，既可作为碳源为酵母菌的生命活动提供碳元素；又可通过细胞呼吸分解，释放能量，为酵母菌提供能源物质。(2) 消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。蒸煮原料通过高温杀灭一部分杂菌，属于传统发酵中的消毒操作。微生物的活性受温度影响，高温会使酵母菌等微生物的蛋白质变性失活，造成菌种死亡，因此摊凉降温可以避免高温杀死接种的发酵菌种，保护酒曲内酵母菌等微生物的活性。(3) 酵母菌的最适生长温度约为28℃，此条件下酵母菌代谢旺盛、增殖速度快，可扩大菌种数量，为后续发酵提供足够的菌种；发酵后期，密封容器内氧气含量快速下降，会抑制酵母菌的有氧呼吸，促进酵母菌进行无氧呼吸（酒精发酵）产生乙醇，使发酵体系内乙醇含量逐渐升高。(4) ① 构建基因表达载体时，目的基因应当插入到启动子和终止子之间，且限制酶不能破坏目的基因和载体上的启动子、终止子和标记基因等，由图可知，EcoR Ⅰ会破坏目的基因；Mfe Ⅰ会破坏载体上的启动子；Hind Ⅲ会破坏载体上的抗性基因（卡那霉素抗性基因），结合限制酶识别序列可知，EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ属于同尾酶，可产生相同的黏性末端，因此构建基因表达载体时，可用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切割质粒，在目的基因的两端分别添加上BamH Ⅰ和Mfe Ⅰ的识别序列。为了保证目的基因能够正常表达，结合目的基因的转录方向，在表达载体上，目的基因的转录方向为从启动子到终止子，因此引物1的5′端引入BamH Ⅰ的识别序列，引物2的5′端需要引入Mfe Ⅰ的识别序列。② 由图可知，α-淀粉酶基因的序列内部存在一个EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ切割重组质粒时，EcoRⅠ会从目的基因的内部将其切断，造成目的基因断裂，因此无法获得完整的α-淀粉酶基因。 6.（2026·全国·高考真题）研究人员利用基因工程和动物细胞工程技术对某品种奶牛进行改良，以使奶牛的乳腺表达并分泌蛋白B，技术路线如图所示。回答下列问题。 （1）在获取目的基因的过程中，步骤①和步骤②所用的酶分别是　　　　　　　　　　　。 （2）完成基因导入后，需要鉴定牛胚胎成纤维细胞染色体DNA上是否成功插入B基因，可使用的检测技术有　　　　　　　　　　　(答出1点即可)等。 （3）牛卵母细胞去核时，所使用的卵母细胞应处于　　　　　　　(填“减数分裂Ⅰ中期”“减数分裂Ⅱ中期”或“有丝分裂中期”)。 （4）步骤③将2种细胞融合常用的方法有　　　　　　　(答出1点即可)等。步骤④胚胎移植前，需要对重构胚进行　　　　　　　　　　　　　　　　　处理，以使重构胚完成细胞分裂和发育进程。 （5）设计实验，鉴定成年转基因母牛的乳腺是否分泌了蛋白B，简要写出实验思路。 【答案】（1）逆转录酶、DNA聚合酶     （2）PCR     （3）减数分裂Ⅱ中期     （4）① 电融合法    ② 激活     （5）取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验      【解析】(1) 步骤① 是以mRNA为模板合成互补DNA的逆转录过程，需要逆转录酶；步骤② 是通过PCR技术扩增目的基因，需要用到耐高温的DNA聚合酶。(2) 检测细胞染色体DNA上是否插入目的基因，属于分子水平的核酸检测，可通过特异性PCR技术扩增出目的基因片段来验证插入是否成功，也可以用DNA分子杂交技术。(3) 动物体细胞核移植的去核操作，需要选用发育到减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，该时期的卵母细胞细胞质具备促进细胞核全能性表达的条件。(4) 动物细胞融合的常用方法有电融合法、聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法；重构胚需要通过激活处理（如电刺激、化学刺激），才能启动细胞分裂，完成后续的发育进程。(5) 检测目的基因是否成功表达出蛋白质，采用抗原-抗体特异性结合的原理，可取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验，即可鉴定乳腺是否分泌了蛋白B。 7.（2026·贵州·高考真题）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的　　　　　对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为　　　　　　　　　的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为　　　　　bp。                                W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                         Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是　　　　　　　　　　试剂；a和b两片段长度相差　　　　　个核苷酸；启动子的该序列从端到端第　　　　　位核苷酸发生了甲基化。 【答案】（1）Bcl I和Xba I     （2）① 3+6    ② 2500     （3）① X    ② 4    ③ 3和9      【解析】(1) 若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列(5'-GGATCC-3')，切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。(2) 在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。(3) 启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'(共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10)，互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断(即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断)。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组:条带位置对应 C/T位点一Y试剂(识别C、T)；2组:条带位置仅对应C位点一Z试剂(识别C)；3组:条带位置对应A/G位点X试剂(识别G、A)；4组:条带位置仅对应G位点一W试剂(识别G)。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y)和2(Z)的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 8.（2026·湖北·高考真题）蛋白激酶CaMKIIδ过度活化可导致某些心血管疾病。该酶过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸（Met）有关。可通过向导RNA引导，将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）精确定位至基因的待编辑位置，使基因相关位点①和②（如图1）的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，从而抑制CaMKIIδ的过度活化。科研人员设计两种向导RNA—sgRNA1和sgRNA6，以此构建了两种ABE，两者在机体心肌细胞中编辑CaMKIIδ基因的效率如图2。 回答下列问题： （1）CaMKIIδ的化学本质是　　　　　　　　。 （2）实验中使用心肌特异性启动子来驱动ABE发挥作用，目的是　　　　　　　　　　　　　　。 （3）图1中sgRNA1序列为________（填标号）。 A. 5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3' B. 5'-GTCTGTGCATCATGGAAGC-3' C. 5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3' D. 5'-CGAAGGUACUACGUGUCUG-3' （4）由图2可知，以　　　　　　　　为向导RNA的ABE编辑效果更好，理由是　　　　　　　　　　　　　　。 （5）镰状细胞贫血是一种遗传病，导致该病的根本原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　；理论上，若用上述技术，需将碱基编辑器导入　　　　　　　　（填细胞名称），从而实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 【答案】（1）蛋白质     （2）使ABE基因仅在心肌细胞中表达，避免影响其他细胞的正常生理功能     （3）C     （4）① sgRNA6    ② 只有基因位点① 和② 的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，才能抑制CaMKⅡδ的过度活化，以sgRNA6为向导的ABE对位点① 和② 均有较高的编辑效率，而以sgRNA1为向导的ABE仅对位点① 有较高编辑效率，对位点② 编辑效率极低     （5）① 控制血红蛋白合成的基因发生了基因突变    ② 造血干细胞      【解析】(1) CaMKIIδ是一种蛋白激酶，由题干信息可知，蛋白激酶CaMKIIδ过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸有关，因此该酶的化学本质为蛋白质。(2) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质，因此为了驱动ABE仅在心肌细胞中表达，需要在编码ABE的基因的上游添加心肌特异性启动子，避免对其他组织细胞造成不必要的编辑，降低副作用。(3) 基因的转录是以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，从模板链的3'端结合RNA聚合酶转录而来，由图示可知与sgRNA结合的向导DNA序列的编码链为5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3'，根据碱基互补配对原则,，且RNA中含U不含T，sgRNA1的碱基序列为5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3'，C符合题意，ABD不符合题意。(4) 由图2可知：含SgRNA1的ABE仅在位点① A→G转换效率高，位点② 几乎无编辑效果；含sgRNA6的ABE在位点① 和② 的A-G转换效率均较高，可同时编辑第281和282位甲硫氨酸，更有效地抑制CaMKII8过度活化。(5) 镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由血红蛋白基因中一个碱基对的替换（A/T→T/A）导致谷氨酸被缬氨酸替换，进而引起血红蛋白结构异常。血红蛋白只在红细胞中被选择性表达合成，红细胞由造血干细胞分化而来，因此将碱基编辑器导入造血干细胞，可使其分化产生正常的红细胞，实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 9.（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的　　　　　　　　（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是　　　　　　　　　　。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A. 24 h检测细胞内 B. 24 h检测细胞外 C. 0 h和24 h检测细胞内 D. 0 h和24 h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射　　　　　　　　　　　　　；该实验结论是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 抗体    ② 使其在星形胶质细胞中特异性表达    ③ KpnⅠ和BamHⅠ     （2）C     （3）① 携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒    ② 在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。      【解析】(1) 实验目的是形成CAR-A细胞（嵌合抗原受体基因），并鉴定这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力，所以表达产物需要与Aβ聚集体特异性结合，所以胞外识别区应选用Aβ聚集体的抗体特定片段编码序列。要使其在星形胶质细胞中特异性表达，所以需要选择特异性启动子。为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，需要将CAR基因编码序列和特异性启动子导入病毒载体中，分析目的基因和载体，可以选择KpnⅠ和BamHⅠ切割目的基因和病毒载体，可以保证目的基因插入病毒载体中，依次形成特异性启动子、CAR表达载体、GFP基因和终止子的表达载体。(2) 要证明细胞具有“吞噬”和“降解”Aβ聚集体的能力，必须检测Aβ是否进入了细胞内部以及其含量的变化。在0 h（更换培养基前）和24 h（更换培养基继续培养后）分别检测细胞内的Aβ聚集体含量，如果24 h时细胞内Aβ含量显著低于0 h，则能确凿地证明CAR-A细胞不仅吞噬了Aβ，还在细胞内将其降解了，C正确，ABD错误。(3) 为检测效果，实验组6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，对照组选择6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒，由于3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降，说明了在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 10.（2026·四川·高考真题）肿瘤的快速增殖使其内部缺氧，有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌（E.coli），构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果，部分操作如图1。回答下列问题。 （1）DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成　　　　　　　　键，连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达，目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效，有人开展了相关实验，结果如图2，请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）色谱分析可区分不同的小分子，同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白，反应后的色谱分析结果如图3。FP蛋白的反应底物是　　　　　　　　　　。 （4）有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉，证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析，用His标签抗体杂交，检测到的组1是　　　　　　　　　　（填“E.coli”或“E.coli-fp”）；兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖，原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 磷酸二酯    ② His标签可被抗体识别，便于FP蛋白的筛选     （2）FP蛋白、PD-1抗体单独使用 时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著     （3）ATP     （4）① E.coli-fp    ② 大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖    ③ 基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果      【解析】(1) DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选。(2) 结合图2曲线分析：和对照组相比，PD-1抗体组、FP蛋白组的肿瘤体积都更小，说明FP蛋白、PD-1抗体单独使用时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著。(3) 分析图3：加入FP蛋白后，ATP的峰值消失，只产生AMP的峰值，说明FP可以催化ATP分解；而GTP加入FP后无变化，因此FP的反应底物是ATP。 (4) 只有工程菌E.coli−fp含有His标签序列，能被His标签抗体检测到，因此出现阳性杂交信号的组1是E.coli−fp。 肿瘤因快速增殖内部形成缺氧环境，大肠杆菌为兼性厌氧菌，可适应缺氧的肿瘤微环境完成生长增殖；能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖。结合前文结论，基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果。 11.（2026·广东·高考真题）疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因（MM-CP）按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题： （1）构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于　　　　　　　　　　　　　　。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的　　　　　　　　　　　　与mRNA上的密码子互补配对，将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 （2）研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为　　　　　　　　　　　　　。从基因传递的角度分析，选用该类启动子的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为降低抗菌肽对按蚊的不利影响，运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊（如图）。与非驱动型相比，驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加，其原因是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然后　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，使更多配子携带MM-CP。 （4）若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 基因重组    ② 反密码子     （2）① 诱导型启动子    ② 使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代    ③ 从预期改造后抗菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响）出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽     （3）以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复     （4）基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险      【解析】(1) 构建转基因按蚊属于基因工程，属于基因重组；翻译过程中，tRNA上的反密码子和mRNA上的密码子配对。(2) 抗菌肽基因仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，所以推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为诱导型启动子。该启动子使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，所以设计思路：从预期改造后抗菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响）出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽。(3) 结合图示可知，Cas9切割野生型染色体后，会以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复，让原本的野生型染色体也变成携带MM-CP的染色体，最终体细胞两条同源染色体均带MM-CP，减数分裂产生的配子几乎都携带该基因，因此后代携带MM-CP的比例显著升高。(4) 从生物进化角度，基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险。 12.（2026·广东·高考真题）玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因VA和VW可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异（图a），且在胚乳发育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如下研究。 回答下列问题： （1）将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为　　　　　　　　　　性状。 （2）根据这对基因的序列设计了3种引物（图a），便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶（延伸速度约为1000 bp/min）、缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核苷酸和　　　　　　　　　　，反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①～⑤（图c）中泳道　　　　　　　　　　　　　　　的带型。 （3）基于品系W构建了针对VW基因的RNAi（可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达）转基因植株。鉴定转基因植株中VW基因表达是否受到影响，应提取植株　　　　　　　　　　　　　　　进行PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果（胚乳由极核和精子结合后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同）： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为　　　　　　　　　　　　　　　　　； ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推测研究人员提出的假设。最合理的是：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　是产生品系A粉质胚乳的原因。 【答案】（1）显性     （2）① 模板DNA/玉米基因组DNA    ② ①     （3）① （胚乳的）RNA    ② 粉质    ③ 粉质：硬质=3：1     （4）VA基因表达量低，编码的催化酶合成不足，无法有效催化非极性胡萝卜素转化为下游产物；非极性胡萝卜素积累，导致形成粉质胚乳      【解析】(1) 粉质品系 A、硬质品系 W 为纯合品系，正反交F1籽粒胚乳全为硬质，说明硬质性状能完全掩盖粉质，硬质为显性性状。(2) PCR反应体系除引物、Taq酶、缓冲液、脱氧核苷酸、水外，还需要模板DNA作为扩增的模板。品系W是纯合VWVW，Taq DNA聚合酶延伸速度约为1000 bp/min，引物1与引物2可扩增出100+196=296bp（约300bp）的片段，引物3延伸的子链至多延伸500bp，不能再作为引物1结合的模板，因此扩增产物对应图c的泳道①。 (3) 要检测VW的表达是否受影响，需要检测转录产物，因此提取胚乳的RNA，通过逆转录PCR检测。 已知VW高表达对应硬质，低表达对应粉质。① 纯合转基因植株的VW表达被RNAi显著降低，因此胚乳性状为粉质。② 杂合转基因植株（V+V−，V+为正常VW，V−为表达被敲低的VW）自交，胚乳由两个基因型相同的极核+一个精子发育而来，仅纯合的VWVW表现为硬质，杂合转基因植株中VW表达被敲低，因此性状比例为粉质：硬质=3：1。(4) 据题干信息可知，VW编码的酶催化非极性胡萝卜素转化为下游产物，品系A的VA表达量低，酶量不足，因此推测：非极性胡萝卜素积累是产生品系A粉质胚乳的原因，若诱变后非极性胡萝卜素合成途径基因突变，非极性胡萝卜素合成减少不再积累，胚乳会变为硬质。 13.（2026·河北·高考真题）黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。回答下列问题： （1）黑曲霉菌种的分离纯化应选用　　　　　　　　　（填“固体”或“液体”）培养基。 （2）细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照　　　　　　　　　原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的　　　　　　　　　端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是　　　　　　　　　。 （3）构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有　　　　　　　　　基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用　　　　　　　　　培养基筛选出转基因成功的菌株。 （4）构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图2）表明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） （5）传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） 【答案】（1）固体      （2）① 碱基互补配对    ② 5′    ③ Sac Ⅰ      （3）① 标记    ② 选择     （4）① 抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；② 抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力     （5）① 省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；② 酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高      【解析】(1) 微生物的分离纯化需要获得单菌落，只有固体培养基上才能形成单菌落，因此选用固体培养基。 (2) 核酸折叠形成双链遵循碱基互补配对原则；PCR扩增时，引物与模板3'端互补，引物延伸的方向是5'端→3'端，额外的限制酶识别序列需要添加在引物的5′端；根据图1载体的酶切位点顺序：启动子-KpnⅠ-A-SpeⅠ-B-NcoⅠ-C-SacⅠ-终止子可知，A位点两侧是KpnⅠ和SpeⅠ，C位点两侧是Nco Ⅰ和Sac Ⅰ，结合题意可知，该过程需要使含片段A和C的转录产物自身折叠形成双链，图1可知，PCR扩增CreA基因D片段时，分别在5'端添加了A片段和C片段对应的限制酶，要使A片段和C片段插入的D片段转录产物互补，则需要将C位点插入的D片段与A位点插入的D片段反向，结合图中载体上的限制酶对应关系可知，限制酶① 应为Sac Ⅰ。 (3) 基因表达载体的结构包括启动子、终止子、目的基因，还需具有标记基因，标记基因的作用是筛选成功转入载体的受体细胞；在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基是选择培养基，可利用选择培养基筛选出转基因菌株。(4) 分析图2曲线，G（原菌株）和G1（抑制CreA表达的菌株）的生物量曲线几乎重合，说明CreA表达抑制对黑曲霉生长无显著影响；G1的淀粉酶活力远高于G，说明抑制CreA表达可以显著提高淀粉酶活力。 (5) 传统工艺需要高温处理淀粉，而淀粉酶R可直接降解生淀粉，因此优势为：① 省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；② 酶促反应条件温和。副产物少，产物纯度更高 14.（2026·山东·高考真题）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是　　　　　　　，载体上与其能自我复制相关的结构是　　　　　　　。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为　　　　　　　　　　　。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，该过程中　　　　　　　　　　　（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 启动子    ② 复制原点     （2）Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ      （3）① DNA聚合酶、DNA连接酶    ② 不需要    ③ 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始     （4）抗原-抗体杂交      【解析】(1) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。(2) 要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。 由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。载体在加尾时，只能加入一种脱氧核苷酸，否则会随机连接，这样载体两端只能加G尾。同理，目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ 。(3) 由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。(4) 检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 15.（2026·黑吉辽蒙·高考真题）我国科学家在半矮秆水稻性状改良研究领域中取得了突破性进展。 （1）已知水稻高秆和半矮秆性状受一对等位基因SD1/sd1控制。SD1基因编码有功能的赤霉素20-氧化酶，催化底物产生赤霉素，控制高秆性状；sd1基因不能产生有功能的酶，控制半矮秆性状。杂交结果说明高秆对半矮秆为显性，从基因型和基因产物功能的角度，对此结论的解释是　　　　　　　　。 （2）半矮秆稻抗倒伏，但高氮肥下才能高产。为使其在低氮肥下高产，科学家找到一种名为“千粒稻”的高秆水稻，该水稻具有低氮肥下高产的相关基因。为寻找该基因，将千粒稻与半矮秆稻杂交，筛选　　　　　　　　性状的半矮秆子代，再与　　　　　　　　杂交。重复以上操作，得到一系列只包含一小段千粒稻染色质但低氮肥高产的杂交品系（C系）。上述过程是为了尽可能避免　　　　　　　　流入C系，以缩小筛选范围。 （3）从C系中筛选到一段DNA序列，命名为qINCA2.qINCA2与半矮秆稻的同源序列INCA2只有一个核苷酸差异，均不编码蛋白质。在低氮肥条件下，INCA2导致局部染色质成为稳定的环，把RCN2基因“锁”在其中（下图b），而qINCA2没有使染色质成环能力（下图c）。 qINCA2控制低氮肥高产性状的分子水平解释为　　　　　　　　。 （4）基于以上机制欲用基因组编辑技术（可以精准快速改变DNA序列）改造另一种氮肥依赖型半矮秆稻品种，培育低氮肥高产型纯合子。合理的方案是先编辑该半矮秆稻的　　　　　　　　，筛选得到低氮肥高产型第一代基因组编辑水稻。由于该水稻可能是　　　　　　　　，需再让其进行　　　　　　　　，然后从中筛选获得目标水稻。 【答案】（1）杂合子基因型为SD1sd1，其中SD1可编码产生有功能的赤霉素20-氧化酶，合成赤霉素，表现为高秆，因此高秆对半矮秆为显性     （2）① 低氮肥高产    ② 半矮秆稻    ③ 千粒稻其余染色质（DNA）     （3）qINCA2没有使染色质成环的能力，无法将RCN2基因锁定，RCN2基因可以正常转录、翻译（正常表达），合成RCN2蛋白，因此水稻在低氮肥条件下表现高产     （4）① INCA2基因    ② 杂合子    ③ 自交      【解析】(1) 显性性状的定义是：杂合子所表现出的性状为显性性状。结合题干信息，只要携带SD1基因就能合成有功能的酶，产生赤霉素，表现高秆，因此高秆对半矮秆为显性。(2) 该过程是通过回交逐步定位目的基因：首先需要筛选获得符合要求的低氮肥高产性状的半矮秆子代，之后与亲本半矮秆稻回交，重复操作后，可淘汰千粒稻中除目的基因所在片段外的其余染色质/DNA，仅保留带目的基因的小段千粒稻染色质，缩小筛选范围。(3) 从题图可知：半矮秆稻的INCA2使染色质成环，抑制RCN2表达，导致低氮肥低产；而千粒稻的qINCA2不能成环，RCN2可正常表达，因此实现低氮肥高产。(4) 待改造的半矮秆稻含INCA2，因此需要编辑其INCA2基因，使其突变为qINCA2类型；水稻是二倍体，一次编辑通常仅改变一对同源染色体中的一个INCA2基因，因此第一代编辑水稻一般为杂合子；杂合子自交后会发生性状分离，可从后代中筛选得到纯合的低氮肥高产目标植株。 16.（2026·黑吉辽蒙·高考真题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是　　　　　　　　。实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用　　　　　　　　（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在　　　　　　　　。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是　　　　　　　　和　　　　　　　　。A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb       B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kbC．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb       D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的　　　　　　　　上。为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是　　　　　　　　。A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′       B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′       D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数（次/小时） 停留时间（分钟/小时） 2小时感染率（%） LT50（天） 第7天死亡率（%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是　　　　　　　　。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的　　　　　　　　评价，符合标准后方可推广。 【答案】（1）① 人工合成法（化学合成法）    ② T4    ③ 未插入目的基因的pPK2空质粒    ④ A    ⑤ D    ⑥ 染色体DNA    ⑦ B     （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高      （3）安全性      【解析】(1) 已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV切割产生平末端，T4 DNA连接酶可以连接平末端，连接效率高于EcolDNA连接酶，因此选T4DNA连接酶。卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2空质粒。原质粒5.0kb，目的基因总长度0.7+1.1=1.8kb，重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：BamHI/EcoRI酶切得到0.7kb+6.1kb（6.8−0.7=6.1）；HindIII/EcoRI酶切得到1.1kb+5.7kb（6.8−1.1=5.7），因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方向为5'→3'。转录模板链为5′−ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC−3′，左侧引物序列为5′−ATGTC…−3′，右侧引物与模板右侧的序列5′…GCTCC−3′反向互补，序列为5′−GGAGC…−3′，因此选B。(2) 根据题干和表格数据，转入Tps基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50更短，最终第7天死亡率更高。(3) 转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 17.（2026·河南·高考真题）4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为　　　　　　　　。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有　　　　　　　　，作用为　　　　　　　　。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是　　　　　　　　，限制酶2是　　　　　　　　。 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带　　　　　　　　（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是　　　　　　　　。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是　　　　　　　　（答出一点即可）。 【答案】（1）① 复制原点    ② 终止子    ③ 终止目的基因的转录     （2）① XhoⅠ    ② NcoⅠ     （3）① b    ② 重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因     （4）工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高      【解析】(1) 载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点（DNA复制的起始位点）。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。(2) 结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5’-TCGAG，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5’-CATGG，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。(3) 根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。(4) 工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 18.（2026·陕晋青宁·高考真题）研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 （1）当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的　　　　　　　　　　　性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是　　　　　　　　　　　(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 （2）为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于　　　　　　　　　　　型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的　　　　　　　　　　　酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是　　　　　　　　　　　。 （3）已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是　　　　　　　　　　　或　　　　　　　　　　　两种组合，原因是　　　　　　　　　　　。 （4）为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是　　　　　　　　　　　。可利用　　　　　　　　　　　法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，　　　　　　　　　　　(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 【答案】（1）① 简并性    ② ③     （2）① 诱导    ② RNA聚合    ③ 引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育     （3）① EcoR I和Kpn I    ② EcoR I和SaI I    ③ 从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变）     （4）① 增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触    ② 农杆菌转化法    ③ 抑制      【解析】(1) 由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因（J*），这样能避免转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同而抑制J基因表达的问题。要确定获得的J*基因是否与设计相符，需要对其进行测序并序列比对，所以选③ 。(2) 因为构建的是仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗虫棉，所以在该载体中，启动子P属于诱导型启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，棉铃虫啃食后，棉花细胞中的RNA聚合酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达。之后检测到J*蛋白在细胞外积累，说明S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育。(3) 已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需要用两种限制酶对载体进行酶切，且这两种限制酶切割后产生的黏性末端不同，这样可以避免自身环化和反向连接，可选择的限制酶组合是EcoR I和Kpn I或EcoR I和SaI I两种组合，原因是根据图中信号肽序列的核苷酸数量，从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变）。(4) 为获得足够的重组质粒，对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触。将融合基因导入棉花茎尖细胞，可利用农杆菌转化法。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，使组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 19.（2026·云南·高考真题）UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。回答下列问题：第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 （1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和　　　　　　　　三步。 （2）构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是　　　　　　　　（答出2点）。第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 （3）我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是　　　　　　　　。 （4）要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加　　　　　　　　　，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是　　　　　　　　；在第二次筛选培养基中添加　　　　　　　　。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是　　　　　　　　（填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并　　　　　　　　。 【答案】（1）延伸     （2）防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接     （3）防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染     （4）① 庆大霉素    ② pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长    ③ 蔗糖    ④ ②    ⑤ 电泳检测      【解析】(1) PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。(2) 构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目的基因与质粒反向连接。(3) 在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格控制，在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略，此类设计的主要目的是防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染。(4) 据图a可知，质粒上含有庆大霉素抗性基因，所以第一次在培养基中添加庆大霉素，由于pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌株；第二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原理，应在培养基中添加蔗糖，原因是pEX质粒上带有蔗糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养基上存活；筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是② ，图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该是切前端重组；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并电泳检测来鉴定。 20.（2026·安徽·高考真题）肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 （1）培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液　　　　　　异常；乳腺癌细胞培养时　　　　　　（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是　　　　　　。 （2）P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为　　　　　　（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是　　　　　　。 （3）S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因　　　　　　S基因的转录，　　　　　　（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。 【答案】（1）① pH    ② 不会    ③ 胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞     （2）① ① ④ 或③ ④    ② 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞     （3）① 抑制    ② 促进      【解析】(1) 动物细胞培养中，CO₂的作用是维持培养液正常的pH，若CO₂不足会导致培养液pH异常；乳腺癌细胞是癌细胞，细胞膜上糖蛋白减少，失去了接触抑制特性，因此培养时不会出现接触抑制；胰蛋白酶处理贴壁细胞分散细胞时，处理时间过长会过度分解细胞蛋白、损伤细胞，因此需要控制处理时间。(2) 构建重组质粒时，需要保证目的基因插入方向正确：质粒启动子在插入位点左侧，转录方向从左到右，而P基因自身转录方向向左，因此需要将P基因的右端（转录起点侧）连接靠近启动子的Bgl II位点，左端连接靠近终止子的Hind III位点，但因质粒的复制原点有Hind III的酶切位点，在启动子和复制原点之间还有BamH I的酶切位点，故只能选择Bgl II作为靠近启动子的酶切位点、Spe I作为靠近终止子的酶切位点。根据碱基互补配对，Bgl II识别序列为AGATCT，P基因右端序列匹配引物③（5'-AGATCTAGGCAT-3'）；Spe I识别序列为ACTAGT，P基因左端序列匹配引物④（5'-ACTAGTCCGTGT-3'），因此选引物③ ④。BglⅡ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，扩增P基因时，也可以在上游引物的5'端添加BamHⅠ识别序列，选择引物① 和④ 。本实验探究P基因的作用，实验组导入含P基因的重组质粒，对照组需要排除质粒本身的影响，因此对照组为转入不含P基因的空质粒的乳腺癌细胞，其余条件与实验组一致。(3) 启动子甲基化会阻碍RNA聚合酶与启动子结合，因此P蛋白诱导S基因启动子甲基化，会抑制S基因的转录；S基因的作用是抑制DNA损伤修复、抑制肿瘤增殖，S基因表达被抑制后，DNA损伤修复可以正常进行，因此会促进肿瘤耐药。 21.（2026·浙江·高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因回答下列问题： （1）表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备　　　　　　　　，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经　　　　　　　　限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 （2）假丝酵母重组菌株的获得：在　　　　　　　　中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用　　　　　　　　方法接种在固体培养基上培养，适时挑选　　　　　　　　再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有　　　　　　　　的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 （3）重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是　　　　　　　　。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或　　　　　　　　，导致甘油合成代谢受阻。 【答案】（1）① 感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌    ② EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ     （2）① 超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台    ② （平板）划线法/稀释涂布平板法    ③ 单菌落    ④ 腐草霉素     （3）① 提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间    ② T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异      【解析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(1) 用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞（可导入外源DNA分子的农杆菌）。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。 从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。 用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。(2) 为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台（或无菌实验室或灭菌的操作台）的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因（Zeoᴿ）。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。(3) 从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 22.（2025·上海·高考真题）I.野生型大肠杆菌质膜上有一种转运葡萄糖的S蛋白，转运时需耗能。研究人员欲将另一种膜蛋白H改造为∆H蛋白，来替代S蛋白转运葡萄糖，形成一种不耗能的转运方式。图1是技术路线图，图2为构建的含有∆H基因的表达载体，其中 ①～ ④表示载体中的相应位置，PstⅠ和BamHⅠ表示相应限制性内切核酸酶的酶切位点。 1. 图1过程Ⅰ～Ⅳ中，获取目的基因发生在___________。(单选) A. Ⅰ B. Ⅱ C. Ⅲ D. Ⅳ 2. 图1过程Ⅱ中，需要使用的酶有___________。(多选) A. PstⅠ B. DNA连接酶 C. BamHⅠ D. DNA聚合酶 3. 图2中，∆H基因的启动子的位置和转录方向最可能是___________。(单选) A. ①，逆时针 B. ②，逆时针 C. ③，顺时针 D. ④，顺时针 4. 为确定表达载体是否含有∆H基因，可以采用的方法有___________。(多选) A. 对表达载体进行基因测序 B. 对表达载体上的特定片段进行PCR C. 酶切表达载体后检测DNA片段长度 D. 观察导入了表达载体的菌株的氨苄抗性 II.如同源染色体联会时发生的交叉互换，两个DNA分子若含有相同序列，可发生重组。在过程Ⅲ中，欲用DNA2中的片段⑦替换野生型大肠杆菌基因组(DNA1)中的S基因，图3中①～⑦代替相应DNA片段，且序列均不相同、无相互包含关系。S基因和替换片段⑦约3000bp(碱基对)，片段①～⑥约为15～25bp。 5. 以DNA2为模板，采用PCR获得含有替换片段 ⑦的PCR产物。若要用该PCR产物与DNA1重组，以完成对S基因的准确替换，则在该PCR产物中，除⑦外还包含①～⑥中的　　　　　　　　　　　；PCR引物的设计应依据的片段是①～⑥中的　　　　　　　　　　　。(编号选填)下表是野生型菌株和∆H菌株在仅碳源含量不同的培养基中的增殖情况，M值越大，反映菌株增殖越快。 培养基中碳源含量 M值 野生型菌株 ∆H菌株 50g/L 0.137 0.157 100g/L 0.127 0.228 6. 根据研究目的，培养基中的碳源应该选择___________。(单选) A. 葡萄糖 B. 葡萄糖和淀粉 C. 淀粉 D. 琼脂 7. 据表中数据，比较∆H菌株和野生型菌株的增殖情况，并分析两者产生差异的原因。 【答案】1. A     2. ABC     3. C     4. ABC     5. ① ② ③    ② ② ③     6. A     7. ∆H转运葡萄糖不消耗能量，葡萄糖浓度越高，进入细胞的葡萄糖越多，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快      【解析】(1) 过程I的内容是改造H基因、大量复制ΔH基因，ΔH基因就是本实验的目的基因，因此获取目的基因发生在过程I，A正确。(2) 图1过程Ⅱ是获得目的基因表达载体的过程，需要使用的酶有DNA连接酶和限制性核酸内切酶，根据图2可知，该目的基因表达载体构建过程中采用了双酶切的方法，因此构建过程中需要的酶有PstⅠ、DNA连接酶、BamHⅠ，ABC正确，D错误。(3) 启动子是RNA聚合酶结合位点，位于目的基因的上游，终止子位于目的基因下游，转录方向从启动子指向终止子。图2中终止子位于ΔH基因下游靠近④ 一侧，因此启动子应位于ΔH基因上游的③ 位置，转录方向为顺时针（从③ 经ΔH指向终止子），C正确。(4) A、对表达载体测序可以直接确认是否含有ΔH基因，A正确；B、对表达载体上的特定片段进行PCR可以实现对目的基因的检测，B正确；C、酶切后检测DNA片段长度，若片段长度符合预期（插入ΔH基因后的长度），即可证明含有目的基因，C正确；D、氨苄抗性基因位于载体上，无论是否插入ΔH基因，载体都携带氨苄抗性，不能通过氨苄抗性鉴定目的基因，D错误。(5) 同源重组需要同源序列，要替换DNA1中S基因，需要ΔH基因（⑦ ）两侧带有与S基因两侧相同的同源序列② 和③ ，才能准确重组替换S基因，因此PCR产物除⑦ 外还需要② ③；PCR引物需要与待扩增片段两端互补，因此引物设计依据② 和③ 的序列。(6) 本实验的研究目的是检验ΔH蛋白能否转运葡萄糖，因此需要选择葡萄糖作为唯一碳源，才能检测菌株利用葡萄糖的能力，A正确。(7) 野生型大肠杆菌吸收葡萄糖需要消耗能量，即吸收葡萄糖的方式为主动运输，∆H菌株吸收葡萄糖的方式不需要消耗能量，为协助扩散，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快。 23.（2025·海南·高考真题）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 （1）质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是　　　　　和　　　　　。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG （2）细胞X是一种贴壁细胞，可用　　　　　（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是　　　　　。 （3）将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有　　　　　作用，且随导入时间推移，增殖速率　　　　　。 （4）siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将　　　　　导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的　　　　　对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：　　　　　。 【答案】（1）① EcoR Ⅰ    ② Xho Ⅰ     （2）① 液体    ② 使贴壁细胞分散为单个细胞，37℃是胰蛋白酶的最适温度     （3）① 促进    ② 增加     （4）① 无靶向的siRNA    ② 表达减少    ③ a、提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用；b、提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用）      【解析】基因工程的基本操作程序：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。(1) 需选择质粒甲和质粒乙共有的限制酶切割，保证目的基因和质粒产生相同黏性末端。质粒甲的目的基因两端有EcoRⅠ和Xho Ⅰ的酶切位点（对应质粒乙的酶切位点），因此用EcoRⅠ和Xho Ⅰ。(2) 动物细胞培养使用液体培养基； 胰蛋白酶在 37℃（人体 / 动物细胞适宜温度）下活性高，可分解细胞间的蛋白质，使贴壁细胞分散成单个细胞，便于传代培养。(3) 与空质粒乙组（对照组）相比，重组质粒乙组（含基因 Z）的细胞数量更多，说明基因 Z 的表达对细胞增殖有促进作用；随导入时间推移，两组细胞数量的差距增大，说明增殖速率加快。(4) ①对照组应导入无关序列的 siRNA（或空载体）（排除 siRNA 本身的影响）；该实验通过抑制基因 Z 的表达（siRNA 切割其 mRNA），目的是探究基因 Z 的表达缺失（或抑制表达）对细胞增殖的影响。② 在分子水平检测基因的表达，可以从转录和翻译水平，可提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用；也可提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用。 24.（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。 （1）获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌　　　　　的功能，导致该细胞器不能产生ATP。 （2）获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株 ①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。 ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向　　　　　。 ③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。 （3）采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择　　　　　。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的　　　　　。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供　　　　　，大肠杆菌为酵母菌提供　　　　　，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：　　　　　。 【答案】（1）线粒体     （2）     （3）① PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）    ② 细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）    ③ 维生素B1    ④ ATP    ⑤ 葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活      【解析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：① 高温变性：DNA解旋过程；② 低温复性：引物结合到互补链DNA上；③ 中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。(1) 线粒体是有氧呼吸产生ATP的主要场所，要获得专性厌氧呼吸的酵母菌株，利用基因敲除技术破坏酵母菌线粒体的功能，就能导致该细胞器不能产生ATP。(2) 要使质粒1线性化，且能与扩增后的基因X经酶切、连接重组为质粒2，引物P3和P4应分别位于质粒1的两端，且方向相反（因为PCR扩增时引物是从5’到3’方向延伸的，这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoR Ⅰ和Not Ⅰ识别序列，与基因X两端的酶切位点匹配）。位置及方向如图：。(3) 促进膜融合的化学试剂通常选择PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）。大肠杆菌细胞壁外层为脂质双分子层膜结构，融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上，酵母菌可进行代谢为大肠杆菌提供维生素B1，大肠杆菌能分泌ATP，为酵母菌提供ATP，表明二者建立了互利共生关系。不能用葡萄糖为碳源筛选融合菌株，原因是葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活，二者都能在以葡萄糖为碳源的培养基上都能生长，无法区分出只有二者互利共生才能生长的融合菌株。 25.（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 回答下列问题： （1）大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素　　　　　的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是　　　　　色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。 （2）Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子　　　　　对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子　　　　　用于该系统。 （3）含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌　　　　　（填选项）。A．含质粒1和质粒2     B．只含质粒1     C．只含质粒2       D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：　　　　　。 【答案】（1）① 卡那霉素和四环素    ② 白     （2）① C    ② A     （3）① B    ② 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌      【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：① 目的基因的获取；② 基因表达载体的构建；③ 将目的基因导入受体细胞；④ 目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。(1) 质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因，其转录出来的短链RNA与目的基因（LacZ基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal分解产生蓝色物质，将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。(2) Cas9的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C对应的菌落数最高，因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A的菌落数和敲除率均较高，因此综合考虑，应选择启动子A作用于该系统。(3) ① 质粒2为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1，B正确，ACD错误。 故选B。 ② 试管2加入蔗糖，质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的生长繁殖，因此试管2含质粒2的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，实验设计思路和预测实验结果为：将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，在无抗生素平板上可以生长，在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。 26.（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是　　　　　　。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是　　　　　　。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有　　　　　　，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有　　　　　　（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及　　　　　　。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中 ①是　　　　　　， ②是　　　　　　， ③是　　　　　　， ④是　　　　　　。 【答案】（1）EcoR Ⅰ、Not Ⅰ     （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落     （3）① 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养    ② 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等     （4）① 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达    ② CAR序列    ③ 终止子    ④ 溶解酶1基因序列    ⑤ 溶解酶2基因序列      【解析】1、基因工程的工具：① 限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；② DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③ 运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成等。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。(1) 构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla  Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。(2) 固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。(3) 研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。(4) 肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中① 是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知② 是终止子，③ 是溶解酶1基因序列，④ 是溶解酶2基因序列。 27.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： （1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的　　　　　　拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是　　　　　　。 （2）拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的　　　　　　（填下图字母）处。理由是　　　　　　。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为　　　　　　。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的　　　　　　中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是　　　　　　。 【答案】（1）① DNA序列    ② COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化     （2）① B    ② B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录     （3）① 外植体    ② 染色体DNA    ③ 生长素和细胞分裂素      【解析】核心思路：通过 “蛋白质工程” 思路，将决定蛋白质细胞内定位的特定肽链与绿色荧光蛋白（GFP）“嫁接”，利用 GFP 的荧光标记，在显微镜下观察线粒体形态变化。知识融合：蛋白质工程：需通过改造基因（DNA 片段）实现肽链 “嫁接”，利用特定肽链（如 COXⅣ 的肽链序列X）的细胞定位功能，引导 GFP 标记线粒体。基因工程：借助农杆菌转化法，将目的序列插入 Ti 质粒的T - DNA（可转移至植物细胞并整合到染色体 DNA 上）。植物组织培养：涉及外植体（离体的器官、组织或细胞）、目的基因整合位置（番茄细胞的染色体 DNA），以及诱导期所需的植物激素（生长素和细胞分裂素，调控细胞脱分化与再分化）。(1) 根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的DNA序列拼接在一起完成 “嫁接”（蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质）。COXⅣ 的一段肽链序列X决定了 COXⅣ 在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP的荧光来观察线粒体的形态变化（利用X的定位功能，使GFP标记线粒体）。(2) 拼接好的序列应插入农杆菌 Ti - DNA 的B处。B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录。(3) 选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为外植体（外植体是植物组织培养中用于培养的离体器官、组织或细胞）。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色体DNA中（农杆菌的 T - DNA 会整合到植物细胞的染色体 DNA 上）。番茄组织培养过程中，诱导期需在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素（植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化过程，芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化）。 28.（2025·江西·高考真题）流行病学调查在传染病防治中具有重要意义。AB基因编码的AB蛋白是致病菌W的一种特异性分泌蛋白。为构建快速检测致病菌W感染的血清学诊断技术(一种抗原抗体特异性反应技术)，研究人员从致病菌W中克隆AB基因，构建表达载体，导入原核宿主E，诱导后，分析表达情况(如表)。 细胞 AB基因的mRNA AB蛋白 致病菌W 十 十 宿主E — — 工程菌 十 — 注：“十”表示有检出，“—”表示未检出回答下列问题： （1）根据中心法则，结合表中数据判断，AB基因在工程菌中能进行　　　　　　　　　　　，但不能进行有效的　　　　　　　　　　　。 （2）分析发现，致病菌W合成AB蛋白时，某些氨基酸使用的部分密码子在宿主E中的使用频率低(称为该物种的稀有密码子，如表中密码子CGG在宿主E中为稀有密码子)。从蛋白质合成条件的角度分析，形成这一现象的原因是宿主E中缺乏　　　　　　　　　　　。 精氨酸的密码子 密码子使用频率(10-3) 致病菌W 宿主E CGA 7.2 4.3 CGC 28.5 26.0 CGG 24.7 4.1 CGU 8.5 21.1 AGA 1.3 1.4 AGG 3.2 1.6 （3）进一步分析发现，宿主E缺乏高效表达GC含量过高的外源基因所需要的机制。已知AB基因的GC含量较高，为在宿主E中实现AB蛋白的高效表达，可将精氨酸密码子CGG的使用进行优化，从第 (2)题表中选择最佳密码子为　　　　　　　　　　　。 （4）现有一位体内未检测到致病菌W的人。为了解此人是否有致病菌W感染史，设计一个直接利用AB蛋白的血清学诊断实验。 ①简要写出实验思路：　　　　　　　　　　　； ②预测实验结果：　　　　　　　　　　　； ③分析实验结果：　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 转录    ② 翻译     （2）稀有密码子所对应的tRNA     （3）CGU     （4）① 取此人血清，与AB蛋白混合， 观察是否发生抗原-抗体反应（或是否出现沉淀现象）    ② 阳性或阴性    ③ 若此人有致病菌W感染史，血清中存在AB蛋白的相应抗体，AB蛋白能与抗体反应形成沉淀。若此人无致病菌W感染史，或致病菌W感染后经过较长时间，体内抗体被降解，血清中不存在AB蛋白的相应抗体，不会形成沉淀      【解析】转录过程以四种核糖核苷酸为原料，以DNA分子的一条链为模板，在RNA聚合酶的作用下消耗能量，合成RNA。翻译过程以氨基酸为原料，以转录过程产生的mRNA为模板，在酶的作用下，消耗能量产生多肽链。(1) 结合表中数据可知，工程菌中含有AB基因的mRNA，说明AB基因在工程菌中能进行转录。工程菌中没有AB蛋白，说明该基因不能进行有效的翻译。(2) 蛋白质合成过程中，需要tRNA搬运氨基酸，致病菌W合成AB蛋白时，某些氨基酸使用的部分密码子在宿主E中的使用频率低，形成这一现象的原因是宿主E中缺乏该密码子所对应的tRNA。(3) 进一步分析发现，宿主E缺乏高效表达GC含量过高的外源基因所需要的机制，AB基因的GC含量较高，精氨酸密码子CGG的GC含量高，精氨酸密码子还有CGU（GC含量降低，可使该基因在在宿主E中高效表达），要对精氨酸密码子CGG的使用进行优化，选择最佳密码子为CGU。(4) 血清学诊断是利用抗原-抗体反应，AB蛋白可作为抗原，若有病菌W感染史，体内会产生相应抗体，能与AB蛋白发生特性结合，并形成沉淀，故实验思路为：取此人血清，与AB蛋白混合， 观察是否发生抗原-抗体反应（是否出现沉淀）。若此人有致病菌W感染史，血清中存在AB蛋白的相应抗体，AB蛋白能与抗体反应形成沉淀。若此人无致病菌W感染史，或致病菌W感染后经过较长时间，体内抗体被降解，血清中不存在AB蛋白的相应抗体，不会形成沉淀。 29.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 （1）研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ①　　　　　　　　； ②将　　　　　　　分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定　　　　　　　，明确蛋白之间的差异。 （2）树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是　　　　　　　　。 （3）树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是　　　　　　　　。 【答案】（1）① 克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因    ② 目的基因与载体    ③ 氨基酸序列     （2）利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。     （3）树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择      【解析】基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。(1) 基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析① 为克隆树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白基因。② 为将树鼩、其他哺乳动物TR1蛋白基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由(2) 中展示的蛋白质之间的差异推测④ 为检测树鼩和其他哺乳动物TRI蛋白质的氨基酸序列。(2) 树鼩TRI蛋白第579位氨基酸为M，人和小鼠TR1蛋白第579位氨基酸为T，利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升高，则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TRI蛋白第579位氨基酸序列差异造成的。(3) 适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树嗣的食物来源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素类物质的植物。 30.（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 （1）CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过　　　　　　　　　　（方法）将该质粒转入植物细胞，并将　　　　　　　　　　整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加　　　　　　　　　　。 （2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为　　　　　　　　　　，对其消毒时需依次使用酒精和　　　　　　　　　　处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是　　　　　　　　　　。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用　　　　　　　　　　技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较　　　　　　　　　　来验证抗病性。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 农杆菌转化法    ② Ti质粒上的T - DNA    ③ 潮霉素     （2）① 外植体    ② 次氯酸钠    ③ 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素     （3）① PCR - 测序    ② 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）     （4）对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。      【解析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定。植物组织培养技术是指在无菌和人工控制的环境条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实等）、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的技术。     (1) 将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。 (2) 在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。(3) 为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。(4) 在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。 31.（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。     注： ①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。 ②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 （1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用　　　　　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是　　　　　　　　。 （2）采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　　　　　　条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是　　　　　　　　。 （3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带　　　　　　　　（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致　　　　　　　　，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是　　　　　　　　。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有　　　　　　　　（答出1点即可）。 【答案】（1）① F2、F4    ② 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制     （2）① 2    ② 验证重组质粒是否构建成功     （3）① 苯丙氨酸或phe    ② 翻译受阻     （4）① 目的基因发生突变     ② 发酵条件优化      【解析】基因工程技术的基本步骤：   1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。   2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。   3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。   4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。(1) 引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。(2) 采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。(3) 观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。 (4) 重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 32.（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。 在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。 回答下列问题： （1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）绘制图乙需统计活菌数，常用方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　，开始发挥作用的时间是　　　　　　　　　　　　　　　　　　，判断理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量　　　　　　　　　（填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）目的基因、终止子、标记基因、复制原点     （2）① 稀释涂布平板法    ② 抑制工程菌IR3C增殖    ③ 15h    ④ 在15h时，IR3C数量下降，而MCS数量上升     （3）① 高于    ② IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。      【解析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。(1) 要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有目的基因、终止子、标记基因、复制原点等。(2) 统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图乙看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MCS数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。(3) 从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MCS三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，抑制工程菌IR3C增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。 33.（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： （1）制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　　　等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物　　　　　　对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为　　　　　　bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是　　　　　　（答出两点即可）。 （2）制备抗蛋白A单克隆抗体用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有　　　　　　（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　　　，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 【答案】（1）① 终止子（复制原点）    ② P1 和 P3    ③ 782    ④ 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失     （2）① 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法）    ② 抗体检测      【解析】1基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminator等，这是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。(1) 重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：缺失分泌到细胞外的信号，重组菌没有将蛋白A释放到细胞外；基因A未表达；基因A丢失。(2) ① 诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。 ② 选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 34.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： （1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及　　　　　　检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有　　　　　　（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是　　　　　　　　。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是　　　　　　　　。 （3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为　　　　　　　　。 （4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：　　　　　　。 【答案】（1）mKate2蛋白或荧光     （2）① 细菌计数板计数法    ② 作为mKate2蛋白的荧光对照    ③ PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解     （3）快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强     （4）先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒① 中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒② 中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中      【解析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。(1) 在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。(2) 检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。(3) 在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 。(4) 为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒② 中的mKate2基因替换为酶A基因，快速生长期合成的阻遏蛋白XC-末端带SsrA短肽，会被降解，在启动子Px的作用下合成酶A，催化莽草酸形成；将质粒① 中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后B基因停止转录，酶B合成停止，减少对莽草酸的转化，将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株，保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累。 35.（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： （1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是　　　　　　。将培养后的菌液混匀并充分　　　　　　，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有　　　　　　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是　　　　　　。     限制酶的识别序列和切割位点如下： （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是　　　　　　，随后在含　　　　　　和　　　　　　　　　　的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第　　　　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是　　　　　　。     【答案】（1）① 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大    ② 稀释     （2）① BamHI    ② SmaI和EcoRV切割后均产生平末端，Spe1和Xba1切割后产生的粘性末端相同，两种情况均会导致部分cg反向链接，新的序列无法被原有酶识别     （3）① 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态    ② 卡拉胶    ③ 四环素     （4）① 44    ② 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小      【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：① 目的基因的获取；② 基因表达载体的构建；③ 将目的基因导入受体细胞；④ 目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。(1) 卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。(2) E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合（如maI和EcoRV或Spe1和Xba1）和T4DNA连接酶重复上述实验，两种情况均会导致部分cg反向链接，新的序列无法被原有酶识别，获得的部分重组质粒分子大小符合预期。(3) 为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。(4) 据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 36.（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA.该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题： （1）要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是　　　　　　　　　。 （2）体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内　　　　　　　　　（填细胞结构名称）的改变。 （3）这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 　　　　　　　　　。 （4）该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入　　　　　　　　　序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。 （5）用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是：　　　　　　　　　。 （6）采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是：　　　　　　　。 【答案】（1）电子显微镜      （2）细胞骨架     （3）防止细胞凋亡，有利于病毒的繁殖     （4）大肠杆菌复制原点 DNA     （5）哺乳动物细胞的 RNA 聚合酶无法识别该病毒基因的启动子     （6）溶解该病毒的包膜，使病毒无法与宿主细胞膜上的受体结合      【解析】病毒的结构较为简单，无细胞结构，主要由核酸（DNA 或 RNA）和蛋白质外壳组成。有些病毒在核衣壳之外还有包膜结构。核酸是病毒的遗传物质，储存着病毒的遗传信息，控制着病毒的繁殖、变异等生命活动。蛋白质外壳则起到保护核酸的作用，同时还能介导病毒与宿主细胞的识别与结合。具有包膜的病毒，其包膜一般来源于宿主细胞膜或核膜，包膜上镶嵌着一些糖蛋白刺突，这些刺突有助于病毒吸附和侵入宿主细胞。(1) 病毒个体极其微小，普通光学显微镜无法清晰观察其形态结构，需要使用电子显微镜才能清楚观察病毒的形态结构。(2) 细胞骨架对于维持细胞的形态具有重要作用，体外培养的梭形昆虫细胞被病毒感染后转变为圆球形，很可能是病毒感染引起了昆虫细胞内细胞骨架的改变。(3) 病毒需要在宿主细胞内进行生存和繁殖，细胞凋亡会导致宿主细胞死亡，不利于病毒的生存和繁殖。病毒基因组中含有的抗细胞凋亡基因可以抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 。(4) 要使病毒 DNA 能在大肠杆菌中复制，需要在病毒 DNA 中插入大肠杆菌复制原点序列，这样才能利用大肠杆菌细胞内的复制系统进行复制。(5) 转录需要特定的酶等条件，该病毒 DNA 能进入哺乳动物细胞，但无对应的转录产物，可能是因为病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子。(6) 该病毒具有包膜结构，包膜的主要成分是脂质等，脂溶剂可以溶解病毒的包膜，蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内。 37.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和　　　　　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　　　　　bp，则一定为正向重组质粒。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　　　　　（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　　　　　（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】（1）① 复制原点    ② XbaI    ③ DNA聚合酶    ④ SmaI和SpeI    ⑤ 550bp     （2）① 4    ② 环化    ③ 测序和序列比对     （3）不能      【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。(1) DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。(2) 由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。(3) 突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 38.（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是　　　　　和　　　　　。模板与引物在PCR反应的　　　　　阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为　　　　　。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加　　　　　（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成　　　　　键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为　　　　　，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量　　　　　，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是　　　　　。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是　　　　　。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是　　　　　和　　　　　。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】（1）① 脱氧核苷酸    ② 引物    ③ 复性    ④ PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。     （2）① SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ    ② 磷酸二酯键     （3）① 细胞表面发出黄色荧光    ② 高     （4）① 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用    ② 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用     （5）① ①    ② ③      【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。(1) 在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。(2) 观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。(3) 若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。(4) 转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。(5) 转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是① 和③。① 衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③ 衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 39.（2025·陕西&山西·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 （1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　　　　　步骤中起作用。 （2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的　　　　　　　　（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-　　　　　　　　-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　　，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 （3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到　　　　　　　　，抗性基因　　　　　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　　　　形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【答案】（1）① 4种脱氧核苷酸    ② 延伸     （2）① 5'端    ② AGATCT    ③ BamHⅠ、EcoRⅠ     （3）① 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上    ② 2    ③ 再分化      【解析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。(1) PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2) 为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。(3) T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 40.（2025·黑龙江&吉林·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。     （1）可从　　　　　　　　中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　　　　　和　　　　　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用　　　　　　　　连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有　　　　　　　　的污染。初步判断实验组　　　　　　　　（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是　　　　　　　　。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有　　　　　　　　。a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'd：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' （4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　　　　　　含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】（1）① 序列数据库    ② Xho Ⅰ    ③ Xba Ⅰ    ④ DNA 连接酶     （2）① 外源DNA    ② 1    ③ 目的基因N大小为2.3kb     （3）GCC     （4）香树脂醇      【解析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。(1) GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。(2) 构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。(3) 编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。(4) 题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 41.（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 （1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用　　　　　　　　（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是　　　　　　　　。 （2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的　　　　　　　　。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落　　　　　　　　（填序号），出现菌落 ④的可能原因是　　　　　　　　。 （3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路　　　　　　　　。 【答案】（1）① 稀释涂布平板法    ② 分离能对该致病菌有抑制作用的内生放线菌     （2）① 指数级扩增    ② ②    ③ 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中     （3）设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测      【解析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。(1) 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了分离能对该致病菌有抑制作用的内生放线菌。(2) PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落① 和③ 。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落② 。 菌落④ 的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。(3) 设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 42.（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： （1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物　　　　　　（选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是　　　　　　；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是　　　　　　。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行　　　　　　。 （2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是　　　　　　（至少答2方面）。 （3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为　　　　　　实验模型小鼠。 （4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是　　　　　　。 【答案】（1）① 5′端    ② 两端包含loxP序列的终止子    ③ 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列    ④ 电泳     （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压     （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM     （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。      【解析】基因工程技术的基本步骤：   1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。   2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。   3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。   4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。(1) PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。(2) 细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。(3) 实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察 M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。(4) 添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 43.（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 （1）Sa产生抗药性可遗传变异的来源有　　　　　　（至少答出2点）。 （2）推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。     ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：　　　　　　，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含　　　　　　的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含　　　　　　的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含　　　　　　　　　　　　的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是　　　　　　。     【答案】（1）基因突变、基因重组、表观遗传等     （2）① 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切    ② 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）    ③ 脱水四环素    ④ 头孢霉素    ⑤ D      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证(1) Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。(2) ① 由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将② 获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。④以③ 获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 题干关键信息 所学知识 信息加工 判断可遗传变异的来源 可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传 Sa是原核生物，没有染色体 简述基因表达载体构建过程 利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，质粒2上含有R基因上下游片段 筛选含质粒2的Sa菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2上有氯霉素抗性基因 筛选并获得不再含有质粒2的菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡 筛选R基因被敲除的Sa PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中 44.（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： （1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是　　　　　　。 （2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是　　　　　　。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用　　　　　　限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其　　　　　　。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是　　　　　　。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是　　　　　　。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是　　　　　　。 【答案】（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合     （2）① EcoRⅠ和NotI    ② AgeⅠ和HindⅢ     （3）① 超数排卵    ② 桑葚胚易于在小鼠子宫着床     （4）排除PCR体系中外源DNA的污染     （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染      【解析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。(1) 利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合(2) 结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。(3) 为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。(4) 利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。(5) 若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 45.（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： （1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于　　　　　微生物，在无氧条件下能进行　　　　　发酵，可用于制作果酒等。 （2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是　　　　　。 （3）工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有　　　　　和　　　　　。 （4）菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是　　　，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为　　　　　。 （5）菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路　　　　　。 【答案】（1）① 异养兼性厌氧    ② 酒精     （2）新鲜水果表皮附着酵母菌     （3）① 平板划线法    ② 稀释涂布平板法     （4）① 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响    ② 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D     （5）从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。      【解析】酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵；醋酸菌是好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，能将糖分分解成醋酸，当缺少糖源时，则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。(1) 酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。(2) 传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。(3) 实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单菌落。(4) 菌株B导入不含FLO基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根据题干可知，FLO基因表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO基因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。(5) 菌株E中无单独的X和Y基因，菌株A含有X和Y基因，需要先利用限制酶从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 46.（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：     （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是　　　　　　　　。 （2）步骤②转化时，科研人员常用　　　　　　　　处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有　　　　　　　　的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是　　　　　　　　。 （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与　　　　　　　　结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是　　　　　　　　（从图2的“A~D”中选填）。     （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。     （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是　　　　　　　　。（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是　　　　　　　　。（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有　　　　　　　　。 【答案】（1）EcoR I、Hind Ⅲ     （2）① CaCl2    ② 卡那霉素    ③ S-F和P-R     （3）① 启动子    ② C     （4）① SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多    ② 高温使蛋白变性    ③ 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持      【解析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。(1) 目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。(2) 将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。(3) RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。(4) （ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。（ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。（ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 47.（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） （1）以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是　　　　　　　　　　　　　。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是　　　　　　　　　　　　　。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是　　　　　　　　　　　　　。 （2）部分小鼠的基因型鉴定结果如图2， ③的基因型为　　　　　　　　　　　　　。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是　　　　　　　　　　　　　（填序号）。 （3）某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是　　　　　　　　　　　　　（“甲”或“乙”），原因是　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① HhG+G-    ② 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加    ③ 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上     （2）① HhG+G+、HhG+G-    ② ④     （3）① 乙    ② 乙的H基因敲除与表达受TM试剂调控      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证(1) 由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降。6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。(2) 由图2可知，③ 含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1和图2，① 只含有h基因，仍正常表达H蛋白，② ③ 都含有H基因，可正常表达H蛋白，④ 含有h基因和G基因，TM试剂激活G酶可剪切LX序列，使h基因异常，无法表达H蛋白，故检测H蛋白水平为0的是④ 。(3) 由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控，故选择H基因条件敲除鼠乙。 题干关键信息 所学知识 信息加工 长期近亲交配导致小鼠后代生存和生育能力下降的遗传学原因 人类的遗传病及其预防 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降 6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列 染色体结构变异 6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 48.（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 （1）基因S启动子的基本组成单位是　　　　　　　　　　　　。 （2）通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是　　　　　　　　　　　　；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是　　　　　　　　　　　　。 （3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有　　　　　　　　　　　　　　。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是　　　　　　　　　　　　　　。 （4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）     （2）① EcoRⅠ    ② 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接（可能会反向链接）     （3）① 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段            ② PCR     （4）品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证(1) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2) ① 根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；② 根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3) ①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；② 在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4) 根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA 49.（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 （1）据表可推测　　　　　　　　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　　　　　　　　　　　。检测NV酶活性时，需测定的指标是　　　　　　　　　　　（答出1点即可）。 （2）表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与　　　　　　　　　　　（选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　　　　　　　　　（选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是　　　　　　　　　　　。 （3）为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　　　　　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 蔗糖    ② 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖    ③ 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等）     （2）① NV 基因    ② >    ③ T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列     （3）① 突变体    ② 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证(1) 根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。(2) 从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。(3) 为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 50.（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 （1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生　　　　　　　　　　　的过程称为细胞分化，分化是基因　　　　　　　　　　　的结果。 （2）对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A. 增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B. 增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C. 一个增强子只能作用于一个基本启动子 D. 很多增强子在不同组织中的活性不同 （3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测　　　　　　　　　　　。 （4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称　　　　　（略）。 【答案】（1）① 稳定性差异    ② 选择性表达      （2）C     （3）各组织器官中G和H的mRNA     （4）      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证(1) 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。(2) AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确；C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误；C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。故选C。(3) 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。(4) 增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下：。 题干关键信息 所学知识 信息加工 细胞分化 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 分化是基因选择性表达的结果 基因表达 包括转录和翻译 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA 51.（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： （1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用　　　　　　　（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 （2）单倍体育种。常用　　　　　　　　的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是　　　　　　　　。 （3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用　　　　　　　酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中　　　　　　　　的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路　　　　　　　　。 【答案】（1）① 纤维素酶和果胶酶    ② 生长素和细胞分裂素     （2）① 花药离体培养    ② 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目     （3）① HindⅢ、BamHⅠ    ② 交链格孢    ③ 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证：(1) 因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。(2) 获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。(3) 根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL，具体思路：设计引物利用PCR扩增野生百合的基因L及其pL；插入Ti质粒构建基因表达载体，利用农杆菌转化 法导入百合B的体细胞，经植物组织培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原体微 生物侵染转基因百合，检测其抗病能力（要体现基因工程的步骤和关键技术，最后要进行个体生 物学水平鉴定） 题干关键信息 所学知识 信息加工 去除细胞壁获得原生质体 植物体细胞杂交的过程 植物体细胞杂交的过程中需要先去除植物细胞的细胞壁，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，需要用相应的酶完成去壁的过程 获得单倍体植株 植物组织培养技术 通过植物组织培养技术，经过脱分化和再分化的过程，利用花药离体培养可获得单倍体 鉴定百合单倍体植株 有丝分裂的过程 单倍体植株是由配子发育而来，染色体数目减半，观察染色体的数目可判断是否是单倍体植株，有丝分裂中期的染色体形态固定，数目清晰，是观察染色体最佳时期 52.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。     （1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是　　　　　　。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了　　　　　　。 （2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　　　。 （3）过程⑤在基因工程中称为　　　　　　，该过程需要的主要酶有　　　　　　。 （4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种　　　　　　的生理状态。 （5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是　　　　　　（答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【答案】（1）① 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖    ② 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关     （2）耐高温的DNA聚合酶     （3）① 基因表达载体的构建    ② 限制酶、DNA连接酶     （4）① 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等    ② 能吸收周围环境中DNA分子     （5）生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证：(1) 选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2) 扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3) 根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4) 大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。(5) 分析表格可知，表中协同系数共3行2列，彼此都不同，因此需要对行、列分别进行分析，各自得出一个原因，正好满足题干要求的2点。 对比同一列的协同系数，如倒数第2列（混1）的3行，从上到下分别为74.33、24.98、1.82，它们有差异的原因在于这三行的“生物质原料”不同（分别是小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯），这是3个数据的自变量，也是因变量协同系数不同的原因。最后一列（混2）的数据也是如此。 对比同一行的协同系数，如第1行（小麦秸秆）的2列，从左到右的分别为74.33、114.64，这两个数据有差异的原因显然在于混1、混2的不同，混1、混2表示酶A、酶B、酶C三种酶的混合物，由于三种酶的配比不同，即混合物中不同酶的含量不同，导致混1、混2协同系数有差异。下方两行（玉米秸秆、玉米芯）的数据也是如此。 综上，表中3行2列的协同系数存在差异的原因有两个，其一是生物质原料存在差异，其二是混合物中不同酶的含量不同。 题干关键信息 所学知识 信息加工 图中④是目的基因的扩增 原理是DNA的半保留复制 该过程温度相对较高，所需的关键酶是耐高温的DNA聚合酶 图中⑤是基因表达载体的构建 其实质是不同DNA片段的切割和连接 该过程需要的关键酶有限制酶和DNA连接酶 图中⑥是将目的基因导入受体细胞 根据受体细胞的不同，导入方法有一定的差异 其受体细胞是原核细胞，常用Ca2+处理受体细胞，使其处于易于吸收周围DNA的状态，即感受态 53.（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 （1）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。、 （3）研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置　　　　　　（填数字）组实验（重复组不计算在内）。 （4）大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （5）发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，最终获得发酵产品。 【答案】（1）在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性     （2）在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成     （3）① 乳酸或有机酸    ② 9     （4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量     （5）提取、分离、纯化      【解析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。(1) 在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。(2) 据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。(3) 碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。(4) 大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。(5) 发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。 54.（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： （1）研究者优化了培养基的　　　　　　　（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 （2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为　　　　　　　　，理由是　　　　　　　　　　　。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是　　　　　。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路　　　　　　。 【答案】（1）碳源、氮源、无机盐     （2）① PT7、PBAD 和PBAD    ② 启动子② 和③ 选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达     （3）杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌     （4）蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达     （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)      【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。(1) 培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2) 题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子① ②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。(3) 光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，可杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌。(4) 由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达。(5) 由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 55.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： （1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　　　　　和　　　　　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）利用　　　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　　　　　　，通过　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为　　　　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　　　　　免疫和　　　　　　　　免疫。 （5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　$