专题15 基因工程（3年汇编）（甘肃专用）2024-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 汇编2024-2026年甘肃高考真题及模拟题，聚焦基因工程综合及应用，以甜醅发酵、水稻抗病基因编辑等真实情境为载体，强化实验流程与跨学科融合，适配高考命题趋势。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |非选择题|多题|基因工程核心流程（如载体构建、酶切鉴定）、蛋白质工程应用（如荧光鱼培育）、实验技术（PCR、抗原-抗体杂交）|情境具时代性（CRISPR-Cas9、CAR-T），问题分层设计（基础填空到协同作用分析），突出真实生产需求（如纤维素酶降解生物质）|

专题15 基因工程 3年汇编1年模拟 考点分类 甘肃考情 命题规律 考点1 基因工程综合 2026甘肃(1题)、2025甘肃(1题)、2024甘肃(1题) · 情境设置：联系传统发酵、作物病害防治和工业酶制剂。 · 考查重点：基因获取、重组、导入、表达及结果检测，综合考查实验流程。 · 命题趋势：突出真实生产需求，强化基因工程与发酵工程、微生物培养的融合。 考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 2026甘肃(1题) · 情境设置：以转基因荧光观赏鱼等新兴生物技术产品为背景。 · 考查重点：目的基因导入、基因表达及转基因生物性状表现。 · 命题趋势：关注基因工程在农业、观赏生物等领域的实际应用及安全意识。 考点1 基因工程综合 1.（2026·甘肃·高考真题）甜醅是西北地区的传统小吃，可由燕麦发酵而成。燕麦经清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后，加入酒曲（含酵母菌等微生物）发酵，即可制成甜醅。回答下列问题。 （1）燕麦中的淀粉被淀粉酶水解成还原糖，为酵母菌提供　　　　　　　　　　。 （2）甜醅制作时，蒸煮原料的操作属于无菌技术中的　　　　　　　　　　；加入酒曲前摊凉是为了避免原料温度过高导致　　　　　　　　　　 （3）发酵初期，需要将温度控制在28℃左右是因为　　　　　　　　　　；发酵后期，密封发酵容器可促进酵母菌的　　　　　　　　　　，使乙醇含量　　　　　　　　　　。 （4）为了推动甜醅的工业化生产，研发人员利用基因工程技术从甜醅中克隆了α-淀粉酶基因，构建了表达载体。实验所用载体结构、引物设计图和限制酶识别序列及酶切位点如下。 ①在设计α-淀粉酶引物序列时，为了将目的基因正确插入表达载体，引物1的5′端引入了BamH Ⅰ识别序列，引物2的5′端需引入　　　　　　　　　　酶的识别序列。 ②构建成功的重组质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切　　　　　　　　　　（填“可以”或“不可以”）切割出完整的α-淀粉酶基因。理由是　　　　　　　　　　。 2.（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 （1）CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过　　　　　　　　　　（方法）将该质粒转入植物细胞，并将　　　　　　　　　　整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加　　　　　　　　　　。 （2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为　　　　　　　　　　，对其消毒时需依次使用酒精和　　　　　　　　　　处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是　　　　　　　　　　。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用　　　　　　　　　　技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较　　　　　　　　　　来验证抗病性。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为　　　　　　　　　　。 3.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。     （1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是　　　　　　。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了　　　　　　。（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　　　。 （3）过程⑤在基因工程中称为　　　　　　，该过程需要的主要酶有　　　　　　。 （4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种　　　　　　的生理状态。 （5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是　　　　　　（答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证：(1) 选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2) 扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3) 根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4) 大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。(5) 分析表格可知，表中协同系数共3行2列，彼此都不同，因此需要对行、列分别进行分析，各自得出一个原因，正好满足题干要求的2点。 对比同一列的协同系数，如倒数第2列（混1）的3行，从上到下分别为74.33、24.98、1.82，它们有差异的原因在于这三行的“生物质原料”不同（分别是小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯），这是3个数据的自变量，也是因变量协同系数不同的原因。最后一列（混2）的数据也是如此。 对比同一行的协同系数，如第1行（小麦秸秆）的2列，从左到右的分别为74.33、114.64，这两个数据有差异的原因显然在于混1、混2的不同，混1、混2表示酶A、酶B、酶C三种酶的混合物，由于三种酶的配比不同，即混合物中不同酶的含量不同，导致混1、混2协同系数有差异。下方两行（玉米秸秆、玉米芯）的数据也是如此。 综上，表中3行2列的协同系数存在差异的原因有两个，其一是生物质原料存在差异，其二是混合物中不同酶的含量不同。 题干关键信息 所学知识 信息加工 图中④是目的基因的扩增 原理是DNA的半保留复制 该过程温度相对较高，所需的关键酶是耐高温的DNA聚合酶 图中⑤是基因表达载体的构建 其实质是不同DNA片段的切割和连接 该过程需要的关键酶有限制酶和DNA连接酶 图中⑥是将目的基因导入受体细胞 根据受体细胞的不同，导入方法有一定的差异 其受体细胞是原核细胞，常用Ca2+处理受体细胞，使其处于易于吸收周围DNA的状态，即感受态 考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2026·甘肃·高考真题）科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish．为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是（        ） A. 步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B. 处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C. 步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D. 新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 1.（2026·甘肃·二模）CAR−T是一种通过基因工程改造的T细胞，能够精准识别肿瘤细胞并发挥治疗作用，其构建过程如图所示。图中各种限制酶的识别位点已注明，质粒含启动子、终止子及氨苄青霉素抗性基因AmpR。下列叙述正确的是（       ） A. 体外扩增CAR基因的基本流程为变性→延伸→复性 B. 可以选择限制酶ClaⅠ和NotⅠ切割目的基因和质粒 C. 使用含有四环素的固体培养基对导入重组质粒的细胞进行筛选 D. 检测目的基因是否成功在T细胞中表达，可以使用抗原—抗体杂交法 2.（2026·甘肃文县第二中学等校·二模）乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程如图，质粒中LacZ基因可使细菌能够利用物质X-gal，从而使菌落呈现蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述错误的是（       ） A. 过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度及比例等有关 B. 过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落 C. 大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，可用抗原—抗体杂交法进行检测 D. 该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高 3.（2026·甘肃兰州·一模）环黄芪醇是黄芪甲苷的核心活性成分，具有抗氧化、增强免疫力等多种药理作用。传统提取法受黄芪种植周期、产量限制，成本较高。科研人员通过基因工程将黄芪中环黄芪醇合成的两个关键酶基因（CAS基因和CYP基因）导入酿酒酵母，构建高产环黄芪醇的基因工程菌，实现环黄芪醇的微生物合成，部分过程如图所示。回答下列问题： （1）从黄芪根组织中提取的RNA可通过　　　　　　　　过程获得cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增CAS基因和CYP基因.PCR扩增时，引物的作用是　　　　　　　　。 （2）基因表达载体的核心组成除目的基因、启动子、终止子外，还必须有　　　　　　　　。为避免同一表达载体上的两个目的基因同源重组，需选用　　　　　　　　（填“相同”或“不同”）的启动子和终止子分别调控两个基因的表达。 （3）构建重组表达载体时，需用限制酶切割载体和目的基因，限制酶的作用特点是　　　　　　　　。 （4）将重组表达载体导入酿酒酵母前，需用　　　　　　　　处理酵母细胞，使其处于感受态。 （5）为检测目的基因是否成功导入酿酒酵母，可采用　　　　　　　　技术进行分子水平检测；若要检测目的基因是否成功表达，需从工程菌株中提取总蛋白，采用　　　　　　　　技术进行检测。 4.（2025·甘肃陇南宕昌一中·一模）（多选）脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的特征成分，CD14蛋白作为LPS的受体，二者结合后会激活细胞内炎症信号通路，引发机体炎症反应，严重时可导致感染性休克。科研人员为开发治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物，开展了抗CD14单克隆抗体的制备及药效研究，相关流程如图（图1为CD14基因重组表达载体构建示意图，XhoI、SalI为同尾酶，切割产生相同黏性末端；图2为单克隆抗体制备流程，SP2/0细胞为骨髓瘤细胞）。回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增CD14基因时，需根据　　　　　　　设计特异性引物，扩增时引物的作用是　　　　　　　　。 （2）图2中，步骤①向小鼠注射的抗原是　　　　　　　　；步骤④“专一抗体检测”的原理是　　　　　　　　；若想大规模制备该单克隆抗体，可将筛选得到的杂交瘤细胞　　　　　　　　。 （3）用XhoI和SalI分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，某同学拟再利用XhoI和SalI这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，你认为该方法　　　　　　　　（填“可行”或“不可行”），其原因是　　　　　　　　。 （4）为探究抗CD14单克隆抗体的抗炎效果，科研人员将等量的小鼠巨噬细胞分为四组：A组加生理盐水，B组加LPS，C组加LPS+低浓度抗CD14单克隆抗体，D组加LPS+高浓度抗CD14单克隆抗体，实验过程中各组添加物质的量均遵循实验设计的原则。培养后检测炎症因子（IL-6）的含量，结果显示B组>C组>D组>A组。请从分子和细胞水平分析D组炎症因子含量低于C组的原因：　　　　　　　。 5.（2026·岷县一中&岷县二中·二模）基因漂移是指一种生物的基因向附近野生近缘种自发转移，导致其基因发生变化的现象，可能引起环境安全问题。杜绝基因漂移的一个办法是在目的基因发挥作用后，利用Cre-LoxP重组系统将其从转基因植株花粉中删除。该技术的原理如下图所示：a部分表示LoxP位点是一段特定的DNA序列，由两个反向重复序列和中间间隔序列组成，间隔序列决定了LoxP位点的方向；b、c部分表示Cre重组酶的作用机理。 回答下列问题： （1）对已知序列的LoxP位点进行PCR扩增需要引物，写出一种引物的前6个碱基　　　　　。 （2）由图可知，Cre重组酶的作用机理是切除两个LoxP位点间的序列还是使两个LoxP位点间的序列发生倒置，与两个LoxP位点　　　　　有关，Cre重组酶在该系统中的作用类似于基因工程工具中的　　　　　。 （3）　　　　　是基因工程的核心步骤。在利用Cre-LoxP重组系统时，为使目的基因发挥作用后被彻底删除，避免其通过花粉传播向其他生物漂移，要将目的基因插入两个　　　　　（填“方向相同”或“方向不同”）的LoxP位点之间，再和启动子、终止子等元件构建到基因表达载体上。 （4）将构建好的含有Cre-LoxP重组系统相关 元件的载体导入水稻细胞，最常用的方法是　　　　　，选用该方法的原理是　　　　　。 （5）检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，常用　　　　　技术。目的基因成功导入后检测其是否翻译成蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术，若没有出现杂交带，可能的原因是　　　　　。 6.（2026·甘肃·一模）人体COX-2基因的表达产物与炎症反应强度密切相关。研究人员欲构建COX-2基因的表达载体以探究其表达调控机制，具体过程如图所示。图中A、B、C、D是4种引物，质粒上两种限制酶BamHI和SacI的识别位点如图所示，LacI基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。已知含有目的基因的供体DNA上也有BamHI和SacI的识别位点。回答下列问题： （1）通过PCR技术扩增COX-2基因时，应使用　　　　　酶，选择的引物组合是　　　　　　　。 （2）若实验室只有显色剂X-gal而没有氨苄青霉素，在构建COX-2基因表达载体时，如果采用单酶切法切割质粒和目的基因，应选择图中的限制酶　　　　　，将目的基因插入质粒的　　　　　　　　之间。在滴加X-gal的培养基中，含有重组质粒的菌落　　　　　（填“能”或“不能”）呈现蓝色，原因是　　　　。 7.（2026·甘肃酒泉·二调）科研人员拟将兔毛角蛋白基因构建重组表达载体，导入棉花细胞培育纤维品质改良的转基因棉花，兔毛角蛋白基因的结构、转录方向及质粒载体的酶切位点分布如图所示。已知所有限制酶均能精准识别并切割其对应的特异性核苷酸序列，不发生非特异性切割，不同限制酶切割后产生的黏性末端均不能互补配对。回答下列问题： （1）每个基因通常有1个启动子，启动子是　　　　　　的起点。构建重组表达载体时，需将兔毛角蛋白基因插入到质粒的　　　　　　之间，才能保证目的基因在受体细胞中正常转录；目的基因插入时，其模板链的　　　　　　（填“5′端”或“3′端”）应靠近质粒的启动子一侧，才能保证转录出正确的mRNA序列。（2）为了使兔毛角蛋白基因能够正确的插入质粒中，PCR获取兔毛角蛋白基因时，需在引物a和引物b的　　　　　　（填“5′端”或“3′端”）分别添加限制酶　　　　　　和　　　　　　的识别序列。 （3）含重组质粒的农杆菌需接种在添加　　　　　　的培养基中，才能筛选出成功转化的农杆菌；若要在个体生物学水平鉴定转基因棉花是否培育成功，可采用的鉴定方法是　　　　　　。 8.（2026·甘肃·二模）半夏是一种单子叶植物，据《本草纲目》和《神农本草经》记载，其块茎具有化痰除湿、止呕健脾等功效。科学家从半夏植株中提取出了具有广谱抗菌作用的水杨酸，现欲通过转基因技术获得能产生水杨酸的酵母菌株系Ⅰ，从而实现工厂化生产。已知甲醇是该酵母菌的唯一碳源，酵母菌的质粒上有甲醇诱导型强启动子，还有一个HIS4基因位点（可以合成组氨酸）。回答下列问题： （1）酵母菌质粒上的强启动子区别于普通启动子的特点是　　　　　　　　　　　　。 （2）在筛选成功转化的酵母菌时，培养基中需要添加　　　　　　物质（填“甲醇”或“组氨酸”），添加的理由是　　　　　　　　　　　　，不需要添加另一种物质的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）酵母菌株系Ⅰ中的目的基因合成的前体物质有时也会被转化成其他成分，使抗菌物质的产量大大下降。科学家分别敲除了合成四种其他物质的关键酶基因，得到了SA03、SA04、SA05、SA06四个新株系。这些株系的细胞增殖量和单位细胞抗菌物质（水杨酸）的产量如下图所示。据此分析，最适合作为生产用菌株的是　　　　　　，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 9.（2026·甘肃陇南康县3校·一模）生物柴油作为新型能源已成为世界上广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究发现，油料作物紫苏具有产油基因DGAT1，现利用基因工程的技术，获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。图1、图2是获得产油微藻的基因工程操作程序，回答以下问题。 （1）图1为构建DGAT1基因文库的过程，①代表　　　　　　过程。 （2）现需将DGAT1基因通过PCR技术进行扩增，在扩增DGAT1基因时，需要根据　　　　　　设计特异性引物序列。 （3）利用转基因技术获得产油微藻的核心步骤为：　　　　　　，据图2分析，该过程需要选择　　　　　　限制酶切割DGAT1基因。 （4）为了保证DGAT1基因能够在微藻细胞中表达，应该将pBI121质粒上的启动子替换为　　　　　　。（5）用　　　　　　方法检测微藻细胞中是否插入了DGAT1基因并转录出了相应的mRNA；若要进一步判断DGAT1基因是否成功表达，需要加入　　　　　　进行检测。 （6）为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表所示。 检测指标 总氮/（mg·L-1） 总磷/（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 地热废水培养基 23.2 4.32 4.56 培养转基因产油微藻11d后 1.9 0.45 0.84 该实验不能说明产油微藻对地热废水有去污能力，请进一步完善实验　　　　　　。 10.（2026·甘肃酒泉·一模）（多选）内切葡聚糖酶是一类糖苷水解酶，能够随机切割纤维素链中的β-1，4-糖苷键，实现碳素的转移和循环。某科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EgⅢ，并将其导入毕赤酵母中构建工程菌，成功实现了高效降解固体废物中纤维素的目的（如图所示）。回答下列问题： （1）利用PCR技术从木霉基因组中获得EgⅢ基因时应选择的两种引物是　　　　　　　，经过n次循环后形成的子代DNA中，同时含有上述两种引物的DNA所占比例为　　　　　　　。 （2）为使EgⅢ基因与质粒连接并正确表达，应选择的限制酶是　　　　　　　，步骤1将重组质粒导入　　　　　　　处理的大肠杆菌，完成转化实验，然后在含有　　　　　　　（填抗生素名称）的培养基中筛选含EgⅢ的大肠杆菌，然后进行扩增。 （3）从分子水平上，利用　　　　　　　方法检测转化毕赤酵母是否合成内切葡聚糖酶，从个体水平上，可将转化毕赤酵母培养在以　　　　　　　为唯一碳源的培养基，检测转化毕赤酵母能否增殖。 11.（2026·甘肃天水彭水一中&彭水二中·二模）在培育转基因抗虫作物过程中,单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。为提高作物的抗虫性,研究人员提取苏云金芽孢杆菌的抗虫蛋白基因Cry1A.301和Vip3A进行融合,培育抗虫作物,其具体过程如图。回答下列问题: （1）①过程需要使用　　　　　　　　　　　酶。引物P2和引物P3之间碱基序列的特点是必须有　　　　　　　　　（填“相同”或“互补”）片段。经图中PCR1过程获得产物1至少需要经过　　　　　　　　　　次扩增循环。（2）重组质粒中启动子是　　　　　　　　　,可驱动目的基因的转录。除图示信息外,重组质粒中还应该有　　　　　　　　　　　。为使②过程中融合基因能按正确方向插入质粒,需在引物P1的　　　　　　　　　　端加上限制酶　　　　　　　　的识别序列。②过程需用到的工具酶,除限制酶外,还有　　　　　　　　　　　　　。 （3）通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定,结果如图所示。泳道1、2分别是用NcoⅠ切割质粒和重组质粒的结果。若已知融合基因已整合到质粒上,请在图中泳道3绘制出用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒所得的电泳结果　　　　　　　。（质粒上NcoⅠ和XhoⅠ识别位点间隔较近,长度可忽略不计） （4）将重组质粒转入农杆菌后,应将该农杆菌置于含　　　　　　　的培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测Cry1A.301-Vip3A融合蛋白抗虫的效果,还需进行个体水平检测,请简述实验思路:　　　　　　　　　　。 12.（2026·甘肃陇南武都·二模）（多选）别藻蓝蛋白（APC）是蓝细菌及藻类中的一种色素蛋白，其生物合成过程如图1。通过构建双质粒表达系统，实现重组别藻蓝蛋白（rAPC）合成通路在大肠杆菌中的完整表达，如图2，请回答下列问题： （1）根据图1中PCB的合成过程可判断，基因表达产物与性状之间的关系是　　　　　　　　。APC的合成受到多种基因的控制，说明基因和性状之间并非　　　　　　　关系。 （2）据图2可知，构建双质粒表达系统时，引物　　　　　　　的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程　　　　　　　（选填“可以”或“不可以”）在同一反应体系中进行。为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应　　　　　　　（选填“大于”或“等于”或“小于”）启动子2。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是　　　　　　　。 （3）一般用　　　　　　　处理大肠杆菌以提高转化的效率。比较图2中过程④和⑤使用的培养基，前者比后者多出的成分有　　　　　　　。 （4）科研人员为探究rAPC对小鼠肝癌的影响，进行了相关实验。下表为部分实验结果： 组别 抑癌率% 细胞灰度值 COX-2 VEGF PCNA 对照组 0 148.3 151.1 155.7 rAPC 低剂量组 25.2 156.2 159.2 157.5 中剂量组 36.7 161.2 159.9 162.3 高剂量组 43.1 165.1 163.5 164.9 化疗药物（CY）组 51.0 165.2 166.2 206.8 注：COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关；细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小。 下列关于实验结果的分析，合理的有　　　　　　　　　。a.rAPC组与CY组对比，能说明rAPC具有抑癌作用b.rAPC能抑制肿瘤的生长，但抑制作用不具有剂量效应c.rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达d.COX-2、VEGF和PCNA在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用 13.（2026·甘肃文县第二中学等校·二模）发酵食品就是利用有益微生物来制作人类喜爱的风味食品。高粱经蒸煮后加入酒曲，酒曲中的红曲霉菌对淀粉具有糖化功能。酯化酶是红曲酒发酵的关键酶之一，K基因的表达产物会降低酯化酶的含量，为了筛选高产酯化酶的优质红曲霉菌，研究人员欲通过基因工程技术对其进行改良。请分析回答下列问题： （1）为了敲除K基因，需要利用PCR技术获得图1中的融合片段N，此过程中加入Mg2+的作用是　　　　　。过程③扩增融合片段时应选用的一对引物为　　　　　；为了后续使融合片段插入质粒中，需要在两引物的　　　　　（填“3′端”或“5′端”）加上限制酶切位点序列。 （2）获得的融合片段N两端的酶切位点如图2所示，为使融合片段N定向插入到质粒中，应选择图中的限制酶　　　　　对质粒A进行酶切，利用　　　　　酶将质粒特定的黏性末端补平后，在DNA连接酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。若用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，可得到　　　　　种长度的片段。 （3）利用重组质粒B和红曲霉菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对K基因进行敲除。同源区段交换后，用图3中的引物1和2对红曲霉菌DNA进行PCR扩增，若扩增产物的碱基长度为　　　　　bp，则说明K基因已被敲除。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 3年汇编1年模拟 考点分类 甘肃考情 命题规律 考点1 基因工程综合 2026甘肃(1题)、2025甘肃(1题)、2024甘肃(1题) · 情境设置：联系传统发酵、作物病害防治和工业酶制剂。 · 考查重点：基因获取、重组、导入、表达及结果检测，综合考查实验流程。 · 命题趋势：突出真实生产需求，强化基因工程与发酵工程、微生物培养的融合。 考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 2026甘肃(1题) · 情境设置：以转基因荧光观赏鱼等新兴生物技术产品为背景。 · 考查重点：目的基因导入、基因表达及转基因生物性状表现。 · 命题趋势：关注基因工程在农业、观赏生物等领域的实际应用及安全意识。 考点1 基因工程综合 1.（2026·甘肃·高考真题）甜醅是西北地区的传统小吃，可由燕麦发酵而成。燕麦经清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后，加入酒曲（含酵母菌等微生物）发酵，即可制成甜醅。回答下列问题。 （1）燕麦中的淀粉被淀粉酶水解成还原糖，为酵母菌提供　　　　　　　　　　。 （2）甜醅制作时，蒸煮原料的操作属于无菌技术中的　　　　　　　　　　；加入酒曲前摊凉是为了避免原料温度过高导致　　　　　　　　　　 （3）发酵初期，需要将温度控制在28℃左右是因为　　　　　　　　　　；发酵后期，密封发酵容器可促进酵母菌的　　　　　　　　　　，使乙醇含量　　　　　　　　　　。 （4）为了推动甜醅的工业化生产，研发人员利用基因工程技术从甜醅中克隆了α-淀粉酶基因，构建了表达载体。实验所用载体结构、引物设计图和限制酶识别序列及酶切位点如下。 ①在设计α-淀粉酶引物序列时，为了将目的基因正确插入表达载体，引物1的5′端引入了BamH Ⅰ识别序列，引物2的5′端需引入　　　　　　　　　　酶的识别序列。 ②构建成功的重组质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切　　　　　　　　　　（填“可以”或“不可以”）切割出完整的α-淀粉酶基因。理由是　　　　　　　　　　。 【答案】（1）碳源 碳源和能源物质     （2）① 消毒    ② 酒曲中的微生物失活     （3）① 28℃是酵母菌的最适生长温度，有利于酵母菌快速增殖，扩大菌种数量    ② 无氧呼吸 酒精发酵    ③ 升高     （4）① Mfe Ⅰ    ② 不可以    ③ α-淀粉酶基因的序列内部存在EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ酶切后目的基因会断裂      【解析】(1) 淀粉属于多糖，水解产生的还原糖含有碳元素，既可作为碳源为酵母菌的生命活动提供碳元素；又可通过细胞呼吸分解，释放能量，为酵母菌提供能源物质。(2) 消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。蒸煮原料通过高温杀灭一部分杂菌，属于传统发酵中的消毒操作。微生物的活性受温度影响，高温会使酵母菌等微生物的蛋白质变性失活，造成菌种死亡，因此摊凉降温可以避免高温杀死接种的发酵菌种，保护酒曲内酵母菌等微生物的活性。(3) 酵母菌的最适生长温度约为28℃，此条件下酵母菌代谢旺盛、增殖速度快，可扩大菌种数量，为后续发酵提供足够的菌种；发酵后期，密封容器内氧气含量快速下降，会抑制酵母菌的有氧呼吸，促进酵母菌进行无氧呼吸（酒精发酵）产生乙醇，使发酵体系内乙醇含量逐渐升高。(4) ① 构建基因表达载体时，目的基因应当插入到启动子和终止子之间，且限制酶不能破坏目的基因和载体上的启动子、终止子和标记基因等，由图可知，EcoR Ⅰ会破坏目的基因；Mfe Ⅰ会破坏载体上的启动子；Hind Ⅲ会破坏载体上的抗性基因（卡那霉素抗性基因），结合限制酶识别序列可知，EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ属于同尾酶，可产生相同的黏性末端，因此构建基因表达载体时，可用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切割质粒，在目的基因的两端分别添加上BamH Ⅰ和Mfe Ⅰ的识别序列。为了保证目的基因能够正常表达，结合目的基因的转录方向，在表达载体上，目的基因的转录方向为从启动子到终止子，因此引物1的5′端引入BamH Ⅰ的识别序列，引物2的5′端需要引入Mfe Ⅰ的识别序列。② 由图可知，α-淀粉酶基因的序列内部存在一个EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ切割重组质粒时，EcoRⅠ会从目的基因的内部将其切断，造成目的基因断裂，因此无法获得完整的α-淀粉酶基因。 2.（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 （1）CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过　　　　　　　　　　（方法）将该质粒转入植物细胞，并将　　　　　　　　　　整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加　　　　　　　　　　。 （2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为　　　　　　　　　　，对其消毒时需依次使用酒精和　　　　　　　　　　处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是　　　　　　　　　　。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用　　　　　　　　　　技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较　　　　　　　　　　来验证抗病性。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 农杆菌转化法    ② Ti质粒上的T - DNA    ③ 潮霉素     （2）① 外植体    ② 次氯酸钠    ③ 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素     （3）① PCR - 测序    ② 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）     （4）对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。      【解析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定。植物组织培养技术是指在无菌和人工控制的环境条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实等）、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的技术。     (1) 将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。 (2) 在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。(3) 为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。(4) 在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。 3.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。     （1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是　　　　　　。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了　　　　　　。（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　　　。 （3）过程⑤在基因工程中称为　　　　　　，该过程需要的主要酶有　　　　　　。 （4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种　　　　　　的生理状态。 （5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是　　　　　　（答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【答案】（1）① 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖    ② 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关     （2）耐高温的DNA聚合酶     （3）① 基因表达载体的构建    ② 限制酶、DNA连接酶     （4）① 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等    ② 能吸收周围环境中DNA分子     （5）生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同      【解析】【关键能力】（1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证：(1) 选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2) 扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3) 根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4) 大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。(5) 分析表格可知，表中协同系数共3行2列，彼此都不同，因此需要对行、列分别进行分析，各自得出一个原因，正好满足题干要求的2点。 对比同一列的协同系数，如倒数第2列（混1）的3行，从上到下分别为74.33、24.98、1.82，它们有差异的原因在于这三行的“生物质原料”不同（分别是小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯），这是3个数据的自变量，也是因变量协同系数不同的原因。最后一列（混2）的数据也是如此。 对比同一行的协同系数，如第1行（小麦秸秆）的2列，从左到右的分别为74.33、114.64，这两个数据有差异的原因显然在于混1、混2的不同，混1、混2表示酶A、酶B、酶C三种酶的混合物，由于三种酶的配比不同，即混合物中不同酶的含量不同，导致混1、混2协同系数有差异。下方两行（玉米秸秆、玉米芯）的数据也是如此。 综上，表中3行2列的协同系数存在差异的原因有两个，其一是生物质原料存在差异，其二是混合物中不同酶的含量不同。 题干关键信息 所学知识 信息加工 图中④是目的基因的扩增 原理是DNA的半保留复制 该过程温度相对较高，所需的关键酶是耐高温的DNA聚合酶 图中⑤是基因表达载体的构建 其实质是不同DNA片段的切割和连接 该过程需要的关键酶有限制酶和DNA连接酶 图中⑥是将目的基因导入受体细胞 根据受体细胞的不同，导入方法有一定的差异 其受体细胞是原核细胞，常用Ca2+处理受体细胞，使其处于易于吸收周围DNA的状态，即感受态 考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2026·甘肃·高考真题）科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish．为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是（        ） A. 步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B. 处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C. 步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D. 新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 【答案】B 【解析】A、该流程属于蛋白质工程范畴，设计荧光蛋白结构后，步骤① 应推测氨基酸序列以及对应的脱氧核苷酸序列（基因序列），不需要推测转运RNA类型，A错误；B、将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法，可通过显微操作将改造后的荧光蛋白基因导入斑马鱼受精卵，B正确；C、斑马鱼是卵生生物，受精卵可在体外适宜环境中发育，不需要移植到斑马鱼体内发育，C错误；D、转基因生物存在潜在的安全风险，新型荧光斑马鱼上市前必须进行安全性评价，D错误。 1.（2026·甘肃·二模）CAR−T是一种通过基因工程改造的T细胞，能够精准识别肿瘤细胞并发挥治疗作用，其构建过程如图所示。图中各种限制酶的识别位点已注明，质粒含启动子、终止子及氨苄青霉素抗性基因AmpR。下列叙述正确的是（       ） A. 体外扩增CAR基因的基本流程为变性→延伸→复性 B. 可以选择限制酶ClaⅠ和NotⅠ切割目的基因和质粒 C. 使用含有四环素的固体培养基对导入重组质粒的细胞进行筛选 D. 检测目的基因是否成功在T细胞中表达，可以使用抗原—抗体杂交法 【答案】D 【解析】A、体外扩增CAR基因采用的是PCR技术，其基本流程为变性→复性→延伸，而不是变性→延伸→复性，A错误；B、由图可知，目的基因（CAR基因）两端的酶切位点：左侧有 Cla Ⅰ、EcoR Ⅰ，右侧有 Not Ⅰ、Hind Ⅲ。质粒上，Cla Ⅰ位点在启动子上游，而NotⅠ位点在EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的右侧。若用Cla Ⅰ和Not Ⅰ切割目的基因，会同时切下目的基因；但质粒上Cla Ⅰ和Not Ⅰ之间的片段包含启动子区域，切割后会破坏质粒的启动子，导致目的基因无法表达，因此不能选择这两种酶。正确的选择应是EcoR Ⅰ和Not Ⅰ，既能保证目的基因完整，又不破坏质粒的启动子，B错误；C、质粒中含有的是氨苄青霉素抗性基因（AmpR），应该使用含有氨苄青霉素的固体培养基对导入重组质粒的细胞进行筛选，而不是四环素，C错误；D、检测目的基因是否成功在T细胞中表达，即检测是否产生了相应的蛋白质，可使用抗原-抗体杂交法，D正确。 2.（2026·甘肃文县第二中学等校·二模）乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程如图，质粒中LacZ基因可使细菌能够利用物质X-gal，从而使菌落呈现蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述错误的是（       ） A. 过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度及比例等有关 B. 过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落 C. 大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，可用抗原—抗体杂交法进行检测 D. 该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高 【答案】B 【解析】1、题图过程① 表示获取目的基因，构建重组质粒，② 表示将重组质粒导入受体细胞并筛选，③ 表示转基因大肠杆菌表达乙肝病毒外壳，④ 表示将乙肝病毒外壳作为疫苗接种，⑤ 表示疫苗受试者体内出现抗体的过程。2、基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mNA：分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。A、① 获取目的基因，构建重组质粒过程中，增加载体和目的基因的浓度及比例，可以增加目的基因与质粒碰撞机会，提高目的基因和载体重组的效率，A正确；B、过程表② 示将重组质粒导入受体细胞，培养基中加青霉素和X-gal可以用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌，BamHI和EcoRI由于破坏了质粒中LacZ基因，却保留了青霉素抗性基因，故白色的大肠杆菌菌落才为所需菌落，B错误；C、乙肝病毒外壳为蛋白质，可用抗原—抗体杂交法检测大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，C正确；D、基因工程疫苗由于只利用了乙肝病毒的外壳，不含其遗传物质，所以不能完成病毒的增殖和感染，D正确。故选B。 3.（2026·甘肃兰州·一模）环黄芪醇是黄芪甲苷的核心活性成分，具有抗氧化、增强免疫力等多种药理作用。传统提取法受黄芪种植周期、产量限制，成本较高。科研人员通过基因工程将黄芪中环黄芪醇合成的两个关键酶基因（CAS基因和CYP基因）导入酿酒酵母，构建高产环黄芪醇的基因工程菌，实现环黄芪醇的微生物合成，部分过程如图所示。回答下列问题： （1）从黄芪根组织中提取的RNA可通过　　　　　　　　过程获得cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增CAS基因和CYP基因.PCR扩增时，引物的作用是　　　　　　　　。 （2）基因表达载体的核心组成除目的基因、启动子、终止子外，还必须有　　　　　　　　。为避免同一表达载体上的两个目的基因同源重组，需选用　　　　　　　　（填“相同”或“不同”）的启动子和终止子分别调控两个基因的表达。 （3）构建重组表达载体时，需用限制酶切割载体和目的基因，限制酶的作用特点是　　　　　　　　。 （4）将重组表达载体导入酿酒酵母前，需用　　　　　　　　处理酵母细胞，使其处于感受态。 （5）为检测目的基因是否成功导入酿酒酵母，可采用　　　　　　　　技术进行分子水平检测；若要检测目的基因是否成功表达，需从工程菌株中提取总蛋白，采用　　　　　　　　技术进行检测。 【答案】（1）① 逆转录（反转录）    ② 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸     （2）① 标记基因（复制原点）    ② 不同     （3）识别DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断裂     （4）Ca2+（CaCl2）     （5）① PCR（DNA分子杂交）    ② 抗原——抗体杂交      【解析】(1) 以 RNA 为模板合成 DNA 的过程为逆转录，是获取真核生物目的基因（cDNA）的常用方法。PCR 中引物的作用是与模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2) 基因表达载体的必备组件包括目的基因、启动子、终止子、标记基因（用于筛选含重组载体的受体细胞）和复制原点（保证载体在受体细胞中复制）。为避免两个目的基因因共用启动子 / 终止子发生同源重组，且保证各自独立表达，需选用不同的启动子和终止子分别调控两个基因。(3) 识别DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断裂，是限制酶（限制性核酸内切酶）的核心作用特点，其具有特异性，能精准切割特定位点。(4) 将重组表达载体导入微生物常用感受态细胞法，用Ca2+（CaCl2）溶液处理细胞，可增大细胞膜通透性，使其处于能吸收周围环境中 DNA 分子的感受态。(5) 检测目的基因是否导入受体细胞，常采用PCR 技术或DNA 分子杂交技术。检测目的基因是否成功表达（产生蛋白质），需采用抗原 — 抗体杂交技术，这是检测翻译层面的直接证据。 4.（2025·甘肃陇南宕昌一中·一模）（多选）脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的特征成分，CD14蛋白作为LPS的受体，二者结合后会激活细胞内炎症信号通路，引发机体炎症反应，严重时可导致感染性休克。科研人员为开发治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物，开展了抗CD14单克隆抗体的制备及药效研究，相关流程如图（图1为CD14基因重组表达载体构建示意图，XhoI、SalI为同尾酶，切割产生相同黏性末端；图2为单克隆抗体制备流程，SP2/0细胞为骨髓瘤细胞）。回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增CD14基因时，需根据　　　　　　　设计特异性引物，扩增时引物的作用是　　　　　　　　。 （2）图2中，步骤①向小鼠注射的抗原是　　　　　　　　；步骤④“专一抗体检测”的原理是　　　　　　　　；若想大规模制备该单克隆抗体，可将筛选得到的杂交瘤细胞　　　　　　　　。 （3）用XhoI和SalI分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，某同学拟再利用XhoI和SalI这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，你认为该方法　　　　　　　　（填“可行”或“不可行”），其原因是　　　　　　　　。 （4）为探究抗CD14单克隆抗体的抗炎效果，科研人员将等量的小鼠巨噬细胞分为四组：A组加生理盐水，B组加LPS，C组加LPS+低浓度抗CD14单克隆抗体，D组加LPS+高浓度抗CD14单克隆抗体，实验过程中各组添加物质的量均遵循实验设计的原则。培养后检测炎症因子（IL-6）的含量，结果显示B组>C组>D组>A组。请从分子和细胞水平分析D组炎症因子含量低于C组的原因：　　　　　　　。 【答案】（1）① CD14基因的两端核苷酸（或碱基）序列    ② 使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸     （2）① CD14蛋白    ② 抗原与抗体的特异性结合    ③ 注射到小鼠腹腔内增殖（或体外进行大规模细胞培养）     （3）① 可行    ② 正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点，可再次被切开；而反向连接的重组 DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点无法切开     （4）高浓度抗CD14单克隆抗体能更多地与巨噬细胞表面的CD14蛋白特异性结合，更有效地阻断LPS与CD14的结合，从而更强地抑制炎症信号通路的激活，使巨噬细胞分泌的炎症因子更少      【解析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。(1) 利用PCR技术扩增CD14基因时，需要根据CD14基因的两端核苷酸（或碱基）序列设计特异性引物。因为引物要与模板DNA特定序列互补配对，从而确保扩增的是目标基因。DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链，引物为DNA合成提供了起始点，扩增时引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。(2) 步骤①因为要制备抗CD14单克隆抗体，需要先让小鼠免疫产生能分泌抗CD14抗体的B淋巴细胞，需向小鼠注射的抗原是CD14蛋白。步骤④“专一抗体检测”的原理是抗原与抗体的特异性结合。只有能与CD14蛋白特异性结合的杂交瘤细胞产生的抗体才能被检测出来。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内或体外培养时可以大量增殖并分泌单克隆抗体。(3) 由于正向连接的重组DNA有XhoI和SalI这两种酶的酶切位点，可再次被切开；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点无法切开。所以可以通过酶切后电泳等检测手段，根据条带情况可以判断连接方向。(4) 从分子和细胞水平分析，高浓度抗CD14单克隆抗体能更多地与巨噬细胞表面的CD14蛋白特异性结合，更有效地阻断LPS与CD14的结合。LPS与CD14结合后会激活细胞内炎症信号通路，引发机体炎症反应，而抗CD14单克隆抗体阻断了这一过程，从而更强地抑制炎症信号通路的激活，使巨噬细胞分泌的炎症因子更少。 5.（2026·岷县一中&岷县二中·二模）基因漂移是指一种生物的基因向附近野生近缘种自发转移，导致其基因发生变化的现象，可能引起环境安全问题。杜绝基因漂移的一个办法是在目的基因发挥作用后，利用Cre-LoxP重组系统将其从转基因植株花粉中删除。该技术的原理如下图所示：a部分表示LoxP位点是一段特定的DNA序列，由两个反向重复序列和中间间隔序列组成，间隔序列决定了LoxP位点的方向；b、c部分表示Cre重组酶的作用机理。 回答下列问题： （1）对已知序列的LoxP位点进行PCR扩增需要引物，写出一种引物的前6个碱基　　　　　。 （2）由图可知，Cre重组酶的作用机理是切除两个LoxP位点间的序列还是使两个LoxP位点间的序列发生倒置，与两个LoxP位点　　　　　有关，Cre重组酶在该系统中的作用类似于基因工程工具中的　　　　　。 （3）　　　　　是基因工程的核心步骤。在利用Cre-LoxP重组系统时，为使目的基因发挥作用后被彻底删除，避免其通过花粉传播向其他生物漂移，要将目的基因插入两个　　　　　（填“方向相同”或“方向不同”）的LoxP位点之间，再和启动子、终止子等元件构建到基因表达载体上。 （4）将构建好的含有Cre-LoxP重组系统相关 元件的载体导入水稻细胞，最常用的方法是　　　　　，选用该方法的原理是　　　　　。 （5）检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，常用　　　　　技术。目的基因成功导入后检测其是否翻译成蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术，若没有出现杂交带，可能的原因是　　　　　。 【答案】（1）5′-ATAACT……3′     （2）① 方向    ② 限制酶     （3）① 构建基因表达载体    ② 方向相同     （4）① 农杆菌转化法    ② 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上     （5）① PCR    ② 目的基因没有转录或转录的mRNA没有翻译      【解析】农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。(1) 引物应与模板链的3′端结合，故可确定引物的前6个碱基为5′-ATAACT……3′。(2) 由图可知，Cre重组酶切除两个LoxP位点间的序列还是使两个LoxP位点间的序列发生倒置，与两个LoxP位点的方向有关，Cre重组酶识别LoxP位点并切除位点间的序列，作用类似于限制酶。(3) 构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。为使目的基因发挥作用后被彻底删除，要将目的基因插入两个方向相同的LoxP位点之间，再构建到基因表达载体上。(4) 农杆菌转化法是常用的导入植物细胞的方法，利用Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上的原理。(5) 检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，常用PCR技术。目的基因成功导入后用抗原-抗体杂交技术检测蛋白质，若没有出现杂交带，可能的原因是目的基因没有转录或转录的mRNA没有翻译。 6.（2026·甘肃·一模）人体COX-2基因的表达产物与炎症反应强度密切相关。研究人员欲构建COX-2基因的表达载体以探究其表达调控机制，具体过程如图所示。图中A、B、C、D是4种引物，质粒上两种限制酶BamHI和SacI的识别位点如图所示，LacI基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。已知含有目的基因的供体DNA上也有BamHI和SacI的识别位点。回答下列问题： （1）通过PCR技术扩增COX-2基因时，应使用　　　　　酶，选择的引物组合是　　　　　　　。 （2）若实验室只有显色剂X-gal而没有氨苄青霉素，在构建COX-2基因表达载体时，如果采用单酶切法切割质粒和目的基因，应选择图中的限制酶　　　　　，将目的基因插入质粒的　　　　　　　　之间。在滴加X-gal的培养基中，含有重组质粒的菌落　　　　　（填“能”或“不能”）呈现蓝色，原因是　　　　。 【答案】（1）① 耐高温的DNA聚合酶    ② B和C     （2）① BamHI    ② 启动子和终止子    ③ 不能    ④ BamHI破坏了LacI基因使其无法表达，不能使显色剂变蓝      【解析】(1) 通过PCR技术扩增COX-2基因时，应使用耐高温的DNA聚合酶，因为PCR过程依次经过高温变性、低温复性、中温延伸的过程，因而需要耐高温的DNA聚合酶，又知PCR过程中子链延伸的方向是游离的脱氧核苷酸依次连接到引物的3’端，即子链的延伸方向是5’→3‘，且DNA双链是反向平行的，因此选择的引物组合是B和C。(2) 若实验室只有显色剂X-gal而没有氨苄青霉素，则在构建重组DNA时需要破坏LacI基因，据此可以与空质粒表现出差别，因此，在构建COX-2基因表达载体时，如果采用单酶切法切割质粒和目的基因，应选择图中的限制酶BamHI，同时将目的基因插入质粒的启动子和终止子之间，确保目的基因正常表达。在滴加X-gal的培养基中，由于重组质粒中的相关基因（LacI基因）被破坏，因而含有重组质粒的菌落“不能”呈现蓝色，即BamHI破坏了LacI基因使其无法表达，不能使显色剂变蓝。 7.（2026·甘肃酒泉·二调）科研人员拟将兔毛角蛋白基因构建重组表达载体，导入棉花细胞培育纤维品质改良的转基因棉花，兔毛角蛋白基因的结构、转录方向及质粒载体的酶切位点分布如图所示。已知所有限制酶均能精准识别并切割其对应的特异性核苷酸序列，不发生非特异性切割，不同限制酶切割后产生的黏性末端均不能互补配对。回答下列问题： （1）每个基因通常有1个启动子，启动子是　　　　　　的起点。构建重组表达载体时，需将兔毛角蛋白基因插入到质粒的　　　　　　之间，才能保证目的基因在受体细胞中正常转录；目的基因插入时，其模板链的　　　　　　（填“5′端”或“3′端”）应靠近质粒的启动子一侧，才能保证转录出正确的mRNA序列。（2）为了使兔毛角蛋白基因能够正确的插入质粒中，PCR获取兔毛角蛋白基因时，需在引物a和引物b的　　　　　　（填“5′端”或“3′端”）分别添加限制酶　　　　　　和　　　　　　的识别序列。 （3）含重组质粒的农杆菌需接种在添加　　　　　　的培养基中，才能筛选出成功转化的农杆菌；若要在个体生物学水平鉴定转基因棉花是否培育成功，可采用的鉴定方法是　　　　　　。 【答案】（1）① 转录    ② 启动子和终止子    ③ 3′端     （2）① 5′端    ② EcoRⅠ    ③ HindⅢ     （3）① 氨苄青霉素    ② 检测并对比转基因棉花与普通非转基因棉花的纤维品质，观察是否出现改良的优良纤维特性      【解析】(1) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动目的基因转录，是转录的起点，终止子负责终止转录过程，因此目的基因必须插入到启动子和终止子之间，才能在受体细胞中正常转录。转录时 RNA 聚合酶沿模板链的3′→5′方向移动合成mRNA，因此插入时需将目的基因模板链的3′端靠近质粒的启动子，才能保证转录出正确的mRNA序列。(2) 质粒上启动子和终止子之间有HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅠ酶切位点，为了使目的基因正确插入并表达，应选择能将目的基因定向插入启动子和终止子之间的限制酶进行切割。根据转录方向和质粒图谱，XbaⅠ有两个酶切位点，会破坏抗性基因，则应选择HindⅢ和EcoRⅠ。由于转录方向是由右向左，根据质粒中启动子的位置，则引物b的5′端添加HindⅢ识别序列，引物a的5′端添加EcoRⅠ识别序列。(3) 质粒上的氨苄青霉素抗性基因为标记基因，可用于筛选成功导入重组质粒的农杆菌，因此需在培养基中添加氨苄青霉素，未导入质粒的农杆菌无法在该培养基上存活。个体生物学水平的鉴定需直接检测转基因生物的性状改良效果，本实验的目的是培育纤维品质改良的转基因棉花，因此可通过对比转基因棉花与普通非转基因棉花的纤维品质，判断是否获得预期的优良性状。 8.（2026·甘肃·二模）半夏是一种单子叶植物，据《本草纲目》和《神农本草经》记载，其块茎具有化痰除湿、止呕健脾等功效。科学家从半夏植株中提取出了具有广谱抗菌作用的水杨酸，现欲通过转基因技术获得能产生水杨酸的酵母菌株系Ⅰ，从而实现工厂化生产。已知甲醇是该酵母菌的唯一碳源，酵母菌的质粒上有甲醇诱导型强启动子，还有一个HIS4基因位点（可以合成组氨酸）。回答下列问题： （1）酵母菌质粒上的强启动子区别于普通启动子的特点是　　　　　　　　　　　　。 （2）在筛选成功转化的酵母菌时，培养基中需要添加　　　　　　物质（填“甲醇”或“组氨酸”），添加的理由是　　　　　　　　　　　　，不需要添加另一种物质的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）酵母菌株系Ⅰ中的目的基因合成的前体物质有时也会被转化成其他成分，使抗菌物质的产量大大下降。科学家分别敲除了合成四种其他物质的关键酶基因，得到了SA03、SA04、SA05、SA06四个新株系。这些株系的细胞增殖量和单位细胞抗菌物质（水杨酸）的产量如下图所示。据此分析，最适合作为生产用菌株的是　　　　　　，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）能高效启动基因的转录，合成大量mRNA     （2）① 甲醇    ② 甲醇可为酵母菌提供碳源并诱导启动子驱动目的基因的转录    ③ 酵母菌的质粒上有HIS4基因，可以合成组氨酸     （3）① SA06    ② 单位细胞中抗菌物质（水杨酸）的产量最高      【解析】(1) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。酵母菌质粒上的强启动子区别于普通启动子的特点是：能高效启动基因的转录，合成大量mRNA。(2) 已知甲醇是该酵母菌的唯一碳源，酵母菌的质粒上有甲醇诱导型强启动子，还有一个HIS4基因位点（可以合成组氨酸）。据此可知：在筛选成功转化的酵母菌时，培养基中需要添加甲醇，不需要添加组氨酸。添加甲醇的理由是：甲醇可为酵母菌提供碳源并诱导启动子驱动目的基因的转录；不需要添加组氨酸的理由是：酵母菌的质粒上有HIS4基因，可以合成组氨酸。(3) 柱形图显示：SA06的单位细胞中抗菌物质（水杨酸）的产量最高，适合作为生产用菌株。 9.（2026·甘肃陇南康县3校·一模）生物柴油作为新型能源已成为世界上广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究发现，油料作物紫苏具有产油基因DGAT1，现利用基因工程的技术，获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。图1、图2是获得产油微藻的基因工程操作程序，回答以下问题。 （1）图1为构建DGAT1基因文库的过程，①代表　　　　　　过程。 （2）现需将DGAT1基因通过PCR技术进行扩增，在扩增DGAT1基因时，需要根据　　　　　　设计特异性引物序列。 （3）利用转基因技术获得产油微藻的核心步骤为：　　　　　　，据图2分析，该过程需要选择　　　　　　限制酶切割DGAT1基因。 （4）为了保证DGAT1基因能够在微藻细胞中表达，应该将pBI121质粒上的启动子替换为　　　　　　。（5）用　　　　　　方法检测微藻细胞中是否插入了DGAT1基因并转录出了相应的mRNA；若要进一步判断DGAT1基因是否成功表达，需要加入　　　　　　进行检测。 （6）为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表所示。 检测指标 总氮/（mg·L-1） 总磷/（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 地热废水培养基 23.2 4.32 4.56 培养转基因产油微藻11d后 1.9 0.45 0.84 该实验不能说明产油微藻对地热废水有去污能力，请进一步完善实验　　　　　　。 【答案】（1）逆转录     （2）DGAT1基因两端的核苷酸序列     （3）① 基因表达载体的构建    ② XbaⅠ和HindⅢ     （4）微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子     （5）① DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法    ② DGAT1抗体     （6）添加用地热废水培养普通微藻的对照组，在相同条件下培养11d后检测总氮、总磷和氟化物的含量      【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。(1) 由图1可知，① 由mRNA到cDNA，该过程表示逆转录。(2) 现需将DGAT1基因通过PCR技术进行扩增，在扩增DGATI基因时，需要根据DGATI基因两端的（已知）核苷酸序列设计特异性引物序列。(3) 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，所以利用转基因技术获得产油微藻的核心步骤为:基因表达载体的构建;构建表达载体过程中需要将目的基因插入载体（质粒）的启动子和终止子之间，目的基因和质粒相连需要具有相同的黏性末端，为了防止目的基因和质粒自身环化，目的基因和质粒均需要采用双酶切法;由图2可知，pBI121质粒启动子和终止子之间存在四种限制酶，即EcoRI、BamH I、XbaI和Hind Ⅲ，而DGATI基因序列中间含有BamHI酶切位点，采用其酶切会将目的基因切开，可见不能选用BamHI酶切，而DGAT1基因转录方向由左向右，综合pBI121质粒的酶切位点、目的基因两端酶切位点及转录方向等因素，需要选择XbaI和Hind Ⅲ限制酶切割DGATI基因。(4) 启动子是RNA聚合酶识别及结合的位点，是基因转录的起始标志，其具有特异性，为了保证DGAT1基因能够在微藻细胞中表达，应该将pBI121质粒上的启动子替换为微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子。(5) 若要检测微藻细胞中DGAT1基因及其转录出的mRNA，属于分子水平上的检测转录产物，可以采用DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法;判断产油微藻细胞中DGAT1基因是否成功表达，属于分子水平上检测翻译的产物--蛋白质，用抗原-抗体杂交技术，需要加入DGAT1抗体检测。(6) 实验缺少对照组，不能确定是不是普通微藻本身有去污能力，所以需要增加一组实验，即添加用地热废水培养普通微藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量。 10.（2026·甘肃酒泉·一模）（多选）内切葡聚糖酶是一类糖苷水解酶，能够随机切割纤维素链中的β-1，4-糖苷键，实现碳素的转移和循环。某科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EgⅢ，并将其导入毕赤酵母中构建工程菌，成功实现了高效降解固体废物中纤维素的目的（如图所示）。回答下列问题： （1）利用PCR技术从木霉基因组中获得EgⅢ基因时应选择的两种引物是　　　　　　　，经过n次循环后形成的子代DNA中，同时含有上述两种引物的DNA所占比例为　　　　　　　。 （2）为使EgⅢ基因与质粒连接并正确表达，应选择的限制酶是　　　　　　　，步骤1将重组质粒导入　　　　　　　处理的大肠杆菌，完成转化实验，然后在含有　　　　　　　（填抗生素名称）的培养基中筛选含EgⅢ的大肠杆菌，然后进行扩增。 （3）从分子水平上，利用　　　　　　　方法检测转化毕赤酵母是否合成内切葡聚糖酶，从个体水平上，可将转化毕赤酵母培养在以　　　　　　　为唯一碳源的培养基，检测转化毕赤酵母能否增殖。 【答案】（1）① 引物2、引物3    ② 1-（1/2n-1）     （2）① BamHI、SalⅠ    ② Ca2+    ③ 氨苄青霉素     （3）① 抗原—抗体杂交    ② 纤维素      【解析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达。2、限制酶的选择原则：不破坏目的基因、保留标记基因、启动子、终止子、复制原点等、确保出现相同黏性末端的原则。为了避免目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接，分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体。(1) DNA复制的方向是从模板链的3'→5'，引物与模板链的复制起始段互补配对，根据图示中EgⅢ基因的方向，应选择的引物是引物2和引物3。DNA复制时，每个子代DNA分子只以其中一条链作为模板进行，PCR第一次复制产生的两个DNA分子只含有引物2或引物3，进行第二次复制时，以最初的DNA模板链复制产生的DNA仍然只含引物2或引物3，以第一次复制产生的子链为模板进行复制产生的DNA同时含有引物2和引物3，依次类推，无论复制多少次，只有2条DNA不满足要求，其余DNA均同时含引物2和引物3，经过n次复制共产生2n个DNA，同时含有上述两种引物的DNA所占比例为（2n-2）/2n，化简的结果是1-（1/2n-1）。(2) 为使EgⅢ基因与质粒连接并正确表达，根据目的基因的转录方向以及质粒上的启动子和终止子的位置，需要利用BamHI和SalI对目的基因所在的DNA进行酶切，从而构建重组DNA分子。步骤1将重组质粒导入Ca2+处理的大肠杆菌，Ca2+处理的目的是增大大肠杆菌的通透性，有利于目的基因的导入，从而完成转化实验。在构建重组DNA分子时破坏了质粒上的卡那霉素抗性基因，质粒上仍保留氨苄青霉素抗性基因，因此在含有氨苄青霉素的培养基中筛选含EgⅢ的大肠杆菌，然后进行扩增。(3) 内切葡聚糖酶是一类糖苷水解酶，化学本质是蛋白质，从分子水平上，利用抗原—抗体杂交法检测转化毕赤酵母是否合成内切葡聚糖酶。我们的目的是获得高效降解固体废物中纤维素的工程菌，因此从个体水平上，可将转化毕赤酵母培养在以纤维素为唯一碳源的培养基，检测转化毕赤酵母能否增殖。 11.（2026·甘肃天水彭水一中&彭水二中·二模）在培育转基因抗虫作物过程中,单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。为提高作物的抗虫性,研究人员提取苏云金芽孢杆菌的抗虫蛋白基因Cry1A.301和Vip3A进行融合,培育抗虫作物,其具体过程如图。回答下列问题: （1）①过程需要使用　　　　　　　　　　　酶。引物P2和引物P3之间碱基序列的特点是必须有　　　　　　　　　（填“相同”或“互补”）片段。经图中PCR1过程获得产物1至少需要经过　　　　　　　　　　次扩增循环。（2）重组质粒中启动子是　　　　　　　　　,可驱动目的基因的转录。除图示信息外,重组质粒中还应该有　　　　　　　　　　　。为使②过程中融合基因能按正确方向插入质粒,需在引物P1的　　　　　　　　　　端加上限制酶　　　　　　　　的识别序列。②过程需用到的工具酶,除限制酶外,还有　　　　　　　　　　　　　。 （3）通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定,结果如图所示。泳道1、2分别是用NcoⅠ切割质粒和重组质粒的结果。若已知融合基因已整合到质粒上,请在图中泳道3绘制出用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒所得的电泳结果　　　　　　　。（质粒上NcoⅠ和XhoⅠ识别位点间隔较近,长度可忽略不计） （4）将重组质粒转入农杆菌后,应将该农杆菌置于含　　　　　　　的培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测Cry1A.301-Vip3A融合蛋白抗虫的效果,还需进行个体水平检测,请简述实验思路:　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① TaqDNA聚合（耐高温的DNA聚合）    ② 互补    ③ 2     （2）① RNA聚合酶识别和结合的部位    ② 复制原点    ③ 5    ④ NcoⅠ    ⑤ DNA连接酶     （3）     （4）① 卡那霉素    ② 分别用转入融合蛋白基因的玉米叶片和等量的普通玉米叶片饲喂害虫,一段时间后,比较饲喂后害虫的生长状况（死亡率）（将等量的转基因玉米和非转基因玉米分别饲喂害虫,检测害虫的存活情况）      【解析】(1) ①过程为PCR扩增,该过程需要耐高温的DNA聚合酶。为使实验PCR1的产物与PCR2的产物融合,设计引物P2和P3时,需让二者5′端一小段DNA序列互补配对。①过程至少需经历2次循环才能得到产物1,如图所示。(2) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动目的基因转录出mRNA。图中重组质粒含有标记基因、启动子、终止子和目的基因,除此之外还需含复制原点。分析图中的质粒,卡那霉素抗性基因中有EcoRⅠ的识别序列,因此切割重组质粒和目的基因时需选择NcoⅠ和XhoⅠ,根据融合基因的转录方向以及质粒中启动子的方向判断,需在引物P1的5′端加上限制酶NcoⅠ的识别序列。②过程为构建基因表达载体,该过程需要用到限制酶和DNA连接酶。(3) 用NcoⅠ切割后,质粒的长度为5.5kb,重组质粒的长度为7kb,故融合基因的长度为7-5.5=1.5（kb）。若融合基因已整合到质粒上,用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒,将产生融合基因（1.5kb）、质粒（5.5kb）两种长度的片段,据此在泳道3的相应位置画图。(4) 重组质粒中有卡那霉素抗性基因,将重组质粒转入农杆菌后,需将农杆菌置于含有卡那霉素的培养基中进行培养,从而筛选出含有重组质粒的农杆菌。在个体水平检测该融合蛋白的抗虫效果时,可用转入融合蛋白基因的玉米叶片和等量的普通玉米叶片分别饲喂害虫,在相同的条件下饲养一段时间后,比较害虫的存活情况。 12.（2026·甘肃陇南武都·二模）（多选）别藻蓝蛋白（APC）是蓝细菌及藻类中的一种色素蛋白，其生物合成过程如图1。通过构建双质粒表达系统，实现重组别藻蓝蛋白（rAPC）合成通路在大肠杆菌中的完整表达，如图2，请回答下列问题： （1）根据图1中PCB的合成过程可判断，基因表达产物与性状之间的关系是　　　　　　　　。APC的合成受到多种基因的控制，说明基因和性状之间并非　　　　　　　关系。 （2）据图2可知，构建双质粒表达系统时，引物　　　　　　　的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程　　　　　　　（选填“可以”或“不可以”）在同一反应体系中进行。为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应　　　　　　　（选填“大于”或“等于”或“小于”）启动子2。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是　　　　　　　。 （3）一般用　　　　　　　处理大肠杆菌以提高转化的效率。比较图2中过程④和⑤使用的培养基，前者比后者多出的成分有　　　　　　　。 （4）科研人员为探究rAPC对小鼠肝癌的影响，进行了相关实验。下表为部分实验结果： 组别 抑癌率% 细胞灰度值 COX-2 VEGF PCNA 对照组 0 148.3 151.1 155.7 rAPC 低剂量组 25.2 156.2 159.2 157.5 中剂量组 36.7 161.2 159.9 162.3 高剂量组 43.1 165.1 163.5 164.9 化疗药物（CY）组 51.0 165.2 166.2 206.8 注：COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关；细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小。 下列关于实验结果的分析，合理的有　　　　　　　　　。a.rAPC组与CY组对比，能说明rAPC具有抑癌作用b.rAPC能抑制肿瘤的生长，但抑制作用不具有剂量效应c.rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达d.COX-2、VEGF和PCNA在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用 【答案】（1）① 基因通过控制酶的合成控制代谢过程，进而控制生物的性状    ② （简单的）一一对应     （2）① 2和3    ② 不可以    ③ 大于    ④ 分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限、减轻受体细胞在代谢上的负担）     （3）① Ca2+    ② 壮观霉素和卡那霉素和琼脂     （4）cd      【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。(1) 从图1中PCB的合成过程可知，血红素转化为PCB需要血红素氧化酶（HO1）和胆绿素还原酶（pcyA）的催化，这体现了基因表达产物与性状之间的关系是基因通过控制相关酶的合成间接控制生物的性状。APC的合成受到APC-α基因、APC-β基因等多种基因的控制，说明基因和性状之间并非一一对应关系。(2) 由图1可知，APC-α基因表达的APC-α肽链和APC-β基因表达的APC-β肽链最终需要连接和组装，再结合图2可知，需要在APC-α基因的下游和APC-β基因的上游添加Sac Ⅰ识别序列，所以在构建双质粒表达系统时，引物2、3的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程不可以在同一反应体系中进行，原因是目的基因上含有相同的酶切位点，如果在同一反应体系进行，可能造成目的基因相连。启动子1在目的基因（APC）的上游，启动子2在目的基因（HO1\pcyA\cpcs\cpcu）的上游，要获得的是APC（αβ）3，说明每个这个三聚体需要3个α和β，而合成其的裂合酶可能可以重复使用，所以为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应大于启动子。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限）。(3) 一般用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态，以提高转化效率。过程④ 是筛选含重组质粒的大肠杆菌，过程⑤ 是克隆化培养，前者比后者多出的成分有壮观霉素、卡那霉素和琼脂，用于筛选成功导入质粒的大肠杆菌。(4) a、rAPC组与对照组对比，低、中、高剂量组的抑癌率均大于对照组，才能说明rAPC具有抑癌作用，a错误；b、由表中数据可知，随着rAPC剂量增加，抑癌率逐渐升高，说明rAPC能抑制肿瘤的生长，且抑制作用具有剂量效应，b错误；c、根据注“细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小”，rAPC组和CY组中COX-2、VEGF和PCNA的细胞灰度值均大于对照组，所以rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达，c正确；d、因为COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关，它们在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用，d正确。故选cd 13.（2026·甘肃文县第二中学等校·二模）发酵食品就是利用有益微生物来制作人类喜爱的风味食品。高粱经蒸煮后加入酒曲，酒曲中的红曲霉菌对淀粉具有糖化功能。酯化酶是红曲酒发酵的关键酶之一，K基因的表达产物会降低酯化酶的含量，为了筛选高产酯化酶的优质红曲霉菌，研究人员欲通过基因工程技术对其进行改良。请分析回答下列问题： （1）为了敲除K基因，需要利用PCR技术获得图1中的融合片段N，此过程中加入Mg2+的作用是　　　　　。过程③扩增融合片段时应选用的一对引物为　　　　　；为了后续使融合片段插入质粒中，需要在两引物的　　　　　（填“3′端”或“5′端”）加上限制酶切位点序列。 （2）获得的融合片段N两端的酶切位点如图2所示，为使融合片段N定向插入到质粒中，应选择图中的限制酶　　　　　对质粒A进行酶切，利用　　　　　酶将质粒特定的黏性末端补平后，在DNA连接酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。若用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，可得到　　　　　种长度的片段。 （3）利用重组质粒B和红曲霉菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对K基因进行敲除。同源区段交换后，用图3中的引物1和2对红曲霉菌DNA进行PCR扩增，若扩增产物的碱基长度为　　　　　bp，则说明K基因已被敲除。 【答案】（1）① 激活耐高温的DNA聚合酶    ② 引物1和引物4    ③ 5'端     （2）① BamHI和Spe I    ② DNA聚合    ③ 1 一     （3）500      【解析】(1) PCR过程中反应体系中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶；PCR扩增需要一对引物分别结合目的片段的两条模板链，要得到完整的融合片段N（上游序列+下游序列），据图1可知，引物1和引物4能结合到模板链上，从而扩增出K基因两侧上下游序列，所以应选用引物1和引物4；DNA复制时引物从3'端延伸，因此限制酶切位点需要加在引物的5'端，不影响引物与模板的结合延伸。(2) BclⅠ（切割后产生GATC黏性末端，与BamHⅠ的黏性末端互补），右端为EcoRⅤ（切割后产生平末端），为实现定向插入，选择质粒的BamHⅠ和SpeⅠ双酶切；BamHⅠ切出的黏性末端可与融合N左端BclⅠ的黏性末端连接，SpeⅠ切出的黏性末端需要用DNA聚合酶补平为平末端，才能与融合N右端EcoRⅤ的平末端连接；BamH和Bcl相同的黏性末端连接后，原有的酶切位点序列发生改变，重组质粒B不能被BamH酶切，用限制酶SmaI和BamHI对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到1种长度的片段。(3) K基因被敲除后，引物1和引物2之间只有上游序列（200bp）和下游序列（300bp），K基因的1000bp被去除，因此扩增产物长度为上、下游片段长度之和，即200+300=500bp。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点1 基因工程综合 1.【答案】（1）碳源 碳源和能源物质     （2）① 消毒    ② 酒曲中的微生物失活     （3）① 28℃是酵母菌的最适生长温度，有利于酵母菌快速增殖，扩大菌种数量    ② 无氧呼吸 酒精发酵    ③ 升高     （4）① Mfe Ⅰ    ② 不可以    ③ α-淀粉酶基因的序列内部存在EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ酶切后目的基因会断裂      2.【答案】（1）① 农杆菌转化法    ② Ti质粒上的T - DNA    ③ 潮霉素     （2）① 外植体    ② 次氯酸钠    ③ 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素     （3）① PCR - 测序    ② 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）     （4）对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。      3.【答案】（1）① 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖    ② 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关     （2）耐高温的DNA聚合酶     （3）① 基因表达载体的构建    ② 限制酶、DNA连接酶     （4）① 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等    ② 能吸收周围环境中DNA分子     （5）生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同      考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】B 1.【答案】D 2.【答案】B 3.【答案】（1）① 逆转录（反转录）    ② 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸     （2）① 标记基因（复制原点）    ② 不同     （3）识别DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断裂     （4）Ca2+（CaCl2）     （5）① PCR（DNA分子杂交）    ② 抗原——抗体杂交      4.【答案】（1）① CD14基因的两端核苷酸（或碱基）序列    ② 使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸     （2）① CD14蛋白    ② 抗原与抗体的特异性结合    ③ 注射到小鼠腹腔内增殖（或体外进行大规模细胞培养）     （3）① 可行    ② 正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点，可再次被切开；而反向连接的重组 DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点无法切开     （4）高浓度抗CD14单克隆抗体能更多地与巨噬细胞表面的CD14蛋白特异性结合，更有效地阻断LPS与CD14的结合，从而更强地抑制炎症信号通路的激活，使巨噬细胞分泌的炎症因子更少      5.【答案】（1）5′-ATAACT……3′     （2）① 方向    ② 限制酶     （3）① 构建基因表达载体    ② 方向相同     （4）① 农杆菌转化法    ② 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上     （5）① PCR    ② 目的基因没有转录或转录的mRNA没有翻译      6.【答案】（1）① 耐高温的DNA聚合酶    ② B和C     （2）① BamHI    ② 启动子和终止子    ③ 不能    ④ BamHI破坏了LacI基因使其无法表达，不能使显色剂变蓝      7.【答案】（1）① 转录    ② 启动子和终止子    ③ 3′端     （2）① 5′端    ② EcoRⅠ    ③ HindⅢ     （3）① 氨苄青霉素    ② 检测并对比转基因棉花与普通非转基因棉花的纤维品质，观察是否出现改良的优良纤维特性      8.【答案】（1）能高效启动基因的转录，合成大量mRNA     （2）① 甲醇    ② 甲醇可为酵母菌提供碳源并诱导启动子驱动目的基因的转录    ③ 酵母菌的质粒上有HIS4基因，可以合成组氨酸     （3）① SA06    ② 单位细胞中抗菌物质（水杨酸）的产量最高      9.【答案】（1）逆转录     （2）DGAT1基因两端的核苷酸序列     （3）① 基因表达载体的构建    ② XbaⅠ和HindⅢ     （4）微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子     （5）① DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法    ② DGAT1抗体     （6）添加用地热废水培养普通微藻的对照组，在相同条件下培养11d后检测总氮、总磷和氟化物的含量      10.【答案】（1）① 引物2、引物3    ② 1-（1/2n-1）     （2）① BamHI、SalⅠ    ② Ca2+    ③ 氨苄青霉素     （3）① 抗原—抗体杂交    ② 纤维素      11.【答案】（1）① TaqDNA聚合（耐高温的DNA聚合）    ② 互补    ③ 2     （2）① RNA聚合酶识别和结合的部位    ② 复制原点    ③ 5    ④ NcoⅠ    ⑤ DNA连接酶      （3）      （4）① 卡那霉素    ② 分别用转入融合蛋白基因的玉米叶片和等量的普通玉米叶片饲喂害虫,一段时间后,比较饲喂后害虫的生长状况（死亡率）（将等量的转基因玉米和非转基因玉米分别饲喂害虫,检测害虫的存活情况）      12.【答案】（1）① 基因通过控制酶的合成控制代谢过程，进而控制生物的性状    ② （简单的）一一对应     （2）① 2和3    ② 不可以    ③ 大于    ④ 分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限、减轻受体细胞在代谢上的负担）     （3）① Ca2+    ② 壮观霉素和卡那霉素和琼脂     （4）cd      13.【答案】（1）① 激活耐高温的DNA聚合酶    ② 引物1和引物4    ③ 5'端     （2）① BamHI和Spe I    ② DNA聚合    ③ 1 一     （3）500      试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $