第18讲 基因工程和蛋白质工程（3大核心+分层专练）（上海专用）2027年高考生物一轮复习讲练测

**基本信息** 以“概念-原理-流程-应用”为主线，融合课标考情、分层训练与核心素养，构建基因工程与蛋白质工程系统化复习体系。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|----|----|----| |课标导向|考情分析+复习建议|“读做写联”四步复习法，易混易错点对比|承接必修2分子基础，关联选修3发酵/细胞工程，形成技术应用链| |核心速记|3大核心+操作流程|重组DNA技术“取→切接→转增→检”步骤简记，工具酶作用位点辨析|从基因工程概念→工具→操作流程，延伸至蛋白质工程定点突变/定向进化| |分层专练|基础16题+情境8题+素养5题|PCR引物设计、酶切位点选择、筛选方案书写技巧|基础题聚焦概念辨析，情境题结合案例（如CAR-T疗法），素养题考查实验设计与科学探究|

第18讲 基因工程和蛋白质工程 （上海专用） 第1部分 课标导向·考情铺垫 第2部分 三大核心·主干速记 核心1 基因工程的概念与应用； 核心2 重组DNA技术的操作流程； 核心3 蛋白质工程 第3部分 分层专练·靶向攻关 基础通关 / 情境应用/ 素养提升 课标导向·考情铺垫 课标导向 沪科版选择性必修3第3章，承接必修2“遗传与进化”的分子基础，与选修3第1章发酵工程、第2章细胞工程共同构成现代生物工程的核心知识体系。学习目标：① 阐述基因工程的概念，列举其理论基础和技术支撑（生命观念、科学思维）；② 准确描述重组DNA技术的三大基本工具及其功能（科学思维）；③ 完整概述PCR技术的原理与操作流程（科学探究）；④ 归纳基因工程四大操作步骤，理解各环节的原理与方法（科学探究）；⑤ 区分蛋白质工程与基因工程，理解定点突变和定向进化的基本策略（科学思维、科学探究）。 课标 本讲要求 课程性质 基因工程与蛋白质工程是现代生物工程的核心技术，属于“生物技术与工程”模块的重点内容，是分子生物学原理在实践中的应用与延伸。 核心素养 ①生命观念：理解DNA双螺旋结构和中心法则是基因工程的理论基础，领悟结构与功能相适应； ②科学思维：通过分析限制酶识别与切割的特异性、PCR原理，培养模型构建与逻辑推理能力； ③科学探究：掌握重组DNA技术四大基本步骤（获取→构建→导入→筛选），能对给定的基因工程项目提出合理的设计方案； ④社会责任：关注转基因产品的安全性、基因治疗的伦理问题，确立利用科学技术造福人类的价值观。 考情分析 基因工程是上海等级考的高频核心考点，几乎每年必考。命题常以综合题（含选择、填空、简答、图表分析）形式出现，分值高（通常占8～15分），综合性强。合格考侧重基础概念识记与简单应用。 考查方式：① 以基因工程操作流程为主线，考查限制酶选择、载体构建、转化方法、筛选鉴定等核心环节；② 以PCR技术为切入点，考查引物设计、扩增原理、电泳鉴定；③ 结合科学史（如人胰岛素生产、抗虫棉培育）创设情境；④ 蛋白质工程常以定点突变方案设计的形式考查，难度较高。 易混易错点 1 限制酶切割的是磷酸二酯键（而非氢键），DNA连接酶连接的也是磷酸二酯键； 2 用同种限制酶切割目的基因和载体才能产生相同黏性末端； 3 PCR中引物方向是5'→3'延伸，引物设计在目的基因的两端外侧； 4 抗药性筛选中注意插入灭活原理； ⑤ 蛋白质工程改造的是基因（DNA水平），不是直接改造蛋白质分子。 新高三复习建议 1. 读——精读教材第3章，重点关注：① 重组DNA技术四大步骤的原理与操作细节；② PCR技术的条件、过程与应用；③ 抗药性筛选法和显色筛选法的原理；④ 蛋白质工程与基因工程的区别与联系。 2. 做——完成课后自我评价题目和各区模拟卷中的基因工程综合题，练习限制酶切位点分析、引物设计、筛选方案书写。 3. 写——用流程图自主绘制“获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→筛选鉴定”的完整操作路线，规范书写每一步的原理和方法。 4. 联——将基因工程知识与必修2的DNA结构、复制、转录翻译，以及选修3的发酵工程（工程菌发酵生产）进行知识串联，形成“分子基础→技术手段→产业应用”的完整知识链。 三大核心·主干速记 核心1 基因工程的概念与应用 一、基因工程的概念 1. 基因工程的定义 基因工程是指将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状的工程技术。 • 由于重组拼接的基因和运载工具都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术 2. 基因工程的核心特征 特征 内涵 操作水平 DNA分子水平（分子水平操作） 操作环境 体外（试管中完成重组） 核心原理 基因重组（不同来源DNA的重新组合） 遗传特点 可遗传给后代，且能定向表达新性状 本质 不同物种间的遗传信息定向转移与重新组合 基因工程突破了物种间遗传信息交流的天然屏障（生殖隔离），使跨物种的基因定向转移成为可能。 3. 基因工程的地位 • 基因工程是现代生物工程的核心技术 • 发酵工程所用的微生物菌种、细胞工程所涉及的细胞株，很多都是采用基因工程技术改造过的 二、基因工程诞生的理论基础与技术支撑 1. 理论基础（三大理论突破） 时间 理论突破 对基因工程的意义 1944年 DNA是遗传物质（肺炎双球菌转化实验） 揭示了DNA可以从一种生物转移到另一种生物，是基因转移操作的先驱性工作 1953年 DNA双螺旋结构和中心法则 阐明了DNA复制、转录和翻译的机制及遗传信息流动方向，为提升目的基因的复制和表达水平奠定基础 1963—1966年 遗传密码的破译 认识到自然界所有生物共用一套遗传密码，为基因的鉴别和合成提供理论依据 2. 技术支撑（三项关键发明） 时间 技术突破 对基因工程的意义 1953年 发现质粒（细菌内的小型DNA） 为基因转移找到了运载工具（载体） 1970年 发现限制性内切核酸酶 为DNA的切割和基因的获取奠定了技术基础 1972年 实现DNA体外重组 首次在体外构建出第一个重组DNA分子 3. 基因工程的诞生标志 1973年，美国科学家考恩（S. N. Cohen）和博耶（H. W. Boyer）等人： • 在体外构建出含有四环素和青霉素两个抗性基因的重组DNA分子 • 将之导入大肠杆菌后，重组DNA分子能稳定复制 • 大肠杆菌表达出相应的抗生素抗性 • 由此宣告了基因工程的诞生 【拓展】 考恩和博耶的实验还证实：不同物种的细菌可以在实验条件下毫无障碍地进行“交流”，遗传物质DNA可以在保持其功能的前提下进行人为拼接。这一发现具有划时代的里程碑意义。 三、基因工程的广泛应用 1. 医学领域 应用实例 原理与意义 重组人胰岛素（1982年上市） 将人胰岛素基因导入大肠杆菌/酵母，实现大规模生产；取代动物胰岛素，避免免疫反应。是人类历史上第一个基因工程产品 重组乙肝疫苗（1997年我国批准） 将乙肝病毒表面蛋白基因转入酵母，酵母高效合成表面抗原蛋白作疫苗；彻底摆脱血液依赖，安全且可大规模生产 基因治疗（1990年首例） 对因腺苷脱氨酶基因（ADA）缺陷而患重度联合免疫缺陷病的儿童进行基因治疗，开创基因治疗新纪元 CAR-T细胞疗法（2017年FDA批准） 利用蛋白质工程改造T细胞受体，用于急性淋巴细胞白血病治疗（属于第二代基因工程应用） 2. 农牧业领域 应用实例 原理与意义 转基因抗虫棉 将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白基因导入棉花；棉铃虫取食后，碱性消化液将蛋白水解为毒性肽→消化道麻痹而死。我国拥有自主知识产权 抗除草剂大豆（1994年批准种植） 从矮牵牛中获得草甘膦抗性基因导入大豆；大田中喷洒草甘膦不影响大豆产量 转基因小鼠（1982年） 将大鼠生长激素基因转入小鼠，培育出体形雄健的转基因小鼠 3. 食品工业领域 应用实例 原理与意义 氨基酸生产 用基因工程改良谷氨酸棒状杆菌，大幅提高谷氨酸产量；全世界每年氨基酸总产量接近5×10⁶ t 转基因微生物发酵 转基因微生物规模化生产氨基酸、抗生素、柠檬酸、丙酮、丁醇等产品 基因工程应用的考查常结合实例分析，要求考生： ① 指出某应用中涉及的目的基因是什么； ② 说明该目的基因导入受体细胞后如何表达出新性状； ③ 分析该应用相较于传统方法的优势。 核心2重组DNA技术的操作流程 一、重组DNA技术的三大基本工具 1. 限制性内切核酸酶（“分子手术刀”） （1）概念与功能 • 来源：主要在细菌中发现（目前已有上千种） • 功能：识别双链DNA的特定序列，并在特定位置切割DNA分子 • 切割的化学键：磷酸二酯键（不是氢键！） （2）识别序列的特点 特点 说明 特异性 每种限制酶只识别一种特定的核苷酸序列 长度 通常为4～8个碱基对（bp） 回文结构 识别序列通常具有回文对称特征（正读和反读相同） 切割方式 在识别序列内部或两侧切断两条链 （3）典型实例 限制酶 识别序列 切割位点 产物特点 EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' G与A之间 产生黏性末端（5'端突出AATT） PstⅠ 5'-CTGCA↓G-3' A与G之间 产生黏性末端（3'端突出） ⚡关键提醒 - 不同限制酶切割后可能产生相同的黏性末端（如BamHⅠ：G↓GATCC 和 MboⅡ：↓GATC） - 黏性末端是单链突出，可通过碱基互补配对形成氢键“粘”在一起 - 限制酶只在识别序列处切割，不改变识别序列之外的DNA序列 （4）细菌的限制－修饰系统 • 限制酶：识别并切割“外源”DNA → 相当于“防御武器” • DNA甲基化酶：对自身DNA的识别序列中碱基进行甲基化修饰 → 保护自身DNA不被切割 • 二者协调表达，构成类似“先天性免疫”的防御机制 【核心素养：生命观念】限制酶必须在识别并结合DNA的特定序列结构后才能发挥切割功能，充分体现了生命大分子结构与功能之间的对应关系。 2. DNA连接酶（“分子缝合针”） （1）功能 • 封闭双链DNA分子中单链的“缺口” • 即连接一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的磷酸二酯键（共价键） • 使两个黏性末端牢固连为一体 （2）作用原理 • 黏性末端在低温下通过氢键“粘”在一起→但氢键不牢固 • DNA连接酶在氢键的基础上封闭缺口，形成共价连接的稳定重组DNA分子 ⚡易错 1　 限制酶切割磷酸二酯键→产生黏性末端 2　 黏性末端通过氢键“粘”在一起→不牢固 3　 DNA连接酶封闭磷酸二酯键的缺口→使连接稳定化 4　 DNA连接酶不能连接平末端（大多数类型） 3. 载体（“分子运输车”） （1）为什么需要载体？ • 目的基因（DNA片段）不具备独立自我复制的能力（缺少复制必需的特定DNA序列） • 需要载体为其提供在受体细胞中独立复制的能力 （2）载体的类型 类型 特点 举例 质粒 双链环状DNA，独立于拟核DNA自主复制；大多携带抗生素抗性基因 pBR322、pUC18/19 病毒DNA 能高效感染宿主细胞并自主复制 噬菌体、腺相关病毒、慢病毒等 （3）载体必须具备的条件 条件 原因 能在受体细胞中独立复制并稳定保存 保证目的基因可随载体一起扩增 具有一个或多个限制酶切位点 便于外源DNA的插入 具有标记基因 便于筛选含重组DNA的受体细胞 对受体细胞无害 不影响受体细胞的正常生命活动 4. 三大基本工具总结 工具 名称 作用 作用位点 限制性内切核酸酶 “分子手术刀” 切割DNA，获取目的基因和切开载体 磷酸二酯键 DNA连接酶 “分子缝合针” 将目的基因与载体连接形成重组DNA 磷酸二酯键 载体 “分子运输车” 携带目的基因进入受体细胞并提供复制能力 — 二、重组DNA技术的四大操作步骤 获取目的基因 → 构建表达载体 → 导入受体细胞 → 筛选和鉴定 （取） （切+接） （转+增） （检） 第一步：获取目的基因（“取”） 1. 目的基因的概念 目的基因是人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。例如：人胰岛素基因、伴孢晶体蛋白基因等。 2. 获取目的基因的方法 方法 适用条件 原理 PCR扩增 目的基因部分序列已知 体外DNA扩增，需已知两侧序列以设计引物 化学合成法 目的基因完整序列已知 按已知序列直接化学合成 大规模筛选 基因序列未知 构建基因文库，基于大规模筛选获得 PCR技术详解 （1）PCR的概念 聚合酶链式反应（PCR）是一项模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术，由美国科学家穆勒斯（K. B. Mullis）于20世纪80年代中期首创。 （2）PCR所需的条件 成分 作用 DNA模板 含有目的基因的DNA（提供扩增的模板链） 引物（2条） 人工合成的短单链DNA；分别与目的基因两端的模板链互补配对；决定扩增的特异性和范围 耐热DNA聚合酶（Taq酶） 催化从引物3'端延伸合成新链；来源于嗜热细菌（能在高温下保持活性） dNTP（四种脱氧核苷三磷酸） dATP、dCTP、dGTP、dTTP；合成新链的原料 缓冲液 提供适宜的pH和Mg²⁺等反应条件 （3）PCR的基本程序（三步循环） 步骤 温度 操作 原理 ① 变性 95℃ 双链DNA解旋为单链模板 高温破坏碱基间的氢键 ② 退火 55~68℃ 两条引物分别与两条单链模板互补结合 温度降低→碱基互补配对形成氢键 ③ 聚合（延伸） 约75℃ Taq酶从引物3'端催化合成新DNA链 DNA聚合酶催化磷酸二酯键形成 · 每完成一次“变性→退火→聚合”即为一个循环； · 重复n次循环，理论上从1分子双链DNA扩增为2ⁿ个分子 · 系统温度升降由PCR扩增仪自动完成 （4）PCR的关键要点 要点 说明 引物设计的前提 目的基因两侧序列已知（以便合成互补引物） 引物的方向 两条引物分别与两条模板链3'端区域互补，引导新链从5'→3'方向合成 耐热酶的必要性 每轮循环需95℃高温变性→普通酶会失活→必须使用耐热DNA聚合酶 退火温度的控制 温度过高→引物不能与模板结合；温度过低→引物与非目标序列结合→非特异性扩增 扩增倍数 n次循环后理论扩增2ⁿ倍 （5）PCR与体内DNA复制的比较 比较项目 PCR（体外） 体内DNA复制 场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内 解旋方式 高温（95℃）变性 解旋酶催化 引物 人工合成的短DNA 短链RNA引物 酶 耐热DNA聚合酶（Taq酶） 普通DNA聚合酶 温度 需经历95℃→55~68℃→75℃循环 恒温（体温） 结果 扩增特定DNA片段 复制整个基因组 第二步：构建表达载体（“切”＋“接”） 1. 操作原理 将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切割出黏性末端（“切”），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（“接”），形成含目的基因且能表达的表达载体。 2. 关键操作原则 原则 说明 用同种限制酶切割 目的基因和载体必须用同一种限制酶切割→产生相同的黏性末端→才能互补配对 也可用不同酶切割 两种识别序列不同但黏性末端相同的限制酶也可分别切割目的基因和载体 注意目的基因方向 目的基因能以正反两种方式接入载体，但大多数情况下只有一种方向正确 防止载体自连 载体两侧黏性末端相同→可能自我环化→形成空载质粒（非重组DNA） 3. 注意事项 • 如果用两种识别序列不同但黏性末端相同的限制酶分别切割目的基因和载体，连接后原来的限制酶识别序列会消失→不能用相应的限制酶重新“卸下”目的基因 • 目的基因两侧的黏性末端相同→能正反两种方式等概率接入载体 • 载体片段两侧的黏性末端也相同→可能自我环化（空载） ⚡命题 ① 选择合适的限制酶（分析质粒和目的基因上的酶切位点） ② 分析连接后重组DNA的类型（重组质粒、空载质粒、目的基因自连） ③ 判断目的基因插入方向是否正确 第三步：将DNA导入受体细胞（“转”＋“增”） 1. 转化的概念 将重组DNA分子导入受体细胞的过程称为转化。由于DNA很难自然进入细胞，需对受体细胞进行特殊处理以提高转化效率。 2. 转化方法 方法类型 具体方法 适用对象 原理 物理方法 电击法 微生物、动植物细胞 电脉冲在细胞膜上形成短暂孔道 物理方法 DNA显微注射 动物受精卵 用玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液 化学方法 CaCl₂法 微生物（大肠杆菌等） CaCl₂处理使细胞处于感受态，增加膜通透性 生物方法 农杆菌转化法 植物细胞 利用根瘤农杆菌感染植物细胞，将表达载体导入 生物方法 病毒感染法 动物细胞 利用动物病毒（如腺相关病毒）高效导入 3. 受体细胞的类型选择 受体类型 受体细胞 应用目的 微生物 大肠杆菌、酵母等 发酵生产基因工程产品（如胰岛素） 植物 愈伤组织/原生质体、生殖细胞或胚胎组织 培育转基因植物 动物 受精卵/早期胚胎细胞、生殖细胞、诱导性多能干细胞 培育转基因动物 4. 扩增 • 转化效率通常很低（10⁻⁴～10⁻²） • 转化后的细胞需经过一段时间培养，使筛选标记性状得以表达→这一过程称为扩增 第四步：筛选和鉴定含目的基因的受体细胞（“检”） 1. 为什么需要筛选？ • 只有少数细胞能接纳DNA分子 • 进入受体细胞的DNA分子可能含有空载质粒（不含目的基因） • 需要从大量细胞中快速、准确找到正确导入目的基因的细胞 2. 抗药性筛选法（以pBR322质粒为例） 前提条件：载体DNA携带抗生素的抗性基因（标记基因） pBR322质粒含两个标记基因： • Ampʳ（氨苄青霉素抗性基因） • Tetʳ（四环素抗性基因） 第一轮筛选： • 将转化扩增的细菌涂布在含氨苄青霉素（Amp）的固体平板上 • 能生长的菌落 → 含有质粒（Ampʳ未被破坏）→ 可能是重组质粒或空载质粒 第二轮筛选： • 将第一轮长出的菌落分别接种到含Amp和含Amp+Tet的平板上 • 若外源DNA插在BamHⅠ位点处（位于Tetʳ基因内部）→ Tetʳ基因被插入灭活 • 含重组质粒的克隆：AmpʳTetˢ → 只在Amp平板上生长 • 含空载质粒的克隆：AmpʳTetʳ → 在Amp和Tet平板上均能生长 插入灭活原理——外源DNA插入某个抗性基因内部→该抗性基因失活→利用这个特征区分重组质粒和空载质粒 3. 显色筛选法（以pUC18/19质粒为例） 标记基因：lacZ'基因 • lacZ'表达的酶蛋白可将无色化合物X-gal水解为蓝色产物 • 将外源DNA插在lacZ'基因内部的限制酶切位点处→lacZ'基因被插入灭活 筛选方法： • 将转化扩增的细菌涂布在含Amp和X-gal的固体培养基上 • 蓝色克隆→ lacZ'未被破坏→空载质粒 • 白色克隆→ lacZ'被插入灭活→重组质粒（含目的基因） 4. 两种筛选方法比较 比较项目 抗药性筛选法 显色筛选法 标记基因 抗生素抗性基因（如Ampʳ、Tetʳ） lacZ'基因 筛选原理 插入灭活→抗性丧失 插入灭活→酶失活→颜色变化 观察指标 菌落是否能在含抗生素培养基上生长 菌落呈现蓝色/白色 重组克隆特征 在Amp平板上生长，在Amp+Tet平板上不生长 在Amp+X-gal平板上呈白色 空载克隆特征 在Amp和Amp+Tet平板上均能生长 在Amp+X-gal平板上呈蓝色 5. 进一步鉴定 经筛选获得的含目的基因的受体细胞还需进一步鉴定： 鉴定方法 目的 PCR技术 确认目的基因是否成功插入载体 凝胶电泳 分析目的基因大小是否正确 基因表达产物分析 检测目的基因是否正确表达（蛋白质的结构和功能分析） 6. 凝胶电泳鉴定 要点 说明 原理 DNA带负电荷（磷酸基团）→通电后向正极泳动 分离依据 根据DNA分子的大小和结构将其分离开 介质 琼脂糖凝胶 结果观察 在紫外灯下观察DNA电泳条带 方向 DNA从负极→正极泳动（负极端上样） 三、转基因动植物的构建 1. 转基因动物 • 常用方法：DNA显微注射 • 受体细胞：受精卵（或早期胚胎细胞） • 操作流程： 1. 用激素使雌鼠超数排卵 2. 与雄鼠交配后取受精卵 3. 在倒置显微镜下用玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液 4. 将注射了DNA的受精卵移植到母鼠子宫发育 5. 繁殖转基因小鼠子代 • 也可用动物病毒（如腺相关病毒、慢病毒）作载体，通过病毒感染高效导入 2. 转基因植物 • 常用方法：农杆菌转化法（用含表达载体的根瘤农杆菌感染受体细胞） • 也可用含表达载体的植物病毒直接感染植物组织 • 由于植物的愈伤组织能再生出整株植物，转基因植物的构建比转基因动物更加简便 3. 转基因后的确认 • 使用PCR等技术确认转基因是否成功 • 确认目的基因在动植物体内是否正确表达 ⚡常考：重组DNA技术四大步骤简记：取→切接→转增→检 - 取：获取目的基因（PCR/化学合成） - 切接：构建表达载体（同种限制酶切+DNA连接酶接） - 转增：导入受体细胞+扩增培养 - 检：筛选鉴定（抗药性/显色筛选+PCR/电泳确认） 核心3蛋白质工程 一、蛋白质工程的概念 1. 定义 蛋白质工程是在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，对天然蛋白质进行理性改造，甚至可以设计并制造出全新的非天然蛋白，以满足人类生产与生活需求的工程技术。 • 蛋白质工程又称第二代基因工程 • 基因工程的产物是天然蛋白质（目的基因是天然存在的） • 蛋白质工程的产物是突变蛋白或全新蛋白（对基因进行了人为改造） 2. 蛋白质工程的必要性 天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，结构和功能适应特定物种的生存需求，但不一定完全符合人类需要： 问题 举例 营养成分不足 常规主食（水稻、玉米）中必需氨基酸（如赖氨酸）含量偏低 工业适应性差 工业用酶在高温和有机溶剂环境中容易失活 药物稳定性差 药物蛋白多肽在机体内半衰期短，需反复使用 功能缺陷 人胰岛素容易聚合，延缓降血糖作用 3. 蛋白质工程的基本思路 预期蛋白质功能 → 设计蛋白质结构 → 推测氨基酸序列 → 确定（改变）基因序列 → 构建突变基因 → 导入受体细胞表达 → 检测突变蛋白性能 二、蛋白质工程的两大操作策略 1. 定点突变（理性设计） （1）概念 在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列，称为基因的定点突变。 （2）原理 • 根据对蛋白质结构与功能关系的了解，精确设计需要改变的氨基酸位点 • 在DNA水平上定向改造该位点的编码序列 （3）实施方法——PCR介导的定点突变 基本流程： 1　 人工化学合成突变引物（含设计好的突变序列）和正常引物 2　 以目的基因为模板进行PCR扩增 3　 突变引物与模板DNA不完全互补→在特定位置引入突变 4　 获得含突变序列的完整突变基因 5　 将突变基因导入受体细胞表达→获得突变蛋白 关键要点： 要点 说明 突变引物的设计 含有需要改变的碱基序列，与模板DNA在突变位点处不完全互补 引物长度 通常为20个碱基左右 适用条件 目的基因编码序列较短时可直接化学合成突变基因；较长时用PCR方案更经济 核心优势 精确、定向，只改变目标位点 （4）经典案例 案例 改造内容 效果 单体速效胰岛素（赖脯胰岛素） 将人胰岛素B链第28位脯氨酸和第29位赖氨酸的顺序互换 不再聚合成多分子→降血糖速率大为提高 L-天冬酰胺酶 将某位赖氨酸更换为丙氨酸 免疫原性下降2.5倍，活性不变（降低过敏反应） t-PA突变蛋白（TNK型） 将第84位半胱氨酸定点突变为丝氨酸 体内半衰期延长、溶栓特异性提高、颅内出血倾向大幅降低 2. 定向进化（非理性设计） （1）概念 在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列，再通过筛选获得所需突变蛋白，称为基因的定向进化。 （2）基本流程 特定基因 → 体外随机突变（如低保真度DNA聚合酶进行PCR） → 构建随机突变基因库 → 导入受体细胞表达 → 一系列随机突变蛋白 → 根据需求筛选 → 获得具有特定优良功能的突变蛋白 （3）与定点突变的比较 比较项目 定点突变 定向进化 突变方式 定向、精确（改变特定位点） 随机（随机改变任一位点） 前提条件 需要了解蛋白质结构与功能的关系 不需要预知结构功能关系 筛选过程 通常不需要大规模筛选 需要大量筛选突变蛋白 适用场景 已知关键氨基酸位点时 不清楚哪些位点需要改变时 本质 理性设计 模拟自然进化（缩短进化时间） （4）诺贝尔奖关联 2018年诺贝尔化学奖授予在蛋白质定向进化领域作出杰出贡献的三位科学家： • 阿诺德（F. H. Arnold）：发展了随机突变和杂交基因片段的定向进化技术 • 史密斯（G. P. Smith）和温特（S. G. P. Winter）：创建了噬菌体展示技术，用于一次性筛选大量随机突变或全新设计的蛋白质 三、蛋白质工程与基因工程的比较 比较项目 基因工程 蛋白质工程 别名 重组DNA技术 第二代基因工程 操作水平 DNA分子水平 DNA分子水平 目的基因 天然存在的基因 经改造/设计的基因 产物 天然蛋白质 突变蛋白/全新蛋白 核心区别 天然基因的重组，产物的结构和功能基本不变 对基因进行设计和改造，获得性能更优的蛋白质 技术关系 蛋白质工程的基础 基因工程的延伸，需借助基因工程的技术手段 共同点 最终都需要通过受体细胞来表达目标蛋白 1. 蛋白质工程不是在蛋白质分子水平上直接操作，而是在基因（DNA）水平上改造基因→再由受体细胞表达出突变蛋白 2. 蛋白质工程必须以基因工程的基本技术为基础（获取突变基因→构建表达载体→导入受体细胞→筛选鉴定） 3. 直接对蛋白质分子进行改造不可行（蛋白质结构复杂、改造后无法遗传）；通过基因操作来改造更合理（可遗传、可大规模表达） 四、蛋白质工程的应用前景 应用领域 具体方向 医药 改造胰岛素（速效/长效）、t-PA（溶栓药）、L-天冬酰胺酶（降低免疫原性）、CAR-T细胞疗法 工业 改造工业用酶（提高热稳定性、耐有机溶剂性） 食品 提高食品中必需氨基酸含量 设计全新蛋白 根据蛋白质结构与功能关系，设计制造自然界不存在的全新蛋白质 分层专练·靶向攻关 基础通关 1．（24-25高一上·上海·期中）通过特定的“工具”可以重新编辑细胞中的遗传信息，以此改变细胞的生物学性状的技术是（    ） A．生态学技术 B．基因编辑技术 C．杂交水稻技术 D．发酵工程技术 2．（21-22高一上·上海·期中）通过特定的“工具”可以重新编辑细胞中DNA的遗传信息，以此改变细胞的生物学性状的技术是（    ） A．转基因技术 B．基因编辑技术 C．杂交水稻技术 D．发酵工程技术 3．（23-24高三上·上海·期末）抗体酶又称催化抗体，是一类免疫球蛋白，其结构如下图所示，它既具有相应的免疫活性，又能像酶那样催化某种化学反应。下列有关叙述错误的是（    ） A．抗体酶与抗原、底物的结合均具有专一性的特点 B．抗体酶可使药物的前体物质在肿瘤组织中水解为活性分子，从而起杀伤作用 C．抗体酶能阻止病毒与靶细胞结合的机理可能是选择性地使病毒外壳蛋白发生水解 D．可通过蛋白质工程对特异抗体的抗原结合位点进行空间改造，使其获得催化功能 （23-24高三上·上海·阶段检测）蛋白质工程，在现代分子免疫学研究和药物研发和改进领域被科学技术人员坚持应用和发展，在对于目标蛋白筛选和鉴定环节，也衍生出了如噬菌体展示技术等方式：根据材料，完成下列小题 4．下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是（　　） A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作 B．蛋白质工程可以创造出自然界不存在的新类型蛋白质 C．蛋白质工程的操作，摆脱了自然界关于遗传信息在生物大分子上传递的规律 D．蛋白质工程产生的蛋白质类药物比基因工程药物更安全，可直接用于治疗患者 5．下图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述正确的是（　　） A．代表蛋白质工程操作思路的过程是①④⑤ B．可以运用重组DNA技术来实现的环节是①② C．①代表DNA复制，②③代表转录和翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA合成 D．蛋白质工程是对基因的组合类型进行定向设计，并通过实验室条件下的基因重组来实现 6．干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．图中新的干扰素基因必须插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间才能表达 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中各项技术环节中，有些需要通过基因工程实现 7．噬菌体展示技术（如下图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　） A．建立噬菌体展示库需限制性内切核酸酶和耐高温DNA聚合酶 B．可利用抗原-抗体杂交技术筛选目标蛋白 C．可用细菌细胞作宿主培养噬菌体 D．该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因 8．（24-25高二下·上海黄浦·期中）口服α-干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。其中，如图中a、b、c、d是引物，表格中为限制酶的切割位点。 （1）（多选）过程①所需的引物是________。 A．a B．b C．c D．d （2）在常规PCR的每一轮扩增反应中，温度随时间的变化顺序是________。 A． B． C． D． （3）（多选）过程②中，将干扰素基因插入Ti质粒时应该选择________限制酶进行酶切。 A．Bcl Ⅰ B．Kpn Ⅰ C．Sac Ⅰ D．Sau3A Ⅰ （4）（多选）在过程③后培养农杆菌时，加入氨苄青霉素可以筛选出________。 A．未导入任何载体的农杆菌 B．导入过表达载体的农杆菌 C．导入“空载”载体的农杆菌 （5）过程④中检测人参愈伤组织细胞是否合成干扰素可以用________方法。 A．同位素标记 B．分光光度法 C．抗原抗体杂交 D．显微观察法 （6）（多选）该基因工程中选用人参愈伤组织而不用人参的其他细胞，可能是因为愈伤组织________。 A．全能性高，便于植株再生 B．分裂旺盛，便于基因整合 C．结构松散，便于农杆菌接触 D．含抗性基因，便于多次筛选 （7）（多选）上述基因工程的理论依据是不同生物________。 A．细胞结构相同 B．DNA双螺旋结构相同 C．都遵循中心法则 D．共有一套遗传密码子 （8）（多选）利用PCR技术进行定点突变可以实现对干扰素基因进行改造，其过程如下图所示。下列分析正确的是________。 A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果 B．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD C．①过程需要先加热至95℃后再冷却至55～68℃ D．利用定点突变技术对GFP基因改造改变蛋白活性属于蛋白质工程 （9）AI模型AlphaFold3可以实现对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，使蛋白质工程取得了极大的进展。下列叙述错误的是_______。 A．AI可通过基因序列预测蛋白质的空间结构 B．AI可基于已有的科研数据构建结构与功能相匹配的蛋白质模型 C．AI与蛋白质工程结合，可以设计自然界不存在的新蛋白质 D．AI设计的蛋白质通常在细胞外合成，不需要对基因进行操作 （25-26高三下·上海·阶段检测）B型血友病患者因缺乏凝血因子Ⅸ(FIX）导致凝血功能障碍。FIX是一种由416个氨基酸构成的蛋白质。某腺病毒（AAV）是一种单链DNA病毒，野生型AAV无致病性、免疫原性弱、复制缺陷，需要辅助病毒进行复制，可作为B型血友病基因治疗的载体。其治疗过程如图1与图2所示。 9．根据题干信息和所学知识，对下列说法进行判断，正确的是_______。【单选】 A．B型血友病症状可以服用FIX缓解 B．AAV可在宿主细胞内独立复制 C．AAV内嘌呤数目和嘧啶数目相同 D．重组AAV病毒具有感染人体细胞的能力 10．B型血友病基因治疗中的目的基因为___________，其被导入受体细胞后利用___________（填“病毒基因”或“受体细胞基因”）编码的RNA聚合酶进行转录。 11．图8中HEK293细胞是人的某种细胞，体外培养时需要提供条件包括___________（编号选填） ①    ②37℃左右的温度    ③抗生素 ④偏酸性的pH    ⑤动物血清    ⑥含有营养物质的合成培养液 12．A、B、C、D（单链DNA片段）可选取作为PCR引物的是___________。【多选】 13．B型血友病与多个突变位点有关。一些显性突变基因无功能，且干扰正常等位基因产物的功能。对于此类B型血友病，下列预防或治疗措施有效的是_______。【多选】 A．孕期B超检查 B．基因检测 C．在患者体内注射针对显性突变基因表达产物的单克隆抗体 D．基于RNA干扰技术，在病变组织细胞中阻断突变基因表达 科研人员以进一步改造后的腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。该腺病毒复制需要E1、E2、E3基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，过程如图所示。PacI、EcoRI、BamHI、PmeI表示相关限制酶的酶切位点。 14．科研人员将S基因用___________（具体名称）酶切后，用DNA连接酶连入质粒Ⅱ，导入大肠杆菌。用添加___________的培养基筛选，将含S基因的重组质粒Ⅱ，用___________（具体名称）酶切后，获得改造后的腺病毒DNA，将其导入A细胞，A细胞自身需含有___________（填“E1”、“E2”或“E3”）基因，最终实现腺病毒在A细胞内的复制。 15．综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点______________________。 （2026·上海金山·二模）科学家通过基因编辑技术将热休克元件（Hse，一段保守的DNA调控序列）靶向插入番茄细胞L5基因（编码细胞壁转化酶）的启动子特定位置，从而培育出抗热胁迫番茄，具体过程如图所示（图中A-G代表物质或结构，①-⑦代表步骤）。 16．图中A代表（　　）（单选） A．Hse B．L5基因 C．含Hse的L5基因片段 D．含Hse的L5基因启动子片段 17．图中Cas9的功能类似于（　　）（单选） A．RNA聚合酶 B．DNA连接酶 C．DNA聚合酶 D．限制性内切核酸酶 18．除了DNA连接酶外，过程②还需加入表3中的________。（编号选填） 表3 序号 酶的种类 识别序列和切割位点 ① XbaⅠ 5’-T\downarrowCTAGA-3’ ② HindⅢ 5’-A\downarrowAGCTT-3’ ③ BclⅠ 5’-T\downarrowGATCA-3’ ④ Sau3AⅠ 5’-\downarrowGATC-3’ 19．若用PCR技术检测Hse是否成功导入农杆菌，图7所示引物①～④中应选用的引物是________。（编号选填） 20．下列对于C的表述正确的是（　　）（多选） A．细胞分化程度较低 B．不同细胞的基因组成差异较大 C．细胞增殖能力较低 D．不同细胞表达的基因差异较小 21．①-⑦过程中需要严格控制激素种类和比例的是________。 22．图中使用到的生物技术有________。（编号选填） ①植物组织培养技术②植物细胞融合技术③细胞核移植技术 ④重组DNA技术⑤蛋白质工程技术 热胁迫会导致果实因能量不足而减产。研究发现通过对L5基因的编辑可以缓解此现象，表4为热胁迫环境下基因编辑前后相关数据检测结果。 表4 番茄叶片 番茄果实 L5表达量 有机物积累量（g） 净光合速率（molCO2·m-2·s-1） L5表达量 蔗糖含量（g） 重量（g） 编辑前 +++ 46.73* 9.77 + 18.63 25.21 编辑后 + 23.19 9.69 +++ 35.33* 36.67* 注：+的数量代表基因表达量，*代表差异显著。 23．根据题干和表4信息推测，Hse对L5基因的表达的影响是（　　）（单选） A．促进L5基因的表达 B．调整不同部位L5基因的表达水平 C．抑制L5基因的表达 D．改变了L5基因表达合成的酶结构 24．根据以上信息，推测通过基因编辑技术将Hse插入番茄L5基因启动子后，番茄抗热胁迫的机理。 情境应用 25．（2025·上海杨浦·模拟预测）包括基因治疗在内的物种性状改良都依赖于将目的基因准确整合至染色体 DNA 中。最近研究人员开发了一种“指哪打哪”的基因定点导入技术 (STITCHR）。该技术由两部分构成， 第一部分为 CRISPR-Cas系统， 后者需要两种试剂： Cas9和sgRNA。其中 Cas9的两个活性部位分别切割DNA 的两条链，但需要sgRNA 将Cas9 引导至 DNA 的特定位点。 （1）根据所学知识判断，sgRNA将Cas9引导至 DNA 特定位点涉及 。 A．转录 B．基因重组 C．逆转录 D．碱基互补配对 （2）根据题干信息判断，下列有关Cas9与限制酶的相同点，正确的是 。 A．均催化磷酸二酯键的断裂 B．均能特异性识别DNA 双链 C．均能催化碱基间氢键的断裂 D．催化产物均为双链DNA片段 STITCHR 技术用到的Cas9是一种经过定点突变后的蛋白（nCas9），即第840位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸。 （3）下图为Cas9基因的编码链，请据此选择合适的PCR 突变引物_______。（编号选填） 参考密码子： 组氨酸（CAC）、丙氨酸（GCC） （第840位密码子的编码序列用下划线表示） ①5’ CTGTATGGGCCG3’ ② 5'CGGCCCATACAG3' ③5’ ATGCTAGGCGAG3’  ④5’ GAGTATGCCGCT3’ （4）本案例中的定点突变与自然界基因突变的结果相比，区别在于 。 A．基因表达的步骤是否改变 B．mRNA 的序列是否一定改变 C．基因的核苷酸序列是否一定改变 D．蛋白质中氨基酸的序列是否一定改变 就像联会时的交叉互换，两个 DNA 分子若含有同源序列。可发生重组。STITCHR 的第二部分是一种转座子（如R2Tg等），含有表达促进DNA 导入的蛋白质的基因。通过Cas9切开的切口，R2Tg 可将其携带的目的基因高效准确插入染色体 DNA。STITCHR 的构建原理如图。 （5）为确保目的基因的定点导入，需要预先通过PCR 将与染色体DNA 同源的序列接在 。 A．启动子两侧 B．nCas9基因两侧 C．目的基因两侧 D．sgRNA 基因两侧 （6）欲确定目的基因能否导入染色体DNA 的特定区域，需要借助凝胶电泳技术对各细胞中的表达载体进行鉴定。为此，作为对照组的细胞应含 。 ① 表达载体1② 表达载体2③ 表达载体3 A．② B．①+③ C．②+③ D．①+②+③ （7）结合实验原理，分析图中下列表达载体在受体细胞中的信息传递情况，发生请打“✔”，不发生请打“×”。 表达载体1 表达载体3 转录 _______ _______ 翻译 _______ _______ （8）如图所示的实验程序需要培养动物细胞。下列有关培养条件的表述，正确的是 。 A．培养箱内需保持无菌环境 B．细胞需经历原代和传代培养 C．通常采用37℃的恒温培养环境 D．需通入5%CO₂维持培养基pH稳定 26．（25-26高三下·上海·阶段检测）人乳头瘤病毒（HPV）是一类专门感染人皮肤及黏膜上皮细胞的DNA病毒。当少量HPV入侵人体皮肤细胞时，人体不表现出明显症状，但当人体持续感染HPV时会诱发宫颈癌，具体过程如图1所示（“+”表示促进，“-”表示抑制）。 （1）图1中细胞I表示________（单选）。 A．T淋巴细胞 B．B淋巴细胞 C．抗原呈递细胞 D．辅助性T细胞 （2）当少量HPV入侵后，一定发生的过程有________（多选）。 A．物质a的分泌增加 B．细胞I的免疫应答增强 C．Thl细胞数量增加 D．浆细胞的识别能力增强 研究人员发现，有一种名为XRCC2的启动子在正常细胞中活性很低，而在肿瘤细胞中却有高活性。利用该特性，研究人员结合DTA基因（白喉毒素A基因，其表达产物能够杀死细胞）开展实验，过程如图2，如表为部分限制酶的识别序列和酶切位点，图3为XRCC2启动子的序列。 NheⅠ 5'-G↓CTAGC-3' EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' KpnⅠ 5'-GGTAC↓C-3' XbaⅠ 5'-T↓CTAGA-3' AgeⅠ 5'-A↓CCGGT-3' HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3' （3）据图2分析，上述过程中，XRCC2-DTA的构建需要的工具有___________（编号选填）。 ①NheⅠ②AgeⅠ③KpnⅠ④EcoRⅠ⑤XbaⅠ⑥HindⅢ⑦DNA连接酶⑧DNA聚合酶 （4）综合上述信息，为大量获得XRCC2启动子，应设计的2条引物序列是__________________、__________________（写出10个碱基）。 （5）成功导入重组质粒的大肠杆菌应具备的特性是______（单选）。 A．仅具备卡那霉素抗性 B．仅具备四环素抗性 C．同时具备卡那霉素和四环素抗性 D．均不具备卡那霉素和四环素抗性 （6）结合已有知识，关于图2中培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的叙述正确的是_______（多选）。 A．3个培养基均需要经过灭菌处理 B．培养基Ⅰ和Ⅲ需要加入一定量的抗生素 C．培养基Ⅰ和Ⅲ的配方是一样的 D．培养基Ⅱ的作用是实现大肠杆菌的扩增 （7）此实验中涉及的生物技术有_______（多选）。 A．细胞融合 B．细胞核移植 C．转基因技术 D．动物细胞培养 实验者通过电转化法分别将0、0.05μg、0.1μg的培养基Ⅱ产物导入不同肿瘤细胞中，结果如图4。 （8）图中实验结果能否说明相较于正常细胞，XRCC2启动子能特异性杀伤肿瘤细胞，并说明理由：__________________________________________________________________。 （25-26高二下·上海松江·阶段检测）炎症性肠病（IBD）的检测目前多依赖于侵入性肠镜，患者不适感强且无法实现动态监测。科学家通过改造益生菌，使其能在感知到肠道炎症标志物硫代硫酸盐时表达声学报告基因（ARG）产生气囊，被超声无创成像，实现肠道炎症原位、无创、可视化检测。相关原理如图1所示。 【益生菌的选择与培养】 大肠杆菌Nissle1917（EscherichiacoliNissle1917，简称EcN）被选作开发此传感器的益生菌。 27．选择EcN的理由可能包括________（编号选填） ①安全无致病性    ②肠道适应性强    ③抗原性较强    ④易基因工程改造 28．使用MAC培养基培养EcN时会形成红色菌落，该培养基成分及作用如表。 成分 作用 胆盐、结晶紫 抑制杂菌生长 乳糖 为发酵产酸提供原料 中性红 pH指示剂，产酸时变为红色，否则无色 蛋白胨、琼脂 提供营养与固体支持 MAC培养基属于________（编号选填） ①天然培养基②合成培养基③固体培养基④通用培养基⑤选择培养基⑥鉴别培养基 【益生菌的改造】 科学家通过Gibsonassembly技术构建了图1所示的同时含有S基因、R基因和ARG基因的表达载体，该技术的原理如图2所示。 29．PCR扩增A、B两个双链DNA片段时，为使它们产生图2所示的重叠末端，应在结合________（编号选填）的引物________（编号选填）添加同源序列。 ①a1②a2③b1④b2⑤5′端⑥3′端 30．据图2，配制Gibsonassembly反应体系时，除从5′端逐个切下核苷酸的酶外，还应添加________（编号选填） ①DNA解旋酶    ②限制性内切酶    ③DNA聚合酶    ④DNA连接酶 31．为实现图1所示过程，S基因和R基因均应选择________（编号选填）的启动子；ARG基因则应选择________（编号选填）的启动子。 ①始终表达②仅在硫代硫酸盐诱导下表达 【传感器的优化】 研究者考虑引入Bxb1酶系统，可在感应硫代硫酸盐后，表达Bxb1酶，催化attB与attP位点之间的不可逆重组，改变P7启动子的方向（图3）。 32．相较图1，你是否赞同图3所示的改造？阐述理由。 33．按照图3的思路，若要同时实现肠道炎症的无创超声诊断与抗炎治疗，还需添加的模块是________（单选） A．attB-抗炎蛋白基因-attP-P7 B．attB-P7-attP-抗炎蛋白基因 C．attB-attP-P7-抗炎蛋白基因 D．attB-P7-抗炎蛋白基因-attP 34．（2025·上海崇明·二模）研究人员利用基因编辑技术对大豆细胞中的基因L进行如图1所示的改造，成功培育出耐盐碱大豆品系。该基因编辑技术的主要原理：在载体上插入靶向大豆基因L的向导DNA序列，该序列的转录产物可引导核酸酶特异性结合基因L上的目标序列并使其突变（图2）。 （1）利用该技术获取突变基因时，与基因L发生特异性结合的是__________。 ①向导DNA序列②与向导DNA配对的RNA序列③核酸酶基因④核酸酶⑤限制性内切核酸酶 （2）构建图1所示重组质粒需要的工具酶有____________。 （3）培养基Ⅰ和培养基Ⅱ中需要添加__________。 A．卡那霉素 B．氨苄青霉素 C．生长素 D．细胞分裂素 （4）结合题意，培育耐盐碱大豆品系涉及的技术有_________。（编号选填） ①微生物分离与培养②植物组织培养技术③植物细胞融合技术④修饰改造天然蛋白⑤设计制造全新蛋白⑥无菌技术 为了检验基因编辑是否成功，从培养基Ⅱ中挑选4株大豆（2n=40）样本提取DNA，通过PCR扩增目标基因L，选用图3中合适的限制酶对PCR产物完全酶切后的电泳结果如图4所示。 BamHI:5'-G1GATCC-3' EcoRI：5＇-GlAATTC-3＇ SacI：5＇-GAGCTIC-3＇ 图3 株1    株2   株3   株4 图4 （5）PCR扩增正常基因L与突变基因L的过程中相同的是_______。 A．引物 B．产物 C．DNA模板 D．基本程序 （6）结合图2、图3和图4，实验中选用的限制性内切核酸酶是_________；其中纯合的突变植株是___________；植株1和3杂交得到纯合突变植株的概率为______。 （7）科研人员欲通过人工化学方法直接合成与突变基因L配对的RNA，将其导入大豆细胞内以提高作物耐盐碱的性状。请结合中心法则说明基因编辑和人工导入RNA两种方案的优劣__________。 35．（25-26高二下·上海·期中）戈壁异常球菌对伽马射线、紫外线和干旱等损伤因子表现出极强的抗性，科学家将来自戈壁异常球菌的Csp2基因导入玉米中，以期提高玉米的抗旱能力，相关操作流程如图1。 （1）戈壁异常球菌与玉米植株细胞共有的细胞结构有_______。 A．质膜 B．染色体 C．核糖体 D．内质网 （2）为了获取足量的Csp2基因，常用_______进行扩增。 A．稀释涂布平板法 B．扩大培养 C．PCR D．凝胶电泳 （3）构建重组Ti质粒是培育转基因抗旱玉米的核心步骤，该过程需要使用的工具酶包括_______。 A．解旋酶 B．限制酶 C．DNA连接酶 D．DNA聚合酶 （4）图2为Ti质粒结构示意图，为确保目的基因成功转入植物细胞并正确表达，切割该质粒应选用的限制酶是______。 注：①T-DNA为可转移的DNA，导入相关菌株并侵染植物细胞后，T-DNA可被整合到该细胞的染色体上；②Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因；③Pst Ⅰ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ为限制酶识别位点 A．Pst Ⅰ、Kpn Ⅰ B．Pst Ⅰ、Hind Ⅲ C．Hind Ⅲ、BamH Ⅰ D．BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ （5）图1中①菌和②技术分别为_______。 A．枯草芽孢杆菌、植物组织培养 B．枯草芽孢杆菌、植物体细胞杂交 C．根瘤农杆菌、植物组织培养 D．根瘤农杆菌、植物体细胞杂交 （6）将重组Ti质粒导入①菌后，需按图3所示流程筛选成功导入重组Ti质粒的①菌。图3中①过程接种方法是______（编号选填）。除营养物质外，培养皿A、B、C中还应分别应添加_______、_______、_______（编号选填），目标菌落为______（选填图3中菌落对应数字） ①平板划线法 ②稀释涂布平板法 ③琼脂 ④氨苄青霉素 ⑤四环素 ⑥氨苄青霉素抗性基因 ⑦四环素抗性基因 （7）关于转基因抗旱玉米的筛选与检测环节，下列叙述正确的是_______。 A．若能在转基因玉米细胞中检测到Csp2基因，则说明该基因工程项目获得成功 B．可对转基因玉米细胞中Csp2基因的mRNA和Csp2蛋白水平进行检测 C．可对干旱条件下转基因玉米的光合速率、相对含水量等生理指标进行检测 D．可检测正常浇水和干旱条件下转基因玉米的存活率，并与野生型玉米进行对照 （8）通过图1流程得到以下三种类型的转基因抗旱玉米植株（线条表示2对同源染色体，圆点表示Csp2基因在染色体的整合位点，且成功整合的Csp2基因均能正常表达抗旱性状）。下列说法中不正确的是_______。 A．若自交产生的子一代中抗旱植株比例为75%，则Csp2基因的整合位点属于类型Ⅲ B．Ⅰ和Ⅱ杂交产生的子一代中抗旱植株比例为100% C．Ⅱ和Ⅲ杂交产生的子一代中不抗旱植株比例为1/8 D．Ⅰ和Ⅲ杂交产生的子一代中抗旱植株比例为100% 素养提升 1.（2026·上海徐汇·二模）咖啡酸是一种具有消炎、抗癌作用的天然化合物，在酵母菌中，因为缺少HpaB和HpaC两种酶而无法合成。科研团队通过PCR等技术获得了目标序列A与HpaC基因的融合片段（见图1），将该片段插入图2所示的结构中得到同时含有HpaB和HpaC基因的重组质粒。利用大肠杆菌扩增重组质粒后，将其导入酵母菌从而高效生产咖啡酸。 （1）据图1、2推测，目标序列A最有可能是 A．复制起点 B．HpaB基因 C．真核生物启动子 D．原核生物启动子 （2）据图1分析，“混合”后的PCR过程中，形成融合片段用到的DNA单链为 A．单链① B．单链② C．单链③ D．单链④ （3）将重组质粒导入大肠杆菌后，为了便于筛选目标大肠杆菌，融合片段应该插入图2中的 （选填图2中的编号）；所筛选出的目标大肠杆菌具有的特点为_______（编号选填） ①具有氨苄青霉素抗性 ②不具有氨苄青霉素抗性 ③在含X-gal培养基上无法生长 ④在含X-gal培养基上为蓝色菌落 ⑤在含X-gal培养基上为白色菌落 （4）为确定扩增后的重组质粒上同时含有HpaB和HpaC基因，可以采用的方法有____ A．对重组质粒进行基因测序 B．对重组质粒上的特定片段进行PCR C．酶切重组质粒后检测DNA片段长度 D．检测大肠杆菌中这两种基因的表达量 将构建的重组质粒导入酵母菌后，相关合成咖啡酸的代谢过程如图3所示。 （5）图3中“■”代表的物质是____ A．丙酮酸 B． C． D．ADP （6)据图3和所学知识判断，下列关于培养该酵母菌的说法，合理的是____ A．使用液体YPD培养基进行培养 B．培养基中葡萄糖需经过滤除菌后加入 C．使用平板划线法对酵母菌进行计数 D．培养结束测定咖啡酸含量时需无菌操作 （7)据图3和所学知识判断，下列措施中，能够提高咖啡酸产量的有____（编号选填） ①促进色氨酸的合成②抑制ARO酶基因的表达③提高FjT酶活性④降低多糖合成酶活性⑤增加葡萄糖转运蛋白数量⑥及时移出产物咖啡酸 （8）导入重组质粒的酵母菌经过一段时间的培养后，发现咖啡酸产量明显低于预期，并在细胞内检测到大量的对香豆酸。请针对这一现象，提出一个基于蛋白质工程的优化方案，包含但不限于采取策略，操作对象，使用方法，改造方向等___________。 （2026·上海闵行·二模）抗性淀粉是一种难以在小肠消化吸收的淀粉，食用后血糖升糖慢，对糖尿病患者友好。研究团队想通过改造SBE酶（淀粉分支酶）以提升水稻中抗性淀粉的含量。图1显示了水稻中抗性淀粉合成的相关途径。 2．结合图1分析，水稻中合成的直链淀粉和支链淀粉________。（多选） A．元素组成不同 B．空间结构不同 C．所需酶不同 D．产生量不同 研究团队利用CRISPR/Cas9系统对水稻SBE酶的SBE基因进行编辑，部分操作过程如图2所示。 3．构建gRNA表达盒的关键技术是引入靶点序列。结合图2分析，下列相关描述正确的是________。（编号选填） ①靶点应选择影响SBE酶功能的关键区 ②靶点的GC含量较高有利于精准编辑 ③引物应包含限制酶识别序列 ④退火时需要DNA聚合酶 4．gRNA表达盒转录形成的gRNA，一部分与SBE基因结合，另一部分能结合Cas9蛋白。结合图2推测，gRNA骨架编码序列转录产物的作用是________。gRNA表达盒中相关元件的正确排序是：启动子→________。（编号选填） ①与靶点序列碱基互补配对 ②结合Cas蛋白 ③gRNA骨架编码序列→靶点序列DNA片段 ④靶点序列DNA片段→gRNA骨架编码序列 5．图2的步骤Ⅰ和Ⅱ的培养基成分中，除生长所需的营养物质外，Ⅰ还需添加________，Ⅱ还需添加________。（编号选填） ①潮霉素    ②卡那霉素    ③生长素和细胞分裂素 研究人员对筛选到的两株SBE基因改变的突变体a和突变体b进行了基因测序，并预测了SBE酶的三维结构，如图3所示，其中框内部分为突变体a与野生型的差异区。下表显示野生型与这两种突变体水稻的部分检测数据。 样品 SBE酶的氨基酸数（个） 抗性淀粉含量（g/100g） 野生型 825 0.24 突变体a 824 1.53 突变体b 150 1.72 6．据题意，突变体水稻能合成而野生型水稻无法合成的物质是________。（编号选填） ①Cas9蛋白的mRNA    ②Cas9蛋白    ③gRNA    ④直链淀粉    ⑤蔗糖 7．根据表3中SBE酶的氨基酸数情况推测，突变体b可能发生________。（编号选填） ①碱基替换    ②碱基缺失    ③碱基插入 8．分析并阐述突变体a的抗性淀粉含量介于野生型和突变体b之间的原因。________ 9.（2026·上海松江·二模）超级细菌产生耐药性的一种机制是：细菌含氨苄青霉素水解酶基因，如KPC基因。研究发现，物质A可影响KPC蛋白（全长为293个氨基酸）的活性。 为探究物质A对KPC的影响，研究者表达KPC基因用于蛋白晶体结构解析及活性检测，KPC的结构如图1，质粒信息如图2，①-⑧代表酶切位点。为了便于蛋白结晶，研究者欲去除KPC中1-24及290—293位氨基酸，所用引物如图3，其中下划线处为限制性内切核酸酶NcoⅠ（5'-CCATGG-3'）和SalⅠ（5'-GTCGAC-3'）的识别序列，灰色部分为KPC基因中两端的部分碱基序列。（起始密码子为5'-AUG-3'，终止密码子为5'-UAA-3'） （1）青霉素滥用导致出现超级细菌的原因是____（编号选填）。 ①青霉素诱导细菌发生定向变异 ②青霉素诱导细菌发生不定向变异 ③青霉素对细菌进行了定向选择 ④青霉素对细菌进行了不定向选择 （2）为便于蛋白结晶，从下列研究者表达KPC基因可能涉及的步骤中，选择必须进行的操作编号并排序：____。 ①PCR扩增KPC基因的全长 ②PCR扩增部分KPC基因 ③构建表达载体 ④导入大肠杆菌 ⑤酶切PCR产物和质粒 ⑥筛选含重组质粒的大肠杆菌 （3)据上述信息，改造前、后的KPC，存在的差异有____（编号选填）。 ①多肽链的数目 ②氨基酸的数量 ③活性中心的氨基酸序列 ④活性中心的空间结构 （4）推测NcoⅠ的酶切位点最有可能位于质粒的____（用图2中的编号选填）。 （5）利用图3的引物进行PCR后，获得的产物总长度应为____bp。 （6）在设计引物1时，研究者在NcoⅠ识别序列与KPC基因序列之间，额外添加了5'-AT-3'。据所学知识推测，这一做法最可能的原因是____（单选）。 A．确保KPC基因能够复制 B．确保KPC基因能够转录 C．提高NcoⅠ的催化效率 D．确保翻译过程中密码子顺序正常 （7）改造前的KPC第289位氨基酸为甘氨酸。根据图3引物序列分析，甘氨酸的密码子是：5'-_____-3'。 （8）根据题意分析，将重组质粒导入大肠杆菌后，为了确保仅含重组质粒的菌落能生长，应选用的培养基是____（单选）。 A．液体通用培养基+氨苄青霉素 B．液体通用培养基+硫酸卡那霉素 C．固体通用培养基+氨苄青霉素 D．固体通用培养基+硫酸卡那霉素 （9）为确保大量发酵过程中质粒不丢失，发酵罐中应添加的成分及发酵应设置的条件有____（编号选填）。 ①琼脂②氨苄青霉素③硫酸卡那霉素④适度搅拌⑤通入无菌空气⑥加入消泡剂 KPC可催化CDC-1分解并释放荧光信号，荧光强度与酶活性呈正相关。为进一步研究物质A对KPC的作用，研究者开展了相关实验，结果如图4。 （10）KPC既能分解氨苄青霉素，也能分解CDC-1。据此可得____（编号选填）。 ①氨苄青霉素与CDC-1结构类似 ②氨苄青霉素与CDC-1均为KPC的抑制剂 ③氨苄青霉素与CDC-1结构不类似 ④氨苄青霉素与CDC-1均为KPC的激活剂 （11）研究者提高组2中CDC-1浓度至饱和后，发现荧光强度一直处于较低水平。据图4及所学知识判断，物质A影响KPC活性的机制符合图5中的哪一种，并说明理由____。 10．（2026·上海静安·二模）高产水稻 随着耕地的减少，提高作物产量是人类面临的一个重大课题。研究发现，一种名为PEL的调控因子可能在水稻维管束鞘细胞的叶绿体发育中发挥重要作用，从而提高水稻光合效率，获得高产水稻。为此，科研人员构建了PEL基因过表达植株来研究PEL的功能。左图是部分实验过程、右图是表达载体示意图，其中ori为复制原点，Hptr为潮霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。 （1）现在PEL基因的完整序列已知，那么过程I可采用的方法有_________。（编号选填） ①PCR        ②化学合成         ③大规模筛选 （2）为促进PEL基因高水平表达，需在表达载体中加入强效启动子。则该强效启动子的位置和转录方向最可能是______。（单选） A．m，顺时针 B．m，逆时针 C．n，顺时针 D．n，逆时针 （3）过程Ⅲ培养农杆菌时，加入卡那霉素可以筛选出_________。（编号选填） ①未导入任何载体的农杆菌 ②导入过表达载体的农杆菌 ③导入“空载”载体的农杆菌 （4）过程Ⅳ中，用水稻愈伤组织作为受体细胞而不用水稻的其他细胞，可能是因为愈伤组织__________。（多选） A．全能性高，便于植株再生 B．分裂旺盛，便于基因整合 C．结构松散，便于农杆菌接触 D．含抗性基因，便于多次筛选 （5）过程Ⅴ除了在培养基中加入潮霉素外，还经常加入头孢霉素。推测同时加入这两种物质的目的是__________。（单选） A．筛选成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 B．筛选成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 C．杀死成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 D．杀死成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 （6）过程Ⅵ获得PEL基因过表达植株的过程不会发生__________（多选） A．脱分化 B．再分化 C．细胞融合 D．细胞壁再生 （7）研究PEL的功能，除PEL基因过表达水稻作为实验组外，还应设计的对照组有__________。（多选） A．野生型水稻 B．野生型小麦 C．导入“空载”载体的水稻 D．PEL基因过表达的拟南芥 （8）除了上述方法外，获得水稻高产品种的方法还有很多，请根据已学知识提出两种不同的方法，并作出简要说明。_____________________________________________。 11.（2026·上海虹口·二模）B细胞淋巴瘤的免疫治疗 B细胞淋巴瘤是由B淋巴细胞生命进程异常引发的疾病。研究人员尝试通过制备“单抗”（单克隆抗体）和“双抗”（双特异性抗体）药物治疗该疾病，部分作用原理如图（a）所示。抗体分子包含Fab段和Fc段，Fab段中VH和VL共同构成抗原结合位点，部分结构如图（b）所示。研究发现，Fc受体和免疫活性物质a受体分别与相应分子结合后，可增强吞噬细胞的功能。（箭头表示作用方向） （1）与正常细胞相比，B细胞淋巴瘤细胞可能发生的变化有_______。（多选） A．细胞凋亡水平异常降低 B．细胞获得无限增殖的能力 C．细胞中原癌基因的表达水平异常升高 D．细胞中抑癌基因对细胞增殖起负调控作用 （2）若用细胞工程制备“单抗”，所涉及的生物技术有_______。（编号选填） ①细胞融合技术    ②原代培养技术    ③胚胎移植技术 ④显微注射技术    ⑤传代培养技术    ⑥细胞核移植技术 （3）欲利用基因工程制备图所示的“单抗”，若VL和VH编码序列中均含有X酶的识别序列，而载体含有Y酶和Z酶的识别序列。据题干信息，获取的目的基因是_______；PCR扩增产物的两端应包含_______。（编号选填）（注：上述限制性内切核酸酶识别序列各不相同） ①X酶的识别序列 ②Y酶的识别序列 ③Z酶的识别序列 ④抗CD20的抗体的VL编码序列 ⑤抗CD20的抗体的VH编码序列 ⑥抗TCR/CD3的抗体的VL编码序列 ⑦抗TCR/CD3的抗体的VH编码序列 ⑧分泌抗CD20的抗体的杂交瘤细胞总RNA逆转录成的DNA （4）在利用基因工程制备“双抗”的过程中，可依次采取的检测方法有_______。（编号排序） ①检测是否成功获得目的基因的表达产物 ②用限制性内切核酸酶切割重组DNA分子 ③检测目的基因的表达产物是否与抗原结合 ④用凝胶电泳法鉴定酶切后的DNA分子片段 （5）研究人员检测了用“双抗”治疗一段时间内实验动物的相关数据，如图所示。为保证药效，应保持血清中“双抗”浓度不低于_______。（用图中的编号选填） （6）请比较用“单抗”和“双抗”治疗B细胞淋巴瘤的效果，并据相关信息简述理由_____________________。 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $ 第18讲 基因工程和蛋白质工程 （上海专用） 分层专练·靶向攻关 基础通关 1．【答案】B 2．【答案】B 3．【答案】D 4．【答案】B 5．【答案】B 6．【答案】B 7．【答案】A 8．【答案】(1)BC (2)C (3)BC (4)BC (5)C (6)BC (7)BCD (8)ACD (9)D 9．【答案】D 10．【答案】 编码FIX的基因 受体细胞基因 11．【答案】②③⑤⑥ 12．【答案】B和C 13．【答案】BCD 14．【答案】 EcoRⅠ和BamHⅠ 氨苄青霉素 PacⅠ E3 15．【答案】重组腺病毒只能在A细胞中才能够复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因 16．【答案】D 17．【答案】D 18．【答案】①③ 19．【答案】③和② 20．【答案】AD 21．【答案】⑤和⑥ 22．【答案】①和④ 23．【答案】B 24．【答案】Hse基因插入后，番茄叶片的净光合速率基本不变，仅通过上调L5基因果实中的表达量，进而增大细胞壁转化酶活性，导致蔗糖积累增多，果实重量增加，从而缓解热胁迫导致的果实减产，提高产量稳定性 情境应用 25．【答案】(1)D (2)AD (3)①② (4)D (5)C (6)ABC (7) √ √ √ × (8)ACD 26.【答案】(1)C (2)ABC (3)①②⑤⑦ (4) 5'-GCTAGCGAGC-3' 5'-ACCGGTCTGC-3' (5)B (6)ABD (7)CD (8)不能。因为实验只展示了XRCC2启动子在肿瘤细胞中的杀伤效果，而没有展示其在正常细胞中的效果。 27．【答案】①②④ 28．【答案】①③⑤⑥ 29．【答案】 ①④ ⑤ 30．【答案】③④ 31．【答案】 ① ② 32．【答案】 参考示例1     支持。未引入Bxb1酶系统时，ARG基因为硫代硫酸盐诱导型表达，表达并不 持续，产生的气囊较少，检测灵敏度不高；引入Bxb1酶系统后，只需少量硫代硫酸 盐诱导便可表达BXb1酶(1分)，该酶催化attB和attP之间的重组，不可逆地改变 P7的方向、使ARG基因持续强烈表达，产生大量气囊，检测灵敏度显著提高。 参考示例2     不支持。未引入Bxb1酶系统时，ARG基因为硫代硫酸盐诱导型表达，只在肠道有炎症时超声成像：引入Bxb1酶系统后，只需少量硫代硫酸盐诱导便可表达Bxb1 酶，该酶催化attB和attP之间的重组，不可逆地改变P7的方向、使 ARG基因持续表达，持续产生大量气囊，即使在肠道炎症缓解后，超声成像仍显示 炎症，易造成误诊。 33．【答案】B 34.【答案】(1)②④ (2)限制酶Bsa Ⅰ和DNA连接酶 (3)ACD (4)①②④⑥ (5)AD (6) SacⅠ 株4 1/4 (7)基因编辑的对象是基因，需先在细胞核转录形成RNA后，再进入细胞质经翻译合成相关蛋白，一旦编辑成功，可遗传且通过基因表达一直发挥作用，但技术要求较高；RNA药物只需通过翻译即可合成相关蛋白，相对基因编辑见效可能更快，但发挥作用后会被降解，需要持续使用 35.【答案】(1)AC (2)C (3)BC (4)C (5)C (6) ② ③ ④ ⑤ 3、6 (7)BCD (8)A 素养提升 1.【答案】(1)C (2)AD (3) ⑥（④） ①⑤（②④） (4)ABC (5)C (6)AB (7)③④⑤⑥ (8)积累大量对香豆酸说明HpaB酶催化对香豆酸转化为咖啡酸的效率偏低，基于蛋白质工程的优化方案： 操作对象为HpaB基因，从预期提高HpaB酶对底物对香豆酸的催化活性出发，设计改造HpaB酶的空间结构，推导改造后所需的氨基酸序列，进一步得到改造对应的核苷酸序列，再通过定点突变技术改造原HpaB基因，将改造后的基因导入酵母菌，筛选得到能表达高活性HpaB酶的工程酵母，即可提高咖啡酸产量。（合理即可，符合蛋白质工程的基本思路即可） 2．【答案】BCD 3．【答案】①②③ 4．【答案】 ② ④ 5．【答案】 ② ①③ 6．【答案】①②③ 7．【答案】①②③ 8．【答案】根据图1可知，SBE活性降低时可合成较多的抗性淀粉，SBE活性与其空间结构密切相关，突变体a的抗性淀粉含量介于野生型和突变体b之间，推测突变体a的SBE酶活性介于野生型和突变体b之间，原因是突变体a的SBE三维结构与野生型相近，但与突变体b三维结构差异较大 9.【答案】(1)③ (2)②⑤③④⑥ (3)② (4)④ (5)812 (6)D (7)GGC (8)D (9)③④⑤⑥ (10)① (11)机制2；回答①：KPC可以分解CDC-1并发出荧光。当加入物质A后，即便CDC- 1浓度饱和，荧光强度依然处在低水平，可能的原因只有KPC在物质A 的作用下，活性中心结构改变，CDC-1难以与KPC结合。符合机制2。 回答②：KPC可以分解CDC-1并发出荧光。若是机制1，当加入物质A 后，它与CDC-1会争夺KPC的活性中心。因此，当CDC-1浓度饱和时， 应有一部分能够争夺到KPC的活性中心，使荧光增强，但这与实验现象 不符。 10.【答案】(1)①②。 (2)D (3)②③ (4)ABC (5)B (6)ACD (7)AC (8)杂交育种：将具有不同优良性状的水稻杂交，从后代中筛选出高产的水稻新品种。诱变育种：利用物理/化学诱变剂诱导水稻发生基因突变，从变异后代中筛选出高产变异株。 （或单倍体育种：取杂交后F1的花药离体培养，秋水仙素诱导染色体加倍，可快速获得纯合高产水稻；多倍体育种：诱导水稻染色体加倍，获得多倍体高产水稻） 11.【答案】(1)ABC (2)①②⑤ (3) ④⑤ ②③ (4)②④①③ (5)③ (6)双抗治疗效果优于单抗，原因是双抗可同时结合B细胞淋巴瘤细胞和CD8⁺T细胞，除了可激活吞噬细胞杀伤癌细胞外，还能诱导CD8⁺T细胞分化为细胞毒性T细胞，特异性杀伤B细胞淋巴瘤细胞 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $ 第18讲 基因工程和蛋白质工程 （上海专用） 第1部分 课标导向·考情铺垫 第2部分 三大核心·主干速记 核心1 基因工程的概念与应用； 核心2 重组DNA技术的操作流程； 核心3 蛋白质工程 第3部分 分层专练·靶向攻关 基础通关 / 情境应用/ 素养提升 课标导向·考情铺垫 课标导向 沪科版选择性必修3第3章，承接必修2“遗传与进化”的分子基础，与选修3第1章发酵工程、第2章细胞工程共同构成现代生物工程的核心知识体系。学习目标：① 阐述基因工程的概念，列举其理论基础和技术支撑（生命观念、科学思维）；② 准确描述重组DNA技术的三大基本工具及其功能（科学思维）；③ 完整概述PCR技术的原理与操作流程（科学探究）；④ 归纳基因工程四大操作步骤，理解各环节的原理与方法（科学探究）；⑤ 区分蛋白质工程与基因工程，理解定点突变和定向进化的基本策略（科学思维、科学探究）。 课标 本讲要求 课程性质 基因工程与蛋白质工程是现代生物工程的核心技术，属于“生物技术与工程”模块的重点内容，是分子生物学原理在实践中的应用与延伸。 核心素养 ①生命观念：理解DNA双螺旋结构和中心法则是基因工程的理论基础，领悟结构与功能相适应； ②科学思维：通过分析限制酶识别与切割的特异性、PCR原理，培养模型构建与逻辑推理能力； ③科学探究：掌握重组DNA技术四大基本步骤（获取→构建→导入→筛选），能对给定的基因工程项目提出合理的设计方案； ④社会责任：关注转基因产品的安全性、基因治疗的伦理问题，确立利用科学技术造福人类的价值观。 考情分析 基因工程是上海等级考的高频核心考点，几乎每年必考。命题常以综合题（含选择、填空、简答、图表分析）形式出现，分值高（通常占8～15分），综合性强。合格考侧重基础概念识记与简单应用。 考查方式：① 以基因工程操作流程为主线，考查限制酶选择、载体构建、转化方法、筛选鉴定等核心环节；② 以PCR技术为切入点，考查引物设计、扩增原理、电泳鉴定；③ 结合科学史（如人胰岛素生产、抗虫棉培育）创设情境；④ 蛋白质工程常以定点突变方案设计的形式考查，难度较高。 易混易错点 1 限制酶切割的是磷酸二酯键（而非氢键），DNA连接酶连接的也是磷酸二酯键； 2 用同种限制酶切割目的基因和载体才能产生相同黏性末端； 3 PCR中引物方向是5'→3'延伸，引物设计在目的基因的两端外侧； 4 抗药性筛选中注意插入灭活原理； ⑤ 蛋白质工程改造的是基因（DNA水平），不是直接改造蛋白质分子。 新高三复习建议 1. 读——精读教材第3章，重点关注：① 重组DNA技术四大步骤的原理与操作细节；② PCR技术的条件、过程与应用；③ 抗药性筛选法和显色筛选法的原理；④ 蛋白质工程与基因工程的区别与联系。 2. 做——完成课后自我评价题目和各区模拟卷中的基因工程综合题，练习限制酶切位点分析、引物设计、筛选方案书写。 3. 写——用流程图自主绘制“获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→筛选鉴定”的完整操作路线，规范书写每一步的原理和方法。 4. 联——将基因工程知识与必修2的DNA结构、复制、转录翻译，以及选修3的发酵工程（工程菌发酵生产）进行知识串联，形成“分子基础→技术手段→产业应用”的完整知识链。 三大核心·主干速记 核心1 基因工程的概念与应用 一、基因工程的概念 1. 基因工程的定义 基因工程是指将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状的工程技术。 • 由于重组拼接的基因和运载工具都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术 2. 基因工程的核心特征 特征 内涵 操作水平 DNA分子水平（分子水平操作） 操作环境 体外（试管中完成重组） 核心原理 基因重组（不同来源DNA的重新组合） 遗传特点 可遗传给后代，且能定向表达新性状 本质 不同物种间的遗传信息定向转移与重新组合 基因工程突破了物种间遗传信息交流的天然屏障（生殖隔离），使跨物种的基因定向转移成为可能。 3. 基因工程的地位 • 基因工程是现代生物工程的核心技术 • 发酵工程所用的微生物菌种、细胞工程所涉及的细胞株，很多都是采用基因工程技术改造过的 二、基因工程诞生的理论基础与技术支撑 1. 理论基础（三大理论突破） 时间 理论突破 对基因工程的意义 1944年 DNA是遗传物质（肺炎双球菌转化实验） 揭示了DNA可以从一种生物转移到另一种生物，是基因转移操作的先驱性工作 1953年 DNA双螺旋结构和中心法则 阐明了DNA复制、转录和翻译的机制及遗传信息流动方向，为提升目的基因的复制和表达水平奠定基础 1963—1966年 遗传密码的破译 认识到自然界所有生物共用一套遗传密码，为基因的鉴别和合成提供理论依据 2. 技术支撑（三项关键发明） 时间 技术突破 对基因工程的意义 1953年 发现质粒（细菌内的小型DNA） 为基因转移找到了运载工具（载体） 1970年 发现限制性内切核酸酶 为DNA的切割和基因的获取奠定了技术基础 1972年 实现DNA体外重组 首次在体外构建出第一个重组DNA分子 3. 基因工程的诞生标志 1973年，美国科学家考恩（S. N. Cohen）和博耶（H. W. Boyer）等人： • 在体外构建出含有四环素和青霉素两个抗性基因的重组DNA分子 • 将之导入大肠杆菌后，重组DNA分子能稳定复制 • 大肠杆菌表达出相应的抗生素抗性 • 由此宣告了基因工程的诞生 【拓展】 考恩和博耶的实验还证实：不同物种的细菌可以在实验条件下毫无障碍地进行“交流”，遗传物质DNA可以在保持其功能的前提下进行人为拼接。这一发现具有划时代的里程碑意义。 三、基因工程的广泛应用 1. 医学领域 应用实例 原理与意义 重组人胰岛素（1982年上市） 将人胰岛素基因导入大肠杆菌/酵母，实现大规模生产；取代动物胰岛素，避免免疫反应。是人类历史上第一个基因工程产品 重组乙肝疫苗（1997年我国批准） 将乙肝病毒表面蛋白基因转入酵母，酵母高效合成表面抗原蛋白作疫苗；彻底摆脱血液依赖，安全且可大规模生产 基因治疗（1990年首例） 对因腺苷脱氨酶基因（ADA）缺陷而患重度联合免疫缺陷病的儿童进行基因治疗，开创基因治疗新纪元 CAR-T细胞疗法（2017年FDA批准） 利用蛋白质工程改造T细胞受体，用于急性淋巴细胞白血病治疗（属于第二代基因工程应用） 2. 农牧业领域 应用实例 原理与意义 转基因抗虫棉 将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白基因导入棉花；棉铃虫取食后，碱性消化液将蛋白水解为毒性肽→消化道麻痹而死。我国拥有自主知识产权 抗除草剂大豆（1994年批准种植） 从矮牵牛中获得草甘膦抗性基因导入大豆；大田中喷洒草甘膦不影响大豆产量 转基因小鼠（1982年） 将大鼠生长激素基因转入小鼠，培育出体形雄健的转基因小鼠 3. 食品工业领域 应用实例 原理与意义 氨基酸生产 用基因工程改良谷氨酸棒状杆菌，大幅提高谷氨酸产量；全世界每年氨基酸总产量接近5×10⁶ t 转基因微生物发酵 转基因微生物规模化生产氨基酸、抗生素、柠檬酸、丙酮、丁醇等产品 基因工程应用的考查常结合实例分析，要求考生： ① 指出某应用中涉及的目的基因是什么； ② 说明该目的基因导入受体细胞后如何表达出新性状； ③ 分析该应用相较于传统方法的优势。 核心2重组DNA技术的操作流程 一、重组DNA技术的三大基本工具 1. 限制性内切核酸酶（“分子手术刀”） （1）概念与功能 • 来源：主要在细菌中发现（目前已有上千种） • 功能：识别双链DNA的特定序列，并在特定位置切割DNA分子 • 切割的化学键：磷酸二酯键（不是氢键！） （2）识别序列的特点 特点 说明 特异性 每种限制酶只识别一种特定的核苷酸序列 长度 通常为4～8个碱基对（bp） 回文结构 识别序列通常具有回文对称特征（正读和反读相同） 切割方式 在识别序列内部或两侧切断两条链 （3）典型实例 限制酶 识别序列 切割位点 产物特点 EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' G与A之间 产生黏性末端（5'端突出AATT） PstⅠ 5'-CTGCA↓G-3' A与G之间 产生黏性末端（3'端突出） ⚡关键提醒 - 不同限制酶切割后可能产生相同的黏性末端（如BamHⅠ：G↓GATCC 和 MboⅡ：↓GATC） - 黏性末端是单链突出，可通过碱基互补配对形成氢键“粘”在一起 - 限制酶只在识别序列处切割，不改变识别序列之外的DNA序列 （4）细菌的限制－修饰系统 • 限制酶：识别并切割“外源”DNA → 相当于“防御武器” • DNA甲基化酶：对自身DNA的识别序列中碱基进行甲基化修饰 → 保护自身DNA不被切割 • 二者协调表达，构成类似“先天性免疫”的防御机制 【核心素养：生命观念】限制酶必须在识别并结合DNA的特定序列结构后才能发挥切割功能，充分体现了生命大分子结构与功能之间的对应关系。 2. DNA连接酶（“分子缝合针”） （1）功能 • 封闭双链DNA分子中单链的“缺口” • 即连接一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的磷酸二酯键（共价键） • 使两个黏性末端牢固连为一体 （2）作用原理 • 黏性末端在低温下通过氢键“粘”在一起→但氢键不牢固 • DNA连接酶在氢键的基础上封闭缺口，形成共价连接的稳定重组DNA分子 ⚡易错 1　 限制酶切割磷酸二酯键→产生黏性末端 2　 黏性末端通过氢键“粘”在一起→不牢固 3　 DNA连接酶封闭磷酸二酯键的缺口→使连接稳定化 4　 DNA连接酶不能连接平末端（大多数类型） 3. 载体（“分子运输车”） （1）为什么需要载体？ • 目的基因（DNA片段）不具备独立自我复制的能力（缺少复制必需的特定DNA序列） • 需要载体为其提供在受体细胞中独立复制的能力 （2）载体的类型 类型 特点 举例 质粒 双链环状DNA，独立于拟核DNA自主复制；大多携带抗生素抗性基因 pBR322、pUC18/19 病毒DNA 能高效感染宿主细胞并自主复制 噬菌体、腺相关病毒、慢病毒等 （3）载体必须具备的条件 条件 原因 能在受体细胞中独立复制并稳定保存 保证目的基因可随载体一起扩增 具有一个或多个限制酶切位点 便于外源DNA的插入 具有标记基因 便于筛选含重组DNA的受体细胞 对受体细胞无害 不影响受体细胞的正常生命活动 4. 三大基本工具总结 工具 名称 作用 作用位点 限制性内切核酸酶 “分子手术刀” 切割DNA，获取目的基因和切开载体 磷酸二酯键 DNA连接酶 “分子缝合针” 将目的基因与载体连接形成重组DNA 磷酸二酯键 载体 “分子运输车” 携带目的基因进入受体细胞并提供复制能力 — 二、重组DNA技术的四大操作步骤 操作步骤概览 获取目的基因 → 构建表达载体 → 导入受体细胞 → 筛选和鉴定 （取） （切+接） （转+增） （检） 第一步：获取目的基因（“取”） 1. 目的基因的概念 目的基因是人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。例如：人胰岛素基因、伴孢晶体蛋白基因等。 2. 获取目的基因的方法 方法 适用条件 原理 PCR扩增 目的基因部分序列已知 体外DNA扩增，需已知两侧序列以设计引物 化学合成法 目的基因完整序列已知 按已知序列直接化学合成 大规模筛选 基因序列未知 构建基因文库，基于大规模筛选获得 PCR技术详解 （1）PCR的概念 聚合酶链式反应（PCR）是一项模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术，由美国科学家穆勒斯（K. B. Mullis）于20世纪80年代中期首创。 （2）PCR所需的条件 成分 作用 DNA模板 含有目的基因的DNA（提供扩增的模板链） 引物（2条） 人工合成的短单链DNA；分别与目的基因两端的模板链互补配对；决定扩增的特异性和范围 耐热DNA聚合酶（Taq酶） 催化从引物3'端延伸合成新链；来源于嗜热细菌（能在高温下保持活性） dNTP（四种脱氧核苷三磷酸） dATP、dCTP、dGTP、dTTP；合成新链的原料 缓冲液 提供适宜的pH和Mg²⁺等反应条件 （3）PCR的基本程序（三步循环） 步骤 温度 操作 原理 ① 变性 95℃ 双链DNA解旋为单链模板 高温破坏碱基间的氢键 ② 退火 55~68℃ 两条引物分别与两条单链模板互补结合 温度降低→碱基互补配对形成氢键 ③ 聚合（延伸） 约75℃ Taq酶从引物3'端催化合成新DNA链 DNA聚合酶催化磷酸二酯键形成 · 每完成一次“变性→退火→聚合”即为一个循环； · 重复n次循环，理论上从1分子双链DNA扩增为2ⁿ个分子 · 系统温度升降由PCR扩增仪自动完成 （4）PCR的关键要点 要点 说明 引物设计的前提 目的基因两侧序列已知（以便合成互补引物） 引物的方向 两条引物分别与两条模板链3'端区域互补，引导新链从5'→3'方向合成 耐热酶的必要性 每轮循环需95℃高温变性→普通酶会失活→必须使用耐热DNA聚合酶 退火温度的控制 温度过高→引物不能与模板结合；温度过低→引物与非目标序列结合→非特异性扩增 扩增倍数 n次循环后理论扩增2ⁿ倍 （5）PCR与体内DNA复制的比较 比较项目 PCR（体外） 体内DNA复制 场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内 解旋方式 高温（95℃）变性 解旋酶催化 引物 人工合成的短DNA 短链RNA引物 酶 耐热DNA聚合酶（Taq酶） 普通DNA聚合酶 温度 需经历95℃→55~68℃→75℃循环 恒温（体温） 结果 扩增特定DNA片段 复制整个基因组 第二步：构建表达载体（“切”＋“接”） 1. 操作原理 将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切割出黏性末端（“切”），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（“接”），形成含目的基因且能表达的表达载体。 2. 关键操作原则 原则 说明 用同种限制酶切割 目的基因和载体必须用同一种限制酶切割→产生相同的黏性末端→才能互补配对 也可用不同酶切割 两种识别序列不同但黏性末端相同的限制酶也可分别切割目的基因和载体 注意目的基因方向 目的基因能以正反两种方式接入载体，但大多数情况下只有一种方向正确 防止载体自连 载体两侧黏性末端相同→可能自我环化→形成空载质粒（非重组DNA） 3. 注意事项 • 如果用两种识别序列不同但黏性末端相同的限制酶分别切割目的基因和载体，连接后原来的限制酶识别序列会消失→不能用相应的限制酶重新“卸下”目的基因 • 目的基因两侧的黏性末端相同→能正反两种方式等概率接入载体 • 载体片段两侧的黏性末端也相同→可能自我环化（空载） ⚡命题 ① 选择合适的限制酶（分析质粒和目的基因上的酶切位点） ② 分析连接后重组DNA的类型（重组质粒、空载质粒、目的基因自连） ③ 判断目的基因插入方向是否正确 第三步：将DNA导入受体细胞（“转”＋“增”） 1. 转化的概念 将重组DNA分子导入受体细胞的过程称为转化。由于DNA很难自然进入细胞，需对受体细胞进行特殊处理以提高转化效率。 2. 转化方法 方法类型 具体方法 适用对象 原理 物理方法 电击法 微生物、动植物细胞 电脉冲在细胞膜上形成短暂孔道 物理方法 DNA显微注射 动物受精卵 用玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液 化学方法 CaCl₂法 微生物（大肠杆菌等） CaCl₂处理使细胞处于感受态，增加膜通透性 生物方法 农杆菌转化法 植物细胞 利用根瘤农杆菌感染植物细胞，将表达载体导入 生物方法 病毒感染法 动物细胞 利用动物病毒（如腺相关病毒）高效导入 3. 受体细胞的类型选择 受体类型 受体细胞 应用目的 微生物 大肠杆菌、酵母等 发酵生产基因工程产品（如胰岛素） 植物 愈伤组织/原生质体、生殖细胞或胚胎组织 培育转基因植物 动物 受精卵/早期胚胎细胞、生殖细胞、诱导性多能干细胞 培育转基因动物 4. 扩增 • 转化效率通常很低（10⁻⁴～10⁻²） • 转化后的细胞需经过一段时间培养，使筛选标记性状得以表达→这一过程称为扩增 第四步：筛选和鉴定含目的基因的受体细胞（“检”） 1. 为什么需要筛选？ • 只有少数细胞能接纳DNA分子 • 进入受体细胞的DNA分子可能含有空载质粒（不含目的基因） • 需要从大量细胞中快速、准确找到正确导入目的基因的细胞 2. 抗药性筛选法（以pBR322质粒为例） 前提条件：载体DNA携带抗生素的抗性基因（标记基因） pBR322质粒含两个标记基因： • Ampʳ（氨苄青霉素抗性基因） • Tetʳ（四环素抗性基因） 第一轮筛选： • 将转化扩增的细菌涂布在含氨苄青霉素（Amp）的固体平板上 • 能生长的菌落 → 含有质粒（Ampʳ未被破坏）→ 可能是重组质粒或空载质粒 第二轮筛选： • 将第一轮长出的菌落分别接种到含Amp和含Amp+Tet的平板上 • 若外源DNA插在BamHⅠ位点处（位于Tetʳ基因内部）→ Tetʳ基因被插入灭活 • 含重组质粒的克隆：AmpʳTetˢ → 只在Amp平板上生长 • 含空载质粒的克隆：AmpʳTetʳ → 在Amp和Tet平板上均能生长 插入灭活原理——外源DNA插入某个抗性基因内部→该抗性基因失活→利用这个特征区分重组质粒和空载质粒 3. 显色筛选法（以pUC18/19质粒为例） 标记基因：lacZ'基因 • lacZ'表达的酶蛋白可将无色化合物X-gal水解为蓝色产物 • 将外源DNA插在lacZ'基因内部的限制酶切位点处→lacZ'基因被插入灭活 筛选方法： • 将转化扩增的细菌涂布在含Amp和X-gal的固体培养基上 • 蓝色克隆→ lacZ'未被破坏→空载质粒 • 白色克隆→ lacZ'被插入灭活→重组质粒（含目的基因） 4. 两种筛选方法比较 比较项目 抗药性筛选法 显色筛选法 标记基因 抗生素抗性基因（如Ampʳ、Tetʳ） lacZ'基因 筛选原理 插入灭活→抗性丧失 插入灭活→酶失活→颜色变化 观察指标 菌落是否能在含抗生素培养基上生长 菌落呈现蓝色/白色 重组克隆特征 在Amp平板上生长，在Amp+Tet平板上不生长 在Amp+X-gal平板上呈白色 空载克隆特征 在Amp和Amp+Tet平板上均能生长 在Amp+X-gal平板上呈蓝色 5. 进一步鉴定 经筛选获得的含目的基因的受体细胞还需进一步鉴定： 鉴定方法 目的 PCR技术 确认目的基因是否成功插入载体 凝胶电泳 分析目的基因大小是否正确 基因表达产物分析 检测目的基因是否正确表达（蛋白质的结构和功能分析） 6. 凝胶电泳鉴定 要点 说明 原理 DNA带负电荷（磷酸基团）→通电后向正极泳动 分离依据 根据DNA分子的大小和结构将其分离开 介质 琼脂糖凝胶 结果观察 在紫外灯下观察DNA电泳条带 方向 DNA从负极→正极泳动（负极端上样） 三、转基因动植物的构建 1. 转基因动物 • 常用方法：DNA显微注射 • 受体细胞：受精卵（或早期胚胎细胞） • 操作流程： 1. 用激素使雌鼠超数排卵 2. 与雄鼠交配后取受精卵 3. 在倒置显微镜下用玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液 4. 将注射了DNA的受精卵移植到母鼠子宫发育 5. 繁殖转基因小鼠子代 • 也可用动物病毒（如腺相关病毒、慢病毒）作载体，通过病毒感染高效导入 2. 转基因植物 • 常用方法：农杆菌转化法（用含表达载体的根瘤农杆菌感染受体细胞） • 也可用含表达载体的植物病毒直接感染植物组织 • 由于植物的愈伤组织能再生出整株植物，转基因植物的构建比转基因动物更加简便 3. 转基因后的确认 • 使用PCR等技术确认转基因是否成功 • 确认目的基因在动植物体内是否正确表达 ⚡常考：重组DNA技术四大步骤简记：取→切接→转增→检 - 取：获取目的基因（PCR/化学合成） - 切接：构建表达载体（同种限制酶切+DNA连接酶接） - 转增：导入受体细胞+扩增培养 - 检：筛选鉴定（抗药性/显色筛选+PCR/电泳确认） 核心3蛋白质工程 一、蛋白质工程的概念 1. 定义 蛋白质工程是在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，对天然蛋白质进行理性改造，甚至可以设计并制造出全新的非天然蛋白，以满足人类生产与生活需求的工程技术。 • 蛋白质工程又称第二代基因工程 • 基因工程的产物是天然蛋白质（目的基因是天然存在的） • 蛋白质工程的产物是突变蛋白或全新蛋白（对基因进行了人为改造） 2. 蛋白质工程的必要性 天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，结构和功能适应特定物种的生存需求，但不一定完全符合人类需要： 问题 举例 营养成分不足 常规主食（水稻、玉米）中必需氨基酸（如赖氨酸）含量偏低 工业适应性差 工业用酶在高温和有机溶剂环境中容易失活 药物稳定性差 药物蛋白多肽在机体内半衰期短，需反复使用 功能缺陷 人胰岛素容易聚合，延缓降血糖作用 3. 蛋白质工程的基本思路 预期蛋白质功能 → 设计蛋白质结构 → 推测氨基酸序列 → 确定（改变）基因序列 → 构建突变基因 → 导入受体细胞表达 → 检测突变蛋白性能 二、蛋白质工程的两大操作策略 1. 定点突变（理性设计） （1）概念 在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列，称为基因的定点突变。 （2）原理 • 根据对蛋白质结构与功能关系的了解，精确设计需要改变的氨基酸位点 • 在DNA水平上定向改造该位点的编码序列 （3）实施方法——PCR介导的定点突变 基本流程： 1　 人工化学合成突变引物（含设计好的突变序列）和正常引物 2　 以目的基因为模板进行PCR扩增 3　 突变引物与模板DNA不完全互补→在特定位置引入突变 4　 获得含突变序列的完整突变基因 5　 将突变基因导入受体细胞表达→获得突变蛋白 关键要点： 要点 说明 突变引物的设计 含有需要改变的碱基序列，与模板DNA在突变位点处不完全互补 引物长度 通常为20个碱基左右 适用条件 目的基因编码序列较短时可直接化学合成突变基因；较长时用PCR方案更经济 核心优势 精确、定向，只改变目标位点 （4）经典案例 案例 改造内容 效果 单体速效胰岛素（赖脯胰岛素） 将人胰岛素B链第28位脯氨酸和第29位赖氨酸的顺序互换 不再聚合成多分子→降血糖速率大为提高 L-天冬酰胺酶 将某位赖氨酸更换为丙氨酸 免疫原性下降2.5倍，活性不变（降低过敏反应） t-PA突变蛋白（TNK型） 将第84位半胱氨酸定点突变为丝氨酸 体内半衰期延长、溶栓特异性提高、颅内出血倾向大幅降低 2. 定向进化（非理性设计） （1）概念 在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列，再通过筛选获得所需突变蛋白，称为基因的定向进化。 （2）基本流程 特定基因 → 体外随机突变（如低保真度DNA聚合酶进行PCR） → 构建随机突变基因库 → 导入受体细胞表达 → 一系列随机突变蛋白 → 根据需求筛选 → 获得具有特定优良功能的突变蛋白 （3）与定点突变的比较 比较项目 定点突变 定向进化 突变方式 定向、精确（改变特定位点） 随机（随机改变任一位点） 前提条件 需要了解蛋白质结构与功能的关系 不需要预知结构功能关系 筛选过程 通常不需要大规模筛选 需要大量筛选突变蛋白 适用场景 已知关键氨基酸位点时 不清楚哪些位点需要改变时 本质 理性设计 模拟自然进化（缩短进化时间） （4）诺贝尔奖关联 2018年诺贝尔化学奖授予在蛋白质定向进化领域作出杰出贡献的三位科学家： • 阿诺德（F. H. Arnold）：发展了随机突变和杂交基因片段的定向进化技术 • 史密斯（G. P. Smith）和温特（S. G. P. Winter）：创建了噬菌体展示技术，用于一次性筛选大量随机突变或全新设计的蛋白质 三、蛋白质工程与基因工程的比较 比较项目 基因工程 蛋白质工程 别名 重组DNA技术 第二代基因工程 操作水平 DNA分子水平 DNA分子水平 目的基因 天然存在的基因 经改造/设计的基因 产物 天然蛋白质 突变蛋白/全新蛋白 核心区别 天然基因的重组，产物的结构和功能基本不变 对基因进行设计和改造，获得性能更优的蛋白质 技术关系 蛋白质工程的基础 基因工程的延伸，需借助基因工程的技术手段 共同点 最终都需要通过受体细胞来表达目标蛋白 1. 蛋白质工程不是在蛋白质分子水平上直接操作，而是在基因（DNA）水平上改造基因→再由受体细胞表达出突变蛋白 2. 蛋白质工程必须以基因工程的基本技术为基础（获取突变基因→构建表达载体→导入受体细胞→筛选鉴定） 3. 直接对蛋白质分子进行改造不可行（蛋白质结构复杂、改造后无法遗传）；通过基因操作来改造更合理（可遗传、可大规模表达） 四、蛋白质工程的应用前景 应用领域 具体方向 医药 改造胰岛素（速效/长效）、t-PA（溶栓药）、L-天冬酰胺酶（降低免疫原性）、CAR-T细胞疗法 工业 改造工业用酶（提高热稳定性、耐有机溶剂性） 食品 提高食品中必需氨基酸含量 设计全新蛋白 根据蛋白质结构与功能关系，设计制造自然界不存在的全新蛋白质 分层专练·靶向攻关 基础通关 1．（24-25高一上·上海·期中）通过特定的“工具”可以重新编辑细胞中的遗传信息，以此改变细胞的生物学性状的技术是（    ） A．生态学技术 B．基因编辑技术 C．杂交水稻技术 D．发酵工程技术 【答案】B 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】通过特定的“工具”可以重新编辑细胞中DNA的遗传信息，以此改变细胞的生物学性状的技术是基因编辑技术。B正确。 故选B。 2．（21-22高一上·上海·期中）通过特定的“工具”可以重新编辑细胞中DNA的遗传信息，以此改变细胞的生物学性状的技术是（    ） A．转基因技术 B．基因编辑技术 C．杂交水稻技术 D．发酵工程技术 【答案】B 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】通过特定的“工具”可以重新编辑细胞中DNA的遗传信息，以此改变细胞的生物学性状的技术是基因编辑技术。B正确。 故选B。 3．（23-24高三上·上海·期末）抗体酶又称催化抗体，是一类免疫球蛋白，其结构如下图所示，它既具有相应的免疫活性，又能像酶那样催化某种化学反应。下列有关叙述错误的是（    ） A．抗体酶与抗原、底物的结合均具有专一性的特点 B．抗体酶可使药物的前体物质在肿瘤组织中水解为活性分子，从而起杀伤作用 C．抗体酶能阻止病毒与靶细胞结合的机理可能是选择性地使病毒外壳蛋白发生水解 D．可通过蛋白质工程对特异抗体的抗原结合位点进行空间改造，使其获得催化功能 【答案】D 【分析】1、抗体酶是指具有催化能力的免疫球蛋白，称为抗体酶或催化抗体，其化学本质是蛋白质。抗体酶具有典型的酶反应特性，即也具有高效性、专一性。 2、将抗体转变为酶主要通过诱导法、引入法、拷贝法三种途径。诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具有高催化活性的单抗即抗体酶；引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能；拷贝法主要是根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。 【详解】A、抗体酶具有抗体和酶的特性，所以与抗原、底物的结合均具有专一性，A正确； B、由图可知，抗体酶的底物结合部位可与药物的前体物质结合，并将其在肿瘤组织中水解为有活性药物分子，从而对其具有杀伤作用，B正确； C、抗体酶可能选择性的使病毒外壳蛋白发生水解，从而阻止病毒与靶细胞结合，C正确； D、借助蛋白质工程无法直接改造蛋白质的空间结构，借助基因工程和蛋白质工程将催化基因的表达产物引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能，D错误。 故选D。 （23-24高三上·上海·阶段检测）蛋白质工程，在现代分子免疫学研究和药物研发和改进领域被科学技术人员坚持应用和发展，在对于目标蛋白筛选和鉴定环节，也衍生出了如噬菌体展示技术等方式：根据材料，完成下列小题 4．下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是（　　） A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作 B．蛋白质工程可以创造出自然界不存在的新类型蛋白质 C．蛋白质工程的操作，摆脱了自然界关于遗传信息在生物大分子上传递的规律 D．蛋白质工程产生的蛋白质类药物比基因工程药物更安全，可直接用于治疗患者 5．下图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述正确的是（　　） A．代表蛋白质工程操作思路的过程是①④⑤ B．可以运用重组DNA技术来实现的环节是①② C．①代表DNA复制，②③代表转录和翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA合成 D．蛋白质工程是对基因的组合类型进行定向设计，并通过实验室条件下的基因重组来实现 6．干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．图中新的干扰素基因必须插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间才能表达 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中各项技术环节中，有些需要通过基因工程实现 7．噬菌体展示技术（如下图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　） A．建立噬菌体展示库需限制性内切核酸酶和耐高温DNA聚合酶 B．可利用抗原-抗体杂交技术筛选目标蛋白 C．可用细菌细胞作宿主培养噬菌体 D．该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因 【答案】4．B 5．B 6．B 7．A 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 4．A、基因的结构决定蛋白质的结构，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造基因来完成，而不是直接对蛋白质分子进行操作，A错误； B、通过改造基因可使蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子，B正确； C、蛋白质工程的操作仍然遵循中心法则，因此没有摆脱自然界关于遗传信息在生物大分子上传递的规律，C错误； D、蛋白质工程产生的蛋白质类药物也需要经过动物实验检验、临床测试后才能用于治疗患者，D错误。 故选B。 5．A、蛋白质工程的基本思路是从预期蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因，获得所需要的蛋白质。因此代表蛋白质工程操作思路的过程是④⑤①②③，A错误； B、①②是目的基因的表达，可通过运用重组DNA技术让其在受体细胞内表达，B正确； C、①代表转录，②代表翻译，③代表加工，④代表分子设计，⑤代表DNA合成，C错误； D、蛋白质工程是通过改造控制性状的基因来完成的，并不是对基因的组合类型进行定向设计，D错误。 故选B。 6．A、蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发，因此图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能，A正确； B、图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，B错误； C、由于基因的结构决定蛋白质的结构，因此图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，C正确； D、图中各项技术环节中，有些需要通过基因工程实现，如目的基因合成后，可将目的基因与运载体结合，导入受体细胞内进行表达，D正确。 故选B。 7．A、建立噬菌体展示库需限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A错误； B、由于抗原和抗体可特异性结合，因此可利用抗原-抗体杂交技术筛选目标蛋白，B正确； C、噬菌体专性寄生在细菌细胞内，因此可用细菌细胞作宿主培养噬菌体，C正确； D、诱变的原理是基因突变，具有不定向性，因此图中通过诱变处理后经过筛选可获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因，D正确。 故选A。 8．（24-25高二下·上海黄浦·期中）口服α-干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。其中，如图中a、b、c、d是引物，表格中为限制酶的切割位点。 （1）（多选）过程①所需的引物是________。 A．a B．b C．c D．d （2）在常规PCR的每一轮扩增反应中，温度随时间的变化顺序是________。 A． B． C． D． （3）（多选）过程②中，将干扰素基因插入Ti质粒时应该选择________限制酶进行酶切。 A．Bcl Ⅰ B．Kpn Ⅰ C．Sac Ⅰ D．Sau3A Ⅰ （4）（多选）在过程③后培养农杆菌时，加入氨苄青霉素可以筛选出________。 A．未导入任何载体的农杆菌 B．导入过表达载体的农杆菌 C．导入“空载”载体的农杆菌 （5）过程④中检测人参愈伤组织细胞是否合成干扰素可以用________方法。 A．同位素标记 B．分光光度法 C．抗原抗体杂交 D．显微观察法 （6）（多选）该基因工程中选用人参愈伤组织而不用人参的其他细胞，可能是因为愈伤组织________。 A．全能性高，便于植株再生 B．分裂旺盛，便于基因整合 C．结构松散，便于农杆菌接触 D．含抗性基因，便于多次筛选 （7）（多选）上述基因工程的理论依据是不同生物________。 A．细胞结构相同 B．DNA双螺旋结构相同 C．都遵循中心法则 D．共有一套遗传密码子 （8）（多选）利用PCR技术进行定点突变可以实现对干扰素基因进行改造，其过程如下图所示。下列分析正确的是________。 A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果 B．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD C．①过程需要先加热至95℃后再冷却至55～68℃ D．利用定点突变技术对GFP基因改造改变蛋白活性属于蛋白质工程 （9）AI模型AlphaFold3可以实现对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，使蛋白质工程取得了极大的进展。下列叙述错误的是_______。 A．AI可通过基因序列预测蛋白质的空间结构 B．AI可基于已有的科研数据构建结构与功能相匹配的蛋白质模型 C．AI与蛋白质工程结合，可以设计自然界不存在的新蛋白质 D．AI设计的蛋白质通常在细胞外合成，不需要对基因进行操作 【答案】(1)BC (2)C (3)BC (4)BC (5)C (6)BC (7)BCD (8)ACD (9)D 【详解】（1）PCR扩增时，子链延伸方向为5'→3'，引物需要结合在目的基因两端，延伸方向朝向目的基因。题图中DNA两条链反向平行，扩增完整干扰素基因需要引物b和c，分别结合模板链的3'端，向目的基因方向延伸，BC符合题意，AD不符合题意。 （2）PCR每一轮扩增的温度步骤为：①高温变性（95℃左右，最高温，使DNA解旋）→②低温复性（55℃左右，最低温，引物结合模板）→③中温延伸（72℃左右，Taq酶最适温度，合成子链），温度变化为高→低→中，C符合题意，ABD不符合题意。 （3）BclⅠ和Sau3AⅠ能识别并切割BclⅠ的序列，但BclⅠ的酶切位点位于Ti质粒的氨苄青霉素抗性基因内部，用BclⅠ和Sau3AⅠ切割会破坏抗性基因，无法后续筛选，为防止反向链接和环化，选择双酶切，因此选择KpnⅠ和SacⅠ切割，AD不符合题意，BC符合题意。 （4）A、未导入任何载体的农杆菌没有氨苄青霉素抗性基因所以不能在加入氨苄青霉素的培养基上生存，A不符合题意， BC、由于表达载体和空载载体都含有氨苄青霉素抗性基因，所以导入过表达载体的农杆菌和导入“空载”载体的农杆菌都能在加入氨苄青霉素的培养基上生存，BC符合题意。 （5）A、同位素标记一般用于制备核酸杂交探针、或者追踪物质的运输路径，无法直接特异性检测细胞内是否合成了干扰素这种特定蛋白质，A不符合题意； B、该方法仅能通过吸光度计算样品中总物质的浓度，无法特异性区分干扰素和细胞内的其他蛋白质，不能确认干扰素是否成功合成，B不符合题意； C、干扰素是蛋白质，检测目的基因是否翻译出蛋白质，常用抗原抗体杂交技术，C符合题意； D、无论光学显微镜还是电子显微镜，都无法特异性识别细胞内的干扰素分子，不能证明干扰素是否合成，D不符合题意。 （6）A、该过程只需要获得愈伤组织细胞，不需要再生植株，不需要利用全能性，A错误； BC、愈伤组织是植物脱分化形成的薄壁组织：分裂旺盛，外源基因更容易整合到宿主染色体DNA中，细胞结构松散，便于农杆菌接触侵染，BC正确； D、愈伤组织本身不含抗性基因，D错误。 （7）基因工程能实现异源基因表达的理论基础：不同生物的DNA都是相同的双螺旋结构，可切割重组；所有生物都遵循中心法则，遗传信息表达规律一致；所有生物共用一套遗传密码，因此异源基因可以合成相同的蛋白质。不同生物细胞结构不一定相同（如原核和真核），A错误，BCD正确。 （8）A、由题图可知，PCR1以原始DNA为模板，用引物a和引物b扩增得到产物AB，A正确； B、②过程是将PCR1和PCR2的产物混合后进行延伸，AB上链和CD下链互为模板和引物，不需要引物a和引物d，B错误； C、①过程需要先加热95℃使AB、CD变性解链，再冷却到55~68℃让互补链复性结合，C正确； D、蛋白质工程通过改造基因改造蛋白质，定点突变改造基因改变蛋白质活性，属于蛋白质工程，D正确。 （9）A、AlphaFold这类AI的核心功能就是可以通过基因推导得到氨基酸序列，进一步预测蛋白质的空间结构，A正确； B、AI是基于已有的海量蛋白质研究数据（结构、功能对应关系数据）进行训练学习的，因此可以构建出结构和功能相匹配的蛋白质模型，B正确； C、AI和蛋白质工程结合，可以根据人类需求设计出自然界不存在的、满足特定功能的新蛋白质，这是当前蛋白质工程的重要发展方向，C正确； D、即使AI完成了蛋白质的设计，要持续获得目标蛋白质，依然需要对编码该蛋白质的基因进行改造操作，再通过表达系统合成蛋白质，不存在不需要操作基因就能获得AI设计的蛋白质的情况，D错误。 （25-26高三下·上海·阶段检测）B型血友病患者因缺乏凝血因子Ⅸ(FIX）导致凝血功能障碍。FIX是一种由416个氨基酸构成的蛋白质。某腺病毒（AAV）是一种单链DNA病毒，野生型AAV无致病性、免疫原性弱、复制缺陷，需要辅助病毒进行复制，可作为B型血友病基因治疗的载体。其治疗过程如图1与图2所示。 9．根据题干信息和所学知识，对下列说法进行判断，正确的是_______。【单选】 A．B型血友病症状可以服用FIX缓解 B．AAV可在宿主细胞内独立复制 C．AAV内嘌呤数目和嘧啶数目相同 D．重组AAV病毒具有感染人体细胞的能力 10．B型血友病基因治疗中的目的基因为___________，其被导入受体细胞后利用___________（填“病毒基因”或“受体细胞基因”）编码的RNA聚合酶进行转录。 11．图8中HEK293细胞是人的某种细胞，体外培养时需要提供条件包括___________（编号选填） ①    ②37℃左右的温度    ③抗生素 ④偏酸性的pH    ⑤动物血清    ⑥含有营养物质的合成培养液 12．A、B、C、D（单链DNA片段）可选取作为PCR引物的是___________。【多选】 13．B型血友病与多个突变位点有关。一些显性突变基因无功能，且干扰正常等位基因产物的功能。对于此类B型血友病，下列预防或治疗措施有效的是_______。【多选】 A．孕期B超检查 B．基因检测 C．在患者体内注射针对显性突变基因表达产物的单克隆抗体 D．基于RNA干扰技术，在病变组织细胞中阻断突变基因表达 科研人员以进一步改造后的腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。该腺病毒复制需要E1、E2、E3基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，过程如图所示。PacI、EcoRI、BamHI、PmeI表示相关限制酶的酶切位点。 14．科研人员将S基因用___________（具体名称）酶切后，用DNA连接酶连入质粒Ⅱ，导入大肠杆菌。用添加___________的培养基筛选，将含S基因的重组质粒Ⅱ，用___________（具体名称）酶切后，获得改造后的腺病毒DNA，将其导入A细胞，A细胞自身需含有___________（填“E1”、“E2”或“E3”）基因，最终实现腺病毒在A细胞内的复制。 15．综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点______________________。 【答案】9．D 10． 编码FIX的基因 受体细胞基因 11．②③⑤⑥ 12．B和C 13．BCD 14． EcoRⅠ和BamHⅠ 氨苄青霉素 PacⅠ E3 15．重组腺病毒只能在A细胞中才能够复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因 【解析】9．A、B型血友病患者因缺乏凝血因子Ⅸ(FIX）导致凝血功能障碍，而FIX是一种由416个氨基酸构成的蛋白质，如果口服，会被消化道中蛋白酶水解，所以B型血友病症状不可以服用FIX缓解，A错误； B、野生型AAV无致病性、免疫原性弱、复制缺陷，需要辅助病毒进行复制，所以AAV不可在宿主细胞内独立复制，B错误； C、AAV是一种单链DNA病毒，嘌呤数目和嘧啶数目不一定相同，C错误； D、因为重组AAV作为基因治疗载体，所以需能感染人体细胞，D正确。 10．B型血友病患者因缺乏凝血因子Ⅸ(FIX）导致凝血功能障碍，所以基因治疗的目的基因是编码FIX的基因，目的基因导入受体细胞后，转录需要受体细胞的RNA聚合酶。 11．①动物细胞培养需要95%空气+5%CO₂，①错误； ②动物细胞培养温度控制在37℃左右，②正确； ③动物细胞培养需要加入抗生素创造无菌环境，③正确； ④动物细胞培养液pH维持在弱碱性，④错误； ⑤动物细胞培养需要添加动物血清，⑤正确； ⑥动物细胞培养需要添加含有营养物质的合成培养液，⑥正确。 ②③⑤⑥正确。 12．由于脱氧核苷酸连接在引物的3'端，所以图中可以作为引物的是B和C。 13．A、孕期B超检查不能检测出基因突变，A错误； B、由于该类血友病是显性突变造成的，基因检测起着预防的作用，B正确； C、在患者体内注射针对显性突变基因表达产物的单克隆抗体可以防止这些基因的表达产物对正常等位基因的干扰，起着治疗作用，C正确； D、在病变组织细胞中阻断突变基因表达，可以防止基因的表达产物对正常等位基因的干扰，起着治疗作用，D正确。 14．目的基因导入启动子和终止子之间，从图中看出，启动子和终止子之间只有EcoRⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，所以S基因用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，用DNA连接酶连入质粒Ⅱ，导入大肠杆菌。质粒Ⅱ有氨苄青霉素抗性基因，所以用含该抗生素的培养基筛选，结合右图，酶切之后，腺病毒DNA两侧含有PacⅠ的黏性末端，所以需要用PacⅠ酶切后，获得改造后的腺病毒DNA，将其导入A细胞，腺病毒复制需要E1、E2、E3基因共同完成，腺病毒DNA上含有E1和E2，所以A细胞自身需含有E3基因，最终实现腺病毒在A细胞内的复制。 15．从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点是：重组腺病毒只能在A细胞中才能够复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因。 （2026·上海金山·二模）科学家通过基因编辑技术将热休克元件（Hse，一段保守的DNA调控序列）靶向插入番茄细胞L5基因（编码细胞壁转化酶）的启动子特定位置，从而培育出抗热胁迫番茄，具体过程如图所示（图中A-G代表物质或结构，①-⑦代表步骤）。 16．图中A代表（　　）（单选） A．Hse B．L5基因 C．含Hse的L5基因片段 D．含Hse的L5基因启动子片段 17．图中Cas9的功能类似于（　　）（单选） A．RNA聚合酶 B．DNA连接酶 C．DNA聚合酶 D．限制性内切核酸酶 18．除了DNA连接酶外，过程②还需加入表3中的________。（编号选填） 表3 序号 酶的种类 识别序列和切割位点 ① XbaⅠ 5’-T\downarrowCTAGA-3’ ② HindⅢ 5’-A\downarrowAGCTT-3’ ③ BclⅠ 5’-T\downarrowGATCA-3’ ④ Sau3AⅠ 5’-\downarrowGATC-3’ 19．若用PCR技术检测Hse是否成功导入农杆菌，图7所示引物①～④中应选用的引物是________。（编号选填） 20．下列对于C的表述正确的是（　　）（多选） A．细胞分化程度较低 B．不同细胞的基因组成差异较大 C．细胞增殖能力较低 D．不同细胞表达的基因差异较小 21．①-⑦过程中需要严格控制激素种类和比例的是________。 22．图中使用到的生物技术有________。（编号选填） ①植物组织培养技术②植物细胞融合技术③细胞核移植技术 ④重组DNA技术⑤蛋白质工程技术 热胁迫会导致果实因能量不足而减产。研究发现通过对L5基因的编辑可以缓解此现象，表4为热胁迫环境下基因编辑前后相关数据检测结果。 表4 番茄叶片 番茄果实 L5表达量 有机物积累量（g） 净光合速率（molCO2·m-2·s-1） L5表达量 蔗糖含量（g） 重量（g） 编辑前 +++ 46.73* 9.77 + 18.63 25.21 编辑后 + 23.19 9.69 +++ 35.33* 36.67* 注：+的数量代表基因表达量，*代表差异显著。 23．根据题干和表4信息推测，Hse对L5基因的表达的影响是（　　）（单选） A．促进L5基因的表达 B．调整不同部位L5基因的表达水平 C．抑制L5基因的表达 D．改变了L5基因表达合成的酶结构 24．根据以上信息，推测通过基因编辑技术将Hse插入番茄L5基因启动子后，番茄抗热胁迫的机理。 【答案】16．D 17．D 18．①③ 19．③和② 20．AD 21．⑤和⑥ 22．①和④ 23．B 24．Hse基因插入后，番茄叶片的净光合速率基本不变，仅通过上调L5基因果实中的表达量，进而增大细胞壁转化酶活性，导致蔗糖积累增多，果实重量增加，从而缓解热胁迫导致的果实减产，提高产量稳定性 【详解】16．分析题意可知，科学家将热休克元件（Hse，一段保守的DNA调控序列）靶向插入番茄细胞L5基因（编码细胞壁转化酶）的启动子特定位置，分析图可知，A代表含Hse的L5基因启动子片段，故选D。 17．限制性内切核酸酶是特异性切割磷酸二酯键，CRISPR/Cas9系统识别特定DNA位点并对目标DNA进行切割的功能与限制性内切核酸酶类似。 18．分析可知，酶①XbaⅠ切割产生的黏性末端为5’-CTAG-3'，酶②HindⅢ切割产生的黏性末端为5’-AGCT-3'，酶③BclⅠ切割产生的黏性末端为5’-GATC-3'，酶④Sau3AⅠ切割产生的黏性末端为5’-GATC-3'，根据A的黏性末端可知，选用酶①和酶④，但由于在质粒上酶④Sau3AⅠ识别序列位于标记基因内部，确保不破坏标记基因，故质粒选用酶①和酶③切割。 19．用PCR技术检测Hse是否成功导入农杆菌，根据目的基因两端的序列设计引物，进行扩增目的基因A，即引物③和②，根据扩增是否能扩增到目的基因A来判断Hse是否成功导入农杆菌。 20．C是脱分化形成的愈伤组织，具有分化程度低，表达程度低，分裂旺盛，增殖能力强，且细胞基因组成基本一致，AD正确。 21．⑤是脱分化，脱分化过程中需要生长素和细胞分裂素比例适中，⑥是再分化，生长素与细胞分裂素比值大于1，有利于生根；生长素与细胞分裂素比值小于1，有利于发芽。 22．过程①②③④涉及转基因技术，过程⑤⑥⑦涉及植物组织培养技术，故图6中使用到的生物技术有①和④。 23．编辑前：叶片L5表达量为+++，果实为+；编辑后，叶片+，果实+++；表明Hse插入后调整不同部位L5基因的表达水平，而非抑制或促进，B正确。 24．Hse基因插入后，番茄叶片的净光合速率基本不变，通过调控L5基因在不同组织中的表达，优化蔗糖分配，在叶片中L5表达下降，细胞壁转化酶（催化蔗糖不可逆分解为果糖和葡萄糖）活性下降，蔗糖分解减少，更多蔗糖转运至果实；在果实中L5表达量上调，细胞壁转化酶活性增大，蔗糖积累增多，果实重量增加，缓解热胁迫导致的果实减产，提高产量稳定性。 情境应用 25．（2025·上海杨浦·模拟预测）包括基因治疗在内的物种性状改良都依赖于将目的基因准确整合至染色体 DNA 中。最近研究人员开发了一种“指哪打哪”的基因定点导入技术 (STITCHR）。该技术由两部分构成， 第一部分为 CRISPR-Cas系统， 后者需要两种试剂： Cas9和sgRNA。其中 Cas9的两个活性部位分别切割DNA 的两条链，但需要sgRNA 将Cas9 引导至 DNA 的特定位点。 （1）根据所学知识判断，sgRNA将Cas9引导至 DNA 特定位点涉及 。 A．转录 B．基因重组 C．逆转录 D．碱基互补配对 （2）根据题干信息判断，下列有关Cas9与限制酶的相同点，正确的是 。 A．均催化磷酸二酯键的断裂 B．均能特异性识别DNA 双链 C．均能催化碱基间氢键的断裂 D．催化产物均为双链DNA片段 STITCHR 技术用到的Cas9是一种经过定点突变后的蛋白（nCas9），即第840位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸。 （3）下图为Cas9基因的编码链，请据此选择合适的PCR 突变引物_______。（编号选填） 参考密码子： 组氨酸（CAC）、丙氨酸（GCC） （第840位密码子的编码序列用下划线表示） ①5’ CTGTATGGGCCG3’ ② 5'CGGCCCATACAG3' ③5’ ATGCTAGGCGAG3’  ④5’ GAGTATGCCGCT3’ （4）本案例中的定点突变与自然界基因突变的结果相比，区别在于 。 A．基因表达的步骤是否改变 B．mRNA 的序列是否一定改变 C．基因的核苷酸序列是否一定改变 D．蛋白质中氨基酸的序列是否一定改变 就像联会时的交叉互换，两个 DNA 分子若含有同源序列。可发生重组。STITCHR 的第二部分是一种转座子（如R2Tg等），含有表达促进DNA 导入的蛋白质的基因。通过Cas9切开的切口，R2Tg 可将其携带的目的基因高效准确插入染色体 DNA。STITCHR 的构建原理如图。 （5）为确保目的基因的定点导入，需要预先通过PCR 将与染色体DNA 同源的序列接在 。 A．启动子两侧 B．nCas9基因两侧 C．目的基因两侧 D．sgRNA 基因两侧 （6）欲确定目的基因能否导入染色体DNA 的特定区域，需要借助凝胶电泳技术对各细胞中的表达载体进行鉴定。为此，作为对照组的细胞应含 。 ① 表达载体1② 表达载体2③ 表达载体3 A．② B．①+③ C．②+③ D．①+②+③ （7）结合实验原理，分析图中下列表达载体在受体细胞中的信息传递情况，发生请打“✔”，不发生请打“×”。 表达载体1 表达载体3 转录 _______ _______ 翻译 _______ _______ （8）如图所示的实验程序需要培养动物细胞。下列有关培养条件的表述，正确的是 。 A．培养箱内需保持无菌环境 B．细胞需经历原代和传代培养 C．通常采用37℃的恒温培养环境 D．需通入5%CO₂维持培养基pH稳定 【答案】(1)D (2)AD (3)①② (4)D (5)C (6)ABC (7) √ √ √ × (8)ACD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因－-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原－抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）sgRNA 将Cas9 引导至 DNA 的特定位点，sgRNA 能与特定位点的DNA进行碱基互补配对，D正确，ABC错误。 故选D。 （2） Cas9的两个活性部位分别切割DNA 的两条链，但需要sgRNA 将Cas9 引导至 DNA 的特定位点，可见Cas9不能特异性识别DNA 双链，Cas9与限制酶的相同点是均催化磷酸二酯键的断裂，催化产物均为双链DNA片段，AD正确，BC错误。 故选AD。 （3）突变引物特定位点的碱基与模板上的碱基不互补配对，但是其余大多数碱基与模板能够配对，因此在适当的条件下，仍可以进行 PCR。克隆出的PCR产物相应位点的核苷酸序列与模板不同，从而表达出的蛋白质特定位点的氨基酸有所不同。题干信息：Cas9是一种经过定点突变后的蛋白（nCas9），即第840位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸，已知Cas9基因的编码链为5'-ATGCTAGCAGAG---------- CGCACCATACAG--------- CTCATATCACGA-3'，组氨酸密码子为CAC，丙氨酸密码子为GCC，据此可知，突变引物需要与编码链5'-CGGCCCATACAG-3'这段序列碱基互补配对，即①5’ -CTGTATGGGCCG3’，而与编码链5'-CGGCCCATACAG-3'互补配对的模板链互补配对的另一条引物则为② 5'CGGCCCATACAG3'，综上所述，PCR 突变引物为①5’ -CTGTATGGGCCG3’，② 5'CGGCCCATACAG3'，①②正确，③④错误。 故选①②。 （4）自然界的基因突变具有不定向性、随机性、可逆性、多害少利性、低频性等特点，而定点突变具有定向性，导致翻译出的蛋白质氨基酸序列一定改变，本案例中的定点突变与自然界基因突变的结果相比，区别在于蛋白质中氨基酸的序列一定改变，ABC错误，D正确。 故选D。 （5）题干信息：STITCHR 的第二部分是一种转座子（如R2Tg等），含有表达促进DNA 导入的蛋白质的基因，通过Cas9切开的切口，R2Tg 可将其携带的目的基因高效准确插入染色体 DNA；两个 DNA 分子若含有同源序列可发生重组，为确保目的基因的定点导入，需要预先通过PCR 将与染色体DNA 同源的序列接在目的基因两侧，C正确，ABD错误。 故选C。 （6）表达载体1含有nCas9基因，表达载体2含有R2Tg基因，表达载体3含有sgRNA基因；sgRNA 将Cas9 引导至 DNA 的特定位点；R2Tg 可将其携带的目的基因高效准确插入染色体 DNA；综合以上信息可知，欲确定目的基因能否导入染色体DNA 的特定区域，需要借助凝胶电泳技术对各细胞中的表达载体进行鉴定。为此，作为对照组的细胞应该为三种类型，即表达载体1+表达载体3，表达载体2，表达载体2+表达载体3，ABC正确，D错误。 故选ABC。 （7）表达载体1含有nCas9基因，表达载体3含有sgRNA基因；而nCas9基因需要通过转录和翻译才能获得nCas9蛋白，sgRNA基因需要通过转录获得sgRNA，然后sgRNA 将Cas9 蛋白引导至 DNA 的特定位点发挥作用，可见表达载体1在受体细胞中存在转录和翻译，表达载体3在受体细胞只存在转录，即如下表所示： （8）培养动物细胞，需要无菌无毒的环境，需要适宜的温度、pH和渗透压等，并将它们置于含有95%空气和5%CO2 的混合气体的 CO2 培养箱中进行培养，ACD正确，B错误。 故选ACD。 26．（25-26高三下·上海·阶段检测）人乳头瘤病毒（HPV）是一类专门感染人皮肤及黏膜上皮细胞的DNA病毒。当少量HPV入侵人体皮肤细胞时，人体不表现出明显症状，但当人体持续感染HPV时会诱发宫颈癌，具体过程如图1所示（“+”表示促进，“-”表示抑制）。 （1）图1中细胞I表示________（单选）。 A．T淋巴细胞 B．B淋巴细胞 C．抗原呈递细胞 D．辅助性T细胞 （2）当少量HPV入侵后，一定发生的过程有________（多选）。 A．物质a的分泌增加 B．细胞I的免疫应答增强 C．Thl细胞数量增加 D．浆细胞的识别能力增强 研究人员发现，有一种名为XRCC2的启动子在正常细胞中活性很低，而在肿瘤细胞中却有高活性。利用该特性，研究人员结合DTA基因（白喉毒素A基因，其表达产物能够杀死细胞）开展实验，过程如图2，如表为部分限制酶的识别序列和酶切位点，图3为XRCC2启动子的序列。 NheⅠ 5'-G↓CTAGC-3' EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' KpnⅠ 5'-GGTAC↓C-3' XbaⅠ 5'-T↓CTAGA-3' AgeⅠ 5'-A↓CCGGT-3' HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3' （3）据图2分析，上述过程中，XRCC2-DTA的构建需要的工具有___________（编号选填）。 ①NheⅠ②AgeⅠ③KpnⅠ④EcoRⅠ⑤XbaⅠ⑥HindⅢ⑦DNA连接酶⑧DNA聚合酶 （4）综合上述信息，为大量获得XRCC2启动子，应设计的2条引物序列是__________________、__________________（写出10个碱基）。 （5）成功导入重组质粒的大肠杆菌应具备的特性是______（单选）。 A．仅具备卡那霉素抗性 B．仅具备四环素抗性 C．同时具备卡那霉素和四环素抗性 D．均不具备卡那霉素和四环素抗性 （6）结合已有知识，关于图2中培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的叙述正确的是_______（多选）。 A．3个培养基均需要经过灭菌处理 B．培养基Ⅰ和Ⅲ需要加入一定量的抗生素 C．培养基Ⅰ和Ⅲ的配方是一样的 D．培养基Ⅱ的作用是实现大肠杆菌的扩增 （7）此实验中涉及的生物技术有_______（多选）。 A．细胞融合 B．细胞核移植 C．转基因技术 D．动物细胞培养 实验者通过电转化法分别将0、0.05μg、0.1μg的培养基Ⅱ产物导入不同肿瘤细胞中，结果如图4。 （8）图中实验结果能否说明相较于正常细胞，XRCC2启动子能特异性杀伤肿瘤细胞，并说明理由：__________________________________________________________________。 【答案】(1)C (2)ABC (3)①②⑤⑦ (4) 5'-GCTAGCGAGC-3' 5'-ACCGGTCTGC-3' (5)B (6)ABD (7)CD （8）不能。因为实验只展示了XRCC2启动子在肿瘤细胞中的杀伤效果，而没有展示其在正常细胞中的效果。 【详解】（1）HPV入侵后，首先由抗原呈递细胞吞噬处理抗原，再将抗原呈递给T细胞，使T细胞分化为Th1、Th2等不同细胞，因此细胞I为抗原呈递细胞。故选C。 （2）ABC、少量HPV入侵后人体启动免疫反应，抗原呈递细胞（细胞I）免疫应答增强，T细胞激活后分化，Th1数量增加，Th1分泌的细胞因子a分泌增加，促进细胞免疫，ABC正确； D、浆细胞不能识别抗原，无识别能力，D错误。 故选ABC。 （3）由题图可知，获取XRCC2启动子基因需要使用Nhe I和Age I进行酶切，获取DTA基因需要使用Age I和Xba I进行酶切，获取的XRCC2启动子基因和DTA基因需要使用DNA连接酶进行连接才能构成XRCC2-DTA融合基因，综上所述过程③XRCC2-DTA 的构建需要的工具有①Nhe I ， ②Age I ，⑤Xba I，⑦DNA 连接酶。 （4）过程①表示从HCA2细胞中通过PCR获得启动子，引物物合成均是5'端→3'端，而XRCC2 启动子的两端为已知序列，中间为位置序列，且XRCC2 启动子左侧有Nhe I限制酶识别序列，右侧有Age I 限制酶识别序列，可知设计引物时需要在两端引入相应酶切位点；由此可以推测，正向引物应含NheⅠ位点（5’-GCTAGC-3’），对应5′-GCTAGCGAGC-3′，反向引物应含AgeⅠ位点（5’-ACCGGT-3’），对应5′-ACCGGTCTGC-3′。 （5）根据质粒上的限制酶种类可知，目的基因插入的位点位于卡那霉素抗性基因所在的位置，故成功导入重组质粒的大肠杆菌应具备的特性是仅具备四环素抗性，故选B。 （6）A、 所有培养用培养基都需要经过灭菌处理，A正确； B、培养基Ⅰ和Ⅲ需要加入一定量的抗生素，防止杂菌污染，B正确； C、培养基I培养大肠杆菌，培养基Ⅲ培养动物细胞，配方完全不同，C错误； D、培养基Ⅱ的作用是扩增大肠杆菌，获得大量重组质粒，D正确。 故选ABD。 （7）AB、该过程未涉及细胞融合和细胞核移植，A、B错误； C、该实验构建重组载体、将目的基因导入受体细胞，属于转基因技术，C正确； D、最终需要培养肿瘤细胞观察结果，用到动物细胞培养技术，D正确。 故选CD。 （8）由于实验只展示了XRCC2启动子在肿瘤细胞中的杀伤效果，而没有展示其在正常细胞中的效果。为了说明XRCC2启动子能特异性杀伤肿瘤细胞，还需要进行对照实验，比较其在正常细胞和肿瘤细胞中的表达和杀伤效果，故不能说明相较于正常细胞，XRCC2启动子能特异性杀伤肿瘤细胞。 （25-26高二下·上海松江·阶段检测）炎症性肠病（IBD）的检测目前多依赖于侵入性肠镜，患者不适感强且无法实现动态监测。科学家通过改造益生菌，使其能在感知到肠道炎症标志物硫代硫酸盐时表达声学报告基因（ARG）产生气囊，被超声无创成像，实现肠道炎症原位、无创、可视化检测。相关原理如图1所示。 【益生菌的选择与培养】 大肠杆菌Nissle1917（EscherichiacoliNissle1917，简称EcN）被选作开发此传感器的益生菌。 27．选择EcN的理由可能包括________（编号选填） ①安全无致病性    ②肠道适应性强    ③抗原性较强    ④易基因工程改造 28．使用MAC培养基培养EcN时会形成红色菌落，该培养基成分及作用如表。 成分 作用 胆盐、结晶紫 抑制杂菌生长 乳糖 为发酵产酸提供原料 中性红 pH指示剂，产酸时变为红色，否则无色 蛋白胨、琼脂 提供营养与固体支持 MAC培养基属于________（编号选填） ①天然培养基②合成培养基③固体培养基④通用培养基⑤选择培养基⑥鉴别培养基 【益生菌的改造】 科学家通过Gibsonassembly技术构建了图1所示的同时含有S基因、R基因和ARG基因的表达载体，该技术的原理如图2所示。 29．PCR扩增A、B两个双链DNA片段时，为使它们产生图2所示的重叠末端，应在结合________（编号选填）的引物________（编号选填）添加同源序列。 ①a1②a2③b1④b2⑤5′端⑥3′端 30．据图2，配制Gibsonassembly反应体系时，除从5′端逐个切下核苷酸的酶外，还应添加________（编号选填） ①DNA解旋酶    ②限制性内切酶    ③DNA聚合酶    ④DNA连接酶 31．为实现图1所示过程，S基因和R基因均应选择________（编号选填）的启动子；ARG基因则应选择________（编号选填）的启动子。 ①始终表达②仅在硫代硫酸盐诱导下表达 【传感器的优化】 研究者考虑引入Bxb1酶系统，可在感应硫代硫酸盐后，表达Bxb1酶，催化attB与attP位点之间的不可逆重组，改变P7启动子的方向（图3）。 32．相较图1，你是否赞同图3所示的改造？阐述理由。 33．按照图3的思路，若要同时实现肠道炎症的无创超声诊断与抗炎治疗，还需添加的模块是________（单选） A．attB-抗炎蛋白基因-attP-P7 B．attB-P7-attP-抗炎蛋白基因 C．attB-attP-P7-抗炎蛋白基因 D．attB-P7-抗炎蛋白基因-attP 【答案】27．①②④ 28．①③⑤⑥ 29． ①④ ⑤ 30．③④ 31． ① ② 32． 参考示例1     支持。未引入Bxb1酶系统时，ARG基因为硫代硫酸盐诱导型表达，表达并不 持续，产生的气囊较少，检测灵敏度不高；引入Bxb1酶系统后，只需少量硫代硫酸 盐诱导便可表达BXb1酶（1分），该酶催化attB和attP之间的重组，不可逆地改变 P7的方向、使ARG基因持续强烈表达，产生大量气囊，检测灵敏度显著提高。 参考示例2     不支持。未引入Bxb1酶系统时，ARG基因为硫代硫酸盐诱导型表达，只在肠道有炎症时超声成像：引入Bxb1酶系统后，只需少量硫代硫酸盐诱导便可表达Bxb1 酶，该酶催化attB和attP之间的重组，不可逆地改变P7的方向、使 ARG基因持续表达，持续产生大量气囊，即使在肠道炎症缓解后，超声成像仍显示 炎症，易造成误诊。 33．B 【详解】27．作为用于人体肠道的工程益生菌，需要满足安全无致病性，能适应肠道环境可稳定存活，且作为基因工程受体易进行基因改造；抗原性过强会引发人体免疫排斥，不适合，故选①②④。 28．该培养基含有蛋白胨等天然成分，难以明确其中每种分子的含量，属于天然培养基，含琼脂提供固体支持，属于固体培养基，胆盐、结晶紫抑制杂菌生长，具有选择作用，属于选择培养基；可通过中性红的颜色变化鉴别分解乳糖的EcN，属于鉴别培养基，因此选①③⑤⑥。 29．要使A、B的相邻末端产生重叠末端，结合图2可知，需要在a2和b1上的序列碱基互补配对，则应添加的同源序列应为故为a1（与a2的对应序列碱基互补配对）和b1，即选①④；PCR延伸从引物3'端开始，为保证扩增的完整性和准确性，额外同源序列需要添加在引物的5'端，不影响扩增，选择⑤。 30．该体系已有从5'端切核苷酸的外切酶，外切酶处理得到重叠单链后，需要DNA聚合酶填补缺口，还需要DNA连接酶连接磷酸二酯键完成片段拼接，故选③④。 31．S蛋白、R蛋白组成硫代硫酸盐感知系统，需要持续表达才能随时检测炎症信号，因此选择①始终表达的启动子；ARG仅需要在检测到硫代硫酸盐（炎症）时表达产气囊，因此选择②硫代硫酸盐诱导型启动子，即仅在硫代硫酸盐诱导下表达。 32．该题为开放性问题，可从两方面分析，具体如下： 参考示例1 支持。未引入Bxb1酶系统时，ARG基因为硫代硫酸盐诱导型表达，表达并不持续，产生的气囊较少，检测灵敏度不高；引入Bxb1酶系统后，只需少量硫代硫酸盐诱导便可表达BXb1酶（1分），该酶催化attB和attP之间的重组，不可逆地改变P7的方向、使ARG基因持续强烈表达，产生大量气囊，检测灵敏度显著提高。 参考示例2 不支持。未引入Bxb1酶系统时，ARG基因为硫代硫酸盐诱导型表达，只在肠道有炎症时超声成像：引入Bxb1酶系统后，只需少量硫代硫酸盐诱导便可表达Bxb1酶，该酶催化atB和atP之间的重组，不可逆地改变P7的方向、使ARG基因持续表达，持续产生大量气囊，即使在肠道炎症缓解后，超声成像仍显示炎症，易造成误诊。 33．分析题图，图3的思路是：P7启动子位于两个重组位点attB和attP之间，目的基因位于attP下游；无炎症时P7方向反向，无法启动目的基因，炎症诱导重组后P7方向翻转，启动下游目的基因表达。因此抗炎蛋白作为目的基因，模块结构应为attB-P7-attP-抗炎蛋白基因，符合该设计思路，故选B。 34．（2025·上海崇明·二模）研究人员利用基因编辑技术对大豆细胞中的基因L进行如图1所示的改造，成功培育出耐盐碱大豆品系。该基因编辑技术的主要原理：在载体上插入靶向大豆基因L的向导DNA序列，该序列的转录产物可引导核酸酶特异性结合基因L上的目标序列并使其突变（图2）。 （1）利用该技术获取突变基因时，与基因L发生特异性结合的是__________。 ①向导DNA序列②与向导DNA配对的RNA序列③核酸酶基因④核酸酶⑤限制性内切核酸酶 （2）构建图1所示重组质粒需要的工具酶有____________。 （3）培养基Ⅰ和培养基Ⅱ中需要添加__________。 A．卡那霉素 B．氨苄青霉素 C．生长素 D．细胞分裂素 （4）结合题意，培育耐盐碱大豆品系涉及的技术有_________。（编号选填） ①微生物分离与培养②植物组织培养技术③植物细胞融合技术④修饰改造天然蛋白⑤设计制造全新蛋白⑥无菌技术 为了检验基因编辑是否成功，从培养基Ⅱ中挑选4株大豆（2n=40）样本提取DNA，通过PCR扩增目标基因L，选用图3中合适的限制酶对PCR产物完全酶切后的电泳结果如图4所示。 BamHI:5'-G1GATCC-3' EcoRI：5＇-GlAATTC-3＇ SacI：5＇-GAGCTIC-3＇ 图3 株1    株2   株3   株4 图4 （5）PCR扩增正常基因L与突变基因L的过程中相同的是_______。 A．引物 B．产物 C．DNA模板 D．基本程序 （6）结合图2、图3和图4，实验中选用的限制性内切核酸酶是_________；其中纯合的突变植株是___________；植株1和3杂交得到纯合突变植株的概率为______。 （7）科研人员欲通过人工化学方法直接合成与突变基因L配对的RNA，将其导入大豆细胞内以提高作物耐盐碱的性状。请结合中心法则说明基因编辑和人工导入RNA两种方案的优劣__________。 【答案】(1)②④ （2）限制酶Bsa Ⅰ和DNA连接酶 (3)ACD (4)①②④⑥ (5)AD (6) SacⅠ 株4 1/4 （7）基因编辑的对象是基因，需先在细胞核转录形成RNA后，再进入细胞质经翻译合成相关蛋白，一旦编辑成功，可遗传且通过基因表达一直发挥作用，但技术要求较高；RNA药物只需通过翻译即可合成相关蛋白，相对基因编辑见效可能更快，但发挥作用后会被降解，需要持续使用 【详解】（1）根据题干信息“在载体上插入靶向大豆基因L的向导DNA序列，该序列的转录产物可引导核酸酶特异性结合基因L上的目标序列并使其突变”，可知与基因L发生特异性结合的是与向导DNA配对的RNA序列以及核酸酶，即②④。 （2）构建重组质粒时，需要用限制酶Bsa Ⅰ切割含有目的基因的外源DNA和运载体，之后用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA。 （3）卡那霉素抗性基因位于可插入植物基因组的T-DNA区，因此需要在大豆培养体系中添加卡那霉素筛选成功转化的细胞；植物组织培养过程中，培养基需要添加生长素和细胞分裂素，诱导脱分化和再分化；氨苄西林抗性基因仅用于筛选农杆菌，不需要添加到大豆培养基中。 （4）该过程需要分离培养导入重组质粒的农杆菌（①），转化后的大豆细胞需要通过植物组织培养获得完整植株（②），全程需要无菌技术防止污染（⑥）；该过程也存在对蛋白质进行改造（④），不涉及植物细胞融合。 （5）PCR扩增正常基因和突变基因时，扩增的是同一基因的位点，因此引物相同，PCR的基本程序都是变性→复性→延伸，基本程序相同；模板分别是正常基因和突变基因，模板不同；产物的碱基序列不同，因此产物不同，故选AD。 （6）对比正常和突变序列，只有突变后产生了SacⅠ的识别位点，因此选择SacⅠ可以区分两种基因；大豆是二倍体，纯合突变植株的两个等位基因都突变，酶切后产生2个片段，电泳显示2个条带，对应株4；株1和株3电泳都显示3个条带，属于杂合突变体，二者杂交得到纯合突变植株的概率为1/4。 （7）基因编辑：优：改变了大豆基因组，变异可遗传，耐盐碱性状可以稳定遗传给后代，可长期维持；劣：技术要求高；或基因编辑的对象是基因，需先在细胞核转录形成RNA后，再进入细胞质经翻 译合成相关蛋白，一旦编辑成功，可遗传且通过基因表达一直发挥作用，但技术要求较高。 人工导入RNA：优：不会改变大豆的基因组和遗传物质，只需通过翻译即可合成相关蛋白，相对基因编辑见效可能更快；劣：RNA在细胞内会被降解，无法稳定存在，性状不能遗传，需要多次导入才能维持耐盐碱性状。 35．（25-26高二下·上海·期中）戈壁异常球菌对伽马射线、紫外线和干旱等损伤因子表现出极强的抗性，科学家将来自戈壁异常球菌的Csp2基因导入玉米中，以期提高玉米的抗旱能力，相关操作流程如图1。 （1）戈壁异常球菌与玉米植株细胞共有的细胞结构有_______。 A．质膜 B．染色体 C．核糖体 D．内质网 （2）为了获取足量的Csp2基因，常用_______进行扩增。 A．稀释涂布平板法 B．扩大培养 C．PCR D．凝胶电泳 （3）构建重组Ti质粒是培育转基因抗旱玉米的核心步骤，该过程需要使用的工具酶包括_______。 A．解旋酶 B．限制酶 C．DNA连接酶 D．DNA聚合酶 （4）图2为Ti质粒结构示意图，为确保目的基因成功转入植物细胞并正确表达，切割该质粒应选用的限制酶是______。 注：①T-DNA为可转移的DNA，导入相关菌株并侵染植物细胞后，T-DNA可被整合到该细胞的染色体上；②Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因；③Pst Ⅰ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ为限制酶识别位点 A．Pst Ⅰ、Kpn Ⅰ B．Pst Ⅰ、Hind Ⅲ C．Hind Ⅲ、BamH Ⅰ D．BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ （5）图1中①菌和②技术分别为_______。 A．枯草芽孢杆菌、植物组织培养 B．枯草芽孢杆菌、植物体细胞杂交 C．根瘤农杆菌、植物组织培养 D．根瘤农杆菌、植物体细胞杂交 （6）将重组Ti质粒导入①菌后，需按图3所示流程筛选成功导入重组Ti质粒的①菌。图3中①过程接种方法是______（编号选填）。除营养物质外，培养皿A、B、C中还应分别应添加_______、_______、_______（编号选填），目标菌落为______（选填图3中菌落对应数字） ①平板划线法 ②稀释涂布平板法 ③琼脂 ④氨苄青霉素 ⑤四环素 ⑥氨苄青霉素抗性基因 ⑦四环素抗性基因 （7）关于转基因抗旱玉米的筛选与检测环节，下列叙述正确的是_______。 A．若能在转基因玉米细胞中检测到Csp2基因，则说明该基因工程项目获得成功 B．可对转基因玉米细胞中Csp2基因的mRNA和Csp2蛋白水平进行检测 C．可对干旱条件下转基因玉米的光合速率、相对含水量等生理指标进行检测 D．可检测正常浇水和干旱条件下转基因玉米的存活率，并与野生型玉米进行对照 （8）通过图1流程得到以下三种类型的转基因抗旱玉米植株（线条表示2对同源染色体，圆点表示Csp2基因在染色体的整合位点，且成功整合的Csp2基因均能正常表达抗旱性状）。下列说法中不正确的是_______。 A．若自交产生的子一代中抗旱植株比例为75%，则Csp2基因的整合位点属于类型Ⅲ B．Ⅰ和Ⅱ杂交产生的子一代中抗旱植株比例为100% C．Ⅱ和Ⅲ杂交产生的子一代中不抗旱植株比例为1/8 D．Ⅰ和Ⅲ杂交产生的子一代中抗旱植株比例为100% 【答案】(1)AC (2)C (3)BC (4)C (5)C (6) ② ③ ④ ⑤ 3、6 (7)BCD (8)A 【详解】（1）戈壁异常球菌是原核生物，玉米是真核生物。二者共有的结构是质膜、核糖体。BD不符合题意，AC符合题意。 （2）PCR是体外大量扩增目的基因的技术；稀释涂布平板法：用于微生物的分离计数；扩大培养：用于微生物的增殖； 凝胶电泳：用于DNA的分离鉴定。ABD不符合题意，C符合题意。 （3）构建基因表达载体（重组Ti质粒）时：限制酶：切割Ti质粒和目的基因，产生相同的黏性末端（或平末端）；DNA连接酶：将目的基因和质粒连接，形成重组DNA；解旋酶：用于DNA复制时解开双链；DNA聚合酶：用于DNA复制或PCR。AD不符合题意，BC符合题意。 （4）HindⅢ、BamHⅠ：两酶切位点均位于T-DNA区域内，使目的基因插入于启动子与终止子之间；启动子、终止子结构完整 ，保障表达；Tetr基因可作筛选标记；ABD不符合题意，C符合题意。 （5）将目的基因导入植物细胞的农杆菌转化法中，使用的是根瘤农杆菌（农杆菌），而非枯草芽孢杆菌；将玉米幼胚（植物细胞）培育为完整转基因植株，利用的是植物组织培养技术，植物体细胞杂交用于远缘物种杂交，不用于转基因植株的再生。ABD不符合题意，C符合题意。 （6）图3中是将菌液稀释后涂布到培养基上，接种方法是稀释涂布平板法。培养皿A：基础培养基，仅添加凝固剂琼脂，用于获得单菌落。培养皿B：添加氨苄青霉素，筛选含氨苄青霉素抗性基因的菌株（即导入质粒的菌）。培养皿C：添加四环素，筛选含四环素抗性基因的菌株（即未重组的质粒菌）。目标菌落为3、6。    （7）A、在转基因玉米细胞中检测到Csp2基因，仅表明目的基因已成功导入受体细胞，但目的基因是否能正常表达及是否具有预期功能尚未确定。基因工程成功的标志是目的基因在受体细胞中稳定存在并表达出相应性状，因此仅检测到基因不能说明工程成功，A错误； B、检测Csp2基因的mRNA和Csp2蛋白，可直接判断目的基因是否在受体细胞中表达，是基因工程中常用的分子水平检测方法，B正确； C、光合速率、相对含水量等生理指标与植物的抗旱能力直接相关，在干旱条件下检测这些指标，可判断转基因玉米是否因导入Csp2基因而表现出抗旱性状，属于个体水平的检测，C正确； D、通过对比正常浇水和干旱条件下转基因玉米与野生型玉米的存活率，可直观反映转基因玉米的抗旱能力，是个体水平检测的有效方法，D正确。 （8）A、由以上分析可知：Ⅲ的两个R基因分别位于两条非同源染色体上，该个体减数分裂产生的配子有3/4含R基因，该个体自交，后代中抗旱能力弱植株占1/16，高抗旱性植株所占的比例15/16，A错误；    B、Ⅰ产生的配子中都有R基因，因此，它与Ⅱ杂交产生的后代中高抗旱性植株所占比例为100%，B正确； C、Ⅲ个体可以产生四种配子，与Ⅱ杂交，后代中高抗旱性植株所占比例为7/8，抗旱能力弱植株所占比例1/8，C正确；    D、Ⅰ产生的配子中都有R基因，因此，它与Ⅲ杂交产生的后代中高抗旱性植株所占比例为100%，D正确。 素养提升 1.（2026·上海徐汇·二模）咖啡酸是一种具有消炎、抗癌作用的天然化合物，在酵母菌中，因为缺少HpaB和HpaC两种酶而无法合成。科研团队通过PCR等技术获得了目标序列A与HpaC基因的融合片段（见图1），将该片段插入图2所示的结构中得到同时含有HpaB和HpaC基因的重组质粒。利用大肠杆菌扩增重组质粒后，将其导入酵母菌从而高效生产咖啡酸。 （1）据图1、2推测，目标序列A最有可能是 A．复制起点 B．HpaB基因 C．真核生物启动子 D．原核生物启动子 （2）据图1分析，“混合”后的PCR过程中，形成融合片段用到的DNA单链为 A．单链① B．单链② C．单链③ D．单链④ （3）将重组质粒导入大肠杆菌后，为了便于筛选目标大肠杆菌，融合片段应该插入图2中的 （选填图2中的编号）；所筛选出的目标大肠杆菌具有的特点为_______（编号选填） ①具有氨苄青霉素抗性 ②不具有氨苄青霉素抗性 ③在含X-gal培养基上无法生长 ④在含X-gal培养基上为蓝色菌落 ⑤在含X-gal培养基上为白色菌落 （4）为确定扩增后的重组质粒上同时含有HpaB和HpaC基因，可以采用的方法有____ A．对重组质粒进行基因测序 B．对重组质粒上的特定片段进行PCR C．酶切重组质粒后检测DNA片段长度 D．检测大肠杆菌中这两种基因的表达量 将构建的重组质粒导入酵母菌后，相关合成咖啡酸的代谢过程如图3所示。 （5）图3中“■”代表的物质是____ A．丙酮酸 B． C． D．ADP （6)据图3和所学知识判断，下列关于培养该酵母菌的说法，合理的是____ A．使用液体YPD培养基进行培养 B．培养基中葡萄糖需经过滤除菌后加入 C．使用平板划线法对酵母菌进行计数 D．培养结束测定咖啡酸含量时需无菌操作 （7)据图3和所学知识判断，下列措施中，能够提高咖啡酸产量的有____（编号选填） ①促进色氨酸的合成②抑制ARO酶基因的表达③提高FjT酶活性④降低多糖合成酶活性⑤增加葡萄糖转运蛋白数量⑥及时移出产物咖啡酸 （8）导入重组质粒的酵母菌经过一段时间的培养后，发现咖啡酸产量明显低于预期，并在细胞内检测到大量的对香豆酸。请针对这一现象，提出一个基于蛋白质工程的优化方案，包含但不限于采取策略，操作对象，使用方法，改造方向等___________。 【答案】(1)C (2)AD (3) ⑥(④) ①⑤(②④) (4)ABC (5)C (6)AB (7)③④⑤⑥ （8）积累大量对香豆酸说明HpaB酶催化对香豆酸转化为咖啡酸的效率偏低，基于蛋白质工程的优化方案： 操作对象为HpaB基因，从预期提高HpaB酶对底物对香豆酸的催化活性出发，设计改造HpaB酶的空间结构，推导改造后所需的氨基酸序列，进一步得到改造对应的核苷酸序列，再通过定点突变技术改造原HpaB基因，将改造后的基因导入酵母菌，筛选得到能表达高活性HpaB酶的工程酵母，即可提高咖啡酸产量。（合理即可，符合蛋白质工程的基本思路即可） 【详解】（1）题干说明酵母菌原本缺少HpaB、HpaC两种酶，构建重组质粒需要同时含两种基因，本次PCR获得的是目标序列A与HpaC的融合片段，质粒中已有HpaB基因、复制起点、启动子，目标序列A最有可能是真核生物启动子，以使目的基因在酵母菌细胞中表达，C正确。 （2）“混合”后的PCR过程中，两条单链互为引物，重叠部分应为单链的3'端，以便DNA聚合酶延伸子链，形成融合片段用到的DNA单链为①④。 （3）融合片段需要插入标记基因中便于筛选，图中lacZ是筛选标记，插入位点⑥（lacZ基因内部）后：Ampr（氨苄抗性基因）未被破坏，因此重组菌保留氨苄抗性；lacZ被插入失活，无法表达水解X-gal的酶，因此在含X-gal的培养基上菌落为白色。（或插入位点④，筛选出的目标大肠杆菌具有的特点为②④） （4）A、基因测序可直接确认序列存在，A正确； B、用特异性引物PCR可扩增出目标片段说明存在，B正确； C、酶切后电泳检测片段长度符合预期说明存在，均正确，C正确； D、检测表达量是检测基因是否表达，大肠杆菌仅用于扩增质粒，不需要基因表达，因此不能通过检测表达确认质粒上是否含基因，D错误。 （5）结合高中知识，葡萄糖分解产生丙酮酸，丙酮酸可进入三羧酸循环，丙酮酸分解产生丙酮酸的过程中同时产生NADH。 （6）A、大规模培养微生物生产代谢产物，使用液体培养基，A正确； B、葡萄糖高温灭菌会发生碳化变性，因此需要过滤除菌后再加入培养基，B正确； C、平板划线法只能分离纯化微生物，不能用于计数，计数需要用稀释涂布平板法，C错误； D、培养结束后测定咖啡酸含量，不需要无菌操作，D错误。 （7）根据代谢路径分析： ①促进色氨酸合成会分流预苯酸，减少酪氨酸生成，降低咖啡酸产量，①错误； ②抑制ARO酶基因表达会减少预苯酸生成，降低产量，②错误； ③提高FjT酶活性，可促进酪氨酸生成更多对香豆酸，提高产量，③正确； ④降低多糖合成酶活性，可让更多葡萄糖流入产酪氨酸的途径，提高产量，④正确； ⑤增加葡萄糖转运蛋白数量，可增加细胞摄入的葡萄糖，原料增加提高产量，⑤正确； ⑥及时移除产物咖啡酸，可解除产物反馈抑制，提高产量，⑥正确。 （8）积累大量对香豆酸说明HpaB酶催化对香豆酸转化为咖啡酸的效率偏低，基于蛋白质工程的优化方案： 操作对象为HpaB基因，从预期提高HpaB酶对底物对香豆酸的催化活性出发，设计改造HpaB酶的空间结构，推导改造后所需的氨基酸序列，进一步得到改造对应的核苷酸序列，再通过定点突变技术改造原HpaB基因，将改造后的基因导入酵母菌，筛选得到能表达高活性HpaB酶的工程酵母，即可提高咖啡酸产量。 （2026·上海闵行·二模）抗性淀粉是一种难以在小肠消化吸收的淀粉，食用后血糖升糖慢，对糖尿病患者友好。研究团队想通过改造SBE酶（淀粉分支酶）以提升水稻中抗性淀粉的含量。图1显示了水稻中抗性淀粉合成的相关途径。 2．结合图1分析，水稻中合成的直链淀粉和支链淀粉________。（多选） A．元素组成不同 B．空间结构不同 C．所需酶不同 D．产生量不同 研究团队利用CRISPR/Cas9系统对水稻SBE酶的SBE基因进行编辑，部分操作过程如图2所示。 3．构建gRNA表达盒的关键技术是引入靶点序列。结合图2分析，下列相关描述正确的是________。（编号选填） ①靶点应选择影响SBE酶功能的关键区 ②靶点的GC含量较高有利于精准编辑 ③引物应包含限制酶识别序列 ④退火时需要DNA聚合酶 4．gRNA表达盒转录形成的gRNA，一部分与SBE基因结合，另一部分能结合Cas9蛋白。结合图2推测，gRNA骨架编码序列转录产物的作用是________。gRNA表达盒中相关元件的正确排序是：启动子→________。（编号选填） ①与靶点序列碱基互补配对 ②结合Cas蛋白 ③gRNA骨架编码序列→靶点序列DNA片段 ④靶点序列DNA片段→gRNA骨架编码序列 5．图2的步骤Ⅰ和Ⅱ的培养基成分中，除生长所需的营养物质外，Ⅰ还需添加________，Ⅱ还需添加________。（编号选填） ①潮霉素    ②卡那霉素    ③生长素和细胞分裂素 研究人员对筛选到的两株SBE基因改变的突变体a和突变体b进行了基因测序，并预测了SBE酶的三维结构，如图3所示，其中框内部分为突变体a与野生型的差异区。下表显示野生型与这两种突变体水稻的部分检测数据。 样品 SBE酶的氨基酸数（个） 抗性淀粉含量（g/100g） 野生型 825 0.24 突变体a 824 1.53 突变体b 150 1.72 6．据题意，突变体水稻能合成而野生型水稻无法合成的物质是________。（编号选填） ①Cas9蛋白的mRNA    ②Cas9蛋白    ③gRNA    ④直链淀粉    ⑤蔗糖 7．根据表3中SBE酶的氨基酸数情况推测，突变体b可能发生________。（编号选填） ①碱基替换    ②碱基缺失    ③碱基插入 8．分析并阐述突变体a的抗性淀粉含量介于野生型和突变体b之间的原因。________ 【答案】2．BCD 3．①②③ 4． ② ④ 5． ② ①③ 6．①②③ 7．①②③ 8．根据图1可知，SBE活性降低时可合成较多的抗性淀粉，SBE活性与其空间结构密切相关，突变体a的抗性淀粉含量介于野生型和突变体b之间，推测突变体a的SBE酶活性介于野生型和突变体b之间，原因是突变体a的SBE三维结构与野生型相近，但与突变体b三维结构差异较大 【详解】2．A、根据图1分析可知，直链淀粉和支链淀粉都是由葡萄糖聚合而成的多糖，元素组成均为C、H、O，A错误； B、直链淀粉为线性结构，支链淀粉有分支，二者空间结构不同，B正确； C、合成路径依赖不同的酶（如SBE酶参与支链淀粉形成），C正确； D、图1可知，在G酶作用下产生直链淀粉反应强度低，而在SBE酶等作用下产生支链淀粉反应强度高，且直链淀粉经过多步反应会生成抗性淀粉，故水稻中合成的直链淀粉和支链淀粉产量不同，D正确。 3．①靶点应选择位于影响SBE酶功能的关键区，以确保编辑后能有效降低SBE酶活性，①正确； ②靶点的GC含量高会增加gRNA与靶点结合的稳定性，有利于精准编辑，②正确； ③引物需要包含限制酶识别序列，以便将gRNA编码序列插入载体中，③正确； ④退火是引物与模板结合的过程，不需要DNA聚合酶，④错误。 4．根据图2，gRNA表达盒转录形成的gRNA，一部分是靶点序列，用于SBE基因结合，另一部分是gRNA骨架，用于结合Cas9蛋白，因此gRNA骨架编码序列转录产物的作用是用于与Cas蛋白结合（②）。在gRNA表达盒中，启动子应先连接靶点序列DNA片段，再连接gRNA骨架编码序列，这样才能保住转录出来的gRNA能同时结合靶点和Cas9蛋白。因此，gRNA表达盒中相关元件的正确排序是④。 5．步骤Ⅰ是将重组质粒导入农杆菌，质粒上含有潮霉素抗性基因（对真核细胞具有毒性）和卡那霉素抗性基因（对原核生物具有毒性），因此需要在培养基中添加卡那霉素（②）进行筛选，成功导入了重组质粒的农杆菌即可以在含有卡那霉素的培养基上能够生长，从而将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。过程Ⅱ是将导入了重组质粒的农杆菌去侵染水稻愈伤组织细胞，需要在培养基上添加潮霉素，这样成功导入了重组质粒的愈伤组织含有卡那霉素抗性基因，能够正常生长，愈伤组织需要在含有生长素和细胞分裂素的培养基上进行再分化形成完整植株。 6．突变体a、b的SBE酶氨基酸数减少，但仍能合成抗性淀粉，说明突变体和野生型一样均能能合成直链淀粉蔗糖等。野生型突变体水稻导入了CRISPR/Cas9系统，可表达Cas9蛋白的mRNA、Cas9蛋白，以及gRNA，故选①②③。 7．分析表中数据可知，突变体b的SBE酶氨基酸个数为150个，相对于野生型而言，说明突变体在转录过程中提前出现终止密码子，从而导致翻译提前结束。即突变体基因的碱基序列可能发生了碱基对的替换、缺失、插入，进而导致转录出来的mRNA提前出现了终止密码子，故选①②③。 8．分析图1可知，SBE酶功能越弱，支链淀粉越少，直链淀粉（抗性淀粉的前体）越多，即抗性淀粉含量与SBE酶活性呈负相关。突变体a的SBE酶氨基酸缺失数量远少于突变体b，导致突变体b的SBE酶空间结构改变更为显著，其催化形成的支链淀粉含量减少，直链淀粉合成量增加；而突变体a的SBE酶活性介于野生型和突变体b之间，因此抗性淀粉含量介于野生型（低）和突变b之间。 9.（2026·上海松江·二模）超级细菌产生耐药性的一种机制是：细菌含氨苄青霉素水解酶基因，如KPC基因。研究发现，物质A可影响KPC蛋白（全长为293个氨基酸）的活性。 为探究物质A对KPC的影响，研究者表达KPC基因用于蛋白晶体结构解析及活性检测，KPC的结构如图1，质粒信息如图2，①-⑧代表酶切位点。为了便于蛋白结晶，研究者欲去除KPC中1-24及290—293位氨基酸，所用引物如图3，其中下划线处为限制性内切核酸酶NcoⅠ（5'-CCATGG-3'）和SalⅠ（5'-GTCGAC-3'）的识别序列，灰色部分为KPC基因中两端的部分碱基序列。（起始密码子为5'-AUG-3'，终止密码子为5'-UAA-3'） （1）青霉素滥用导致出现超级细菌的原因是____（编号选填）。 ①青霉素诱导细菌发生定向变异 ②青霉素诱导细菌发生不定向变异 ③青霉素对细菌进行了定向选择 ④青霉素对细菌进行了不定向选择 （2）为便于蛋白结晶，从下列研究者表达KPC基因可能涉及的步骤中，选择必须进行的操作编号并排序：____。 ①PCR扩增KPC基因的全长 ②PCR扩增部分KPC基因 ③构建表达载体 ④导入大肠杆菌 ⑤酶切PCR产物和质粒 ⑥筛选含重组质粒的大肠杆菌 （3)据上述信息，改造前、后的KPC，存在的差异有____（编号选填）。 ①多肽链的数目 ②氨基酸的数量 ③活性中心的氨基酸序列 ④活性中心的空间结构 （4）推测NcoⅠ的酶切位点最有可能位于质粒的____（用图2中的编号选填）。 （5）利用图3的引物进行PCR后，获得的产物总长度应为____bp。 （6）在设计引物1时，研究者在NcoⅠ识别序列与KPC基因序列之间，额外添加了5'-AT-3'。据所学知识推测，这一做法最可能的原因是____（单选）。 A．确保KPC基因能够复制 B．确保KPC基因能够转录 C．提高NcoⅠ的催化效率 D．确保翻译过程中密码子顺序正常 （7）改造前的KPC第289位氨基酸为甘氨酸。根据图3引物序列分析，甘氨酸的密码子是：5'-_____-3'。 （8）根据题意分析，将重组质粒导入大肠杆菌后，为了确保仅含重组质粒的菌落能生长，应选用的培养基是____（单选）。 A．液体通用培养基+氨苄青霉素 B．液体通用培养基+硫酸卡那霉素 C．固体通用培养基+氨苄青霉素 D．固体通用培养基+硫酸卡那霉素 （9）为确保大量发酵过程中质粒不丢失，发酵罐中应添加的成分及发酵应设置的条件有____（编号选填）。 ①琼脂②氨苄青霉素③硫酸卡那霉素④适度搅拌⑤通入无菌空气⑥加入消泡剂 KPC可催化CDC-1分解并释放荧光信号，荧光强度与酶活性呈正相关。为进一步研究物质A对KPC的作用，研究者开展了相关实验，结果如图4。 （10）KPC既能分解氨苄青霉素，也能分解CDC-1。据此可得____（编号选填）。 ①氨苄青霉素与CDC-1结构类似 ②氨苄青霉素与CDC-1均为KPC的抑制剂 ③氨苄青霉素与CDC-1结构不类似 ④氨苄青霉素与CDC-1均为KPC的激活剂 （11）研究者提高组2中CDC-1浓度至饱和后，发现荧光强度一直处于较低水平。据图4及所学知识判断，物质A影响KPC活性的机制符合图5中的哪一种，并说明理由____。 【答案】(1)③ (2)②⑤③④⑥ (3)② (4)④ (5)812 (6)D (7)GGC (8)D (9)③④⑤⑥ (10)① （11）机制2；回答①：KPC可以分解CDC-1并发出荧光。当加入物质A后，即便CDC- 1浓度饱和，荧光强度依然处在低水平，可能的原因只有KPC在物质A 的作用下，活性中心结构改变，CDC-1难以与KPC结合。符合机制2。 回答②：KPC可以分解CDC-1并发出荧光。若是机制1，当加入物质A 后，它与CDC-1会争夺KPC的活性中心。因此，当CDC-1浓度饱和时， 应有一部分能够争夺到KPC的活性中心，使荧光增强，但这与实验现象 不符。 【详解】（1）基因突变具有多方向性（不定向性）和随机性等特点，青霉素起筛选作用，③青霉素对细菌进行了定向选择导致出现超级细菌。 （2）基因工程的基本程序为：获取目的基因→构建重组DNA→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定；为便于蛋白结晶，研究者欲去除KPC中1-24及290-293位氨基酸，故表达KPC基因可能涉及的步骤：②PCR扩增部分KPC基因（用于检测目的基因）→⑤酶切PCR产物和质粒→③构建表达载体→④导入大肠杆菌→⑥筛选含重组质粒的大肠杆菌。 （3）研究者去除了KPC中1-24及290-293位氨基酸，改造仅去除了两端的氨基酸，多肽链仍然是1条，多肽数目不变；去掉两端共28个氨基酸，氨基酸数量改变；活性中心位于序列中间，因此活性中心的氨基酸序列和空间结构都没有改变，仅②符合。 （4）目的基因需要插入载体的启动子与终止子之间，且基因的编码链5'端应该位于启动子一侧，由图3可知，引物1中含有5'-ATG-3'，可知引物1所在的序列为目的基因的编码链，又引物1含有NcoⅠ的酶切位点；根据图2中启动子和终止子的位置，可知，NcoⅠ的酶切位点最有可能位于质粒的④位置。 （5）KPC蛋白全长为293个氨基酸，去除KPC中1-24及290-293位氨基酸后，即KPC基因长度为293×3-28×3=795bp，结合引物上的酶切识别序列可知，利用图3的引物进行PCR后，获得的产物总长度应为795bp+8bp+9bp=812bp。 （6）起始密码子是5'-AUG-3'，在设计引物1时，研究者在NcoⅠ识别序列（5'-CCATGG-3'）与KPC基因序列之间，额外添加了5'-AT-3'原因是为了保证读码框不变，确保翻译过程中密码子顺序正常。 （7）KPC蛋白全长为293个氨基酸，引物1和引物2中灰色部分为KPC基因中两端的部分碱基序列，且PCR扩增需要去除KPC中1-24及290-293位氨基酸，而引物2的互补序列是KPC基因末端序列，终止密码子为5'-UAA-3'，结合引物2上的5'-TTA-3'可知，KPC蛋白第289个氨基酸对应的密码子是5'-GGC-3'。 （8）重组质粒上具有硫酸卡那霉素抗性基因，将重组质粒导入大肠杆菌后，为了确保仅含重组质粒的菌落能生长，应选用的培养基是固体通用培养基+硫酸卡那霉素。 （9）质粒上具有硫酸卡那霉素抗性基因，为确保大量发酵过程中质粒不丢失，发酵罐中应添加的成分及发酵应设置的条件有：发酵为液体培养，不需要琼脂；需要添加硫酸卡那霉素进行选择，防止质粒丢失；发酵过程需要适度搅拌、通入无菌空气保证氧气供应，加入消泡剂消除气泡，因此选③④⑤⑥。 （10）酶具有专一性，只能催化结构类似的一类底物，KPC可以催化两种底物分解，说明氨苄青霉素和CDC-1结构类似，因此选①。 （11）分析图5可知，机制1中物质A为竞争性抑制剂，可以通过提高底物浓度解除抑制；机制2中物质A为非竞争性抑制剂，物质A结合活性中心外位点，破坏酶结构，提高底物浓度酶活性也无法恢复；研究者提高CDC-1浓度至饱和后，荧光强度仍然很低，说明提高底物浓度无法解除物质A对KPC的抑制作用，表明物质A是非竞争性抑制剂，物质A影响KPC活性的机制符合图5中的机制2。 10．（2026·上海静安·二模）高产水稻 随着耕地的减少，提高作物产量是人类面临的一个重大课题。研究发现，一种名为PEL的调控因子可能在水稻维管束鞘细胞的叶绿体发育中发挥重要作用，从而提高水稻光合效率，获得高产水稻。为此，科研人员构建了PEL基因过表达植株来研究PEL的功能。左图是部分实验过程、右图是表达载体示意图，其中ori为复制原点，Hptr为潮霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。 （1）现在PEL基因的完整序列已知，那么过程I可采用的方法有_________。（编号选填） ①PCR        ②化学合成         ③大规模筛选 （2）为促进PEL基因高水平表达，需在表达载体中加入强效启动子。则该强效启动子的位置和转录方向最可能是______。（单选） A．m，顺时针 B．m，逆时针 C．n，顺时针 D．n，逆时针 （3）过程Ⅲ培养农杆菌时，加入卡那霉素可以筛选出_________。（编号选填） ①未导入任何载体的农杆菌 ②导入过表达载体的农杆菌 ③导入“空载”载体的农杆菌 （4）过程Ⅳ中，用水稻愈伤组织作为受体细胞而不用水稻的其他细胞，可能是因为愈伤组织__________。（多选） A．全能性高，便于植株再生 B．分裂旺盛，便于基因整合 C．结构松散，便于农杆菌接触 D．含抗性基因，便于多次筛选 （5）过程Ⅴ除了在培养基中加入潮霉素外，还经常加入头孢霉素。推测同时加入这两种物质的目的是__________。（单选） A．筛选成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 B．筛选成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 C．杀死成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 D．杀死成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 （6）过程Ⅵ获得PEL基因过表达植株的过程不会发生__________（多选） A．脱分化 B．再分化 C．细胞融合 D．细胞壁再生 （7）研究PEL的功能，除PEL基因过表达水稻作为实验组外，还应设计的对照组有__________。（多选） A．野生型水稻 B．野生型小麦 C．导入“空载”载体的水稻 D．PEL基因过表达的拟南芥 （8）除了上述方法外，获得水稻高产品种的方法还有很多，请根据已学知识提出两种不同的方法，并作出简要说明。_____________________________________________。 【答案】(1)①②。 (2)D (3)②③ (4)ABC (5)B (6)ACD (7)AC （8）杂交育种：将具有不同优良性状的水稻杂交，从后代中筛选出高产的水稻新品种。诱变育种：利用物理/化学诱变剂诱导水稻发生基因突变，从变异后代中筛选出高产变异株。 （或单倍体育种：取杂交后F1的花药离体培养，秋水仙素诱导染色体加倍，可快速获得纯合高产水稻；多倍体育种：诱导水稻染色体加倍，获得多倍体高产水稻） 【详解】（1）目的基因序列已知时，可以通过PCR技术扩增获得目的基因，也可以通过人工化学合成获得；大规模筛选适用于目的基因序列未知的情况，因此选①②。 （2）启动子是RNA聚合酶结合位点，需要位于目的基因的上游，且转录方向需要和目的基因一致。由图可知，PEL基因转录方向为向左，也就是逆时针方向，因此启动子应位于PEL基因上游位置n，转录方向为逆时针，故选D。 （3）卡那霉素抗性基因（Kanr）位于载体上，无论是插入PEL的过表达载体，还是空载载体都携带该抗性基因，因此导入了载体（过表达载体/空载）的农杆菌都能在含卡那霉素的培养基存活，未导入载体的农杆菌会被杀死，因此可筛选出②③。 （4）愈伤组织是植物细胞脱分化形成的薄壁细胞：全能性高，更容易再生为完整植株；分裂旺盛，便于外源基因整合到受体染色体上；结构松散，便于农杆菌接触感染；水稻愈伤组织本身不含抗性基因，抗性基因来自导入的载体，D错误，故选ABC。 （5）潮霉素抗性基因用于筛选成功转化（导入目的基因）的愈伤组织；头孢霉素是抗生素，可以杀死共培养后残留的农杆菌，避免农杆菌过度生长影响愈伤组织发育，故选B。 （6）过程VI是将已经获得的目标愈伤组织培养为完整植株，该过程会发生再分化，脱分化是获得愈伤组织的过程，已经在之前步骤完成，本过程不会发生；该实验是转基因技术，不涉及细胞融合，且愈伤组织本身已有细胞壁，不需要再产生细胞壁，因此不会发生的是ACD。 （7）实验目的是研究PEL基因在水稻中的功能，对照组需要设置野生型水稻（和过表达植株比较性状）、导入空载载体的水稻（排除转基因操作、载体插入位点对结果的干扰），实验对象为水稻，不需要其他物种对照，故选AC。 （8）除了上述方法外，获得水稻高产品种的方法还有很多，如①杂交育种：将具有不同优良性状的水稻杂交，从后代中筛选出高产的水稻新品种。②诱变育种：利用物理/化学诱变剂诱导水稻发生基因突变，从变异后代中筛选出高产变异株。 （或单倍体育种：取杂交后F1的花药离体培养，秋水仙素诱导染色体加倍，可快速获得纯合高产水稻；多倍体育种：诱导水稻染色体加倍，获得多倍体高产水稻） 11.（2026·上海虹口·二模）B细胞淋巴瘤的免疫治疗 B细胞淋巴瘤是由B淋巴细胞生命进程异常引发的疾病。研究人员尝试通过制备“单抗”（单克隆抗体）和“双抗”（双特异性抗体）药物治疗该疾病，部分作用原理如图（a）所示。抗体分子包含Fab段和Fc段，Fab段中VH和VL共同构成抗原结合位点，部分结构如图（b）所示。研究发现，Fc受体和免疫活性物质a受体分别与相应分子结合后，可增强吞噬细胞的功能。（箭头表示作用方向） （1）与正常细胞相比，B细胞淋巴瘤细胞可能发生的变化有_______。（多选） A．细胞凋亡水平异常降低 B．细胞获得无限增殖的能力 C．细胞中原癌基因的表达水平异常升高 D．细胞中抑癌基因对细胞增殖起负调控作用 （2）若用细胞工程制备“单抗”，所涉及的生物技术有_______。（编号选填） ①细胞融合技术    ②原代培养技术    ③胚胎移植技术 ④显微注射技术    ⑤传代培养技术    ⑥细胞核移植技术 （3）欲利用基因工程制备图所示的“单抗”，若VL和VH编码序列中均含有X酶的识别序列，而载体含有Y酶和Z酶的识别序列。据题干信息，获取的目的基因是_______；PCR扩增产物的两端应包含_______。（编号选填）（注：上述限制性内切核酸酶识别序列各不相同） ①X酶的识别序列 ②Y酶的识别序列 ③Z酶的识别序列 ④抗CD20的抗体的VL编码序列 ⑤抗CD20的抗体的VH编码序列 ⑥抗TCR/CD3的抗体的VL编码序列 ⑦抗TCR/CD3的抗体的VH编码序列 ⑧分泌抗CD20的抗体的杂交瘤细胞总RNA逆转录成的DNA （4）在利用基因工程制备“双抗”的过程中，可依次采取的检测方法有_______。（编号排序） ①检测是否成功获得目的基因的表达产物 ②用限制性内切核酸酶切割重组DNA分子 ③检测目的基因的表达产物是否与抗原结合 ④用凝胶电泳法鉴定酶切后的DNA分子片段 （5）研究人员检测了用“双抗”治疗一段时间内实验动物的相关数据，如图所示。为保证药效，应保持血清中“双抗”浓度不低于_______。（用图中的编号选填） （6）请比较用“单抗”和“双抗”治疗B细胞淋巴瘤的效果，并据相关信息简述理由_____________________。 【答案】(1)ABC (2)①②⑤ (3) ④⑤ ②③ (4)②④①③ (5)③ （6）双抗治疗效果优于单抗，原因是双抗可同时结合B细胞淋巴瘤细胞和CD8⁺T细胞，除了可激活吞噬细胞杀伤癌细胞外，还能诱导CD8⁺T细胞分化为细胞毒性T细胞，特异性杀伤B细胞淋巴瘤细胞 【详解】（1）AB、B细胞淋巴瘤细胞属于癌细胞，癌细胞的特点是凋亡受阻，凋亡水平异常降低，获得无限增殖的能力，AB正确； C、原癌基因突变后其表达异常升高，促进细胞异常增殖，C正确； D、正常细胞中抑癌基因对增殖起负调控作用，癌细胞中抑癌基因突变失活或活性降低，负调控功能丧失，D错误。 （2）细胞工程制备单克隆抗体，需要将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合（①），对融合得到的杂交瘤细胞进行动物细胞培养，动物细胞培养包含原代培养（②）和传代培养（⑤）；胚胎移植、显微注射、细胞核移植均不涉及，故选①②⑤。 （3）分析题意，本实验目的是制备针对B细胞淋巴瘤的单抗，单抗结合的抗原是淋巴瘤细胞的CD20蛋白，因此目的基因是抗CD20抗体的VL和VH​编码序列（④⑤）；已知VL​和VH​内部都含有X酶识别序列，不能用X酶切割，载体只有Y酶、Z酶的识别序列，因此PCR扩增产物的两端需要加上Y酶和Z酶的识别序列（②③），才能将目的基因完整插入载体。 （4）基因工程的检测顺序：首先验证重组DNA构建是否正确，先用限制酶切割重组DNA（②），再通过凝胶电泳鉴定酶切片段的大小是否正确（④）；随后检测目的基因是否成功表达出蛋白质（①），最后检测表达产物是否具有特异性结合抗原的功能（③），因此顺序为②④①③。 （5）由图可知，当血清中双抗浓度低于③对应浓度后，B细胞淋巴瘤细胞数量开始快速上升，药效丧失，因此需要保持浓度不低于③。 （6）双抗可同时结合B细胞淋巴瘤细胞和CD8⁺T细胞，除了可激活吞噬细胞杀伤癌细胞外，还能诱导CD8⁺T细胞分化为细胞毒性T细胞，特异性杀伤B细胞淋巴瘤细胞，比单抗多了细胞免疫的杀伤途径，因此抗肿瘤效果更强。 20 / 21 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