2026届高三生物一轮复习导学案教学设计课件重叠延伸PCR定点突变技术

重叠延伸PCR定点诱变技术 授课教师：江傅焜 一、教学目标 1. 生命观念：阐述重叠延伸PCR的原理。 2. 科学思维：我能准确说出重叠延伸PCR的原理，并能像科学家一样，通过画图解释为什么需要4条引物。 3. 探究实践：能独立设计含突变位点的引物系统，分组完成纸质链段的退火与延伸模拟实验，提升科学探究与协作解决问题的能力。 二、教学重难点 重点：掌握重叠延伸PCR的基本原理与操作流程； 难点：准确绘制并解释PCR过程中中各类DNA产物的生成过程。 回顾基础，回答以下问题： 1.什么是引物？ 2.引物在DNA复制中的作用是？为什么需要引物？ 3.PCR反应中需要加入几种引物？为什么？ 4.设计引物的依据是？ 5.引物设计的原则是？ 6.如果设计引物时，假设我们故意让引物上的某一个碱基与模板不配对（错配），你们觉得，PCR反应还能进行吗？如果能进行，新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 回顾基础，回答以下问题： 1.什么是引物？ 2.引物在DNA复制中的作用是？为什么需要引物？ 3.PCR反应中需要加入几种引物？为什么？ 引物是一小段能与DNA_____________________________互补配对的短单链核酸（P77相关信息）。 使DNA聚合酶能够从引物的_________端开始连接脱氧核苷酸。 DNA聚合酶__________（填“能”或“不能”）从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸加至已有核酸链的游离3'-羟基上，即它需要引物链的存在。 ____种，DNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列_______(填“相同”或“不同”)，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 母链的一段碱基序列 3’ 不能 2 不同 回顾基础，回答以下问题： 4.设计引物的依据是？ 5.引物设计的原则是？ 6.如果设计引物时，假设我们故意让引物中间的某一个碱基与模板不配对（错配），你们觉得，PCR反应还能进行吗？如果能进行，新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 要有一段已知目的基因的_________(提示：填核酸的基本单位)序列。 引物与母链碱基互补配对； 引物自身且两种引物之间_____（填“能”或“不能”）发生碱基互补配对； 引物的长度要适宜； 严格控制引物中________(填“A、T”或“G、C”)含量。 核苷酸 不能 G、C 回顾基础，回答以下问题： 6.如果设计引物时，假设我们故意让引物中间的某一个碱基与模板不配对（错配），你们觉得，PCR反应还能进行吗？ 如果我们在设计引物时，故意让引物中间的某一个碱基与模板不配对（错配），PCR反应________进行。（填“还能”或“不能”） 如果能进行，新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 它会在这个位点引入一个_________(填“突变”或“新的碱基序列”)。利用这个原理，我们就可以在体外对基因进行精准的改造，这就是我们今天要学习的——重叠延伸PCR定点突变技术。 还能 突变 重叠延伸PCR PCR定点突变技术 给你3分钟自主分析整个过程。 8 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 PCR定点突变技术 9 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 PCR定点突变技术 10 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 11 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 ? 引物4 12 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 ? 引物2 引物3 方案一： 引物1 引物4 引物4 方案二： Taq酶 Taq酶 Taq酶 Taq酶 引物4 引物1 13 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 ? 引物2 引物3 方案一： 引物1 引物4 引物4 方案二： Taq酶 Taq酶 Taq酶 Taq酶 引物4 引物1 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 对比： 怎么快速判断引物的碱基序列？ 14 引物4 引物1 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 突变前： 突变后： 引物3 ？ ？ 引物2 ？ ？ 互补 互补 【规律小结】 15 跟踪训练1 重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。 下列说法错误的是（ ） A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物 B 跟踪训练2 重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR 扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将水蛭基因组上的水蛭素基因glpk的第47位氨基酸M突变为I，构建出了高抗凝血活性的水蛭素（为什么将第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸就能提高抗凝血活性？这个氨基酸的变化是如何由DNA层面的碱基突变决定的？），其原理如下图。请回答下列问题： (1)含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的_______。通过PCR1获得产物AB需要进行___________次的PCR扩增。 b和c 3 跟踪训练3 基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术，图示为利用PCR技术进行定点突变的流程。 (1) 第一阶段PCR过程中需要进行___轮循环才会出现所需的DNA 片段，酶①应为_________________，引物X和Y分别为______和_______。 (2) 要完成两处位点的定点突变，共需要设计____种引物，通过该技术获得的突变基因_______(填“不可以”或“可以”表达出原来自然界不存在的蛋白质。 2 耐高温的DNA聚合酶 引物2 引物4 6 可以 【课堂总结】 重叠延伸PCR是一种PCR定点突变技术。 该技术正常突变一处位点，要使用__条引物（如图所示），其中引物2和3的突起处代表与模板链______互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的.因此，分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在__________酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 4 DNA聚合 不能 【课后作业1】 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图4所示。 （1）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为________（假设引物为单链DNA）。 T-A或C-G A或G 【课后作业1】 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图4所示。 （2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生_____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为________________________________________________________________。 3 引物2和引物3中存 在互补片段，置于同一反应 体系时会发生结合而失去作用 【课后作业2】 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是______________________除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________________________________________________________(答出2个结构即可)。 RNA聚合酶 限制酶的酶切位点、 标记基因、复制原点 【课后作业2】 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的____________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F2和R1或F1和R2 a链 【课后作业2】 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。条带2所检出的蛋白__________________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 不是 【课堂反馈】 教学目标 对应的评价任务（表现性指标） 能阐述重叠延伸PCR的原理 课堂总结的填空，我正确了_____小题 能运用归纳、演绎与模型建构的方法，解释PCR过程中各类DNA产物的生成逻辑，准确绘制反应流程图 跟踪训练1-3，我正确了____小题 能独立设计含突变位点的引物系统，分组完成纸质链段的退火与延伸模拟实验 动画演示，我能正确完成实验模拟操作 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $ 重叠延伸PCR定点诱变---教学设计 教材分析： 本教学内容隶属于高中生物学“生物技术与工程”模块，是基因工程单元的深化与拓展。在知识体系上，它承接了DNA复制、中心法则、常规PCR扩增及基因表达载体构建等前置知识，并为后续学习CRISPR-Cas9等现代基因编辑技术奠定基础。其核心概念包括PCR扩增原理、引物设计原则、DNA聚合酶的作用机制以及基因改造的基本逻辑。 从课程标准来看，该内容紧密对接《普通高中生物学课程标准》中关于“发展科学思维、提升探究实践能力”的要求，尤其强调通过模型建构培养学生批判性思维。同时，通过对水蛭素基因改造这一真实科研情境的剖析，引导学生理解生命观念中的“结构与功能相适应”。 学情分析： 授课对象为高二学生，已系统学习过必修与选择性必修基因工程的课程，具备一定的生物学基础知识。他们熟悉DNA双螺旋结构、半保留复制过程、转录翻译机制以及常规PCR的操作流程，对限制酶、连接酶、质粒载体等基因工程基本工具也有一定了解。此外，学生已具备一定的图表分析能力，能够解读电泳图谱并进行简单的数据推理，且在前期学习中积累了小组合作探究的经验。 然而，在认知层面仍存在潜在障碍：首先，对于“引物自身可作为模板”这一反向思维模式较为陌生，难以理解第二轮PCR中无外加引物即可完成拼接的机制；其次，多轮PCR后产物种类繁多，学生容易混淆不同阶段生成的DNA片段；最后，部分学生易将“互补引物”与“非特异性结合”混为一谈，影响对实验设计严谨性的认识。 值得肯定的是，学生普遍关注前沿生物科技动态，对医药健康类话题兴趣浓厚，尤其喜欢动手模拟、角色扮演等互动性强的学习方式。因此，采用任务驱动、模型建构的教学策略，能有效激发其探究欲望，促进深度学习的发生。 教学目标： 1. 生命观念：能阐述重叠延伸PCR的原理，解释碱基序列的改变如何导致蛋白质功能的改变。 2. 科学思维：能利用纸笔绘制PCR过程中各类DNA产物的生成逻辑图；能运用归纳演绎法，推导出突变位点对应的碱基变化。 3. 科学探究：能独立设计含突变位点的引物对，通过模拟实验验证重叠延伸的过程。 教学重难点： 教学重点：掌握重叠延伸PCR的基本原理与操作流程； 教学难点：准确绘制并解释PCR过程中中各类DNA产物的生成过程。 突破策略 针对上述难点，采用“动画演示+分步绘图”的教学方法。首先播放动态视频展示PCR循环全过程，帮助学生建立整体印象；随后引导学生分步绘制每一轮PCR后的产物示意图，强化细节记忆；最后提供纸质DNA链与引物卡片，让学生亲手模拟高温变性、降温退火与聚合酶延伸的过程，直观体验“搭桥”机制，将抽象的分子事件具象化，从而突破认知瓶颈。 教学过程： 环节1： 1.视频导入：展示PCR全过程模拟动画。回顾引物相关基础知识点。 1.1 什么是引物？ 引物是一小段能与DNA_____________________________互补配对的短单链核酸（P77相关信息）。 1.2 引物在DNA复制中的作用是？为什么需要引物？ 使DNA聚合酶能够从引物的_________端开始连接脱氧核苷酸。DNA聚合酶__________（填“能”或“不能”）从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸加至已有核酸链的游离3'-羟基上，即它需要引物链的存在。 1.3 PCR反应中需要加入几种引物？为什么？ ____种，DNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列_______(填“相同”或“不同”)，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 1.4 设计引物的依据是？ 要有一段已知目的基因的_________(提示：填核酸的基本单位)序列。 1.5 引物设计的原则是？ 引物与母链碱基互补配对； 引物自身且两种引物之间_____（填“能”或“不能”）发生碱基互补配对； 引物的长度要适宜； 严格控制引物中________(填“A、T”或“G、C”)含量。 1.6 如果设计引物时，假设我们故意让引物上的某一个碱基与模板不配对（错配），你们觉得，PCR反应还能进行吗？如果能进行，新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 如果我们在设计引物时，故意让引物中间的某一个碱基与模板不配对（错配），PCR反应________进行。（填“还能”或“不能”） 新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 它会在这个位点引入一个______________________________(填“突变”或“新的碱基序列”)。 环节2：任务探究 2.展示重叠延伸PCR基本流程图，要求同学们3分钟内，整理好流程图的过程。 内容解析： 2.1 请画出两个反应体系中，引物1和引物2；引物3和引物4的延伸结果 2.2 请画出第二次PCR的延伸结果 我们想得到的定点突变的目的基因如图所示，那应该如何获得目的基因呢？ 请同学们根据一开始的流程图，思考如何获得上述的目的基因。（画图） 怎么快速判断引物的碱基序列？观察突变前、突变后的DNA，你能发现什么规律？ 环节3：考点迁移训练 跟踪训练1 重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是（ ） A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物 跟踪训练2 重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR 扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将水蛭基因组上的水蛭素基因glpk的第47位氨基酸M突变为I，构建出了高抗凝血活性的水蛭素，其原理如下图。请回答下列问题： 含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的___________________________。通过PCR1获得产物AB需要进行___________次的PCR扩增。 跟踪训练3 基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术，图示为利用PCR技术进行定点突变的流程。 (1) 第一阶段PCR过程中需要进行___轮循环才会出现所需的DNA 片段，酶①应为_________________________________________，引物X和Y分别为__________和___________。 (2) 要完成两处位点的定点突变，共需要设计____种引物，通过该技术获得的突变基因___________(填“不可以”或“可以”表达出原来自然界不存在的蛋白质。 【课堂总结】 重叠延伸PCR是一种PCR定点突变技术。 该技术正常突变一处位点，要使用__条引物（如图所示），其中引物2和3的突起处代表与模板链______互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的.因此，分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在__________酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 课堂统计： 重叠延伸PCR定点诱变课后作业： 姓名：__________ 班级：_________ 评价： 1.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图4所示。 （1）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为___________________才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为_____________（假设引物为单链DNA）。 （2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生_____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为________________________________________________________________。 2.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是______________________除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________________________________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的____________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。条带2所检出的蛋白__________________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 1 学科网（北京）股份有限公司 $ 重叠延伸PCR定点诱变---学案 教学目标： 1. 生命观念：能阐述重叠延伸PCR的原理，解释碱基序列的改变如何导致蛋白质功能的改变。 2. 科学思维：能利用纸笔绘制PCR过程中各类DNA产物的生成逻辑图；能运用归纳演绎法，推导出突变位点对应的碱基变化。 3. 科学探究：能独立设计含突变位点的引物对，通过模拟实验验证重叠延伸的过程。 教学重难点： 教学重点：掌握重叠延伸PCR的基本原理与操作流程； 教学难点：准确绘制并解释PCR过程中中各类DNA产物的生成过程。 教学过程： 环节1： 1.视频导入：展示PCR全过程模拟动画。回顾引物相关基础知识点。 1.1 什么是引物？ 引物是一小段能与DNA_____________________________互补配对的短单链核酸（P77相关信息）。 1.2 引物在DNA复制中的作用是？为什么需要引物？ 使DNA聚合酶能够从引物的_________端开始连接脱氧核苷酸。DNA聚合酶__________（填“能”或“不能”）从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸加至已有核酸链的游离3'-羟基上，即它需要引物链的存在。 1.3 PCR反应中需要加入几种引物？为什么？ ____种，DNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列_______(填“相同”或“不同”)，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 1.4 设计引物的依据是？ 要有一段已知目的基因的_________(提示：填核酸的基本单位)序列。 1.5 引物设计的原则是？ 引物与母链碱基互补配对； 引物自身且两种引物之间_____（填“能”或“不能”）发生碱基互补配对； 引物的长度要适宜； 严格控制引物中________(填“A、T”或“G、C”)含量。 1.6 如果设计引物时，假设我们故意让引物上的某一个碱基与模板不配对（错配），你们觉得，PCR反应还能进行吗？如果能进行，新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 如果我们在设计引物时，故意让引物中间的某一个碱基与模板不配对（错配），PCR反应________进行。（填“还能”或“不能”） 新合成出来的子代DNA链会发生什么变化？ 它会在这个位点引入一个______________________________(填“突变”或“新的碱基序列”)。 环节2：任务探究 2.展示重叠延伸PCR基本流程图，要求同学们3分钟内，整理好流程图的过程。 内容解析： 2.1 请画出两个反应体系中，引物1和引物2；引物3和引物4的延伸结果 2.2 请画出第二次PCR的延伸结果 我们想得到的定点突变的目的基因如图所示，那应该如何获得目的基因呢？ 请同学们根据一开始的流程图，思考如何获得上述的目的基因。（画图） 怎么快速判断引物的碱基序列？观察突变前、突变后的DNA，你能发现什么规律？ 环节3：考点迁移训练 跟踪训练1 重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是（ ） A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物 跟踪训练2 重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR 扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将水蛭基因组上的水蛭素基因glpk的第47位氨基酸M突变为I，构建出了高抗凝血活性的水蛭素，其原理如下图。请回答下列问题： 含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的___________________________。通过PCR1获得产物AB需要进行___________次的PCR扩增。 跟踪训练3 基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术，图示为利用PCR技术进行定点突变的流程。 (1) 第一阶段PCR过程中需要进行___轮循环才会出现所需的DNA 片段，酶①应为_________________________________________，引物X和Y分别为__________和___________。 (2) 要完成两处位点的定点突变，共需要设计____种引物，通过该技术获得的突变基因___________(填“不可以”或“可以”表达出原来自然界不存在的蛋白质。 【课堂总结】 重叠延伸PCR是一种PCR定点突变技术。 该技术正常突变一处位点，要使用__条引物（如图所示），其中引物2和3的突起处代表与模板链______互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的.因此，分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在__________酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 课堂统计： 重叠延伸PCR定点诱变课后作业： 姓名：__________ 班级：_________ 评价：_________ 1.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图4所示。 （1）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为___________________才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为_____________（假设引物为单链DNA）。 （2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生_____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为________________________________________________________________。 2.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是______________________除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________________________________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的____________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。条带2所检出的蛋白__________________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 1 学科网（北京）股份有限公司 $