2027届高三生物一轮复习课件 重组DNA技术的基本工具

该高中生物学高考复习课件聚焦基因工程专题，覆盖重组DNA技术基本工具（限制酶、DNA连接酶、运载体）及DNA粗提取与鉴定实验等核心考点，依据高考评价体系分析限制酶作用规律、运载体条件等高频考点权重，归纳选择、实验设计、综合应用等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“考点深度解析+高考真题实训+核心素养融合”，如通过双酶切法防止目的基因环化、标记基因筛选重组质粒等典型实例，培养科学思维和探究实践素养，指导学生掌握实验关键步骤与答题技巧，助力学生高效冲刺，为教师复习教学提供精准指导。

第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 发光树 棉花 棉铃虫 导入抗虫基因 第四届花生 为什么不用杂交育种？诱变育种？写出实验思路（基因工程+植物组织培养） 在原有基因上发生基因突变，产生新基因——等位基因 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 1.DNA是遗传物质， 不同个体可以转移。 2.测定氨基酸序列的方法，胰岛素氨基酸序列的测定。 3.DNA双螺旋结构模型，遗传物质自我复制的假说。 4.实验证明DNA的半保留复制。不久，克里克提出中心法则。 5.破译氨基酸的密码子。 7.发现了第一个限制酶。 6.质粒可自我复制，可在细菌细胞间转移。 9.成功构建了体外重组DNA分子。 10.基因工程正式问世。 13.重组人胰岛素被批准上市。 1944年 1950年 1953年 1958年 1961年 1967年 1970年 20世纪70年代初 1972年 1973年 1982年 8.多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶。 11.发明了DNA序列分析的方法。 1977年 14.第一例转基因烟草。 1983年 15.第一条转基因鱼。 1984年 16.PCR为获取目的基因提供了有效手段。 1985年 17.人类基因组计划启动。 1990年 18.发明多种高通量测序技术。 21世纪 19.对特定基因的定点插入、敲除或替换。 2013年 生物化学、分子生物学和微生物学等学科→基因工程。   第四届花生 1.概念： 2.基本工具： 一、基因工程概念及其基本工具：（P67—73） 苏云金杆菌 抗虫棉 导入抗虫基因 按照人们的愿望，通过______等技术赋予生物__________ __，创造出更符合人们需要的新的________和________。 转基因 新的遗传特 性 生物类型 生物产品 第四届花生 毒蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。毒蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，毒蛋白不会对人畜产生上述影响。 1.基因工程概念： （1）别 名： （2）原 理： （3）操作对象： （4）操作水平： （5）操作环境： （6）操作目的： （7）优 点： 主要在生物体外。 基因（具有遗传效应的DNA片段）。 DNA分子水平。 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品。 基因重组 定向改造生物的遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍。 重组DNA技术 第四届花生 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 思考1：基因重组？ ①减数分裂形成配子时 ②人为类型 第四届花生 思考2：为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ ①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸； ②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。 ③都遵循碱基互补配对原则。 第四届花生 复习DNA基本单位、连接方式、结构 思考3：为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ ①基因是控制生物性状的独立遗传单位； ②基因的表达过程相同； ③生物界共用一套遗传密码。 第四届花生 相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质，同一蛋白质在不同细胞中的功能相同。 思考4：基因工程的基本步骤？DNA双螺旋的直径只有2nm，操作的“分子工具”？ 苏云金杆菌 普通棉花(无抗虫特性) 抗虫基因 导入棉花细胞 提取 抗虫棉： 含Bt抗虫蛋白 将体外重组DNA分子导入受体细胞 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 第四届花生 毒蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。毒蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，毒蛋白不会对人畜产生上述影响。 2.基本工具： （1）分子手术刀——限制性内切核酸酶： （2）分子缝合针——DNA连接酶： （3）分子运输车——载体： 第四届花生 （1）分子手术刀——限制性内切核酸酶： ①简 称： ②来 源： ③化学本质： ③种 类： ④命 名： ⑤作 用： ⑥识别序列： ⑦作用结果： 限制酶 主要是原核生物。 蛋白质 数千种 （一类酶） 生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母 第四届花生 （1）分子手术刀——限制性内切核酸酶： ⑤作用： 5' 3' 5' 3' T A G G T A T C C A 能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 磷酸二酯键 专一性 第四届花生 限制酶通常不能切割单链DNA。其识别位点依赖双链DNA的特定序列（如EcoRI识别GAATTC↓），单链状态下无法形成稳定的酶-底物复合物。绝大多数限制酶不切割RNA。其进化功能是保护细菌免受噬菌体DNA入侵 思考1：限制性酶与一般酶的共同点？ 思考2：限制性酶切细菌本身的DNA？为什么？存在作用？ 噬菌体侵染细菌 催化作用、专一性、活性受温度、PH的影响。 不会： ①通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 ②通过长期的进化，细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列。 作用：用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。 第四届花生 1.细菌，没有核膜，没有免疫系统。进化出一种自保的防御机制，细菌能切割外源DNA（如病毒基因组），从而限制外源遗传物质的扩散。 2.“限制”外源遗传物质的扩散；“内切”表明酶在DNA链内部切割（而非从末端开始） ；作用于核酸，限制酶特指切割DNA的酶。 （1）分子手术刀——限制性内切核酸酶： ⑥识别序列： ⑦作用结果： 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，（少数4个、8个或其他数量）。 中轴线 黏性末端 平末端 产生黏性末端或平末端。 第四届花生 限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。 SmaⅠ Eco RⅠ 识别序列：____________； 切割部位：____________________ 5' 3' G C T T A A 3' 5' A A T T C G 中轴线 识别序列：____________； 切割部位：____________________ 5'-GAATTC-3' GA之间的磷酸二酯键 黏性末端：_________ C C 3' 5' G G G C 5' 3' C G G G C C 5'-CCCGGG-3' CG之间的磷酸二酯键 中轴线 平末端 5'-AATT-3' ①限制酶作用1次，断___个___________，形成___个黏性（平）末端； ②____键自动断， 但形成平末端时不断氢键！ 2 磷酸二酯键 氢 ⑦作用结果： 产生黏性末端或平末端。 2 第四届花生 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 1个切割位点，2个黏性末端；1个切割位点，2个平末端 现学现用1——P75思考.讨论： 找到两条片段上Eco RⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”、重组。 ① ② ③ ④ ⑤ 第四届花生 现学现用1——P75思考.讨论： AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC…3′ GCCGTATG…5′ 3′…TATCGTACGATAGGTACTTAA 5′…ATAGCATGCTATCCATG 5′…TCCTAG 3′…AGGATCTTAA AATTCCATAC…3′ GGTATG…5′ ③同种限制酶切割不同DNA产生相同的黏性末端→可重新连接成新的DNA分子，但仍可被原来的限制酶切割。 思考1：单酶切法重组DNA的结果？ ① ② ③ ④ ⑤ 第四届花生 单酶切法重组DNA的局限性： ①自身环化、自连； ②目的基因反向连接； 第四届花生 【过渡】如何解决这些问题？ 现学现用3——P75拓展题2： ④不同限制酶切割不同DNA可能产生相同的黏性末端→可重新连接成新的DNA分子，可能不会被原来的限制酶切割。 同尾酶 第四届花生 1.同尾酶：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。 思考2：选择哪种限制酶来获得Bt基因？ 现学现用4——模拟切出苏云金杆菌DNA分子中的“Bt抗虫基因” 5’--GGATCCC…TGAATTCAT …CCCGGG…GCTAAGCTTGATCGAATTCAA--3’ 3’--CCTAGGG…ACTTAAGTA…GGGCCC…CGATTCGAACTAGCTTAAGTT--5’ Bt基因 原则：切下且不破坏目的基因。 Bam HⅠ EcoRⅠ    SmaⅠ HindⅢ 思考1：要获得目的基因，一般需要__个酶切位点、断__个磷酸二酯键、形成__个末端。     2 4 4 EcoRⅠ    第四届花生 切取目的基因时所选限制酶不能切断目的基因，当目的基因两侧都有限制酶的识别序列时，可用相应限制酶将目的基因切下。 双酶切法优点： 防止自身环化、反向连接→简化后续操作，提高重组率。 第四届花生 切取目的基因时所选限制酶不能切断目的基因，当目的基因两侧都有限制酶的识别序列时，可用相应限制酶将目的基因切下。 可以用同一种限制酶切下（单酶切），也可用两种限制酶切下（双酶切）。 思考1：可否将Bt基因直接导入棉花细胞？ 植物组织培养 资料1：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；即便可进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 资料2：1967年，科学家发现一种独立于细菌拟核DNA之外且可以进行自我复制的环状DNA分子——质粒，其可以在细菌之间转移，是基因转移的载体。在之后，科学家又相继在真菌和一些植物细胞中发现了质粒。 抗虫棉 苏云金杆菌 导入 棉花细胞 思考2：质粒的本质？如何将二者连起来？ 第四届花生 2.基本工具： （3）分子运输车——载体： ①作用： ②种类： ①质粒： ②区别： ③条件： 将外源基因送入受体细胞，并使其大量复制、表达。 苏云金杆菌 导入 棉花细胞 质粒、噬菌体、动植物病毒等。 第四届花生 ①质粒： ②与噬菌体、动植物病毒的区别： 裸露的、结构简单、独立于______________或____________ 之外，并具有 能力的 。 真核细胞细胞核 原核细胞拟核DNA 自我复制 环状双链DNA分子 最常用的载体、天然基础上人工改造的。 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差别。 第四届花生 学生疑惑点：”裸露“，指的是质粒的DNA没有结合任何蛋白质，使其能够直接与细菌相互作用。 ③作为载体的条件： 复制原点 目的基因 插入位点 氨苄青霉素抗性基因 b.能在受体细胞复制并稳定保存； a.有一个至多个限制酶切割位点； EcoR Ⅰ Sma Ⅰ . . . c.有标记基因； d.对受体细胞无害。 （便于目的基因插入） （便于重组DNA分子的筛选） （便于目的基因扩增） 送目的基因，并使目的基因进行大量复制。 第四届花生 启动子: 转录的起点，在转录过程中起调控作用。终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。提示：①载体能与外源基因连接需具备什么条件？ ②载体要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在需具备什么条件？ ③我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 思考1：如何筛选出被导入了载体的大肠杆菌？ 培养 加入氨苄青霉素 结果：导入重组质粒或普通载体的大肠杆菌存活并繁殖。 导入 第四届花生 ①原理：导入载体的细胞的获得抗性基因并在细胞内表达，受体细胞产生抗性→可用添加相应物质的选择培养基筛选。 目的基因一定成功重组到质粒上了吗？ 思考2：如何筛选出重组质粒？ 氨苄青霉素抗性基因 新霉素 抗性基因 ①选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？为什么？ 3种限制酶不是同尾酶 防止目的基因和质粒的自身环化； 防止目的基因反向连接到载体上。 双酶切法：Hind Ⅲ、PstⅠ； 第四届花生 思考2：如何筛选出重组质粒？ 氨苄青霉素抗性基因 新霉素 抗性基因 3种限制酶不是同尾酶 目的基因 插入位置 ②筛选原理及思路： 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含1个标记基因，普通质粒上含有2个标记基因。 不具有抗性 1个抗性 2个抗性 第四届花生 思考2：如何筛选出重组质粒？ ②筛选原理及思路： 氨苄青霉素抗性基因 新霉素 抗性基因 目的基因 插入位置 图1 图2 先将受体细胞放在含______的培养基上培养，再通过________法在__________培养基上培养，选择__________________________的细胞即为含目的基因载体的受体细胞。 新霉素 影印接种 氨苄青霉素 抗新霉素但不能抗氨苄青霉素 第四届花生 资料：LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 无法存活 存活；白色 存活；蓝色 现学现用5——模拟切出苏云金杆菌DNA分子中的“Bt抗虫基因” 第四届花生 5’--… TG 3’--…ACTTAA AATTCA…--3’ GT…--5’ Bt基因 GTA…GGGCCC…AGCTTAA AATTCAT …CCCGGG…TCG 苏云金杆菌 思考3：如何将目的基因与“分子运输车”连接起来呢？ 第四届花生 2.基本工具： （2）分子缝合针——DNA连接酶： ①作用：将___________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的__________。 ②种类： 双链DNA片段 磷酸二酯键 （氢键自动形成） E.coli DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶 E.coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 DNA连接酶作用没有特异性，可以连接多种末端。 第四届花生 DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA!DNA连接酶作用没有特异性。可以连接多种末端 限制酶的选择技巧 图甲：目的基因片段 图乙：质粒 ①不能破坏目的基因、标记基因→选择两端的限制酶切割位点；如SmaⅠ（×）； ②切割目的基因、质粒的用同种酶或同尾酶→产生相同的黏性末端。 方案一： 只用PstⅠ切割目的基因和质粒。 方案二： 同时用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒。 重组质粒时，同尾酶使切割位点的选择范围扩大。 单酶切法：环化、自连、反向连接； 双酶切法：防止自身环化、反向连接→简化后续操作、提高重组率。 第四届花生 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ； ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ； ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的割位点) ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端 AATTCA…--3’ GT…--5’ Bt基因 GTA…GGGCCC…AGCTTAA AATTCAT …CCCGGG…TCG 5’--… TG 3’--…ACTTAA AATTCA…--3’ GT…--5’ Bt基因 GTA…GGGCCC…AGCTTAA CAT …CCCGGG…TCG 5’--… TG 3’--…ACTTAA AATT DNA连接酶 DNA聚合酶 磷酸二酯键 片段 平末端 碱基互补配对的黏性末端 ：将单个脱氧核苷酸连接到已有的核酸片段3’末端。 思考4：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ 第四届花生 头脑风暴——最大可能挖掘相关酶的考点： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 ⑥水解酶 ⑦逆转录酶 作用、结果？ 限制酶 DNA连接酶 解旋酶 DNA聚合酶 第四届花生 项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较 第四届花生 小结：重组DNA技术的基本工具 E.coli DNA连接酶 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 作用部位： 种类 DNA连 接酶 切开DNA分子的磷酸二酯键 主要存在于原核生物中 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上 ④ 常有特殊的标记基因 运载 工具 条件 种类： 磷酸二酯键 限制酶 作用部位： 来源： 特点： 作用结果： 产生黏性末端或平末端 第四届花生 学以致用： 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 取出 转移 请你描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉。 思考：如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？ 物理、化学性质差异 第四届花生 细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。 一、基因工程概念及其基本工具：（P67—75） 3.DNA的粗提取与鉴定： （1）实验原理： （2）材料用具： （3）实验步骤： （4）结果分析与评价： 第四届花生 思考：如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？（细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。） 3.DNA的粗提取与鉴定： （1）实验原理： ①提取原理： ②鉴定原理： DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 第四届花生 3.DNA的粗提取与鉴定： （2）材料用具： ①材料的选取： 含DNA的生物材料，含量相对较高的成功率更大。 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多、材料易取。 第四届花生 柠檬酸钠防止血液凝固的原理是通过与血液中的钙离子结合，形成可溶性的柠檬酸钙，从而减少血液中钙离子的浓度。钙离子在血液凝固过程中扮演着关键角色，它的减少有效地阻止了血液凝固。 3.DNA的粗提取与鉴定： （2）材料用具： 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺 ②试剂 蒸馏水 溶解并提取DNA 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 研磨液成分 作用 SDS EDTA Tris-HCl缓冲液 使蛋白质变性 抑制DNA酶 稳定DNA 第四届花生 SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜和核膜，释放DNA；同时使蛋白质变性，便于后续分离。 EDTA（乙二胺四乙酸）：螯合金属离子（如Mg²⁺、Ca²⁺），抑制核酸酶活性，防止DNA被酶解。 Tris-HCl：维持溶液的pH稳定，通常调节至7.5-8.0。DNA对pH变化敏感，稳定的pH环境可防止DNA降解。 试一试： （1）操作顺序： （2）每一步的原理或作用？ ③→②→①→④→⑤ 第四届花生 3.DNA的粗提取与鉴定： （3）实验步骤： 取材研磨 过滤/离心 DNA粗提取 DNA鉴定 称洋葱，切碎，入研钵，倒入研磨液，充分研磨。 ①研磨的目的： 注意事项： 破碎细胞，释放DNA。 ②研磨时间不宜太长、不宜太用力。 ③可加入纤维素酶、果胶酶。 ④若是动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 研磨液 第四届花生 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有利于充分研磨防止DNA被破坏 ； 取材研磨 过滤/离心 DNA粗提取 DNA鉴定 方法一：在漏斗中垫上_____过滤研磨液，_____冰箱中静置后取_______ ； 方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取________。 纱布 上清液 上清液 ①纱布不能用滤纸代替： DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 （3）实验步骤： 4℃ 3.DNA的粗提取与鉴定： ②低温放置： a.抑制核酸水解酶的活性→抑制DNA降解； b.抑制分子运动→使DNA易形成沉淀析出； c.增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 ③上清液可能含有的杂质： 核蛋白、多糖等。 上清液 研磨液 第四届花生 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 DNA粗提取 DNA鉴定 取材研磨 过滤/离心 3.DNA的粗提取与鉴定： （3）实验步骤： 方法一：上清液中加入体积相等的____________溶液，静置2~3min，溶液中出现的____________就是粗提取的DNA 。用玻璃棒____________搅拌，卷起丝状物，并用_____吸去上面的水分。 方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的_______（粗提取的DNA）晾干。 预冷的酒精 白色丝状物 沿一个方向 滤纸 沉淀物 ①目的： 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 ②搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 上清液 研磨液 丝状物 沉淀物 第四届花生 若不是白色，则可能是含有杂质较多 3.DNA的粗提取与鉴定： （3）实验步骤： 实验组 对照组 沸水浴加热 DNA粗提取 DNA鉴定 取材研磨 过滤/离心 将丝状物或沉淀物溶于________________溶液中，加入_______试剂，混合均匀后，将试管置于________加热5min。 二苯胺 2mol/L的NaCl 沸水浴 不变蓝 呈现蓝色 加速颜色反应速度 第四届花生 有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 3.DNA的粗提取与鉴定： （4）结果分析与评价： 思考1：怎么确认DNA所含杂质较少？若鉴定结果呈现蓝色比较？ ①观察提取的DNA的颜色，若不是白色丝状物→杂质较多。 ②若蓝色比较浅→提取的DNA含量低，或实验操作过程出现了失误。 思考2：哪些失误可能导致蓝色比较浅？ ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分； ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，二苯胺易被空气氧化，影响鉴定效果。 第四届花生 思考3：如何进一步处理DNA粗提取物（丝状物或沉淀）提纯DNA？ ②DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mo l/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。→ ①DNA粗提取物加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液→ 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质。 降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。 与DNA溶解度不同 第四届花生 有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 DNA粗提取与鉴定实验成功的关键： (1)破碎细胞应彻底充分。 (2)含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。 (3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。 (4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。 (5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 第四届花生 方法一： 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 方法二： 可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。 方法三： 由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 第四届花生 FormatFactory : www.pcfreetime.com Lavf56.40.101 Tencent APD MTS Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $