专题11 胚胎工程与基因工程（专项训练）（2大考向）（黑吉辽蒙专用）2026年高考生物真题题源解密

**基本信息** 聚焦胚胎工程与基因工程，以“考情-真题-模拟”为框架，通过题型归类与素养导向构建知识网络，强化实验分析与逻辑推理能力。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |基因工程|3真题+11模拟|限制酶选择、PCR引物设计、载体构建分析；“题干信息-知识迁移-结果推导”三步法|工具（限制酶/连接酶/载体）→操作程序（目的基因获取→表达载体构建→导入与鉴定）→应用（工程菌/转基因）| |胚胎工程|2真题+9模拟|胚胎发育阶段判断、核移植流程分析；图表信息转化与过程推理|早期胚胎发育（受精卵→桑椹胚→囊胚）→技术应用（核移植/胚胎移植）→伦理评估|

专题11 胚胎工程与基因工程 内容导览 考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。 2026年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。 近3年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。 名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。 命题解读 考向 题目 1.高频考点： 胚胎工程、基因工程。 2.素养考向 1. 生命观念：运用生物学基本概念和原理，引导学生形成物质与能量观相关的生命观念； 2. 科学思维：通过工程学构想，考查学生基于事实逻辑辨析概念、判断命题正误的演绎推理能力，落实科学思维素养； 3. 社会责任：结合生活或生产实例的情境，引导学生分析基因工程，胚胎工程相关知识的应用，落实社会责任素养； 4. 科学探究：基于人类生产或生活某一需求的相关资料，考查学生对实验设计、结果检测基本逻辑的理解，落实科学探究素养。 考向1 基因工程 ①2026·黑吉辽蒙卷 ②2025·黑吉辽蒙卷 ③2024·黑吉辽卷 考向2 胚胎工程 ①2026·黑吉辽蒙卷 ②2025·黑吉辽蒙卷 2026年高考中，整套试题体现新高考生物“基础覆盖广、情境真实、图表信息密集、实验探究突出”的命题特点。总体难度中等偏上，区分度主要来自图表判读、多选题选项甄别、遗传推理、实验流程补全和规范表达。情境真实多元，贴近生产生活与科学研究；图文表信息密集，突出综合判读能力；重过程推理，强化生物的实验探究能力；实践导向突出，强调生物问题解决。 预测2027年高考，该专题对图表判读与过程推理能力有很大的提升，曲线、路径图、结构图会承载更多信息。 考向一 基因工程 1. （2026·黑吉辽蒙卷·第25题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 (1)为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E.coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。 A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′    B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′ C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′    D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）——导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 (3)该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 【答案】 (1) 人工合成法（化学合成法） T4 未插入目的基因的pPK2空质粒 A D 染色体DNA B (2)工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高 (3)安全性 【详解】 （1）已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV切割产生平末端，T4 DNA连接酶可以连接平末端，连接效率高于E.coli连接酶，因此选T4DNA连接酶。卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2空质粒。原质粒5.0kb，目的基因总长度0.7+1.1=1.8kb，重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：BamHI/EcoRI酶切得到0.7kb+6.1kb（6.8−0.7=6.1）；HindIII/EcoRI酶切得到1.1kb+5.7kb（6.8−1.1=5.7），因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方向为5'→3'。转录模板链为5′−ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC−3′，左侧引物序列为5′−ATGTC…−3′，右侧引物与模板右侧的序列5′…GCTCC−3′反向互补，序列为5′−GGAGC…−3′，因此选B。 （2）根据题干和表格数据，转入Tps基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50​更短，最终第7天死亡率更高。 （3）转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 考向二 胚胎工程 2.（2026·黑吉辽蒙卷·第13题）为模拟胚胎发育过程中子宫的力学环境，科学家设计了水凝胶材料，小鼠囊胚在其内部生长，如下图。下列叙述正确的是（　　） A．囊胚置于水凝胶之前，已经历了桑椹胚阶段 B．胚胎培养时，物质分子由培养基至胚胎单向转移 C．水凝胶基质硬度越大，越有利于胚胎生长 D．囊胚孵化后，与水凝胶接触的部位由滋养层变为透明带 【答案】A 【解析】 命题立意 本题以胚胎发育过程中子宫力学环境研究为情境，引导学生利用胚胎工程的知识。考查的必备知识为胚胎的发育过程、孵化，关键能力分析、运用知识解决实际问题的能力。 A 正确选项 小鼠早期胚胎发育依次经历受精卵、卵裂、桑椹胚、囊胚阶段，因此囊胚置于水凝胶之前已经历了桑椹胚阶段 B 错误选项 胚胎培养时，物质分子是双向转移的：培养基中的营养物质进入胚胎，胚胎代谢产生的废物排出到培养基中 C 错误选项 水凝胶模拟子宫的力学环境，只有基质硬度与子宫正常力学环境相近时才有利于胚胎生长，并非硬度越大越有利 D 错误选项 囊胚孵化是指囊胚扩大导致透明带破裂、胚胎从透明带中伸出的过程，孵化后透明带消失，与水凝胶接触的部位是滋养层 一、基因工程的基本工具 1. 限制性内切核酸酶（限制酶） （1）来源：主要从原核生物中分离纯化得到。 （2）作用特点：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 （3）切割结果：产生黏性末端（两条链切口处的末端伸出互补的单链）或平末端（两条链切口处的末端是平整的）。 （4）作用意义：限制酶是基因工程的“手术刀”，为DNA的切割和重组提供了特异性的工具。 2. DNA连接酶 （1）作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，是基因工程的“缝合针”。 （2）种类及区别： E.coli DNA连接酶：能连接黏性末端。 T4 DNA连接酶：既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率较低。 3. 载体 （1）作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因能够在受体细胞中复制、表达或稳定遗传。 （2）必备条件： 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 有一个或多个限制酶切割位点，以便外源DNA片段插入。 具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选（如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等）。 对受体细胞无害，不会影响受体细胞的正常生命活动。 （3）常用类型： 质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，是最常用的载体。 噬菌体：经过改造的噬菌体载体，可将较大的DNA片段导入细菌细胞。 动植物病毒：经过改造的病毒载体，可将目的基因导入动植物细胞。 二、基因工程的基本操作程序 1. 目的基因的获取 （1）目的基因定义：编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 （2）常用方法： 从基因文库中获取：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。包括基因组文库（包含一种生物的全部基因）和cDNA文库（包含一种生物的部分基因，由mRNA反转录而来）。 利用PCR技术扩增目的基因：PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可在短时间内大量扩增目的基因。其过程包括变性（90-95℃，双链DNA解旋为单链）、复性（55-60℃，引物与单链DNA互补结合）、延伸（72℃，Taq DNA聚合酶催化合成新的DNA链）三个步骤，循环往复实现DNA片段的指数级扩增。 人工合成：如果目的基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成；如果基因序列未知，但已知其编码的蛋白质的氨基酸序列，可先推测出mRNA的核苷酸序列，再根据碱基互补配对原则推测出目的基因的核苷酸序列，进而人工合成。 2. 基因表达载体的构建（核心步骤） （1）构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成结构： 目的基因：编码所需蛋白质或调控因子的基因片段。 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 终止子：位于基因的尾端，是转录终止的信号，使RNA聚合酶停止转录。 标记基因：便于重组DNA分子的筛选。用于鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。如抗生素抗性基因。 复制原点：载体自我复制的起点，保证载体在受体细胞中复制。 3. 将目的基因导入受体细胞 （1）转化的定义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 （2）常用导入方法： 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上的特点）、花粉管通道法（我国独创，简便经济）。 动物细胞：显微注射技术（最常用，将重组DNA分子直接注入受精卵的细胞核内）。 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理微生物细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态，然后将重组DNA分子与感受态细胞混合培养，使重组DNA分子进入受体细胞）。 4. 目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平检测： 检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上：采用DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的目的基因作探针，与受体细胞的DNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已插入。 检测目的基因是否转录出mRNA：采用分子杂交技术，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已转录。 检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用抗原-抗体杂交技术，用相应的抗体与受体细胞提取的蛋白质进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已翻译出蛋白质。 （2）个体水平鉴定： 植物：抗虫或抗病的接种实验，观察受体生物是否表现出相应的抗虫或抗病特性；观察转基因植物的性状是否符合预期。 动物：观察转基因动物的性状是否符合预期，如转基因动物的生长速率、产奶量等。 考向1 基因工程 1. （2025·黑吉辽蒙卷·第25题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 2.（2024·黑吉辽卷·第25题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______和______。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】(1) 除去蛋白质杂质 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2) PCR技术扩增 人工合成 (3) RNA聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因转录效率 (4)HygBR (5) F3 R2 (6)D 【分析】（1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶 酶具有专一性 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精 DNA在冷酒精中溶解度较低 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质。研磨液中的SDS能使蛋白质变性，因此无需担心DNA酶水解DNA。但即使有蛋白质变性剂使蛋白质变性改变其理化性质，仍然有可溶性、不溶性的蛋白质杂志通过沉淀、过滤等物理方式难以去除，因此为了获得较纯的DNA，保证提取的DNA作为PCR模板的品质，需要加入蛋白酶。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 （2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因转录效率。 （4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 （6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。 ABC不符合题意，D符合题意。 故选D。 3.（2024·黑吉辽卷·第7题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 考向2 胚胎工程 4.（2025·黑吉辽蒙卷·第9题）研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。下列叙述错误的是（    ） A．体细胞核进入去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚 B．移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态 C．胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化 D．为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植 【答案】C 【分析】动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。胚胎移植是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体叫“受体”。通过任何一项技术（如转基因、核移植和体外受精等）获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。 【详解】A、由于M Ⅱ期卵母细胞的细胞更大，便于进行技术操作，细胞质中含有激发细胞核全能性的物质，因此体细胞核移植到去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚，A正确； B、移植前胚胎发育率低，细胞核来自于已分化的体细胞，全能性容易受到影响，因此可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态，B正确； C、根据题干，早期胚胎大多都不能发育至囊胚期，必然不是孵化的原因，着床在孵化之后发生，孵化是胚胎从透明带中伸展出来（不是滋养层），C错误； D、胚胎细胞核全能性高于体细胞，因此为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植，D正确。 1．（2026·辽宁·模拟预测）科研人员从野生森林猫皮肤组织中分离培养得到成纤维细胞，利用中华田园猫卵母细胞作为细胞核受体，通过细胞核置换和人工激活，制作出多个体细胞克隆胚胎，将克隆胚胎移植入受体母猫后，经过62天孕育，成功得到一只森林猫体细胞克隆后代，实验流程如图所示。下列叙述错误的是（  ） A．用来克隆的卵母细胞需要在体外培养到MⅡ期 B．用电刺激、乙醇等方法可以激活重构胚 C．过程①采用了动物细胞工程中的体细胞核移植技术 D．将图示胚胎移植到狗的体内也可以正常发育 【答案】D 【详解】A、体细胞核移植中，受体卵母细胞需体外培养到减数第二次分裂中期（MⅡ期），该时期卵母细胞的细胞质含有促进细胞核全能性表达的物质，适合作为核受体，A正确； B、获得重构胚后，可通过电刺激、乙醇、钙离子载体等方法进行人工激活，使其启动分裂和发育进程，B正确； C、过程①是将野生森林猫的体细胞核植入去核卵母细胞中，属于动物细胞工程的体细胞核移植技术，C正确； D、胚胎移植要求供体和受体为同种生物，且生理状态匹配，猫和狗属于不同物种，存在免疫排斥、子宫发育环境不兼容等问题，胚胎无法在狗体内正常发育，D错误。 2．（2026·辽宁沈阳·模拟预测）科研人员以猪为实验材料开展核移植研究，相关流程如图所示，可用相关试剂提升重构胚发育效率，但目前该技术仍普遍存在克隆效率偏低的问题。下列叙述错误的是（　　） A．过程①去除的核实质上是纺锤体-染色体复合物 B．过程②体外培养重构胚，需培养至原肠胚阶段 C．过程③胚胎移植前，需对受体母猪进行同期发情处理 D．对重构胚进行激活处理，也可使用Ca2+载体处理 【答案】B 【详解】A、过程①去除的是减数第二次分裂中期（MⅡ期）卵母细胞的核，该时期卵母细胞核膜已经解体，遗传物质以纺锤体-染色体复合物的形式存在，因此去除的核实质上是纺锤体-染色体复合物，A正确； B、过程②体外培养重构胚，进行胚胎移植时需要将胚胎培养至桑葚胚或囊胚阶段，原肠胚细胞分化程度高，移植后成活率极低，不能培养至原肠胚阶段再移植，B错误； C、过程③胚胎移植前，需对受体母猪进行同期发情处理，使受体母猪和供体母猪的生殖器官生理状态一致，为移入的胚胎提供相同的生理发育环境，保证胚胎可以正常存活发育，C正确； D、重构胚的激活可采用物理法（电刺激）或化学法（Ca2+载体、乙醇等）处理，因此使用Ca2+载体处理可以实现重构胚的激活，D正确。 3．（2026·辽宁·三模）乌珠穆沁白山羊为绒肉兼用型品种，当前因种群小、近亲繁殖而出现品种资源危机。现利用生物技术开展保护工作，相关叙述正确的是（    ） A．在动物细胞培养过程中大多数细胞是悬浮在培养液中生长增殖的 B．核移植技术中需去除MⅡ期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物 C．胚胎移植操作前通常需对多只受体进行超数排卵和同期发情处理 D．为提高胚胎的利用率，可选用未分化的囊胚和桑椹胚进行胚胎分割 【答案】B 【详解】A、动物细胞培养时，大多数动物细胞具有贴壁生长的特性，仅少数细胞（如淋巴细胞）可悬浮生长增殖，A错误； B、核移植技术选择MⅡ期卵母细胞作为受体细胞，此时卵母细胞无核膜，遗传物质以纺锤体—染色体复合物形式存在，去核操作需去除该结构，B正确； C、胚胎移植前仅需对供体进行超数排卵处理以获得更多配子，受体仅需做同期发情处理，无需超数排卵，C错误； D、桑葚胚阶段细胞尚未分化，囊胚阶段细胞已分化为内细胞团和滋养层细胞，不存在“未分化的囊胚”，D错误。 4．（2026·吉林·模拟预测）中国科学家选择了比格犬作为受体及代孕母亲，成功克隆了一只濒危物种北极狼。通过克隆技术获得北极狼的基本过程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．从重组细胞到甲胚胎，胚胎体积不断增大 B．需对代孕比格犬注射激素使其同期发情 C．克隆狼的部分遗传性状与代孕比格犬相同 D．将重组细胞直接移植到代孕犬子宫中可缩短克隆周期 【答案】B 【详解】A 、从重组细胞到甲胚胎，为卵裂期，胚胎总体积基本不变或略缩小，A错误； B 、胚胎移植需对代孕母体同期发情处理，保证移植生理状态一致，B正确； C 、克隆狼核基因来自核供体，质基因来自卵母细胞供体，与代孕母体无遗传关系，C错误； D 、重组细胞必须在体外培养至桑葚胚或囊胚阶段才能移植到子宫，不能直接移植单个细胞，D错误。 5．（2026·黑龙江哈尔滨·模拟预测）哈尔滨医科大学发表论文揭示了过表达转录因子Nr5a2对克隆小鼠胚胎发育效率的影响，部分结果如图所示，下列有关叙述不正确的是（　　） A．培育过程中可用电刺激或Ca2+载体等激活重构胚 B．通过核移植获得多个个体有利于生物多样性的形成 C．体外培养重构胚时，需提供适宜的营养及气体环境 D．Nr5a2过表达可促进桑葚胚向囊胚转化，提高发育效率 【答案】B 【详解】A、核移植过程中，重构胚可通过电刺激、Ca2+载体等物理或化学方法激活，使其完成细胞分裂和发育进程，A正确； B、核移植属于无性繁殖，获得的多个个体遗传物质高度相似，不会丰富种群基因库，不利于生物多样性的形成，B错误； C、体外培养重构胚（早期胚胎）时，需要提供充足的营养（如添加血清等），同时提供95%空气+5%CO2的适宜气体环境以维持培养环境pH稳定，C正确； D、据柱状图可知，与Nr5a2 mRNA浓度为0的对照组相比，加入Nr5a2 mRNA后桑葚胚/囊胚转化率均升高，说明Nr5a2过表达可促进桑葚胚向囊胚转化，提高发育效率，D正确。 6．（2026·黑龙江·模拟预测）辅助生殖技术包括体外受精、胚胎培养、胚胎移植等，胚胎反复植入失败（RIF）是辅助生殖领域亟待破解的难题。我国研究团队构建的3D人工子宫模型，首次在实验室实现了胚胎植入与早期发育的全过程模拟，为治疗RIF提供了全新潜在方案。下列相关叙述正确的是（　　） A．取卵前，需通过口服促性腺激素类药物进行超数排卵 B．体外受精时，采集的精子可直接与成熟的卵子共同培养 C．需使用免疫抑制剂以避免受体子宫对植入胚胎的排斥反应 D．该模型模拟子宫的激素环境，为胚胎探索适宜的着床条件 【答案】D 【详解】A、促性腺激素的化学本质为蛋白质，口服会被消化道中的蛋白酶分解失活，无法发挥作用，超数排卵需通过注射促性腺激素类药物实现，A错误； B、体外受精时，采集的精子需先进行获能处理，成熟卵子也需培养至减数第二次分裂中期才具备受精能力，二者不能直接共同培养完成受精，B错误； C、受体子宫对外来植入的胚胎基本不发生免疫排斥反应，是胚胎移植的生理学基础之一，无需使用免疫抑制剂，C错误； D、该3D人工子宫模型需要模拟真实子宫的激素等内环境条件，才能实现胚胎植入与早期发育的全过程模拟，进而探索适宜胚胎着床的条件，为治疗RIF提供方案，D正确。 7．（2026·黑龙江大庆·模拟预测）MSTN基因是调控肌肉生长的抑制素基因。敲除家猪的MSTN基因可增加肌纤维数量，提高瘦肉率。下列关于培育MSTN基因敲除家猪的实验操作，合理的是（　　） A．给雌猪注射孕激素，以获得卵母细胞 B．敲除MSTN基因的受精卵经体外培养获得早期胚胎后移植 C．移植前需对受体进行妊娠检查和免疫学检查 D．胚胎需经质量检测和性别鉴定后才能移植 【答案】B 【详解】A、获得卵母细胞需对雌猪注射促性腺激素进行超数排卵处理，孕激素的作用是进行同期发情处理，无法获得更多卵母细胞，A错误； B、敲除MSTN基因的受精卵需经体外培养发育至桑葚胚或囊胚阶段的早期胚胎后，才能进行胚胎移植，该操作合理，B正确； C、受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，移植前无需进行免疫学检查，且妊娠检查是胚胎移植后判断是否受孕的操作，不是移植前的操作，C错误； D、本培育目标是获得MSTN基因敲除的家猪，对性别无特殊要求，无需进行性别鉴定，D错误。 8．（2026·黑龙江哈尔滨·二模）下列有关哺乳动物的受精和胚胎早期发育的叙述，正确的是（ ） A．精子和卵子一经排出即具有受精能力 B．受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂 C．滋养层细胞将来发育成胎儿的各种组织 D．早期胚胎发育过程中，胚胎的体积持续增大 【答案】B 【详解】A、精子排出后需要经过获能过程才具备受精能力，卵子排出后需要发育至减数第二次分裂中期才具备受精能力，A错误； B、受精卵在输卵管中形成后，会立即在输卵管内开始进行有丝分裂（卵裂过程），边分裂边向子宫方向移动，B正确； C、囊胚时期的滋养层细胞将来发育为胎膜和胎盘，内细胞团细胞将来才会发育成胎儿的各种组织，C错误； D、早期胚胎发育的卵裂阶段，细胞数量不断增加，但胚胎总体积基本不变，D错误。 9．（2026·黑龙江大庆·模拟预测）“EMT-Cas12a”疗法利用外泌体(纳米囊泡)搭载基因剪刀“Cas12a”，剪碎感染细胞内的病毒基因组。下列说法正确的是（　　） A．Cas12a切割病毒基因组的原理与限制酶相似，切割后一定产生黏性末端 B．将Cas12a基因导入外泌体表达时，需构建含启动子、终止子、标记基因等的表达载体 C．外泌体的膜结构由双层磷脂分子构成，是基因工程中最常用的载体 D．用PCR扩增Cas12a基因时，需在反应体系中加入解旋酶和DNA聚合酶 【答案】B 【详解】A、Cas12a和限制酶都是切割DNA的磷酸二酯键，原理相似，但限制酶切割产物既可能是黏性末端，也可能是平末端，因此Cas12a切割后不一定产生黏性末端，A错误； B、目的基因要在受体中正常表达，构建的基因表达载体必须包含启动子、终止子、标记基因、目的基因等核心组件，B正确； C、外泌体是囊泡，膜由单层磷脂双分子层构成，且基因工程中最常用的载体是质粒，不是外泌体，C错误； D、PCR扩增目的基因时，利用高温使DNA双链解旋，不需要加入解旋酶，仅需加入耐高温的DNA聚合酶，D错误。 10．（2026·吉林松原·模拟预测）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．步骤1和步骤2的目的是获取滤液中的沉淀物，步骤3的目的是获取上清液 B．步骤1研磨后用纱布过滤，步骤4将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴 C．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察 【答案】D 【详解】A、步骤1研磨后DNA溶解在研磨液中，步骤2过滤的目的是获取含DNA的滤液，去除沉淀物中的细胞残渣等杂质；步骤3加入95%冷酒精后DNA析出，目的是获取沉淀物中的DNA，而非上清液，A错误； B、步骤4进行DNA鉴定时，需先将丝状物溶解于2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴，不能直接将丝状物加入二苯胺试剂，B错误； C、琼脂糖凝胶需用电泳缓冲液配制，而非无菌水，以此保证电泳过程中pH等环境稳定，C错误； D、电泳时待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时及时断电，取出凝胶置于紫外灯下观察条带，D正确。 11．（2026·吉林·模拟预测）2024年诺贝尔化学奖解开蛋白质折叠的秘密，AI模型可以借助于机器深度“学习算法”，协助科研人员完成某种特定蛋白质的设计。下列叙述错误的是（    ） A．蛋白质的空间结构多样，主要与氢键、二硫键等化学键有关 B．AI模型可预测新型蛋白质的三维结构，依据原理是中心法则 C．AI模型可预测蛋白质中某位点氨基酸的改变对细胞的影响 D．AI设计的高温酶，能为工业生物催化提供更稳定的酶制剂 【答案】B 【详解】A、蛋白质的空间结构多样，其形成与维持主要依赖氢键、二硫键等化学键。氢键可稳定蛋白质的二级结构（如α-螺旋、β-折叠），二硫键可稳定蛋白质的三级结构，A正确； B、中心法则的核心内容是遗传信息的传递方向，即DNA→RNA→蛋白质，主要决定肽链次序。而AI模型预测新型蛋白质的三维结构，依据的是蛋白质的氨基酸序列与其空间结构之间的对应关系，B错误； C、蛋白质的功能由其结构决定，而结构与氨基酸序列密切相关。AI模型可通过学习分析。预判氨基酸序列的改变对蛋白质结构的影响，进而预测其对细胞功能的影响，C正确； D、在工业生物催化中，高温环境下普通酶易失活，而Al设计的高温酶能保持稳定的催化活性，为工业生产提供更稳定的酶制剂，D正确。 12．（2026·吉林长春·模拟预测）以下生物技术与工程的实验叙述中，正确的是（　　） A．琼脂糖凝胶电泳过程中，凝胶载样缓冲液（内含指示剂）具有防止DNA样品浮出加样孔，便于肉眼观察电泳大体进程的作用 B．DNA粗提取实验中，洋葱研磨液既可以通过过滤留取滤渣，也可以通过离心留取沉淀 C．PCR反应中适当降低复性温度，有利于提高PCR产物的特异性 D．生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上继续培养时不需要光照 【答案】A 【详解】A、琼脂糖凝胶电泳的载样缓冲液含甘油等成分可增加样品密度，避免DNA样品浮出加样孔，缓冲液中的指示剂可随电泳迁移，肉眼即可观察电泳的大体进程，A正确； B、DNA粗提取实验中，DNA溶解在洋葱研磨液的液相中，过滤需留取含DNA的滤液，离心需留取含DNA的上清液，滤渣和沉淀为细胞碎片等杂质，B错误； C、PCR反应中适当提高复性温度，可减少引物与模板的非特异性结合，提高产物特异性；降低复性温度会增加非特异性结合，降低产物特异性，C错误； D、愈伤组织诱导生芽的过程属于再分化阶段，芽的分化、叶绿素的合成都需要光照，该阶段需要提供光照，D错误。 13．（2026·辽宁·三模）下列关于生物技术与工程的实施过程的说法错误的是（　　） A．啤酒生产时，为加快大麦种子内淀粉的水解，可用赤霉素处理 B．进行DNA的粗提取与鉴定时，整个提取过程可以不使用离心机 C．在原代培养和传代培养前，都需要对动物细胞用胰蛋白酶等处理 D．将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物可防止转基因花粉传播 【答案】C 【详解】A、赤霉素可诱导大麦种子无需发芽就合成α-淀粉酶，加快淀粉水解，可简化啤酒生产工艺、降低成本，A正确； B、DNA粗提取实验中，可通过过滤、静置获得上清液，在上清液中加冷酒精静置析出DNA即可完成提取，B正确； C、原代培养前需要用胰蛋白酶处理剪碎的动物组织，分散为单个细胞制成细胞悬液；传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集，C错误； D、将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，可防止转基因花粉传播，D正确。 14．（2026·辽宁·三模）CAR-T疗法是改造患者的T细胞，使其表面表达能识别特定癌细胞抗原的受体（CAR），从而精准攻击癌细胞，其治疗思路如下图。为探究CAR-T细胞对肝癌细胞在体外的杀伤作用，科研人员将效应细胞（即正常T细胞、CAR-T细胞）分别与肝癌细胞体外混合培养，结果发现CAR-T细胞对靶细胞的杀伤率远高于正常T细胞。已知乳酸脱氢酶是在所有细胞中稳定存在的酶，下列相关叙述错误的是（　　） A．CAR-T细胞在自然情况下不存在，体现了蛋白质工程的应用 B．CAR-T细胞培养时要定期更换培养液，避免代谢物的积累 C．培养液中乳酸脱氢酶的含量可反映效应细胞对靶细胞的杀伤率 D．CAR-T细胞对肝癌细胞的体外杀伤属于基因所决定的细胞凋亡 【答案】A 【详解】A、CAR-T细胞是通过基因工程将CAR基因导入T细胞得到的，属于基因工程的应用，而非蛋白质工程。蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质，制造出新的蛋白质，而这里是将已有基因导入细胞，让细胞表达特定受体，A错误； B、CAR-T细胞培养属于动物细胞培养，细胞代谢会产生有害代谢产物，定期更换培养液可避免代谢物积累损伤细胞，B正确； C、乳酸脱氢酶是胞内稳定存在的酶，只有靶细胞裂解死亡时才会释放到培养液中，因此培养液中乳酸脱氢酶含量越高，说明被杀伤的靶细胞越多，可反映效应细胞对靶细胞的杀伤率，C正确； D、CAR-T细胞对肝癌细胞的杀伤是因为CAR-T细胞表面的CAR蛋白能识别肝癌细胞的抗原，进而启动细胞免疫，使肝癌细胞发生细胞凋亡，而细胞凋亡是由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，D正确。 15．（2026·辽宁营口·三模）我国研究团队首次在实验室完整复刻人类胚胎着床的全过程，结果如图所示，接触阶段，胚胎分泌的因子与子宫内膜受体结合，打造了促进“附着位点”形成和抑制上皮细胞凋亡两条通路，若两条通路被阻断，囊胚附着率将下降68%；入侵阶段，胚胎与子宫内膜相互分泌因子，促进滋养层细胞增殖。下列相关叙述正确的是（    ） A．图示胚胎已经出现细胞的分化，从中分离的胚胎干细胞具有发育的全能性 B．胚胎分泌的因子与子宫内膜受体结合有利于胚胎定位以及移植胚胎的存活 C．胚胎与子宫内膜相互分泌因子可促进滋养层细胞发育成胎膜和胎盘的一部分 D．囊胚进一步发育为原肠胚，导致透明带破裂，胚胎继续分化形成组织、器官 【答案】ABC 【详解】A、图示胚胎处于囊胚阶段，已经出现滋养层细胞和内细胞团的细胞分化，从内细胞团中分离的胚胎干细胞具有发育的全能性，可分化为动物体内任何一种组织细胞，A正确； B、由题干可知，胚胎分泌的因子与子宫内膜受体结合可促进“附着位点”形成，有利于胚胎定位，促进胚胎着床，进而提高移植胚胎的存活率，B正确； C、滋养层细胞未来可发育为胎膜和胎盘，胚胎与子宫内膜相互分泌因子能促进滋养层细胞增殖，可进一步促进其发育为胎膜和胎盘的一部分，C正确； D、囊胚进一步扩大会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来（即孵化），之后囊胚才进一步发育为原肠胚，继续分化形成组织、器官，D错误。 16．（2026·辽宁·模拟预测）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。下列叙述正确的是（  ） A．步骤①是基因工程的核心步骤，需要使用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体 B．与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W所选的启动子不同 C．步骤②可以利用显微操作法将重组表达载体导入受精卵 D．鉴定W蛋白基因是否成功表达可以检测转基因动物的尿液是否存在W蛋白 【答案】BD 【详解】A、步骤①是基因表达载体的构建，为基因工程的核心步骤，该过程所需的工具酶为限制酶、DNA连接酶，载体属于基因工程的操作工具，A错误； B、乳腺生物反应器需使用乳腺蛋白基因的启动子，使目的基因在乳腺细胞中特异性表达；膀胱生物反应器需使用膀胱上皮细胞特异性表达的基因的启动子，使目的基因在膀胱上皮细胞中表达，二者所选启动子不同，B正确； C、将重组表达载体导入动物受精卵的常用方法为显微注射法，C错误； D、膀胱生物反应器的目标是让W蛋白随转基因动物的尿液排出，因此检测转基因动物的尿液中是否存在W蛋白，可鉴定W蛋白基因是否成功表达，D正确。 17．（2026·辽宁沈阳·模拟预测）大肠杆菌的培养分为生长期和稳定期两个阶段，其胞内莽草酸代谢途径如图甲。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，细胞中无法大量积累莽草酸。为保证大肠杆菌生长期正常生长且稳定期大量积累莽草酸，研究者敲除野生型大肠杆菌某个相关内源酶基因，并导入图乙两种质粒，调控代谢途径中关键酶在不同阶段的合成与分解速率。下列说法错误的是（　　） 注：M、N为酶A或酶B基因；启动子Pgeo仅在生长期开启转录；基因X编码的阻遏蛋白可阻遏启动子PX开启转录；带SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌逐渐降解。 A．敲除的内源酶基因是酶B基因 B．质粒①中的M表示酶A基因 C．改造后的菌株在生长期可正常合成细胞生长必需物 D．改造后的菌株胞内阻遏蛋白X的含量进入稳定期后不再变化 【答案】BD 【详解】A、由图甲可知，酶B可将莽草酸转化为细胞生长必需物，欲在稳定期大量积累莽草酸，应敲除酶B对应的基因，A正确； B、为了保证细胞正常生长，并在稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的M基因替换为酶B基因，使相关代谢途径酶B在生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的N基因替换为酶A基因，利用其调控机制在稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株，即质粒①中的M表示酶B基因，质粒②中的N表示酶A基因，B错误； C、改造后的菌株在生长期莽草酸正常转化为细胞生长必需物，并无前体积累，稳定期由于酶B基因受到抑制，酶B的合成受阻，从而提高莽草酸的积累量，C正确； D、由题意可知，要保证大肠杆菌生长期正常生长且稳定期大量积累莽草酸，则生长期让菌株能正常合成细胞生长所需物质，需要酶B把莽草酸继续转化，而在稳定期又能尽量“关闭”对莽草酸的进一步利用，从而高水平积累莽草酸，基因X编码的阻遏蛋白可阻遏启动子PX开启转录，所以菌株经改造后，胞内阻遏蛋白X的含量在生长期保持稳定、在稳定期积累，D错误。 18．（2026·黑龙江哈尔滨·三模）果肉红色是花色素苷大量积累导致的。某二倍体植物果肉中花色素苷的含量与两对等位基因A/a、D/d有关。与显性基因相比，隐性基因均缺失一个片段（如图1所示，黑色区域为缺失片段）。用特定的引物对相关基因进行扩增、电泳，检测结果如图2、图3。 (1)用P1/P2引物扩增，白肉不会得到扩增产物，原因是_____。 (2)浅红肉的基因型有______种，白肉的基因型是______。 (3)若某深红品种与白肉品种杂交，F1全部表现为中红。 ①亲本基因型为______。 ②为探究A/a、D/d两对等位基因是否位于同一对同源染色体上（不考虑互换），设计实验方案：F1自交，观察并统计F2果肉表型及比例。 写出预期结果和相应结论： 若F2果肉表型及比例为_____，则两对基因位于非同源染色体上； 若F2果肉表型及比例为_____，则两对基因位于一对同源染色体上。 【答案】(1)白肉基因型为aa，a基因片段缺失导致P2引物无法与模板结合 (2) 2/二/两 aaDD、aaDd、aadd (3) AAdd、aaDD 深红：中红：浅红：白肉＝3：6：3：4 深红：中红：白肉＝1：2：1 【详解】（1）据题干信息和题图1可知，隐性基因a相比显性基因A缺失一个片段，白肉基因型为aa。 因为a基因片段缺失，导致引物P2无法与模板结合，所以用P1/P2引物扩增时，白肉不会得到扩增产物。 （2）果肉红色是花色素苷大量积累导致，且与两对等位基因A/a、D/d有关。从图2和图3电泳结果及果肉颜色对应关系可知，浅红果肉对应的基因型是AADD、AaDD，共2种。 白肉基因型为aa，那么白肉的基因型为aaDD、aaDd、aadd。 （3）①某深红品种与白肉品种杂交，F1全部表现为中红。深红的基因型为A_ DD，白肉为aa_ _，要使F1全为中红（A_Dd），则亲本基因型为AAdd、aaDD。 ②若两对等位基因位于非同源染色体上，F1（AaDd）自交，遵循自由组合定律。F2中A_DD（深红）的比例为3/4×1/4=3/16，A_Dd（中红）的比例为3/4×2/4=6/16，A_dd（浅红）的比例为3/4×1/4=3/16，aa_ _（白肉）的比例为1/4×1=4/16，所以表型及比例为深红：中红：浅红：白肉=3：6：3：4。 若两对等位基因位于一对同源染色体上，F1（AaDd）产生的配子为Ad、aD，自交后代基因型及比例为AAdd：AaDd：aaDD=1：2：1，表型及比例为深红：中红：白肉=1：2：1。 19．（2026·黑龙江大庆·模拟预测）增强子是DNA上的调控序列，能结合转录因子并提高基因转录频率。胶质母细胞瘤(GBM)细胞中转录因子SOX2和OLIG2高表达，正常神经元几乎不表达。科学家设计了一种基因治疗线路： GBM细胞：增强子A结合SOX2/OLIG2，增强子B结合普通转录因子 → 转录开启 → HSV-TK基因表达 → 癌细胞死亡。 正常神经元：缺乏SOX2/OLIG2，增强子A无结合，增强子B结合普通转录因子 → 转录关闭 → HSV-TK基因沉默 → 细胞存活。 注：HSV-TK表达产物能将无毒物质转化为有毒物质。 HSV-TK模板链序列(部分)：5'-ATGCGTAGC……CGATCGAT-3' (1)从基因结构角度判断，增强子___________(填“属于”或“不属于”)编码区。增强子与转录因子结合后，___________(填“促进”或“抑制”)RNA聚合酶与启动子的结合。HSV-TK表达产物的基本单位是___________。 (2)正常神经元细胞中HSV-TK基因处于沉默状态，从调控机制分析，直接原因是缺少___________与增强子A结合，无法激活转录程序；增强子A、B调控基因转录具有___________特异性。 (3)使用逆转录PCR测定HSV-TK基因的表达量，在PCR扩增阶段，反应体系中除了荧光探针外，必须包含的成分有____________。 A．cDNA模板 B．引物 C．耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) D．四种脱氧核苷酸(dNTPs) E．逆转录酶 (4)根据HSV-TK基因模板链序列，写出PCR时使用的引物(假设引物长度为6个碱基) 上游引物：5'___________3' 下游引物：5'___________3' (5)从该基因疗法的分子机制角度说明患者接受治疗后，肿瘤显著缩小且无明显副作用的原因：___________。 【答案】(1) 不属于 促进 氨基酸 (2) SOX2/OLIG2 细胞(或组织) (3)ABCD (4) 5’-ATCGAT-3’ 5’-ATGCGT-3’ (5)胶质母细胞瘤(GBM)细胞中高表达SOX2和OLIG2，它们能与增强子A结合，同时增强子B结合普通转录因子，二者协同作用才能使HSV-TK基因转录表达，将无毒前药转化为有毒物质杀死癌细胞，使肿瘤缩小(合理即可) 【详解】（1）由题干信息可知，增强子是DNA上的调控序列，能结合转录因子并提高基因转录频率，由此判断增强子不属于编码区； 增强子与转录因子结合后，能促进RNA聚合酶与启动子的结合； HSV-TK表达产物能将无毒物质转化为有毒物质，即HSV-TK 的化学本质为酶，属于蛋白质，蛋白质的基本组成单位是氨基酸。 （2）由题干信息可知，GBM细胞中，增强子A结合SOX2/OLIG2，增强子B结合普通转录因子 → 转录开启 → HSV-TK基因表达 → 癌细胞死亡。正常神经元细胞中HSV-TK基因处于沉默状态，从调控机制分析，直接原因是缺少SOX2/OLIG2与增强子A结合，无法激活转录程序；GBM细胞中，增强子能调控基因转录，正常神经元细胞中，增强子A、B不能调控基因转录，故增强子A、B调控基因转录具有细胞（或组织）特异性。 （3）逆转录PCR 扩增的必需成分有cDNA 模板、引物、耐高温 DNA 聚合酶、四种脱氧核苷酸。PCR 扩增阶段无需逆转录酶，逆转录酶只作用于逆转录合成 cDNA 的前期步骤。 （4）HSV-TK模板链序列(部分)：5'-ATGCGTAGC……CGATCGAT-3'，其互补链的序列为5'-ATCGATCG……GCTACGCAT-3'，PCR时使用的引物需要结合在目的基因的3'，使DNA聚合酶能够从引物的3'开始连接脱氧核苷酸，故上游引物（结合到模板链3'端）的序列为5’-ATCGAT-3’，下游引物（结合到编码链3'端）的序列为5’-ATGCGT-3’。 （5）从该基因疗法的分子机制角度说明患者接受治疗后，肿瘤显著缩小且无明显副作用的原因：胶质母细胞瘤(GBM)细胞中高表达SOX2和OLIG2，它们能与增强子A结合，同时增强子B结合普通转录因子，二者协同作用才能使HSV-TK基因转录表达，将无毒物质转化为有毒物质杀死癌细胞，使肿瘤缩小。 20．（2026·黑龙江哈尔滨·二模）从分解纤维素的细菌（A菌）中提取出一种纤维素酶基因（CBHⅡ）并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒（图1）连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌（B菌）。回答下列问题。 几种限制酶识别序列及酶切位点 限制酶 识别序列及酶切位点 Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' BstEⅡ 5'-G↓GTNACC-3'（N为任意碱基） SacⅠ 5'-GAGCT↓C-3' MspⅠ 5'-C↓CGG-3' BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3' (1)构建成重组质粒时，应选择限制酶____________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段（X和Y），X两端的黏性末端分别为—CTAG和—CAATG，则Y两端的黏性末端分别为—CTAG和____________。 (2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接（如图2），因此PCR扩增过程中，对两种引物的要求是5'端______，3'端_______。PCR产物一般通过_______来鉴定，为了能在波长为300nm紫外灯下检测出DNA分子，需要用____________对DNA进行染色。 (3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素____________（填“M”或“N”）的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示（片段过小时检测不到条带）。据图分析，菌落_____中成功导入了重组质粒。 (4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基均分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种____________，实验结果说明____________。 【答案】(1) BglⅡ、BstEⅡ —CATTG (2) 分别添加相应的限制酶识别序列 与模板链互补 琼脂糖凝胶电泳 核酸染料 (3) N 2、3 (4) A菌 B菌分解纤维素能力比A菌更强 【详解】（1）需要将目的基因插入高效启动子之后，至少保留一个标记基因M或N，故选择BglⅡ、BstEⅡ对质粒进行酶切；根据表格中 BglⅡ、BstEⅡ识别序列和切割位点，X 端的黏性末端有-CTAG 和-CAATG，则 Y 端与之互补为-CTAG 和-CATTG。   （2）引物是从子链的5'端往3'方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与表达载体正确连接，当目的基因的CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点时，则需要在引物的5'端分别添加相应限制酶的识别序列，引物的3'端与模板链互补延伸子链。PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，为了便于对分离后的DNA片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 （3）限制酶BglⅡ、BstEⅡ破坏了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒导入A菌，并将其接种在含抗生素N的培养基上培养，图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。 （4）为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，实验的自变量为是否接种和菌种的不同，因变量是纤维素含量，对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由柱状图长短可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强，说明工程菌分解纤维素效率更高。 21．（2026·黑龙江·模拟预测）为培育广谱抗虫耐除草剂玉米，科研人员将我国自主研发的抗虫融合基因m2cryAb-vip3A插入表达载体pCAMBIA中（其中的bar为耐除草剂基因，使玉米能抵抗草铵膦类除草剂），构建了重组质粒pCAMBIA+m2cryAb-vip3A，经农杆菌转化后形成具有“抗虫+耐除草剂”的双优性状组合的转基因玉米LD05，过程如图所示。请回答下列问题： (1)抗虫融合基因m2cryAb-vip3A是以苏云金芽孢杆菌的cry1Ab和vip3Aa原始DNA序列为基础，对两个基因进行改造优化，将优化后的基因通过中间序列连接从而获得融合基因。连接前需将基因cry1Ab编码区_____移除，使核糖体可连续翻译至基因vip3Aa，得到的融合蛋白包含两种杀虫蛋白的功能域，拓展了其杀虫类型。该过程属于______工程的范畴。 (2)构建重组质粒时，为了将融合基因m2cryAb-vip3A插入表达载体pCAMBIA中，需在引物____的____（选填“3'”或“5'”）端添加酶切位点，对融合基因进行PCR和酶切后，用DNA连接酶将其连入已用限制酶______处理的表达载体中。 (3)该重组质粒中基因bar与m2cryAb-vip3A串联排列，属于串联基因。与融合基因相比，串联基因在分子水平上的特点及其在基因表达上的优势为_______________。 (4)通过农杆菌转化法将重组质粒上的T-DNA整合到玉米的染色体上之后，可利用含有_____的培养基筛选转化成功的外植体。从个体生物学水平鉴定转基因玉米LD05是否培育成功的方法为___________。 【答案】(1) 对应终止密码子的序列 蛋白质 (2) 2、3 5' Xba Ⅰ和Sac Ⅰ (3)串联基因各自带有独立的启动子和终止子等元件，转录产生独立的mRNA，翻译成独立的多肽，肽链可以独立盘曲、折叠，使得形成的蛋白质分子各自保持天然的空间构象与生物活性 (4) 草铵膦类除草剂 接种害虫、喷洒草铵膦类除草剂 【详解】（1）若要两个基因片段能够连续表达形成融合蛋白，则必须移除第一个基因（cry1Ab）末端对应终止密码子的序列，否则翻译会在第一个基因结束时终止，无法连续翻译至第二个基因。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。题干强调对两个基因进行改造和优化，获得的融合基因表达的融合蛋白是一种包含两种杀虫蛋白功能域的新的蛋白质，这属于蛋白质工程的范畴。 （2）PCR过程中，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下延伸子链时，是将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，故要对融合基因进行PCR应选择引物2和引物3，酶切位点等非配对序列应添加在引物的5'端，才不会影响引物与模板的结合及PCR扩增效率。构建基因表达载体时需将目的基因接入启动子和终止子之间，结合题图知要将融合基因m2cryAb-vip3A插入表达载体pCAMBIA中，可选用的限制酶有Xba Ⅰ、BamH Ⅰ和Sac Ⅰ，其中BamH Ⅰ会将融合基因切断，故只能选择限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ处理表达载体。 （3）由题图可知，串联基因的两个基因各自带有独立的启动子和终止子，转录产生两条独立的mRNA，翻译成两条独立的多肽；融合基因的两个基因共用一个启动子，转录产生一条mRNA，翻译成一条融合多肽。串联基因在基因表达上的优势在于两条肽链可以独立盘曲、折叠，使得形成的蛋白质分子各自保持天然的空间构象与生物活性，避免因融合而导致某一结构域折叠异常或功能受损，该设计对于“抗虫+耐除草剂”这种功能上不需要物理连接的双优性状组合更为合理。 （4）转化成功的外植体的染色体上应插入了重组质粒的T-DNA，T-DNA上没有卡那霉素抗性基因，而已知bar为耐除草剂基因，使玉米能抵抗草铵膦类除草剂，故可将bar作为标记基因，利用含有草铵膦类除草剂的培养基筛选转化成功的外植体。要从个体生物学水平鉴定转基因玉米LD05是否培育成功，可在温室或田间条件下对LD05的目标性状（抗虫+耐除草剂）进行直接观测，如接种害虫、喷洒除草剂。 22．（2026·辽宁营口·三模）刺糖多孢菌是一种能产生大环内酯类杀虫剂----多杀菌素的重要工业菌株，其拥有的I-B型CRISPR/Cas3系统具有重要的生理意义，CRISPR/Cas 3系统能将入侵的外源DNA片段整合到自身的CRISPR序列中，随后将该序列转录并加工为成熟的crRNA；DNA的侵染。科研人员尝试将某个与副产物合成相关的基因整合到CRISPR中构建编辑质粒，以敲除该基因（敲除原理如图)，获得相关高产多杀菌素的菌。回答下列问题。 (1)已知CRISPR/Cas3的复合物相当于基因工程中的限制酶，推测crRNA的作用是________，而Cas3蛋白可以破坏DNA分子的___，由此实现特定基因的敲除。但有时CRISPR/Cas3系统会出现错误切割非目标DNA的情况，可能的原因是______。 (2)为初步检测编辑质粒（含碳青霉烯抗性基因）是否成功导入刺糖多孢菌，研究人员将转化后的刺糖多孢菌分为两个实验组（8-1与8-2)，并设置阳性组（已明确携带碳青霉烯抗性基因，8-3）与阴性组（未导入编辑质粒，8-4）进行对照，将各组菌体置于加入了碳青霉烯的培养基中进行培养，结果如图所示，此结果说明________，请从操作过程角度分析出现该情况的原因可能是_____（答出一点即可）。 (3)编辑质粒导入成功后，为验证目的基因（副产物相关基因）是否被成功敲除，需要设计引物通过PCR进行检测。研究人员根据目的基因碱基序列设计了三对备选引物（如表，方向均为5＇→3＇)，应选第________对，作出该选择的依据是___________。 第一对 上游 TGGAGTGAAGCTGGATCATG 下游 TGAGGTAACTCATTCTCGTT 第二对 上游 CGGAAGTGAGACTGGATGAT 下游 ATCATCCAGTCTCACTTCCG 第三对 上游 GCGGGGATTTTTTTCCCAGG 下游 ATCCGGCAAAAAAAACTTGC (4)即使已确定目的基因成功被敲除，仍不能说明已获得所需高产菌，还需进行个体水平鉴定，鉴定的指标为_________。 【答案】(1) 识别并结合特定的目标 DNA 序列 磷酸二酯键 非目标 DNA 序列与 crRNA 存在部分碱基互补配对 (2) 没有获得抗碳青霉烯的特性 可能转化过程中（如热激 / 电击）温度、电压等条件不当，导致感受态细胞死亡或质粒无法进入细胞 (3) 一 第一对引物：上游引物可与目的基因模板链的 3' 端互补，下游引物可与目的基因互补链的 3' 端互补，符合 PCR 引物的设计规则；第二对引物：上下游引物序列反向互补，会发生引物二聚体反应，无法特异性扩增目的基因；第三对引物：仅给出了一条上游序列，缺少下游引物，无法完成 PCR 扩增 (4)检测并对比敲除菌与野生型菌株的多杀菌素产量（或发酵产物中多杀菌素的含量），若敲除菌的多杀菌素产量显著高于野生型，则说明获得了所需的高产菌 【详解】（1）CRISPR/Cas 系统的核心是 “精准定位 + 切割”，crRNA 相当于 “导航员”，它通过碱基互补配对，特异性结合到目标基因的 DNA 序列上，引导 Cas3 蛋白找到切割位点。 CRISPR/Cas 的特异性来自 crRNA 与目标 DNA 的互补配对，故crRNA的作用是识别并结合特定的目标 DNA 序列。Cas3 蛋白破坏磷酸二酯键将目标 DNA 切断，从而实现基因敲除。非目标 DNA 序列与 crRNA 存在部分碱基互补配对，会导致 Cas3 蛋白被错误引导并切割。 （2）由图可知，阳性组（8-3）：携带抗碳青霉烯抗性基因，培养基上长出菌落，说明碳青霉烯筛选条件有效；阴性组（8-4）：未导入质粒，无菌落，说明未导入抗性基因的菌无法在筛选培养基上存活；实验组（8-1、8-2）：和阴性组一样无菌落，说明没有获得抗碳青霉烯的特性，即编辑质粒没有成功导入。可能转化过程中（如热激 / 电击）温度、电压等条件不当，导致感受态细胞死亡或质粒无法进入细胞，导致出现该情况。 （3）第一对引物：上游引物可与目的基因模板链的 3' 端互补，下游引物可与目的基因互补链的 3' 端互补，符合 PCR 引物的设计规则；第二对引物：上下游引物序列反向互补，会发生引物二聚体反应，无法特异性扩增目的基因；第三对引物：仅给出了一条上游序列，缺少下游引物，无法完成 PCR 扩增。故应该选择第一对引物。 （4）可以在个体水平检测并对比敲除菌与野生型菌株的多杀菌素产量（或发酵产物中多杀菌素的含量），若敲除菌的多杀菌素产量显著高于野生型，则说明获得了所需的高产菌。 23．（2026·辽宁朝阳·三模）人凝血因子Ⅶ（FⅦ）是肝细胞分泌的单链糖蛋白酶原，对于血小板减少等病症具有良好的治疗效果。利用家兔乳腺生物反应器表达重组FⅦ，具有产量高、成本低的优势。pBC1质粒（图1）带有山羊β-酪蛋白基因的部分序列，帮助外源基因在乳腺上皮细胞中表达。结合图示，回答下列问题： (1)用限制酶Xho Ⅰ切割pBC1质粒和FⅦ基因后，需用_____________酶连接两者。连接前用碱性磷酸酶去除载体游离的磷酸基团，可防止_______；FⅦ基因的磷酸基团保留，则构建重组载体时生成了_____________个磷酸二酯键，后续借助受体细胞的DNA修复机制补齐缺口。获得的重组质粒中，目的基因的接入方向_____________（填“唯一”或“不唯一”）。 (2)重组质粒pBC1-FⅦ扩增后，经Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切得到目标DNA片段，纯化后备用。对成年未发情的母兔注射_____________进行超数排卵，与正常公兔配种后收集受精卵。将纯化的目标DNA通过_____________技术注入受精卵，早期胚胎经胚胎移植后，由受体母兔产下转基因兔。检测转基因兔染色体是否插入FⅦ基因，可采用__________（填检测方法）。 (3)β-酪蛋白是哺乳动物乳腺上皮细胞特异性表达的蛋白质，pBC1质粒中，来自山羊的_____________序列是外源基因在乳腺上皮细胞中正确转录的必要条件。pBC1质粒上的β-酪蛋白外显子无起始密码子编码序列，而FⅦ基因含起始密码子编码序列。由此推测，转基因雌兔乳腺上皮细胞中表达的蛋白质可能有_____________。 A．山羊的β-酪蛋白   B．FⅦ    C．转基因兔的兔源β-酪蛋白 (4)FⅦ基因随机整合到家兔基因组，转入的外源基因的数量即基因拷贝数无法控制。用抗原—抗体杂交技术鉴定乳汁中的FⅦ含量（条带宽窄、深浅与蛋白质含量正相关），实验结果如图2所示。应该选择__________（填转基因兔编号）生产FⅦ；乳汁FⅦ含量与基因拷贝数_________（填“有”或“没有”）明显相关性。 【答案】(1) DNA连接酶 载体自身环化或载体之间相连接 两 不唯一 (2) 促性腺激素 显微注射 DNA 分子杂交技术（或PCR） (3) β-酪蛋白基因启动子和终止子 BC (4) 转基因兔3 没有 【详解】（1）限制酶切割后，载体和目的基因的连接需要用 DNA 连接酶连接两个DNA片段，形成磷酸二酯键；碱性磷酸酶去除载体游离的磷酸基团后，载体自身无法形成磷酸二酯键，可防止载体自身环化或载体之间连接；载体的两条链都无游离磷酸基团，目的基因的两条链保留磷酸基团，因此每条链各形成1个磷酸二酯键，共生成2个；载体去磷酸化后，目的基因的磷酸基团能与载体的羟基连接，接入方向不是唯一的； （2）对母兔注射促性腺激素可促进其超数排卵，获得更多卵母细胞；将纯化的目标 DNA 片段注入受精卵的常用方法是显微注射技术；检测转基因兔染色体是否插入目的基因，可采用 PCR 或 DNA 分子杂交技术，通过特异性探针检测目的基因的存在； （3）启动子是 RNA 聚合酶结合的位点，终止子终止转录，二者是外源基因在乳腺上皮细胞中正确转录的必要条件，pBC1质粒中，含有β-酪蛋白基因启动子和终止子； A：pBC1 质粒上的山羊 β- 酪蛋白外显子无起始密码子，无法合成山羊的 β- 酪蛋白，A错误； B ：FⅦ基因含起始密码子，可被转录翻译为FⅦ蛋白，B正确； C ：转基因兔自身的兔源 β- 酪蛋白基因正常表达，因此细胞中仍会合成兔源 β- 酪蛋白，C正确。 故选BC。 （4）根据图 2，条带3最宽最深，说明转基因兔3的乳汁中FⅦ含量最高，应选择其生产FⅦ； 对比条带可知，拷贝数2~8的转基因兔3的FⅦ含量高于拷贝数20~30的转基因兔2、4，说明乳汁FⅦ含量与基因拷贝数没有明显相关性。 24．（2026·辽宁·模拟预测）RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种，如图所示，①~⑥表示相关过程。请分析回答： 注：Hygr：潮霉素抗性基因    Kanr：卡那霉素抗性基因 限制酶：XhoⅠ：5'-C↓TCGAG-3'；BamHⅠ：5'-G↓GATCC-3'；SalI：5'-G↓TCGAC-3'；BglⅡ：5'-A↓GATCT-3'，C4pdk启动子：受光诱导的强启动子，驱动基因在大豆叶肉细胞中特异表达 LB：TDNA左边界  RB：TDNA右边界 (1)过程①一般从_______细胞中提取总RNA，参与该过程的酶有_____，其产物中____（填“含有”或“不含有”）启动子、终止子和内含子序列。 (2)已知①过程rca基因的a链和获取它的模板mRNA互补，反义rca基因的模板链为_____（填a链或b链），反义rca基因的____端（填N或M）接在C4pdk启动子的后面。依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，写出引物1的碱基序列5'___3'（只写出前8个碱基即可）。 (3)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是______，⑤过程后可用含_____的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。分子水平上转基因大豆培育成功的标志是______。 (4)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2。据图分析，RCA对大豆的光合作用具有促进作用，其机理主要是通过___来影响光合作用强度。 【答案】(1) 大豆叶肉 逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 不含有 (2) b链 N AGATCTGT (3) 驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达 潮霉素 RCA表达量减少 (4)RCA可提高Rubisco活力（促进暗反应） 【详解】（1）RCA是叶绿体蛋白，其基因在叶肉(含叶绿体的)细胞中表达，故从大豆叶肉细胞提取总RNA，过程①是逆转录PCR，需要逆转录酶、TaqDNA聚合酶参与，cDNA由mRNA逆转录而来，不含有启动子、终止子和内含子序列。 （2）①过程rca基因的a链和获取它的模板mRNA互补，则a链是模板链，反义rca基因需要转录出和rcamRNA互补的 RNA，所以它的模板链要和原rca的模板链相反，也就是用b链作为反义基因的模板链（这样转录出的RNA才会和原mRNA互补）。启动子驱动基因从5'到3'转录。原rca基因的N端是转录的起始端（靠近启动子的一端），要构建反义基因，需要把N端接在C4pdk启动子后面，这样转录出的RNA才能和原rca的mRNA反向互补，发挥沉默作用。质粒上用BamH I和Sal I切割，rca基因用Bgl Ⅱ（与BamH I属于同尾酶）和Xho I（与Sal I产生相同的黏性末端）切割，由于目的基因是反向接入，所以目的基因M端连接Xho I识别序列，N端连接Bgl Ⅱ识别序列。引物1需与模板链互补，且要引入限制酶识别位点，结合图中引物1的设计区域碱基序列和Bgl Ⅱ的识别序列可知，引物1的碱基序列应该是5´­­­­-AGATCTGT-3´。 （3）C4pdk启动子是光诱导的叶肉细胞特异启动子，替换后可驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达，表达载体含潮霉素抗性基因，故用含潮霉素的培养基筛选，分子水平上，转基因成功的标志是rca基因沉默，即RCA表达量减少。 （4）转基因大豆（rca 基因沉默）的光合速率、Rubisco活力均低于野生型，说明RCA能促进光合作用，主要通过提高Rubisco活力实现。 25．（2026·辽宁锦州·模拟预测）你是学校生物科技社团的成员，社团正在开展一项针对B细胞淋巴瘤的“CAR-T细胞疗法”模拟研发项目。该病的特点是肿瘤细胞表面高表达CD19抗原蛋白。你需要完成从设计、构建到优化的全流程任务。 任务一：资料查阅与原理分析 经过文献阅读，你了解了CAR-T细胞疗法的基本流程，如下图所示： (1)CAR-T细胞是在T细胞中导入人工设计的能够靶向特定抗原的受体基因（CAR基因），使其表达CAR蛋白，这相当于为T细胞安装了追踪肿瘤细胞“导航系统”。本研究项目中该“导航系统”能特异性识别肿瘤细胞表面的_____。 任务二：CAR基因的获取与载体构建 (2)CAR-T细胞的制备离不开转基因技术。构建基因表达载体时，CAR基因必须位于_____之间，以确保其在T细胞中正常表达。若要实现该疗法的长期疗效，通常利用逆转录病毒作为_____，利用其特性将CAR基因整合到T细胞的_____上。 任务三：CAR-T细胞的激活与培养 (3)将T细胞改造成CAR-T细胞后，需在体外进行大量扩增，其培养液中通常要加入白细胞介素-2等细胞因子，其主要作用是_________。 任务四：问题分析与优化迭代 (4)在模拟临床试验时发现，部分患者在治疗后肿瘤复发，原因是肿瘤细胞发生了"抗原逃逸"（即CD19抗原丢失）。提出一项具有可行性的改进策略：_____。 (5)正常B淋巴细胞也会表达CD19蛋白，导致CAR-T细胞在杀伤肿瘤B淋巴细胞的同时可能会误伤它们。为解决这一问题，项目组设想给CAR-T细胞安装一个“药物可控开关”：当患者出现严重副作用时，可通过服药来快速清除体内的CAR-T细胞。已知该药物本身无毒，但可被特定酶转化为某种能引发CAR-T细胞凋亡的物质。若要实现这一功能，对CAR-T细胞进行基因改造时，应在该特定酶基因的上游添加_____，通过药物调控其表达，从而选择性清除CAR-T细胞。 【答案】(1)CD19抗原蛋白 (2) 启动子和终止子 载体 染色体DNA (3)促进T细胞的分裂/增殖、分化 (4)开发同时靶向CD19和肿瘤 B细胞表面另一种抗原的双靶点CAR-T细胞 (5)诱导型启动子（或药物诱导型启动子） 【详解】（1）题干明确指出，B 细胞淋巴瘤的肿瘤细胞表面高表达CD19抗原蛋白，而CAR-T细胞的 “导航系统”（CAR 蛋白）是靶向该特定抗原的受体，因此能特异性识别CD19抗原蛋白，引导CAR-T靶向杀伤肿瘤细胞。 （2）基因表达载体中，目的基因（CAR 基因）必须插在启动子与终止子之间，启动子是 RNA 聚合酶结合位点驱动转录，终止子终止转录，保证基因正常转录翻译；逆转录病毒属于动物病毒载体，可侵染 T 细胞，能将携带的 CAR 基因整合到宿主染色体DNA上，实现目的基因稳定遗传、长期表达，保障长期疗效。 （3）白细胞介素 - 2（IL-2）是一种关键的 T 细胞生长因子，其主要作用是促进CAR-T细胞的增殖与活化，同时增强其细胞毒性和免疫活性，以满足体外大量扩增的需求，为后续回输患者做好准备。 （4）据题干信息可知，抗原逃逸是CD19抗原丢失，原有CAR无法识别，改进的思路是开发双靶点CAR-T 细胞，同时靶向CD19和另一种肿瘤B细胞抗原，即使 CD19丢失，仍能通过另一靶点识别并杀伤肿瘤细胞。 （5）要实现 “药物可控开关”，需要让特定酶基因的表达受药物调控，仅在给药时表达，将无毒药物转化为诱导CAR-T细胞凋亡的物质。 在基因工程中，应在该特定酶基因的上游添加可被药物诱导的启动子（或药物诱导型启动子 / 诱导型启动子），通过药物结合启动子调控下游酶基因的表达，从而在需要时选择性清除CAR-T细胞。 26．（2026·辽宁·三模）科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（下图），水杨酸是常见的水体污染物。请回答： (1)获得纯净的大肠杆菌的关键是防止________。若需分离得到大肠杆菌单菌落，可采用________（答2种方法）。 (2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活________启动子，最终使菌体发出红色荧光，根据________可判定环境中的水杨酸浓度。 (3)水杨酸羟化酶基因可催化水杨酸分解。为清除水体中的水杨酸，科学家向工程菌中导入水杨酸羟化酶基因。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA基因应插入D位点、ccdB基因应插入下图中的________位点。 (4)在分子水平上可以采用________技术检测nahR蛋白。科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是________。与血清中的抗体相比，抗nahR蛋白的单克隆抗体优点是________。 (5)结果显示智能工程菌的灵敏性并未达到预期，为提升nahR蛋白的生物活性，科研人员欲通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，请按正确顺序排列：________。 ①采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列 ②推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点 ③通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构 ④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性 【答案】(1) 杂菌污染 平板划线法、稀释涂布平板法 (2) Ps（水杨酸诱导） 红色荧光强度 (3)B (4) 抗原-抗体杂交 刺激小鼠免疫系统产生特异性B细胞 准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备（特异性强、灵敏度高、可大量制备） (5)③②①④ 【详解】（1）获得纯净大肠杆菌的关键是防止外来杂菌的污染，无菌技术是微生物培养的核心。分离单菌落的常用方法有两种：平板划线法：通过连续划线稀释菌种，获得单菌落。稀释涂布平板法：通过梯度稀释和涂布，获得分散的单菌落。 （2）水杨酸与调控蛋白结合形成复合物，激活水杨酸诱导启动子Ps​，驱动下游红色荧光蛋白基因mrfp表达，使菌体发出红色荧光。水杨酸浓度越高，激活的Ps​启动子越多，红色荧光蛋白表达量越高，荧光强度越强，因此可通过红色荧光强度判定水杨酸浓度。 （3）水杨酸存在时，ccdA表达抗毒素蛋白，抑制ccdB毒蛋白的作用，菌体存活并分解水杨酸。水杨酸耗尽时，需启动 “自毁”：此时ccdA不再表达，ccdB毒蛋白发挥作用，菌体死亡。因此，ccdA基因应插入依赖水杨酸诱导表达的区域下游（D位点，mrfp与终止子之间），而ccdB基因应插入持续表达启动子Pc的下游，即B位点。 （4）检测目的基因表达的蛋白质（nahR 蛋白），分子水平常用抗原 - 抗体杂交技术。给小鼠注射 nahR 蛋白的目的是作为抗原，诱导小鼠发生免疫反应，产生能分泌特异性抗体的 B 淋巴细胞。单克隆抗体相比血清抗体，具有特异性强、灵敏度高、可体外大量制备的优点。 （5）蛋白质工程的基本流程：通过 X 射线衍射技术分析原始 nahR 蛋白的空间结构（预期蛋白质功能出发，分析结构），推导出提高生物学活性所需的关键氨基酸替换位点（设计改造方案），采用定点突变技术修改 nahR 基因的脱氧核苷酸序列（改造基因），将改造后的 nahR 基因导入受体细胞并检测其生物学活性（表达与检测），即③②①④。 27．（2026·辽宁·三模）水蛭素（Hirudin）可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。研究人员利用重叠延伸PCR技术，替换Hirudin基因的一个碱基对，获得“Hirudin改良基因”，再构建基因表达载体，以获得含有“Hirudin改良基因”的重组DNA分子。相关过程、质粒及限制酶的酶切位点如图所示（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增含有Hirudin基因的片段时，温度的控制至关重要。若变性温度过低，则会因_____导致反应效率降低；其中复性温度设置需参考引物中碱基的_____。引物长度一般在15-30个核苷酸之间，如果引物过短则特异性差，易与_____随机互补结合从而发生错配；如果引物过长则自身容易发生_____而形成稳定的双链结构。在制备PCR反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，还需要_____。 (2)将Hirudin基因诱变为Hirudin改良基因的过程中，发生了碱基对的_____（填“增添”“缺失”或“替换”）。由图可知，引物2和引物3_____（填“完全”或“不完全”）互补配对。图中参与重叠延伸过程的两条DNA单链为_____（从“1、2、3、4”中选择）。 (3)为将Hirudin改良基因与质粒高效连接，需用限制酶_____切割目的基因。将重组质粒导入大肠杆菌制备工程菌，之后用含_____的培养基培养大肠杆菌，以筛选工程菌。 【答案】(1) DNA双链不能充分解开 组成和数量 模板链 碱基互补配对 更换微量移液器的枪头 (2) 替换 完全 1、4 (3) BamHI和EcoRI 氨苄青霉素 【详解】（1）利用PCR技术扩增含有Hirudin基因的片段时，若变性温度过低，没有足够多的能量解开双螺旋，则会因DNA双链不能充分解开导致反应效率降低；其中复性温度设置需参考引物中碱基的组成和数量；复性温度下发生的过程是两种引物分别与 Hirudin 基因的两条单链结合，该过程遵循碱基互补配对原则，如果引物过短则特异性差，易与模板链随机互补结合从而发生错配；如果引物过长则自身容易发生碱基互补配对而形成稳定的双链结构。用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，为防止不同溶液之间的污染，还需要更换微量移液器的枪头。 （2）题意显示，研究人员利用重叠延伸PCR 技术，替换 Hirudin基因的一个碱基对，获得“Hirudin改良基因”，可见，将 Hirudin基因诱变为 Hirudin改良基因的过程中，发生了碱基对的“替换”。由图可知，引物2和引物3“完全”互补配对，为后续重叠延伸作准备。 图中参与重叠延伸过程的两条 DNA单链为1和4，因为这两条链有互补的部分，且子链延伸开始端为游离的3'端，可直接在DNA聚合酶作用下延伸形成改良Hirudin基因。 （3）根据模板链的方向可知 Hirudin改良基因的转录方向为从左向右，基因上游只能用BamH Ⅰ切割，而质粒无相同酶切位点，选择同尾酶BglⅡ；下游则选用两者都有的EcoRⅠ，因此用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ切割目的基因,用BglⅡ和EcoRⅠ切割质粒。若将重组质粒导入大肠杆菌制备工程菌，首先需用含Ca2+的培养液处理大肠杆菌使其成为感受态，之后用含氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，以筛选工程菌，因为重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因。 28．（2026·辽宁·模拟预测）C-1027是由球孢链球菌C-1027菌种产生的一种具有抗癌作用的新型抗生素，其核心杀伤机制在于对DNA的毁灭性破坏，可有效摧毁真核细胞的染色质DNA并诱发细胞凋亡。研究人员拟筛选具有C-1027表达活性的菌种，并对其进行改造，使其可高效表达该抗生素。回答下列问题： (1)选择土壤作为样本筛选该菌株最可能的原因是___________。科研人员进行了如下实验操作：在待测土壤煮沸浸出液中加入DNA酶抑制剂与带标记的C-1027基因特异分子探针，检测是否出现带标记的DNA双链区段。该实验操作的目的是检测___________，操作中将土壤浸出液煮沸的目的是___________。 (2)为构建携带C-1027基因的大肠杆菌表达载体(空载质粒如图)，对C-1027基因的PCR扩增产物与质粒双酶切，随后使用E．coliDNA连接酶进行高效连接(连接平末端效率低)。为保证连接的准确性和高效性，应使用的限制酶为___________，双酶切的意义在于___________。 (3)为提高重组质粒导入大肠杆菌的效率，可用___________处理大肠杆菌。为高效筛选出成功转化并可表达C-1027的大肠杆菌，利用影印法进行简单的鉴别，操作如下：在含有四环素的培养基(培养基1)中接种待筛选的菌液，使用一块用丝绵包裹的、与培养基大小基本相同的圆柱形木块轻轻印下菌落，并接种至含有卡那霉素的培养基(培养基2)中。目的菌种菌落生存状况为：___________。 (4)对C-1027进一步研究发现，该蛋白由一个负责靶向的蛋白辅基与一个负责杀伤的烯二炔发色团构成。研究人员欲改造C-1027蛋白，使其可用于靶向结肠癌的治疗，可用蛋白质工程技术，其一般流程为___________。 【答案】(1) 球孢链球菌(C-1027菌种)主要分布在土壤 土壤样品中是否含有C-1027基因(或其特异序列) 使DNA双链变成单链 (2) SpeⅠ和BamHⅠ或XbaⅠ和BamHⅠ 防止目的基因反向插入，并减少载体自连，提高连接效率(合理即可) (3) Ca2+ 培养基Ⅰ中菌落存活，但培养基Ⅱ上(对应位置)菌落不存活 (4)预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列(基因)——获得所需要的蛋白质 【详解】（1）土壤是微生物的大本营，选择土壤作为样本筛选该菌株最可能的原因是球孢链球菌(C-1027菌种)主要分布在土壤。 科研人员进行了如下实验操作：在待测土壤煮沸浸出液中加入DNA酶抑制剂（可避免DNA被水解，保证DNA的完整性）与带标记的C-1027基因特异分子探针（可以根据碱基互补配对原则检测目标DNA的存在），因此，通过该操作后可检测土壤样品中是否含有C-1027基因。操作的目的是检测土壤样品中是否含有C-1027基因(或其特异序列)，操作中将土壤浸出液煮沸的目的将氢键打开，使探针和待测DNA进行互补，即通过加热使DNA双链变成单链。 （2）为构建携带C-1027基因的大肠杆菌表达载体(空载质粒如图)，对C-1027基因的PCR扩增产物与质粒双酶切，随后使用E．Coli DNA连接酶进行高效连接。为保证连接的准确性和高效性，应使用的限制酶为SpeⅠ和BamHⅠ或XbaⅠ和BamHⅠ，这里不选择EcoRⅤ和SmaⅠ的原因是二者切出的是平末端（连接效率低，不选择），SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶，因而也不选择。 双酶切的意义在于防止目的基因反向插入，并减少载体自连，提高连接效率，保证目的基因正向插入。 （3）为提高重组质粒导入大肠杆菌的效率，可用Ca2+处理大肠杆菌使之成为感受态，因而可以提高转化效率。为高效筛选出成功转化并可表达C-1027的大肠杆菌，利用影印法进行简单的鉴别，操作如下：在含有四环素的培养基(培养基1)中接种待筛选的菌液，使用一块用丝绵包裹的、与培养基大小基本相同的圆柱形木块轻轻印下菌落，并接种至含有卡那霉素的培养基(培养基2)中。由于重组质粒中卡那霉素抗性基因被破坏，因此，目的菌种菌落生存状况为培养基Ⅰ中菌落存活，但培养基Ⅱ上(对应位置)菌落不存活，据此选择出目标菌种。 （4）对C-1027进一步研究发现，该蛋白由一个负责靶向的蛋白辅基与一个负责杀伤的烯二炔发色团构成。研究人员欲改造C-1027蛋白，使其可用于靶向结肠癌的治疗，可用蛋白质工程技术，蛋白质工程最终的落脚点是通过修饰和合成基因实现，因此被称为第二代基因工程，其一般流程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列(基因)——获得所需要的蛋白质。 29．（2026·辽宁朝阳·三模）通过无融合生殖技术获得的二倍体杂交水稻克隆种子，是由特殊分裂产生的卵细胞（2N）直接发育形成。我国科学家借助基因开关系统（PSGS，由“基因锁”和“基因钥匙”构成）解决了克隆种子与有性种子的分选难题。已知DNA分子中存在两个相同且同向的LoxP序列时，Cre重组酶可特异性识别并敲除两个LoxP序列之间的基因。图1为LoxP序列，箭头处表示Cre重组酶的酶切位点，图2为Cre重组酶敲除基因的过程，图3为将PSGS导入水稻细胞获得转基因水稻TO的过程，其中“基因锁”可利用同向LoxP序列及其间的基因抑制下游红色荧光蛋白基因的表达，而“基因钥匙”在有性生殖过程中才发挥作用。回答下列问题。 (1)图2中片段1形成环状结构的原因是_____。 (2)图3中步骤Ⅰ～Ⅳ中，PSGS与DNA发生重组的步骤有_____（填序号）；步骤Ⅰ获取PSGS时，应选用下表中的限制酶_____（填编号）。 编号 限制酶 识别序列及切割位点 编号 限制酶 识别序列及切割位点 ① HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3′ ④ SalI 5′-G↓TCGAC-3' ② XbaI 5′-T↓CTAGA-3' ⑤ SpeI 5'-A↓CTAGT-3' ③ SacI 5'-GAGCT↓C-3' ⑥ BamHI 5′-G↓GATCC-3' (3)为了分选有性种子和克隆种子，需实现水稻有性种子胚中“基因锁”的特异性敲除，图3中启动子2的类型是_____（填编号）。 ①花粉特异性启动子②分生组织特异性启动子③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性） (4)研究人员获得转基因水稻TO后，对其自交产生的种子胚进行荧光检测，并从种子胚中提取DNA，对PSGS序列进行PCR扩增。预期红色荧光种子胚中扩增出的产物长度_____（填“大于”、“等于”或“小于”）无荧光种子胚中的产物长度，其原因是_____。 【答案】(1)两个LoxP序列的b区被Cre重组酶定点切开，使待敲除基因两端产生互补黏性末端，首尾相接形成环状DNA (2) Ⅰ和Ⅲ ①⑤ (3)① (4) 小于 Cre基因表达产生的Cre重组酶敲除了“基因锁”中的基因序列，使PSGS长度变短 【详解】（1）根据题意，两个LoxP序列的b区被Cre重组酶定点切开，使待敲除基因两端产生互补黏性末端，首尾相接形成环状DNA。 （2）基因工程中，步骤Ⅰ将PSGS与Ti质粒拼接构建重组质粒，属于不同来源DNA的重组；步骤Ⅲ农杆菌转化时，T-DNA整合到水稻染色体基因组中，也发生DNA重组，因此重组发生在Ⅰ、Ⅲ。Ti质粒的酶切位点为HindⅢ和XbaⅠ，左端用HindⅢ（编号①）可直接匹配PSGS左端酶切位点；XbaⅠ切割后产生的黏性末端为5′−CTAG−3′，SpeI（编号⑤）切割后也产生相同的黏性末端，可互补连接，因此限制酶选①⑤。 （3）题意要求Cre基因仅在有性生殖中发挥作用：克隆种子由卵细胞直接发育，不经过受精；有性种子由受精卵发育，含父本花粉的遗传物质。选择花粉特异性启动子，仅在有性生殖的花粉中启动Cre表达，实现有性种子基因锁的特异性敲除，因此选①。 （4）Cre基因表达产生的Cre重组酶敲除了“基因锁”中的基因序列，使PSGS长度变短，红色荧光种子胚中扩增出的产物长度小于无荧光种子胚中的产物长度。 30．（2026·辽宁沈阳·模拟预测）t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸替换成丝氨酸，能显著降低上述副作用。下图是通过定点突变技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因重组质粒的示意图。请回答下列问题： (1)科学家获得上述t-PA突变蛋白的生物技术手段属于_______工程。其基本流程为：根据t-PA突变蛋白的________设计其空间结构→推测应有的______和核苷酸序列→定点改造t-PA基因的脱氧核苷酸序列→获得所需要的t-PA突变蛋白。 (2)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点是突变部位的碱基，则引物b中该突变位点的碱基是__________。 (3)重叠延伸后利用引物__________进行PCR3，可获得大量改良t-PA基因。对t-PA改良基因产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因：_____________（答出一点即可）。 (4)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶_______切开，才能与t-PA突变基因准确并高效连接。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。若将转化后的大肠杆菌接种在含有___________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的菌落呈_______色。 【答案】(1) 蛋白质工程 预期功能 氨基酸序列 (2)G (3) a、d 复性温度过低、引物特异性不高 (4) Xma Ⅰ、Bgl Ⅱ 新霉素、X-gal 白 【详解】（1）科学家获得t-PA突变蛋白的生物技术手段属于蛋白质工程。蛋白质工程的基本流程为：根据t-PA突变蛋白的预期功能设计其空间结构→推测应有的氨基酸序列和核苷酸序列→定点改造t-PA基因的脱氧核苷酸序列→获得所需要的t-PA突变蛋白。 （2）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t-PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G。 （3）由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3'端结合，故据图可知，重叠延伸后利用引物a和引物d进行PCR3，可获得大量改良t-PA基因。出现非目的序列产物的原因有引物特异性不强，即与非目的序列有同源性、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。 （4）根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即新霉素抗性基因为标记基因，作用是便于筛选出成功导入质粒（普通质粒和重组质粒）的大肠杆菌。此外在培养基上还要加入X-gal，培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型：一类是导入普通质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有LacZ基因而呈蓝色；另一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中的LacZ基因在构建重组质粒时被破坏，则该细菌表现为白色。因此若将转化后的大肠杆菌接种在含有新霉素、X-gal的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的菌落呈白色。 31．（2026·辽宁·三模）科研人员以斑马鱼为模式生物，获得在胰岛区域特异性表达GFP（绿色荧光蛋白，可在荧光显微镜下观察到绿色荧光）的转基因斑马鱼（G品系斑马鱼）。回答下列问题： (1)制备G品系斑马鱼 ①获得GFP基因。 限制酶 识别序列及切割位点 SphⅠ CGTAC↓G HindⅢ A↓AGCTT KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ G↓AATTC ②制备重组质粒。已构建初步重组质粒如图1所示。为替换载体原有启动子，还需使用________限制酶切割质粒，并将能在_________中特异性表达的基因的启动子连接在相应位置。 ③导入受体细胞。将重组质粒利用_________法导入斑马鱼的_________。 ④若在荧光显微镜下观察小鱼的各个器官时发现仅胰岛发出绿色荧光，表明成功得到G品系斑马鱼。从G品系斑马鱼中筛选出一条只导入了一个GFP基因的个体，让其与野生型杂交，令F1中能发绿色荧光的斑马鱼自由交配，再从F2中筛选纯合G品系。筛选的具体操作是找到GFP插入的位置，并针对插入位点的上下游和GFP基因自身序列设计了引物，各引物的位置如图2所示，其中α链为转录的模板链。提取F2不同个体的DNA，并选用引物_________进行PCR并电泳，结果会出现如图3的三种情况，其中加样孔_________对应的个体是纯合G品系斑马鱼。统计发现，F2中纯合G品系占比为4/9，则提取所有F1中能发绿色荧光斑马鱼的DNA进行PCR和电泳（不更改引物），结果与图3中加样孔2情况一致的个体占比为_________。 (2)pdx1蛋白为决定胰岛形成的最为关键的蛋白质，科研人员特异性敲除G品系斑马鱼受精卵的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。荧光显微镜下观察N品系斑马鱼的荧光情况为_________，原因是________。 【答案】(1) HindⅢ、KpnⅠ 胰岛 显微注射 受精卵 1、4 1 2/3 (2) N品系斑马鱼无荧光 pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质，基因敲除后胰岛不存在，因此不发绿色荧光 【详解】（1）②选择限制酶，要替换载体原有的启动子，需要选择能在启动子两端进行切割的限制酶，从图1可以看到启动子的两端是HindⅢ和KpnⅠ的酶切位点，所以使用这两种限制酶可以精准切除原有启动子，同时不破坏其他关键序列。启动子的选择，因为我们要获得在胰岛区域特异性表达GFP的转基因斑马鱼，所以需要将能在胰岛中特异性表达的基因的启动子连接到载体上，这样才能保证GFP只在胰岛部位表达。 ③导入受体细胞的方法和受体，将重组质粒导入斑马鱼细胞常用显微注射法，这种方法可以精准地将质粒注入到斑马鱼的受精卵中，因为受精卵具有全能性，能发育成完整的个体，保证转基因性状可以稳定遗传。   ④PCR引物选择与个体筛选，引物选择：要筛选纯合G品系斑马鱼，需要选择能同时检测插入位点和GFP基因的引物，引物1结合插入位点上游，引物4结合GFP基因序列，只有同时含有插入的GFP基因和对应位点的个体才能被扩增出条带，所以选用引物1、4。纯合G品系斑马鱼的两条同源染色体都插入了GFP基因，PCR电泳后会出现对应条带，对应图3中的加样孔1； F₁发荧光个体全部为杂合子G+，自由交配，子代基因型比例： GG:G+:++ = 1:2:1，全部子代 4 份；其中发荧光个体为GG+G+ = 3 份（GG1 份、G+2 份），野生 ++ 不发荧光排除。 提取所有 F₁中发荧光斑马鱼的 DNA（即只看 F₂里能发荧光的个体：GG、G+）做 PCR 电泳。  GG（纯合）：电泳条带和加样孔 1 一致，占荧光个体比例1/3；G+（杂合）：电泳条带和加样孔 2 一致，占荧光个体比例2/3；因此和加样孔 2 情况一致的个体占比为2/3。 （2）荧光情况：N品系斑马鱼无荧光。原因：pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质，特异性敲除该基因后，胰岛无法形成，而GFP基因是在胰岛特异性启动子驱动下表达的，没有胰岛就无法表达GFP，因此不会发绿色荧光。 1 / 11 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题11 胚胎工程与基因工程 内容导览 考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。 2026年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。 近3年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。 名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。 命题解读 考向 题目 1.高频考点： 胚胎工程、基因工程。 2.素养考向 1. 生命观念：运用生物学基本概念和原理，引导学生形成物质与能量观相关的生命观念； 2. 科学思维：通过工程学构想，考查学生基于事实逻辑辨析概念、判断命题正误的演绎推理能力，落实科学思维素养； 3. 社会责任：结合生活或生产实例的情境，引导学生分析基因工程，胚胎工程相关知识的应用，落实社会责任素养； 4. 科学探究：基于人类生产或生活某一需求的相关资料，考查学生对实验设计、结果检测基本逻辑的理解，落实科学探究素养。 考向1 基因工程 ①2026·黑吉辽蒙卷 ②2025·黑吉辽蒙卷 ③2024·黑吉辽卷 考向2 胚胎工程 ①2026·黑吉辽蒙卷 ②2025·黑吉辽蒙卷 2026年高考中，整套试题体现新高考生物“基础覆盖广、情境真实、图表信息密集、实验探究突出”的命题特点。总体难度中等偏上，区分度主要来自图表判读、多选题选项甄别、遗传推理、实验流程补全和规范表达。情境真实多元，贴近生产生活与科学研究；图文表信息密集，突出综合判读能力；重过程推理，强化生物的实验探究能力；实践导向突出，强调生物问题解决。 预测2027年高考，该专题对图表判读与过程推理能力有很大的提升，曲线、路径图、结构图会承载更多信息。 考向一 基因工程 1. （2026·黑吉辽蒙卷·第25题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 (1)为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E.coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。 A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′    B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′ C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′    D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）——导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 (3)该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 考向二 胚胎工程 2.（2026·黑吉辽蒙卷·第13题）为模拟胚胎发育过程中子宫的力学环境，科学家设计了水凝胶材料，小鼠囊胚在其内部生长，如下图。下列叙述正确的是（　　） A．囊胚置于水凝胶之前，已经历了桑椹胚阶段 B．胚胎培养时，物质分子由培养基至胚胎单向转移 C．水凝胶基质硬度越大，越有利于胚胎生长 D．囊胚孵化后，与水凝胶接触的部位由滋养层变为透明带 命题立意 本题以胚胎发育过程中子宫力学环境研究为情境，引导学生利用胚胎工程的知识。考查的必备知识为胚胎的发育过程、孵化，关键能力分析、运用知识解决实际问题的能力。 A 正确选项 小鼠早期胚胎发育依次经历受精卵、卵裂、桑椹胚、囊胚阶段，因此囊胚置于水凝胶之前已经历了桑椹胚阶段 B 错误选项 胚胎培养时，物质分子是双向转移的：培养基中的营养物质进入胚胎，胚胎代谢产生的废物排出到培养基中 C 错误选项 水凝胶模拟子宫的力学环境，只有基质硬度与子宫正常力学环境相近时才有利于胚胎生长，并非硬度越大越有利 D 错误选项 囊胚孵化是指囊胚扩大导致透明带破裂、胚胎从透明带中伸出的过程，孵化后透明带消失，与水凝胶接触的部位是滋养层 一、基因工程的基本工具 1. 限制性内切核酸酶（限制酶） （1）来源：主要从原核生物中分离纯化得到。 （2）作用特点：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 （3）切割结果：产生黏性末端（两条链切口处的末端伸出互补的单链）或平末端（两条链切口处的末端是平整的）。 （4）作用意义：限制酶是基因工程的“手术刀”，为DNA的切割和重组提供了特异性的工具。 2. DNA连接酶 （1）作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，是基因工程的“缝合针”。 （2）种类及区别： E.coli DNA连接酶：能连接黏性末端。 T4 DNA连接酶：既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率较低。 3. 载体 （1）作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因能够在受体细胞中复制、表达或稳定遗传。 （2）必备条件： 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 有一个或多个限制酶切割位点，以便外源DNA片段插入。 具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选（如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等）。 对受体细胞无害，不会影响受体细胞的正常生命活动。 （3）常用类型： 质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，是最常用的载体。 噬菌体：经过改造的噬菌体载体，可将较大的DNA片段导入细菌细胞。 动植物病毒：经过改造的病毒载体，可将目的基因导入动植物细胞。 二、基因工程的基本操作程序 1. 目的基因的获取 （1）目的基因定义：编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 （2）常用方法： 从基因文库中获取：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。包括基因组文库（包含一种生物的全部基因）和cDNA文库（包含一种生物的部分基因，由mRNA反转录而来）。 利用PCR技术扩增目的基因：PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可在短时间内大量扩增目的基因。其过程包括变性（90-95℃，双链DNA解旋为单链）、复性（55-60℃，引物与单链DNA互补结合）、延伸（72℃，TaqDNA聚合酶催化合成新的DNA链）三个步骤，循环往复实现DNA片段的指数级扩增。 人工合成：如果目的基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成；如果基因序列未知，但已知其编码的蛋白质的氨基酸序列，可先推测出mRNA的核苷酸序列，再根据碱基互补配对原则推测出目的基因的核苷酸序列，进而人工合成。 2. 基因表达载体的构建（核心步骤） （1）构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成结构： 目的基因：编码所需蛋白质或调控因子的基因片段。 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 终止子：位于基因的尾端，是转录终止的信号，使RNA聚合酶停止转录。 标记基因：便于重组DNA分子的筛选。用于鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。如抗生素抗性基因。 复制原点：载体自我复制的起点，保证载体在受体细胞中复制。 3. 将目的基因导入受体细胞 （1）转化的定义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 （2）常用导入方法： 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上的特点）、花粉管通道法（我国独创，简便经济）。 动物细胞：显微注射技术（最常用，将重组DNA分子直接注入受精卵的细胞核内）。 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理微生物细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态，然后将重组DNA分子与感受态细胞混合培养，使重组DNA分子进入受体细胞）。 4. 目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平检测： 检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上：采用DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的目的基因作探针，与受体细胞的DNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已插入。 检测目的基因是否转录出mRNA：采用分子杂交技术，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已转录。 检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用抗原-抗体杂交技术，用相应的抗体与受体细胞提取的蛋白质进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已翻译出蛋白质。 （2）个体水平鉴定： 植物：抗虫或抗病的接种实验，观察受体生物是否表现出相应的抗虫或抗病特性；观察转基因植物的性状是否符合预期。 动物：观察转基因动物的性状是否符合预期，如转基因动物的生长速率、产奶量等。 考向1 基因工程 1. （2025·黑吉辽蒙卷·第25题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 2.（2024·黑吉辽卷·第25题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______和______。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 题干关键信息 所学知识 信息加工 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶 酶具有专一性 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精 DNA在冷酒精中溶解度较低 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA 3.（2024·黑吉辽卷·第7题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 考向2 胚胎工程 4.（2025·黑吉辽蒙卷·第9题）研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。下列叙述错误的是（    ） A．体细胞核进入去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚 B．移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态 C．胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化 D．为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植 1．（2026·辽宁·模拟预测）科研人员从野生森林猫皮肤组织中分离培养得到成纤维细胞，利用中华田园猫卵母细胞作为细胞核受体，通过细胞核置换和人工激活，制作出多个体细胞克隆胚胎，将克隆胚胎移植入受体母猫后，经过62天孕育，成功得到一只森林猫体细胞克隆后代，实验流程如图所示。下列叙述错误的是（  ） A．用来克隆的卵母细胞需要在体外培养到MⅡ期 B．用电刺激、乙醇等方法可以激活重构胚 C．过程①采用了动物细胞工程中的体细胞核移植技术 D．将图示胚胎移植到狗的体内也可以正常发育 2．（2026·辽宁沈阳·模拟预测）科研人员以猪为实验材料开展核移植研究，相关流程如图所示，可用相关试剂提升重构胚发育效率，但目前该技术仍普遍存在克隆效率偏低的问题。下列叙述错误的是（　　） A．过程①去除的核实质上是纺锤体-染色体复合物 B．过程②体外培养重构胚，需培养至原肠胚阶段 C．过程③胚胎移植前，需对受体母猪进行同期发情处理 D．对重构胚进行激活处理，也可使用Ca2+载体处理 3．（2026·辽宁·三模）乌珠穆沁白山羊为绒肉兼用型品种，当前因种群小、近亲繁殖而出现品种资源危机。现利用生物技术开展保护工作，相关叙述正确的是（    ） A．在动物细胞培养过程中大多数细胞是悬浮在培养液中生长增殖的 B．核移植技术中需去除MⅡ期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物 C．胚胎移植操作前通常需对多只受体进行超数排卵和同期发情处理 D．为提高胚胎的利用率，可选用未分化的囊胚和桑椹胚进行胚胎分割 4．（2026·吉林·模拟预测）中国科学家选择了比格犬作为受体及代孕母亲，成功克隆了一只濒危物种北极狼。通过克隆技术获得北极狼的基本过程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．从重组细胞到甲胚胎，胚胎体积不断增大 B．需对代孕比格犬注射激素使其同期发情 C．克隆狼的部分遗传性状与代孕比格犬相同 D．将重组细胞直接移植到代孕犬子宫中可缩短克隆周期 5．（2026·黑龙江哈尔滨·模拟预测）哈尔滨医科大学发表论文揭示了过表达转录因子Nr5a2对克隆小鼠胚胎发育效率的影响，部分结果如图所示，下列有关叙述不正确的是（　　） A．培育过程中可用电刺激或Ca2+载体等激活重构胚 B．通过核移植获得多个个体有利于生物多样性的形成 C．体外培养重构胚时，需提供适宜的营养及气体环境 D．Nr5a2过表达可促进桑葚胚向囊胚转化，提高发育效率 6．（2026·黑龙江·模拟预测）辅助生殖技术包括体外受精、胚胎培养、胚胎移植等，胚胎反复植入失败（RIF）是辅助生殖领域亟待破解的难题。我国研究团队构建的3D人工子宫模型，首次在实验室实现了胚胎植入与早期发育的全过程模拟，为治疗RIF提供了全新潜在方案。下列相关叙述正确的是（　　） A．取卵前，需通过口服促性腺激素类药物进行超数排卵 B．体外受精时，采集的精子可直接与成熟的卵子共同培养 C．需使用免疫抑制剂以避免受体子宫对植入胚胎的排斥反应 D．该模型模拟子宫的激素环境，为胚胎探索适宜的着床条件 7．（2026·黑龙江大庆·模拟预测）MSTN基因是调控肌肉生长的抑制素基因。敲除家猪的MSTN基因可增加肌纤维数量，提高瘦肉率。下列关于培育MSTN基因敲除家猪的实验操作，合理的是（　　） A．给雌猪注射孕激素，以获得卵母细胞 B．敲除MSTN基因的受精卵经体外培养获得早期胚胎后移植 C．移植前需对受体进行妊娠检查和免疫学检查 D．胚胎需经质量检测和性别鉴定后才能移植 8．（2026·黑龙江哈尔滨·二模）下列有关哺乳动物的受精和胚胎早期发育的叙述，正确的是（ ） A．精子和卵子一经排出即具有受精能力 B．受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂 C．滋养层细胞将来发育成胎儿的各种组织 D．早期胚胎发育过程中，胚胎的体积持续增大 9．（2026·黑龙江大庆·模拟预测）“EMT-Cas12a”疗法利用外泌体(纳米囊泡)搭载基因剪刀“Cas12a”，剪碎感染细胞内的病毒基因组。下列说法正确的是（　　） A．Cas12a切割病毒基因组的原理与限制酶相似，切割后一定产生黏性末端 B．将Cas12a基因导入外泌体表达时，需构建含启动子、终止子、标记基因等的表达载体 C．外泌体的膜结构由双层磷脂分子构成，是基因工程中最常用的载体 D．用PCR扩增Cas12a基因时，需在反应体系中加入解旋酶和DNA聚合酶 10．（2026·吉林松原·模拟预测）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．步骤1和步骤2的目的是获取滤液中的沉淀物，步骤3的目的是获取上清液 B．步骤1研磨后用纱布过滤，步骤4将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴 C．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察 11．（2026·吉林·模拟预测）2024年诺贝尔化学奖解开蛋白质折叠的秘密，AI模型可以借助于机器深度“学习算法”，协助科研人员完成某种特定蛋白质的设计。下列叙述错误的是（    ） A．蛋白质的空间结构多样，主要与氢键、二硫键等化学键有关 B．AI模型可预测新型蛋白质的三维结构，依据原理是中心法则 C．AI模型可预测蛋白质中某位点氨基酸的改变对细胞的影响 D．AI设计的高温酶，能为工业生物催化提供更稳定的酶制剂 12．（2026·吉林长春·模拟预测）以下生物技术与工程的实验叙述中，正确的是（　　） A．琼脂糖凝胶电泳过程中，凝胶载样缓冲液（内含指示剂）具有防止DNA样品浮出加样孔，便于肉眼观察电泳大体进程的作用 B．DNA粗提取实验中，洋葱研磨液既可以通过过滤留取滤渣，也可以通过离心留取沉淀 C．PCR反应中适当降低复性温度，有利于提高PCR产物的特异性 D．生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上继续培养时不需要光照 13．（2026·辽宁·三模）下列关于生物技术与工程的实施过程的说法错误的是（　　） A．啤酒生产时，为加快大麦种子内淀粉的水解，可用赤霉素处理 B．进行DNA的粗提取与鉴定时，整个提取过程可以不使用离心机 C．在原代培养和传代培养前，都需要对动物细胞用胰蛋白酶等处理 D．将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物可防止转基因花粉传播 14．（2026·辽宁·三模）CAR-T疗法是改造患者的T细胞，使其表面表达能识别特定癌细胞抗原的受体（CAR），从而精准攻击癌细胞，其治疗思路如下图。为探究CAR-T细胞对肝癌细胞在体外的杀伤作用，科研人员将效应细胞（即正常T细胞、CAR-T细胞）分别与肝癌细胞体外混合培养，结果发现CAR-T细胞对靶细胞的杀伤率远高于正常T细胞。已知乳酸脱氢酶是在所有细胞中稳定存在的酶，下列相关叙述错误的是（　　） A．CAR-T细胞在自然情况下不存在，体现了蛋白质工程的应用 B．CAR-T细胞培养时要定期更换培养液，避免代谢物的积累 C．培养液中乳酸脱氢酶的含量可反映效应细胞对靶细胞的杀伤率 D．CAR-T细胞对肝癌细胞的体外杀伤属于基因所决定的细胞凋亡 15．（2026·辽宁营口·三模）我国研究团队首次在实验室完整复刻人类胚胎着床的全过程，结果如图所示，接触阶段，胚胎分泌的因子与子宫内膜受体结合，打造了促进“附着位点”形成和抑制上皮细胞凋亡两条通路，若两条通路被阻断，囊胚附着率将下降68%；入侵阶段，胚胎与子宫内膜相互分泌因子，促进滋养层细胞增殖。下列相关叙述正确的是（    ） A．图示胚胎已经出现细胞的分化，从中分离的胚胎干细胞具有发育的全能性 B．胚胎分泌的因子与子宫内膜受体结合有利于胚胎定位以及移植胚胎的存活 C．胚胎与子宫内膜相互分泌因子可促进滋养层细胞发育成胎膜和胎盘的一部分 D．囊胚进一步发育为原肠胚，导致透明带破裂，胚胎继续分化形成组织、器官 16．（2026·辽宁·模拟预测）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。下列叙述正确的是（  ） A．步骤①是基因工程的核心步骤，需要使用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体 B．与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W所选的启动子不同 C．步骤②可以利用显微操作法将重组表达载体导入受精卵 D．鉴定W蛋白基因是否成功表达可以检测转基因动物的尿液是否存在W蛋白 17．（2026·辽宁沈阳·模拟预测）大肠杆菌的培养分为生长期和稳定期两个阶段，其胞内莽草酸代谢途径如图甲。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，细胞中无法大量积累莽草酸。为保证大肠杆菌生长期正常生长且稳定期大量积累莽草酸，研究者敲除野生型大肠杆菌某个相关内源酶基因，并导入图乙两种质粒，调控代谢途径中关键酶在不同阶段的合成与分解速率。下列说法错误的是（　　） 注：M、N为酶A或酶B基因；启动子Pgeo仅在生长期开启转录；基因X编码的阻遏蛋白可阻遏启动子PX开启转录；带SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌逐渐降解。 A．敲除的内源酶基因是酶B基因 B．质粒①中的M表示酶A基因 C．改造后的菌株在生长期可正常合成细胞生长必需物 D．改造后的菌株胞内阻遏蛋白X的含量进入稳定期后不再变化 18．（2026·黑龙江哈尔滨·三模）果肉红色是花色素苷大量积累导致的。某二倍体植物果肉中花色素苷的含量与两对等位基因A/a、D/d有关。与显性基因相比，隐性基因均缺失一个片段（如图1所示，黑色区域为缺失片段）。用特定的引物对相关基因进行扩增、电泳，检测结果如图2、图3。 (1)用P1/P2引物扩增，白肉不会得到扩增产物，原因是_____。 (2)浅红肉的基因型有______种，白肉的基因型是______。 (3)若某深红品种与白肉品种杂交，F1全部表现为中红。 ①亲本基因型为______。 ②为探究A/a、D/d两对等位基因是否位于同一对同源染色体上（不考虑互换），设计实验方案：F1自交，观察并统计F2果肉表型及比例。 写出预期结果和相应结论： 若F2果肉表型及比例为_____，则两对基因位于非同源染色体上； 若F2果肉表型及比例为_____，则两对基因位于一对同源染色体上。 19．（2026·黑龙江大庆·模拟预测）增强子是DNA上的调控序列，能结合转录因子并提高基因转录频率。胶质母细胞瘤(GBM)细胞中转录因子SOX2和OLIG2高表达，正常神经元几乎不表达。科学家设计了一种基因治疗线路： GBM细胞：增强子A结合SOX2/OLIG2，增强子B结合普通转录因子 → 转录开启 → HSV-TK基因表达 → 癌细胞死亡。 正常神经元：缺乏SOX2/OLIG2，增强子A无结合，增强子B结合普通转录因子 → 转录关闭 → HSV-TK基因沉默 → 细胞存活。 注：HSV-TK表达产物能将无毒物质转化为有毒物质。 HSV-TK模板链序列(部分)：5'-ATGCGTAGC……CGATCGAT-3' (1)从基因结构角度判断，增强子___________(填“属于”或“不属于”)编码区。增强子与转录因子结合后，___________(填“促进”或“抑制”)RNA聚合酶与启动子的结合。HSV-TK表达产物的基本单位是___________。 (2)正常神经元细胞中HSV-TK基因处于沉默状态，从调控机制分析，直接原因是缺少___________与增强子A结合，无法激活转录程序；增强子A、B调控基因转录具有___________特异性。 (3)使用逆转录PCR测定HSV-TK基因的表达量，在PCR扩增阶段，反应体系中除了荧光探针外，必须包含的成分有____________。 A．cDNA模板 B．引物 C．耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) D．四种脱氧核苷酸(dNTPs) E．逆转录酶 (4)根据HSV-TK基因模板链序列，写出PCR时使用的引物(假设引物长度为6个碱基) 上游引物：5'___________3' 下游引物：5'___________3' (5)从该基因疗法的分子机制角度说明患者接受治疗后，肿瘤显著缩小且无明显副作用的原因：___________。 20．（2026·黑龙江哈尔滨·二模）从分解纤维素的细菌（A菌）中提取出一种纤维素酶基因（CBHⅡ）并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒（图1）连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌（B菌）。回答下列问题。 几种限制酶识别序列及酶切位点 限制酶 识别序列及酶切位点 Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' BstEⅡ 5'-G↓GTNACC-3'（N为任意碱基） SacⅠ 5'-GAGCT↓C-3' MspⅠ 5'-C↓CGG-3' BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3' (1)构建成重组质粒时，应选择限制酶____________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段（X和Y），X两端的黏性末端分别为—CTAG和—CAATG，则Y两端的黏性末端分别为—CTAG和____________。 (2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接（如图2），因此PCR扩增过程中，对两种引物的要求是5'端______，3'端_______。PCR产物一般通过_______来鉴定，为了能在波长为300nm紫外灯下检测出DNA分子，需要用____________对DNA进行染色。 (3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素____________（填“M”或“N”）的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示（片段过小时检测不到条带）。据图分析，菌落_____中成功导入了重组质粒。 (4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基均分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种____________，实验结果说明____________。 21．（2026·黑龙江·模拟预测）为培育广谱抗虫耐除草剂玉米，科研人员将我国自主研发的抗虫融合基因m2cryAb-vip3A插入表达载体pCAMBIA中（其中的bar为耐除草剂基因，使玉米能抵抗草铵膦类除草剂），构建了重组质粒pCAMBIA+m2cryAb-vip3A，经农杆菌转化后形成具有“抗虫+耐除草剂”的双优性状组合的转基因玉米LD05，过程如图所示。请回答下列问题： (1)抗虫融合基因m2cryAb-vip3A是以苏云金芽孢杆菌的cry1Ab和vip3Aa原始DNA序列为基础，对两个基因进行改造优化，将优化后的基因通过中间序列连接从而获得融合基因。连接前需将基因cry1Ab编码区_____移除，使核糖体可连续翻译至基因vip3Aa，得到的融合蛋白包含两种杀虫蛋白的功能域，拓展了其杀虫类型。该过程属于______工程的范畴。 (2)构建重组质粒时，为了将融合基因m2cryAb-vip3A插入表达载体pCAMBIA中，需在引物____的____（选填“3'”或“5'”）端添加酶切位点，对融合基因进行PCR和酶切后，用DNA连接酶将其连入已用限制酶______处理的表达载体中。 (3)该重组质粒中基因bar与m2cryAb-vip3A串联排列，属于串联基因。与融合基因相比，串联基因在分子水平上的特点及其在基因表达上的优势为_______________。 (4)通过农杆菌转化法将重组质粒上的T-DNA整合到玉米的染色体上之后，可利用含有_____的培养基筛选转化成功的外植体。从个体生物学水平鉴定转基因玉米LD05是否培育成功的方法为___________。 22．（2026·辽宁营口·三模）刺糖多孢菌是一种能产生大环内酯类杀虫剂----多杀菌素的重要工业菌株，其拥有的I-B型CRISPR/Cas3系统具有重要的生理意义，CRISPR/Cas 3系统能将入侵的外源DNA片段整合到自身的CRISPR序列中，随后将该序列转录并加工为成熟的crRNA；DNA的侵染。科研人员尝试将某个与副产物合成相关的基因整合到CRISPR中构建编辑质粒，以敲除该基因（敲除原理如图)，获得相关高产多杀菌素的菌。回答下列问题。 (1)已知CRISPR/Cas3的复合物相当于基因工程中的限制酶，推测crRNA的作用是________，而Cas3蛋白可以破坏DNA分子的___，由此实现特定基因的敲除。但有时CRISPR/Cas3系统会出现错误切割非目标DNA的情况，可能的原因是______。 (2)为初步检测编辑质粒（含碳青霉烯抗性基因）是否成功导入刺糖多孢菌，研究人员将转化后的刺糖多孢菌分为两个实验组（8-1与8-2)，并设置阳性组（已明确携带碳青霉烯抗性基因，8-3）与阴性组（未导入编辑质粒，8-4）进行对照，将各组菌体置于加入了碳青霉烯的培养基中进行培养，结果如图所示，此结果说明________，请从操作过程角度分析出现该情况的原因可能是_____（答出一点即可）。 (3)编辑质粒导入成功后，为验证目的基因（副产物相关基因）是否被成功敲除，需要设计引物通过PCR进行检测。研究人员根据目的基因碱基序列设计了三对备选引物（如表，方向均为5＇→3＇)，应选第________对，作出该选择的依据是___________。 第一对 上游 TGGAGTGAAGCTGGATCATG 下游 TGAGGTAACTCATTCTCGTT 第二对 上游 CGGAAGTGAGACTGGATGAT 下游 ATCATCCAGTCTCACTTCCG 第三对 上游 GCGGGGATTTTTTTCCCAGG 下游 ATCCGGCAAAAAAAACTTGC (4)即使已确定目的基因成功被敲除，仍不能说明已获得所需高产菌，还需进行个体水平鉴定，鉴定的指标为_________。 23．（2026·辽宁朝阳·三模）人凝血因子Ⅶ（FⅦ）是肝细胞分泌的单链糖蛋白酶原，对于血小板减少等病症具有良好的治疗效果。利用家兔乳腺生物反应器表达重组FⅦ，具有产量高、成本低的优势。pBC1质粒（图1）带有山羊β-酪蛋白基因的部分序列，帮助外源基因在乳腺上皮细胞中表达。结合图示，回答下列问题： (1)用限制酶Xho Ⅰ切割pBC1质粒和FⅦ基因后，需用_____________酶连接两者。连接前用碱性磷酸酶去除载体游离的磷酸基团，可防止_______；FⅦ基因的磷酸基团保留，则构建重组载体时生成了_____________个磷酸二酯键，后续借助受体细胞的DNA修复机制补齐缺口。获得的重组质粒中，目的基因的接入方向_____________（填“唯一”或“不唯一”）。 (2)重组质粒pBC1-FⅦ扩增后，经Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切得到目标DNA片段，纯化后备用。对成年未发情的母兔注射_____________进行超数排卵，与正常公兔配种后收集受精卵。将纯化的目标DNA通过_____________技术注入受精卵，早期胚胎经胚胎移植后，由受体母兔产下转基因兔。检测转基因兔染色体是否插入FⅦ基因，可采用__________（填检测方法）。 (3)β-酪蛋白是哺乳动物乳腺上皮细胞特异性表达的蛋白质，pBC1质粒中，来自山羊的_____________序列是外源基因在乳腺上皮细胞中正确转录的必要条件。pBC1质粒上的β-酪蛋白外显子无起始密码子编码序列，而FⅦ基因含起始密码子编码序列。由此推测，转基因雌兔乳腺上皮细胞中表达的蛋白质可能有_____________。 A．山羊的β-酪蛋白   B．FⅦ    C．转基因兔的兔源β-酪蛋白 (4)FⅦ基因随机整合到家兔基因组，转入的外源基因的数量即基因拷贝数无法控制。用抗原—抗体杂交技术鉴定乳汁中的FⅦ含量（条带宽窄、深浅与蛋白质含量正相关），实验结果如图2所示。应该选择__________（填转基因兔编号）生产FⅦ；乳汁FⅦ含量与基因拷贝数_________（填“有”或“没有”）明显相关性。 24．（2026·辽宁·模拟预测）RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种，如图所示，①~⑥表示相关过程。请分析回答： 注：Hygr：潮霉素抗性基因    Kanr：卡那霉素抗性基因 限制酶：XhoⅠ：5'-C↓TCGAG-3'；BamHⅠ：5'-G↓GATCC-3'；SalI：5'-G↓TCGAC-3'；BglⅡ：5'-A↓GATCT-3'，C4pdk启动子：受光诱导的强启动子，驱动基因在大豆叶肉细胞中特异表达 LB：TDNA左边界  RB：TDNA右边界 (1)过程①一般从_______细胞中提取总RNA，参与该过程的酶有_____，其产物中____（填“含有”或“不含有”）启动子、终止子和内含子序列。 (2)已知①过程rca基因的a链和获取它的模板mRNA互补，反义rca基因的模板链为_____（填a链或b链），反义rca基因的____端（填N或M）接在C4pdk启动子的后面。依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，写出引物1的碱基序列5'___3'（只写出前8个碱基即可）。 (3)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是______，⑤过程后可用含_____的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。分子水平上转基因大豆培育成功的标志是______。 (4)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2。据图分析，RCA对大豆的光合作用具有促进作用，其机理主要是通过___来影响光合作用强度。 25．（2026·辽宁锦州·模拟预测）你是学校生物科技社团的成员，社团正在开展一项针对B细胞淋巴瘤的“CAR-T细胞疗法”模拟研发项目。该病的特点是肿瘤细胞表面高表达CD19抗原蛋白。你需要完成从设计、构建到优化的全流程任务。 任务一：资料查阅与原理分析 经过文献阅读，你了解了CAR-T细胞疗法的基本流程，如下图所示： (1)CAR-T细胞是在T细胞中导入人工设计的能够靶向特定抗原的受体基因（CAR基因），使其表达CAR蛋白，这相当于为T细胞安装了追踪肿瘤细胞“导航系统”。本研究项目中该“导航系统”能特异性识别肿瘤细胞表面的_____。 任务二：CAR基因的获取与载体构建 (2)CAR-T细胞的制备离不开转基因技术。构建基因表达载体时，CAR基因必须位于_____之间，以确保其在T细胞中正常表达。若要实现该疗法的长期疗效，通常利用逆转录病毒作为_____，利用其特性将CAR基因整合到T细胞的_____上。 任务三：CAR-T细胞的激活与培养 (3)将T细胞改造成CAR-T细胞后，需在体外进行大量扩增，其培养液中通常要加入白细胞介素-2等细胞因子，其主要作用是_________。 任务四：问题分析与优化迭代 (4)在模拟临床试验时发现，部分患者在治疗后肿瘤复发，原因是肿瘤细胞发生了"抗原逃逸"（即CD19抗原丢失）。提出一项具有可行性的改进策略：_____。 (5)正常B淋巴细胞也会表达CD19蛋白，导致CAR-T细胞在杀伤肿瘤B淋巴细胞的同时可能会误伤它们。为解决这一问题，项目组设想给CAR-T细胞安装一个“药物可控开关”：当患者出现严重副作用时，可通过服药来快速清除体内的CAR-T细胞。已知该药物本身无毒，但可被特定酶转化为某种能引发CAR-T细胞凋亡的物质。若要实现这一功能，对CAR-T细胞进行基因改造时，应在该特定酶基因的上游添加_____，通过药物调控其表达，从而选择性清除CAR-T细胞。 26．（2026·辽宁·三模）科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（下图），水杨酸是常见的水体污染物。请回答： (1)获得纯净的大肠杆菌的关键是防止________。若需分离得到大肠杆菌单菌落，可采用________（答2种方法）。 (2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活________启动子，最终使菌体发出红色荧光，根据________可判定环境中的水杨酸浓度。 (3)水杨酸羟化酶基因可催化水杨酸分解。为清除水体中的水杨酸，科学家向工程菌中导入水杨酸羟化酶基因。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA基因应插入D位点、ccdB基因应插入下图中的________位点。 (4)在分子水平上可以采用________技术检测nahR蛋白。科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是________。与血清中的抗体相比，抗nahR蛋白的单克隆抗体优点是________。 (5)结果显示智能工程菌的灵敏性并未达到预期，为提升nahR蛋白的生物活性，科研人员欲通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，请按正确顺序排列：________。 ①采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列 ②推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点 ③通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构 ④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性 27．（2026·辽宁·三模）水蛭素（Hirudin）可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。研究人员利用重叠延伸PCR技术，替换Hirudin基因的一个碱基对，获得“Hirudin改良基因”，再构建基因表达载体，以获得含有“Hirudin改良基因”的重组DNA分子。相关过程、质粒及限制酶的酶切位点如图所示（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增含有Hirudin基因的片段时，温度的控制至关重要。若变性温度过低，则会因_____导致反应效率降低；其中复性温度设置需参考引物中碱基的_____。引物长度一般在15-30个核苷酸之间，如果引物过短则特异性差，易与_____随机互补结合从而发生错配；如果引物过长则自身容易发生_____而形成稳定的双链结构。在制备PCR反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，还需要_____。 (2)将Hirudin基因诱变为Hirudin改良基因的过程中，发生了碱基对的_____（填“增添”“缺失”或“替换”）。由图可知，引物2和引物3_____（填“完全”或“不完全”）互补配对。图中参与重叠延伸过程的两条DNA单链为_____（从“1、2、3、4”中选择）。 (3)为将Hirudin改良基因与质粒高效连接，需用限制酶_____切割目的基因。将重组质粒导入大肠杆菌制备工程菌，之后用含_____的培养基培养大肠杆菌，以筛选工程菌。 28．（2026·辽宁·模拟预测）C-1027是由球孢链球菌C-1027菌种产生的一种具有抗癌作用的新型抗生素，其核心杀伤机制在于对DNA的毁灭性破坏，可有效摧毁真核细胞的染色质DNA并诱发细胞凋亡。研究人员拟筛选具有C-1027表达活性的菌种，并对其进行改造，使其可高效表达该抗生素。回答下列问题： (1)选择土壤作为样本筛选该菌株最可能的原因是___________。科研人员进行了如下实验操作：在待测土壤煮沸浸出液中加入DNA酶抑制剂与带标记的C-1027基因特异分子探针，检测是否出现带标记的DNA双链区段。该实验操作的目的是检测___________，操作中将土壤浸出液煮沸的目的是___________。 (2)为构建携带C-1027基因的大肠杆菌表达载体(空载质粒如图)，对C-1027基因的PCR扩增产物与质粒双酶切，随后使用E．coliDNA连接酶进行高效连接(连接平末端效率低)。为保证连接的准确性和高效性，应使用的限制酶为___________，双酶切的意义在于___________。 (3)为提高重组质粒导入大肠杆菌的效率，可用___________处理大肠杆菌。为高效筛选出成功转化并可表达C-1027的大肠杆菌，利用影印法进行简单的鉴别，操作如下：在含有四环素的培养基(培养基1)中接种待筛选的菌液，使用一块用丝绵包裹的、与培养基大小基本相同的圆柱形木块轻轻印下菌落，并接种至含有卡那霉素的培养基(培养基2)中。目的菌种菌落生存状况为：___________。 (4)对C-1027进一步研究发现，该蛋白由一个负责靶向的蛋白辅基与一个负责杀伤的烯二炔发色团构成。研究人员欲改造C-1027蛋白，使其可用于靶向结肠癌的治疗，可用蛋白质工程技术，其一般流程为___________。 29．（2026·辽宁朝阳·三模）通过无融合生殖技术获得的二倍体杂交水稻克隆种子，是由特殊分裂产生的卵细胞（2N）直接发育形成。我国科学家借助基因开关系统（PSGS，由“基因锁”和“基因钥匙”构成）解决了克隆种子与有性种子的分选难题。已知DNA分子中存在两个相同且同向的LoxP序列时，Cre重组酶可特异性识别并敲除两个LoxP序列之间的基因。图1为LoxP序列，箭头处表示Cre重组酶的酶切位点，图2为Cre重组酶敲除基因的过程，图3为将PSGS导入水稻细胞获得转基因水稻TO的过程，其中“基因锁”可利用同向LoxP序列及其间的基因抑制下游红色荧光蛋白基因的表达，而“基因钥匙”在有性生殖过程中才发挥作用。回答下列问题。 (1)图2中片段1形成环状结构的原因是_____。 (2)图3中步骤Ⅰ～Ⅳ中，PSGS与DNA发生重组的步骤有_____（填序号）；步骤Ⅰ获取PSGS时，应选用下表中的限制酶_____（填编号）。 编号 限制酶 识别序列及切割位点 编号 限制酶 识别序列及切割位点 ① HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3′ ④ SalI 5′-G↓TCGAC-3' ② XbaI 5′-T↓CTAGA-3' ⑤ SpeI 5'-A↓CTAGT-3' ③ SacI 5'-GAGCT↓C-3' ⑥ BamHI 5′-G↓GATCC-3' (3)为了分选有性种子和克隆种子，需实现水稻有性种子胚中“基因锁”的特异性敲除，图3中启动子2的类型是_____（填编号）。 ①花粉特异性启动子②分生组织特异性启动子③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性） (4)研究人员获得转基因水稻TO后，对其自交产生的种子胚进行荧光检测，并从种子胚中提取DNA，对PSGS序列进行PCR扩增。预期红色荧光种子胚中扩增出的产物长度_____（填“大于”、“等于”或“小于”）无荧光种子胚中的产物长度，其原因是_____。 30．（2026·辽宁沈阳·模拟预测）t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸替换成丝氨酸，能显著降低上述副作用。下图是通过定点突变技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因重组质粒的示意图。请回答下列问题： (1)科学家获得上述t-PA突变蛋白的生物技术手段属于_______工程。其基本流程为：根据t-PA突变蛋白的________设计其空间结构→推测应有的______和核苷酸序列→定点改造t-PA基因的脱氧核苷酸序列→获得所需要的t-PA突变蛋白。 (2)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点是突变部位的碱基，则引物b中该突变位点的碱基是__________。 (3)重叠延伸后利用引物__________进行PCR3，可获得大量改良t-PA基因。对t-PA改良基因产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因：_____________（答出一点即可）。 (4)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶_______切开，才能与t-PA突变基因准确并高效连接。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。若将转化后的大肠杆菌接种在含有___________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的菌落呈_______色。 31．（2026·辽宁·三模）科研人员以斑马鱼为模式生物，获得在胰岛区域特异性表达GFP（绿色荧光蛋白，可在荧光显微镜下观察到绿色荧光）的转基因斑马鱼（G品系斑马鱼）。回答下列问题： (1)制备G品系斑马鱼 ①获得GFP基因。 限制酶 识别序列及切割位点 SphⅠ CGTAC↓G HindⅢ A↓AGCTT KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ G↓AATTC ②制备重组质粒。已构建初步重组质粒如图1所示。为替换载体原有启动子，还需使用________限制酶切割质粒，并将能在_________中特异性表达的基因的启动子连接在相应位置。 ③导入受体细胞。将重组质粒利用_________法导入斑马鱼的_________。 ④若在荧光显微镜下观察小鱼的各个器官时发现仅胰岛发出绿色荧光，表明成功得到G品系斑马鱼。从G品系斑马鱼中筛选出一条只导入了一个GFP基因的个体，让其与野生型杂交，令F1中能发绿色荧光的斑马鱼自由交配，再从F2中筛选纯合G品系。筛选的具体操作是找到GFP插入的位置，并针对插入位点的上下游和GFP基因自身序列设计了引物，各引物的位置如图2所示，其中α链为转录的模板链。提取F2不同个体的DNA，并选用引物_________进行PCR并电泳，结果会出现如图3的三种情况，其中加样孔_________对应的个体是纯合G品系斑马鱼。统计发现，F2中纯合G品系占比为4/9，则提取所有F1中能发绿色荧光斑马鱼的DNA进行PCR和电泳（不更改引物），结果与图3中加样孔2情况一致的个体占比为_________。 (2)pdx1蛋白为决定胰岛形成的最为关键的蛋白质，科研人员特异性敲除G品系斑马鱼受精卵的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。荧光显微镜下观察N品系斑马鱼的荧光情况为_________，原因是________。 1 / 11 学科网（北京）股份有限公司 $