专题15 基因工程（3年汇编）（贵州专用）2024-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 汇编2024-2026年贵州高考真题及模拟题，聚焦基因工程两大核心考点，以真菌碳源利用、高粱抗虫育种等真实科研情境为载体，突出操作程序理解与技术应用能力考查。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |非选择题|多题（含综合大题）|基因工程基本操作程序（PCR技术）、基因表达载体构建、蛋白质工程应用|以番茄线粒体形态调控情境考查蛋白质工程设计，结合PCR电泳结果分析考查科学思维，契合高考从单一识记转向综合应用的命题趋势|

专题 15 基因工程 3年汇编1年模拟 考点分类 贵州考情 命题规律 考点01 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026贵州(1题)、2024贵州(1题) · 情境设置：以高粱抗虫育种、真菌碳源利用机制等生产科研情境为载体。 · 考查重点：侧重PCR扩增目的基因、基因表达载体构建与转化等基本操作程序的理解与应用。 · 命题趋势：从单一技术识记转向程序性步骤在真实问题中的设计、分析与评价，强调操作流程的逻辑性。 考点02 基因工程和蛋白质工程的应用 2025贵州(1题) · 情境设置：以番茄线粒体形态影响果实成熟等农艺性状改良情境切入。 · 考查重点：聚焦蛋白质工程中特定肽段“嫁接”设计、基因表达定位调控，考查结构与功能关系的应用。 · 命题趋势：指向蛋白质工程与基因工程融合，突出定向改造生物学功能的新情境、综合性设问。 考点1 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 （1）据表可推测　　　　　　　　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　　　　　　　　　　　。检测NV酶活性时，需测定的指标是　　　　　　　　　　　（答出1点即可）。 （2）表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与　　　　　　　　　　　（选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　　　　　　　　　（选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是　　　　　　　　　　　。 （3）为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　　　　　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是　　　　　　　　　　　。 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 2.（2026·贵州·高考真题）（多选）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的　　　　　对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为　　　　　　　　　的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为　　　　　bp。                                W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                          Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是　　　　　　　　　　试剂；a和b两片段长度相差　　　　　个核苷酸；启动子的该序列从端到端第　　　　　位核苷酸发生了甲基化。 考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： （1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的　　　　　　拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是　　　　　　。 （2）拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的　　　　　　（填下图字母）处。理由是　　　　　　。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为　　　　　　。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的　　　　　　中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是　　　　　　。 1.（2026·贵州贵阳·联考）反向PCR技术是一种用已知基因序列扩增外侧未知序列的技术，扩增前先用限制酶切割样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，部分过程如图所示。下列叙述错误的是（        ） A. 反向PCR技术的原理是DNA半保留复制 B. 过程②中根据已知基因两端的部分核苷酸序列设计引物1和引物4 C. 过程③中耐高温的DNA聚合酶从引物的5'端开始延伸子链 D. 过程③至少要到第三轮循环才能获得两条等长的未知序列片段 2.（2026·贵州·一模）某科研小组利用质粒（图甲）和目的基因（图乙）构建重组DNA。下列分析错误的是 A. 用限制酶HindⅢ和PstI切割质粒，可得到2条DNA片段 B. 不能用AluI酶切割质粒和外源DNA的原因是AluI酶会破坏目的基因 C. 构建重组DNA时，需选择SmaI酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA D. 导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 3.（2026·贵州遵义·二模）巢式PCR技术是一种改良PCR技术，通常利用两套引物进行两轮扩增（如图）。下列叙述错误的是（　　） A. 第一轮扩增需在体系中加入DNA聚合酶、外引物和原料等 B. 第二轮扩增通常需要转移到含内引物的新体系中进行 C. 只利用内引物对DNA模板进行扩增无法获得目标产物 D. 与传统PCR技术相比，巢式PCR技术能提高扩增的特异性 4.（2026·贵州·一模）科学家将鱼的抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，使其可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、Hin dⅢ、AluⅠ四种限制性内切核酸酶切割位点，如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（AmpR为氨苄青霉素抗性基因），其中①~④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图回答下列问题： （1）在构建重组DNA时，可用一种或多种限制性内切核酸酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性内切核酸酶　　　　　分别对含鱼的抗冻蛋白基因的DNA片段和质粒进行切割，充分切割后产生的DNA片段分别为　　　　　种和　　　　　种。 （2）基因工程中的核心步骤是　　　　　（填序号），该步骤的目的是　　　　　。为了使目的基因正常表达，其上游必须有启动子，它是　　　　　识别和结合的部位。若限制酶切出了黏性末端，要选择　　　　　（填“E.coli DNA连接酶”“T4 DNA连接酶”或“E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶”）进行连接。 （3）图中将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法称为　　　　　。它是利用载体Ti质粒中含有　　　　　，可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体DNA上。 （4）检测番茄植株细胞中鱼的抗冻蛋白基因是否成功表达，从分子水平上常采用的方法是　　　　　。 5.（2026·贵州六盘水·二模）为提升陆地棉的抗除草剂能力，研究人员以海岛棉（含抗草铵膦除草剂基因Bar）为基因供体、陆地棉为受体，构建了含该基因的重组Ti质粒（质粒结构及Bar基因两端序列如图所示），通过农杆菌介导将重组质粒的T－DNA片段转入陆地棉细胞，经植物组织培养和抗性筛选获得转基因棉花植株。回答下列问题： （1）抗草铵膦除草剂基因在该工程中被称为　　　　　　　，基因工程的核心步骤是　　　　　　　。 （2）限制酶EcoRI和BamHI切割的化学键是　　　　　　　，与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是　　　　　　　（答出两点即可）。 （3）Bar基因缺少限制酶的识别序列，为确保目的基因正确连接到质粒上，需要在引物的　　　　　　　端添加限制酶EcoRI和BamHI的识别序列。 （4）提取转基因棉花的基因组DNA，通常利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。在凝胶中DNA分子的迁移速率与　　　　　　　有关（答出两点即可）。 6.（2026·贵州贵阳·二模）科研人员从强耐盐植物胡杨中获得PeCPK7抗盐基因，拟通过基因工程技术将其导入水稻，培育耐盐水稻新品种。图1为实时荧光定量PCR（qPCR）扩增PeCPK7基因的原理示意图，PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶在延伸子链时可将与模板结合的Taqman探针切开，目的基因每完成一次扩增，就会对应酶切一定数量的探针，释放荧光信号，图2为PeCPK7基因和农杆菌Ti质粒的酶切图谱以及相关限制酶的识别序列与切割位点。回答下列问题： （1）常规PCR技术中的变性步骤需通过高温处理，其作用是　　　　　　　；与细胞内DNA复制的DNA聚合酶相比，qPCR所用的Taq DNA聚合酶具有　　　　　　　（答出2点）的特点。 （2）据图1分析，qPCR中荧光信号的强度与扩增出目的基因的量呈　　　　　　　（填“正相关”或“负相关”）；PCR扩增时，引物的作用是　　　　　　　。 （3）构建重组Ti质粒时，为保证目的基因正确插入且不破坏质粒的核心结构，应选用的限制酶是　　　　　　　；重组质粒通过农杆菌转化法导入水稻细胞，利用了农杆菌Ti质粒上的　　　　　　　可转移并整合到植物细胞染色体DNA上的特性。 （4）成功转化的水稻细胞需通过　　　　　　　技术培育成完整植株，可通过添加　　　　　　　的培养基筛选出阳性转化水稻细胞；PeCPK7基因转录时的模板链为　　　　　　　（填“α链”或“β链”）。 7.（2026·贵州贵阳·联考）为大批量生产干扰素，科学家将干扰素基因转入大肠杆菌细胞中获得工程菌，再通过工程菌发酵制取干扰素。回答下列问题： （1）若用SAU3AⅠ完全切割图1质粒，可获得　　　　　　　　个片段，切割得到的黏性末端　　　　　　　　（填“能”或“不能”）相互任意拼接。 （2）若图2中的②链是模板链，为将干扰素基因定向插入图1的质粒中，应在引物甲和乙的　　　　　　　　（填“3'”或“5'”）端分别添加　　　　　　　　、　　　　　　　　（填限制酶）的识别序列，若将该目的基因扩增n代，则其中同时含有引物甲和引物乙的DNA分子有　　　　　　　　个。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌前先用　　　　　　　　处理大肠杆菌，目的是　　　　　　　　。在含四环素的培养基中形成的菌落不一定是转化的大肠杆菌，原因是　　　　　　　　。 （4）利用工程菌发酵制取的干扰素无生物活性，原因可能是　　　　　　　　。 8.（2026·贵州安顺·二模）科研人员为了培育出对草甘膦和烟青虫具有抗性的烟草植株，构建了人工合成重组Bt抗虫基因（分子大小为0.96kb）和草甘膦抗性基因（分子大小为1.3kb）的植物表达载体。培育过程中目的基因的检测与鉴定是基因工程中的重要步骤。回答下列问题。 （1）利用农杆菌转化法将表达载体导入烟草的外植体，在后续培养过程中，所用的MS培养基中均加入一定浓度的草甘膦，其目的是　　　　　　　　　。 （2）获得再生植株后，研究人员采用PCR技术检测目的基因是否整合到烟草细胞的染色体上。下图为PCR扩增产物凝胶电泳的结果，1号对照的作用是　　　　　　　　　。电泳结果表明符合检测要求的转化植株有　　　　　　　　　，推测不符合要求的植株出现问题的原因可能是　　　　　　　　　（答出一点即可）。 注：1和2分别是阳性和阴性对照，3-8为待测的转化烟草植株 研究人员对上述成功导入目的基因的烟草植株做进一步检测，发现某些转基因烟草的细胞中没有表达出Bt抗虫蛋白，请分析可能的原因：　　　　　　　　　　　　（答出一点即可）。上述检测筛选出的转化植株还需在个体水平上做　　　　　　　　　　　　鉴定。 9.（2026·贵州毕节·二模）（多选）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　　　　　（选填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′—　　　　　　　　—3′和5′—　　　　　　　　—3′。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，目标基因L部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，限制酶识别序列、切割位点及PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　　　　　（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 10.（2026·贵州·学业水平适应性测试）A基因编码蛋白可以抑制β病毒的增殖，为了构建抑制β病毒增殖的受体细胞，科研人员开展了如下实验。 限制酶的识别序列和切割位点如下： SpeI：5'-ACTAGT-3'；XbaI：；BamHI： 回答下列问题： （1）利用PCR扩增A基因所需的酶是　　　　　　　　，PCR扩增所需引物的长度一般为20-30个核苷酸，引物不能太短的原因是　　　　　　　　。为了便于后续将A基因连接到载体上，设计引物时需要在　　　　　　　　（选填“5′端”或“3′端”）添加　　　　　　　　限制酶的识别序列以便进行双酶切。 （2）构建载体时，A基因和质粒能被DNA连接酶正确连接的原因是　　　　　　　　，载体构建成功后，　　　　　　　　（选填“能”或“不能”）用原剪切A基因的限制酶切割重组质粒获得完整A基因，理由是　　　　　　　　。 （3）目的基因进入受体细胞后是否稳定表达，需要进行检测和鉴定。请以β-GFP病毒悬液（GFP：绿色荧光蛋白基因）为实验材料，设计实验检测受体细胞是否具有抑制β病毒的增殖能力，写出实验思路　　　　　　　　。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 15 基因工程 考点1 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】（1）① 蔗糖    ② 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖    ③ 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等）     （2）① NV 基因    ② >    ③ T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列     （3）① 突变体    ② 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞      2.【答案】（1）Bcl I和Xba I     （2）① 3+6    ② 2500     （3）① X    ② 4    ③ 3和9      考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】（1）① DNA序列    ② COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化     （2）① B    ② B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录     （3）① 外植体    ② 染色体DNA    ③ 生长素和细胞分裂素      1.【答案】C 2.【答案】C 3.【答案】C 4.【答案】（1）① PstⅠ、SmaⅠ    ② 4##四    ③ 2##二##两     （2）① ①    ② 使目的基因在受体细胞中稳定存在、成功表达和发挥作用并能遗传给下一代    ③ RNA聚合酶    ④ E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶     （3）① 农杆菌转化法    ② T-DNA     （4）抗原—抗体杂交      5.【答案】（1）① 目的基因    ② 基因表达载体的构建     （2）① 磷酸二酯键    ② 防止反向连接或自身环化     （3）5'     （4）DNA分子的大小、凝胶的浓度和DNA分子的构象      6.【答案】（1）① 使双链DNA解旋为单链，为PCR扩增提供单链模板    ② 耐高温、能酶切Taqman探针（或切断磷酸二酯键）     （2）① 正相关    ② 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸     （3）① EcoR I和Xho I    ② T—DNA     （4）① 植物组织培养    ② 潮霉素    ③ 链      7.【答案】（1）① 3    ② 能     （2）① 5'    ② HindⅢ    ③ BclⅠ（或SAU3AⅠ）    ④ 2n-2     （3）① Ca2+    ② 使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态    ③ 导入空质粒的大肠杆菌也含有四环素抗性基因，可在含四环素的培养基上生长     （4）大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体，无法对干扰素进行加工修饰      8.【答案】（1）筛选出抗草甘膦的植株     （2）① 确定目的基因条带的位置    ② 3、4、5、6    ③ 在植物表达载体导入烟草细胞的过程中，有部分重组Bt抗虫基因丢失；部分表达载体构建错误，未插入重组Bt抗虫基因    ④ 重组Bt抗虫基因导入了烟草细胞中，但是没有转录出相应的mRNA；重组Bt抗虫基因能正常转录，但是没有翻译出Bt抗虫蛋白    ⑤ 抗虫、抗草甘膦      9.【答案】（1）① 低    ② GTTT    ③ CAAT     （2）① 卡那霉素    ② Sac Ⅰ    ③ ③     （3）1/4      10.【答案】（1）① 耐高温的DNA聚合酶    ② 引物太短会降低特异性，容易与模板DNA的非目的位点发生非特异性结合，无法保证扩增目的基因的特异性    ③ 5′端    ④ SpeI和BamHI的识别序列     （2）① A基因经过SpeI和BamHI酶切后产生的黏性末端能与质粒被XbaⅠ和BamHⅠ酶切后产生的黏性末端相同    ② 不能    ③ A基因左侧与质粒的XbaI酶切后产生的黏性末端实现连接后形成的碱基序列不能被XbaI识别。     （3）将受体细胞和正常细胞均置于β-GFP病毒悬液中，设计为两组实验，然后将等量β-GFP病毒分别加入两组中，培养适当时间后检测两组细胞中荧光强度的变化      试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 15 基因工程 3年汇编1年模拟 考点分类 贵州考情 命题规律 考点01 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026贵州(1题)、2024贵州(1题) · 情境设置：以高粱抗虫育种、真菌碳源利用机制等生产科研情境为载体。 · 考查重点：侧重PCR扩增目的基因、基因表达载体构建与转化等基本操作程序的理解与应用。 · 命题趋势：从单一技术识记转向程序性步骤在真实问题中的设计、分析与评价，强调操作流程的逻辑性。 考点02 基因工程和蛋白质工程的应用 2025贵州(1题) · 情境设置：以番茄线粒体形态影响果实成熟等农艺性状改良情境切入。 · 考查重点：聚焦蛋白质工程中特定肽段“嫁接”设计、基因表达定位调控，考查结构与功能关系的应用。 · 命题趋势：指向蛋白质工程与基因工程融合，突出定向改造生物学功能的新情境、综合性设问。 考点1 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 （1）据表可推测　　　　　　　　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　　　　　　　　　　　。检测NV酶活性时，需测定的指标是　　　　　　　　　　　（答出1点即可）。 （2）表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与　　　　　　　　　　　（选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　　　　　　　　　（选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是　　　　　　　　　　　。 （3）为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　　　　　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 蔗糖    ② 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖    ③ 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等）     （2）① NV 基因    ② >    ③ T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列     （3）① 突变体    ② 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞      【解析】 【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 （2）逻辑推理与论证 (1)小问详解： 根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 (2)小问详解： 从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 (3)小问详解： 为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 2.（2026·贵州·高考真题）（多选）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的　　　　　对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为　　　　　　　　　的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为　　　　　bp。                                W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                          Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是　　　　　　　　　　试剂；a和b两片段长度相差　　　　　个核苷酸；启动子的该序列从端到端第　　　　　位核苷酸发生了甲基化。 【答案】（1）Bcl I和Xba I     （2）① 3+6    ② 2500     （3）① X    ② 4    ③ 3和9      【解析】(1)小问详解： 若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列(5'-GGATCC-3')，切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 (2)小问详解： 在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 (3)小问详解： 启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'(共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10)，互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断(即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断)。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组:条带位置对应 C/T位点一Y试剂(识别C、T)；2组:条带位置仅对应C位点一Z试剂(识别C)；3组:条带位置对应A/G位点X试剂(识别G、A)；4组:条带位置仅对应G位点一W试剂(识别G)。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y)和2(Z)的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 考点2 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： （1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的　　　　　　拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是　　　　　　。 （2）拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的　　　　　　（填下图字母）处。理由是　　　　　　。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为　　　　　　。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的　　　　　　中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是　　　　　　。 【答案】（1）① DNA序列    ② COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化     （2）① B    ② B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录     （3）① 外植体    ② 染色体DNA    ③ 生长素和细胞分裂素      【解析】 核心思路：通过 “蛋白质工程” 思路，将决定蛋白质细胞内定位的特定肽链与绿色荧光蛋白（GFP）“嫁接”，利用 GFP 的荧光标记，在显微镜下观察线粒体形态变化。知识融合：蛋白质工程：需通过改造基因（DNA 片段）实现肽链 “嫁接”，利用特定肽链（如 COXⅣ 的肽链序列X）的细胞定位功能，引导 GFP 标记线粒体。基因工程：借助农杆菌转化法，将目的序列插入 Ti 质粒的T - DNA（可转移至植物细胞并整合到染色体 DNA 上）。植物组织培养：涉及外植体（离体的器官、组织或细胞）、目的基因整合位置（番茄细胞的染色体 DNA），以及诱导期所需的植物激素（生长素和细胞分裂素，调控细胞脱分化与再分化）。 (1)小问详解： 根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的DNA序列拼接在一起完成 “嫁接”（蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质）。COXⅣ 的一段肽链序列X决定了 COXⅣ 在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP的荧光来观察线粒体的形态变化（利用X的定位功能，使GFP标记线粒体）。 (2)小问详解： 拼接好的序列应插入农杆菌 Ti - DNA 的B处。B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录。 (3)小问详解： 选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为外植体（外植体是植物组织培养中用于培养的离体器官、组织或细胞）。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色体DNA中（农杆菌的 T - DNA 会整合到植物细胞的染色体 DNA 上）。番茄组织培养过程中，诱导期需在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素（植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化过程，芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化）。 1.（2026·贵州贵阳·联考）反向PCR技术是一种用已知基因序列扩增外侧未知序列的技术，扩增前先用限制酶切割样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，部分过程如图所示。下列叙述错误的是（        ） A. 反向PCR技术的原理是DNA半保留复制 B. 过程②中根据已知基因两端的部分核苷酸序列设计引物1和引物4 C. 过程③中耐高温的DNA聚合酶从引物的5'端开始延伸子链 D. 过程③至少要到第三轮循环才能获得两条等长的未知序列片段 【答案】C 【解析】 A、反向PCR技术根据DNA半保留复制的原理对目的基因进行大量复制，A正确； B、反向PCR是用反向的引物扩增未知序列，故过程②选择引物1和引物4，B正确； C、耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸子链，C错误；、 D、PCR第一轮和第二轮循环得到的两条DNA片段均不等长，故至少要到第三轮循环才可获得两条链等长的未知序列DNA片段，D正确。 2.（2026·贵州·一模）某科研小组利用质粒（图甲）和目的基因（图乙）构建重组DNA。下列分析错误的是 A. 用限制酶HindⅢ和PstI切割质粒，可得到2条DNA片段 B. 不能用AluI酶切割质粒和外源DNA的原因是AluI酶会破坏目的基因 C. 构建重组DNA时，需选择SmaI酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA D. 导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 【答案】C 【解析】 根据目的基因两端限制酶的识别、切割位点和质粒中限制酶的识别位点可选择合适的限制酶，要求既不破坏目的基因，又不会破坏质粒中的所有抗性基因。据图可知应选择HindI和PstI同时切割质粒和外源DNA。 【解析】 A、限制酶HindI和PstI在质粒上各有一个识别切割位点，用HindI和PstI切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确； B、AluI的识别、切割位点位于目的基因中，用AluI酶外源DNA会破坏目的基因，B正确； C、选择SmaI和Pst1同时切割质粒和外源DNA，质粒中的两个标记基因均会被破坏，并且会造成目的基因反向连接，C错误； D、选择HindI和PstI同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 故选C。 【点睛】 选择限制酶的方法 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。 3.（2026·贵州遵义·二模）巢式PCR技术是一种改良PCR技术，通常利用两套引物进行两轮扩增（如图）。下列叙述错误的是（　　） A. 第一轮扩增需在体系中加入DNA聚合酶、外引物和原料等 B. 第二轮扩增通常需要转移到含内引物的新体系中进行 C. 只利用内引物对DNA模板进行扩增无法获得目标产物 D. 与传统PCR技术相比，巢式PCR技术能提高扩增的特异性 【答案】C 【解析】 PCR技术的原理是细胞内DNA复制，需要模板、原料、能量、酶、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。 【解析】 A 、PCR反应的基本组分包括模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP原料和缓冲液等。巢式PCR第一轮使用外引物，因此需要加入这些组分，A正确； B 、为了避免第一轮的外引物对第二轮扩增造成干扰，巢式PCR的第二轮反应通常会将第一轮产物转移到新的反应体系中，并加入内引物，B正确； C 、内引物的结合位点位于原始DNA模板上，理论上可以直接对其进行扩增，只是扩增效率和特异性远低于经过第一轮外引物扩增后的产物，C错误； D 、巢式PCR通过两轮扩增，先使用外引物扩增一段较大的片段，再使用内引物在第一轮产物内部扩增目标片段，大大降低了非特异性扩增的概率，显著提高了扩增的特异性，D正确。 故选C。 4.（2026·贵州·一模）科学家将鱼的抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，使其可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、Hin dⅢ、AluⅠ四种限制性内切核酸酶切割位点，如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（AmpR为氨苄青霉素抗性基因），其中①~④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图回答下列问题： （1）在构建重组DNA时，可用一种或多种限制性内切核酸酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性内切核酸酶　　　　　分别对含鱼的抗冻蛋白基因的DNA片段和质粒进行切割，充分切割后产生的DNA片段分别为　　　　　种和　　　　　种。 （2）基因工程中的核心步骤是　　　　　（填序号），该步骤的目的是　　　　　。为了使目的基因正常表达，其上游必须有启动子，它是　　　　　识别和结合的部位。若限制酶切出了黏性末端，要选择　　　　　（填“E.coli DNA连接酶”“T4 DNA连接酶”或“E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶”）进行连接。 （3）图中将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法称为　　　　　。它是利用载体Ti质粒中含有　　　　　，可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体DNA上。 （4）检测番茄植株细胞中鱼的抗冻蛋白基因是否成功表达，从分子水平上常采用的方法是　　　　　。 【答案】（1）① PstⅠ、SmaⅠ    ② 4##四    ③ 2##二##两     （2）① ①    ② 使目的基因在受体细胞中稳定存在、成功表达和发挥作用并能遗传给下一代    ③ RNA聚合酶    ④ E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶     （3）① 农杆菌转化法    ② T-DNA     （4）抗原—抗体杂交      【解析】(1)小问详解： 据图分析，鱼的抗冻蛋白基因（目的基因）上具有三种限制酶切割位点，AluⅠ的切割位点存在于目的基因中，因此不宜选用AluⅠ，质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ四种限制酶切割位点，PstⅠ的切割位点存在于目的基因的两侧，SmaⅠ的切割位点存在于目的基因的左侧，为避免目的基因和载体酶切后自身环化、任意连接，需要用两种限制酶切割产生不同末端，应该选择PstⅠ、SmaⅠ分别切割目的基因和质粒； 含目的基因的DNA是线性分子，共有3个酶切位点（2个PstⅠ、1个SmaⅠ），线性DNA中n个酶切位点产生n+1个片段，因此共产生3+1=4个片段；质粒是环状DNA，共有2个酶切位点（1个PstⅠ、1个SmaⅠ），环状DNA中n个酶切位点产生n个片段，因此产生2个片段。 (2)小问详解： 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图中的①步骤，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞内稳定存在和成功表达、并能遗传给下一代；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动目的基因转录；E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都可以连接黏性末端，故要选择E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶进行连接。 (3)小问详解： 将目的基因导入番茄细胞等植物细胞常用农杆菌转化法，利用载体Ti质粒中含有T—DNA，可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体DNA上。 (4)小问详解： 番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因表达的产物是抗冻蛋白，可以利用抗原一抗体杂交技术进行检测。 5.（2026·贵州六盘水·二模）为提升陆地棉的抗除草剂能力，研究人员以海岛棉（含抗草铵膦除草剂基因Bar）为基因供体、陆地棉为受体，构建了含该基因的重组Ti质粒（质粒结构及Bar基因两端序列如图所示），通过农杆菌介导将重组质粒的T－DNA片段转入陆地棉细胞，经植物组织培养和抗性筛选获得转基因棉花植株。回答下列问题： （1）抗草铵膦除草剂基因在该工程中被称为　　　　　　　，基因工程的核心步骤是　　　　　　　。 （2）限制酶EcoRI和BamHI切割的化学键是　　　　　　　，与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是　　　　　　　（答出两点即可）。 （3）Bar基因缺少限制酶的识别序列，为确保目的基因正确连接到质粒上，需要在引物的　　　　　　　端添加限制酶EcoRI和BamHI的识别序列。 （4）提取转基因棉花的基因组DNA，通常利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。在凝胶中DNA分子的迁移速率与　　　　　　　有关（答出两点即可）。 【答案】（1）① 目的基因    ② 基因表达载体的构建     （2）① 磷酸二酯键    ② 防止反向连接或自身环化     （3）5'     （4）DNA分子的大小、凝胶的浓度和DNA分子的构象      【解析】 基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达。 (1)小问详解： 抗草铵膦除草剂基因是基因供体，在该工程中被称为目的基因，基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。 (2)小问详解： 限制酶EcoRI和BamHI切割的化学键是磷酸二酯键，其作用是在特定的识别位点将DNA链切开，与单酶切相比，双酶切（产生不同的黏性末端）构建基因表达载体的优点是可防止反向连接或自身环化。 (3)小问详解： 由质粒的限制酶位点和启动子、终止子方向可知，Bar基因缺少限制酶的识别序列，为确保目的基因正确连接到质粒上，需要在引物的5’端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列。 (4)小问详解： 在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与凝胶的浓度和DNA分子的构象有关。 6.（2026·贵州贵阳·二模）科研人员从强耐盐植物胡杨中获得PeCPK7抗盐基因，拟通过基因工程技术将其导入水稻，培育耐盐水稻新品种。图1为实时荧光定量PCR（qPCR）扩增PeCPK7基因的原理示意图，PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶在延伸子链时可将与模板结合的Taqman探针切开，目的基因每完成一次扩增，就会对应酶切一定数量的探针，释放荧光信号，图2为PeCPK7基因和农杆菌Ti质粒的酶切图谱以及相关限制酶的识别序列与切割位点。回答下列问题： （1）常规PCR技术中的变性步骤需通过高温处理，其作用是　　　　　　　；与细胞内DNA复制的DNA聚合酶相比，qPCR所用的Taq DNA聚合酶具有　　　　　　　（答出2点）的特点。 （2）据图1分析，qPCR中荧光信号的强度与扩增出目的基因的量呈　　　　　　　（填“正相关”或“负相关”）；PCR扩增时，引物的作用是　　　　　　　。 （3）构建重组Ti质粒时，为保证目的基因正确插入且不破坏质粒的核心结构，应选用的限制酶是　　　　　　　；重组质粒通过农杆菌转化法导入水稻细胞，利用了农杆菌Ti质粒上的　　　　　　　可转移并整合到植物细胞染色体DNA上的特性。 （4）成功转化的水稻细胞需通过　　　　　　　技术培育成完整植株，可通过添加　　　　　　　的培养基筛选出阳性转化水稻细胞；PeCPK7基因转录时的模板链为　　　　　　　（填“α链”或“β链”）。 【答案】（1）① 使双链DNA解旋为单链，为PCR扩增提供单链模板    ② 耐高温、能酶切Taqman探针（或切断磷酸二酯键）     （2）① 正相关    ② 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸     （3）① EcoR I和Xho I    ② T—DNA     （4）① 植物组织培养    ② 潮霉素    ③ 链      【解析】(1)小问详解： 常规PCR变性步骤的作用是通过高温使DNA双链解旋（或使DNA变性），为引物结合提供单链模板。与细胞内DNA聚合酶相比，qPCR所用的Taq DNA聚合酶具有以下两个核心特点：耐高温：可在PCR循环中反复经历90℃以上高温而不失活；它具有能酶切Taqman探针（或切断磷酸二酯键），这也是 qPCR 中能切开 Taqman 探针释放荧光信号的基础。 (2)小问详解： 题目中说明 “目的基因每完成一次扩增，就会对应酶切一定数量的探针，释放荧光信号”，因此目的基因扩增的量越多，被切开的探针就越多，释放的荧光信号强度就越高，二者呈正相关。DNA 聚合酶无法从头合成 DNA 链，只能从已有的核酸片段（引物）的 3' 端开始延伸，因此引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (3)小问详解： 限制酶选择：为避免目的基因和质粒自身环化、反向连接，同时保留完整的启动子和终止子，据图可知，Sal I和Nhe I会破坏目的基因，MunI有两个酶切位点，因此选择限制酶EcoR I和Xho I切割图2中的Ti质粒。农杆菌 Ti 质粒上的 T-DNA（可转移 DNA）能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上，因此可利用这一特性将目的基因导入植物细胞。 (4)小问详解： 水稻细胞属于植物细胞，具有全能性，需通过植物组织培养技术（脱分化和再分化）培育成完整植株。筛选培养基：Ti 质粒上有潮霉素抗性基因，因此将转入 PeCPK7 抗盐基因的水稻细胞置于含有潮霉素的培养基中筛选。转录模板：PeCPK7 抗盐基因的转录方向是从左到右，根据碱基互补配对原则，转录时以α 链为模板（因为转录方向与模板链的 3'→5' 方向一致）。 7.（2026·贵州贵阳·联考）为大批量生产干扰素，科学家将干扰素基因转入大肠杆菌细胞中获得工程菌，再通过工程菌发酵制取干扰素。回答下列问题： （1）若用SAU3AⅠ完全切割图1质粒，可获得　　　　　　　　个片段，切割得到的黏性末端　　　　　　　　（填“能”或“不能”）相互任意拼接。 （2）若图2中的②链是模板链，为将干扰素基因定向插入图1的质粒中，应在引物甲和乙的　　　　　　　　（填“3'”或“5'”）端分别添加　　　　　　　　、　　　　　　　　（填限制酶）的识别序列，若将该目的基因扩增n代，则其中同时含有引物甲和引物乙的DNA分子有　　　　　　　　个。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌前先用　　　　　　　　处理大肠杆菌，目的是　　　　　　　　。在含四环素的培养基中形成的菌落不一定是转化的大肠杆菌，原因是　　　　　　　　。 （4）利用工程菌发酵制取的干扰素无生物活性，原因可能是　　　　　　　　。 【答案】（1）① 3    ② 能     （2）① 5'    ② HindⅢ    ③ BclⅠ（或SAU3AⅠ）    ④ 2n-2     （3）① Ca2+    ② 使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态    ③ 导入空质粒的大肠杆菌也含有四环素抗性基因，可在含四环素的培养基上生长     （4）大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体，无法对干扰素进行加工修饰      【解析】(1)小问详解： SAU3AⅠ的识别序列存在于BamHⅠ和BclⅠ的识别序列中，故SAU3AⅠ可切割BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，完全切割后可获得3个片段，由于切割后得到的黏性末端相同，相互之间能任意拼接。 (2)小问详解： 质粒上有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，若用BamHⅠ酶切割，则两个抗性基因都将被破坏，故质粒用BclⅠ和HindⅢ切割，故干扰素基因用BclⅠ和HindⅢ切割。由于②链是模板链，再结合质粒上启动子的位置，可判断引物甲的5'端添加HindⅢ的识别序列，引物乙的5'端添加BclⅠ（或SAU3AⅠ）的识别序列。PCR技术运用了DNA复制的原理，因此目的基因扩增n代后产生子代DNA分子数为2n，又由于亲代DNA分子的两条链中不含引物，故子代中同时含有引物甲和引物乙的DNA分子有2n-2个。 (3)小问详解： 将干扰素基因导入大肠杆菌前先用Ca2+处理大肠杆菌，目的是使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由于导入空质粒的大肠杆菌也含有四环素抗性基因，可在含四环素的培养基上生长，因此在含四环素的培养基中形成的菌落不一定是转化的大肠杆菌。 (4)小问详解： 大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体，无法对干扰素进行加工修饰，故利用工程菌发酵制取的干扰素无生物活性。 8.（2026·贵州安顺·二模）科研人员为了培育出对草甘膦和烟青虫具有抗性的烟草植株，构建了人工合成重组Bt抗虫基因（分子大小为0.96kb）和草甘膦抗性基因（分子大小为1.3kb）的植物表达载体。培育过程中目的基因的检测与鉴定是基因工程中的重要步骤。回答下列问题。 （1）利用农杆菌转化法将表达载体导入烟草的外植体，在后续培养过程中，所用的MS培养基中均加入一定浓度的草甘膦，其目的是　　　　　　　　　。 （2）获得再生植株后，研究人员采用PCR技术检测目的基因是否整合到烟草细胞的染色体上。下图为PCR扩增产物凝胶电泳的结果，1号对照的作用是　　　　　　　　　。电泳结果表明符合检测要求的转化植株有　　　　　　　　　，推测不符合要求的植株出现问题的原因可能是　　　　　　　　　（答出一点即可）。 注：1和2分别是阳性和阴性对照，3-8为待测的转化烟草植株 研究人员对上述成功导入目的基因的烟草植株做进一步检测，发现某些转基因烟草的细胞中没有表达出Bt抗虫蛋白，请分析可能的原因：　　　　　　　　　　　　（答出一点即可）。上述检测筛选出的转化植株还需在个体水平上做　　　　　　　　　　　　鉴定。 【答案】（1）筛选出抗草甘膦的植株     （2）① 确定目的基因条带的位置    ② 3、4、5、6    ③ 在植物表达载体导入烟草细胞的过程中，有部分重组Bt抗虫基因丢失；部分表达载体构建错误，未插入重组Bt抗虫基因    ④ 重组Bt抗虫基因导入了烟草细胞中，但是没有转录出相应的mRNA；重组Bt抗虫基因能正常转录，但是没有翻译出Bt抗虫蛋白    ⑤ 抗虫、抗草甘膦      【解析】(1)小问详解： 草甘膦抗性基因在载体中既是目的基因，也是筛选标记基因。未成功导入该基因的细胞不具备草甘膦抗性，在含草甘膦的培养基上会死亡；只有成功整合了草甘膦抗性基因的细胞才能存活并分化成植株。 (2)小问详解： 1号是阳性对照，便于确定目的基因Bt抗虫基因和草甘膦抗性基因条带的位置。电泳结果表明符合检测要求的转化植株即同时含有0.96kb（Bt抗虫基因）和1.3kb（草甘膦抗性基因）两条带的植株是3、4、5、6。不符合要求的植株如7和8，因为缺少Bt抗虫基因条带，原因可能是在植物表达载体导入烟草细胞的过程中，有部分重组Bt抗虫基因丢失；部分表达载体构建错误，未插入重组Bt抗虫基因。基因整合成功但未表达蛋白，属于基因表达调控层面的问题，可能发生在转录水平、转录后水平、翻译水平或翻译后水平。如重组Bt抗虫基因导入了烟草细胞中，但是没有转录出相应的mRNA；重组Bt抗虫基因能正常转录，但是没有翻译出Bt抗虫蛋白。个体水平的鉴定是检测转基因植株是否真正获得了预期的抗性性状。需从这两个性状分别进行生物学鉴定：喷施草甘膦观察是否产生抗性；人工接种烟青虫观察是否抗虫。 9.（2026·贵州毕节·二模）（多选）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　　　　　（选填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′—　　　　　　　　—3′和5′—　　　　　　　　—3′。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，目标基因L部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，限制酶识别序列、切割位点及PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　　　　　（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】（1）① 低    ② GTTT    ③ CAAT     （2）① 卡那霉素    ② Sac Ⅰ    ③ ③     （3）1/4      【解析】(1)小问详解： 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因L时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，根据图甲所示的载体信息，以及Bsa I酶的识别序列和切割位点可知，经Bsa I酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-GTTT-3'、5′-CAAT-3'。 (2)小问详解： 根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac I酶切位点上存在差异，而BamH I和EcoR I这两个限制酶的酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac I，限制酶Sac I在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙电泳结果可知，只有③为纯合突变的植株。 (3)小问详解： 根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选，该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 10.（2026·贵州·学业水平适应性测试）A基因编码蛋白可以抑制β病毒的增殖，为了构建抑制β病毒增殖的受体细胞，科研人员开展了如下实验。 限制酶的识别序列和切割位点如下： SpeI：5'-ACTAGT-3'；XbaI：；BamHI： 回答下列问题： （1）利用PCR扩增A基因所需的酶是　　　　　　　　，PCR扩增所需引物的长度一般为20-30个核苷酸，引物不能太短的原因是　　　　　　　　。为了便于后续将A基因连接到载体上，设计引物时需要在　　　　　　　　（选填“5′端”或“3′端”）添加　　　　　　　　限制酶的识别序列以便进行双酶切。 （2）构建载体时，A基因和质粒能被DNA连接酶正确连接的原因是　　　　　　　　，载体构建成功后，　　　　　　　　（选填“能”或“不能”）用原剪切A基因的限制酶切割重组质粒获得完整A基因，理由是　　　　　　　　。 （3）目的基因进入受体细胞后是否稳定表达，需要进行检测和鉴定。请以β-GFP病毒悬液（GFP：绿色荧光蛋白基因）为实验材料，设计实验检测受体细胞是否具有抑制β病毒的增殖能力，写出实验思路　　　　　　　　。 【答案】（1）① 耐高温的DNA聚合酶    ② 引物太短会降低特异性，容易与模板DNA的非目的位点发生非特异性结合，无法保证扩增目的基因的特异性    ③ 5′端    ④ SpeI和BamHI的识别序列     （2）① A基因经过SpeI和BamHI酶切后产生的黏性末端能与质粒被XbaⅠ和BamHⅠ酶切后产生的黏性末端相同    ② 不能    ③ A基因左侧与质粒的XbaI酶切后产生的黏性末端实现连接后形成的碱基序列不能被XbaI识别。     （3）将受体细胞和正常细胞均置于β-GFP病毒悬液中，设计为两组实验，然后将等量β-GFP病毒分别加入两组中，培养适当时间后检测两组细胞中荧光强度的变化      【解析】(1)小问详解： 利用PCR扩增A基因所需的酶是耐高温的DNA聚合酶，因为PCR过程是通过温度调节DNA的解聚的；PCR扩增所需引物的长度一般为20-30个核苷酸，若引物太短会降低特异性，容易与模板DNA的非目的位点发生非特异性结合，无法保证扩增目的基因的特异性。为了便于后续将A基因连接到载体上，需要在目的基因的外侧添加相应的限制酶识别序列，结合图示可知，设计引物时需要在“5′端”添加限制酶SpeI和BamHI的识别序列，这里不选择限制酶XbaI的原因是目的基因中有该酶的识别位点，且该酶与SpeI是同尾酶。 (2)小问详解： 构建载体时，A基因经过SpeI”和BamHI酶切后产生的黏性末端能与质粒被XbaI和BamHI酶切后产生的黏性末端相同，因而能被DNA连接酶正确连接，载体构建成功后“不能”用原剪切A基因的限制酶切割重组质粒获得完整A基因，因为A基因左侧与质粒的XbaI酶切后产生的黏性末端实现连接后形成的碱基序列为5'-TCTAGT-3',该序列不能被XbaI识别。 (3)小问详解： A基因编码蛋白可以抑制β病毒的增殖，目的基因进入受体细胞后是否稳定表达，需要进行检测和鉴定。β病毒携带GFP基因，病毒增殖越多，受体细胞的绿色荧光越强；则实验思路为，将受体细胞和正常细胞均置于β-GFP病毒悬液中，设计为两组实验，然后将等量β-GFP病毒分别加入两组中，培养适当时间后检测两组细胞中荧光强度的变化，若受体细胞中荧光强度低于正常细胞可说明目的基因表达成功。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $