2026届高三生物一轮复习课件 -利用PCR技术获取目的基因（PCR技术微专题）

该高中生物学高考复习课件聚焦PCR技术及应用，依据高考评价体系梳理了RT-PCR、qPCR、大引物PCR、融合PCR等核心考点，分析基因工程中定点突变、融合基因等高频考查内容，归纳选择、填空等常考题型，体现高考备考的针对性和实用性。 课件亮点在于结合禽流感检测真实情境设计探究实践，如qPCR的Ct值分析、大引物PCR突变步骤，培养科学思维和探究实践素养。通过荧光定量PCR选择题等高考真题解析易错点，提供答题模板，帮助学生掌握得分技巧，教师可据此精准指导复习，助力高效备考。

流感中的分子利器 —利用PCR技术获取和扩增目的基因 胶体金免疫层析法 （血清学方法） 目前检测禽流感的方法主要有以下3种: 病毒分离与鉴定 病毒核酸检测 血清学试验 存在耗时长（通常需要7 ~14 天）、对生物安全要求较高 无法区分疫苗免疫与病毒感染 低致病性禽流感 病毒感染 省时、特异性强 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 目前实验室针对禽流感的检测主要有以下3种方法:分别是病毒分离与鉴定、病毒核酸检测、血清学试验。禽流感通用快速检测试纸就是利用血清学方法进行检测的，检测阳性是确认禽流感病毒感染的条件之一，但最终确诊仍需结合临床症状、病理变化，并通过病毒的分离与鉴定等来完成。目前病毒核酸检测因具有省时特异强而被广泛推荐应用于临床检测和监测工作中，这就需要用到PCR技术。 先对目的基因进行扩增 病毒核酸极少 病鸽咽拭子、排泄物 提取 任务一：检测禽流感病毒感染的策略 快速获得大量病毒基因 检测是否感染禽流感病毒 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 核酸检测时，通常是在病鸽的泄殖腔、排泄物中提取核酸 2.PCR中微量离心管中应加入哪些组分？ 1.PCR中多次循环的步骤是什么？ 引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链 否； RT-PCR技术 活动①： 模板、一对引物、 Taq DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、无菌水 变性、复性、延伸 追问：能否用PCR技术扩增禽流感病毒基因？ 逆转录酶 核酸酶H （RNaseH） DNA聚合酶 单链RNA DNA-RNA杂交双链 单链DNA 双链DNA 3.引物的作用？ 任务一：检测禽流感病毒感染的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 常规RT-PCR的灵敏度相对较低，且无法进行定量检测 原因：感染初期，病鸽排泄物中病毒含量极少 如何解决？ 需借助其他检测方法（如qPCR）综合评估病毒含量 任务一：检测禽流感病毒感染的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 M 1 2 3 4 5 6 7 引物设计好就可以开始PCR了，在老师的帮助下，同学们也是在市农科所的实验室体验了RT-PCR的整个过程，实验室的科研人员告诉同学们，病鸽确实是感染了低致病性禽流感病毒。看到实验结果后，细心的同学提出了一个问题，为什么5号、7号加样孔的结果不明显？科研人员解释道，那是因为取样时，样本中的病毒含量极少，RT-PCR无法检测得到。这就需要使用灵敏度更高的方法来检测了。这种方法就是实时荧光定量PCR。 实时荧光定量PCR(qPCR)：指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，实现了PCR从定性到定量的飞跃。 样本采集及病毒灭活处理 提取RNA 5’ 3’ 步骤一 病毒RNA提取 引物1 引物2 R Q 酶、引物、dNTP、荧光探针等 R Q 发出荧光 荧光检测 步骤三 qPCR 任务二：检测禽流感病毒载量的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 酶、引物、dNTP等 5’ 3’ 5’ 3’ RNA-DNA杂交分子 步骤二 病毒cDNA合成 cDNA 实时荧光定量PCR也叫qPCR，是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，实现了PCR从定性到定量的飞跃的技术。它用于检测禽流感病毒感染的步骤大概如下。首先是提取病毒的RNA然后是反转录合成CDNA，最后是进行qPCR。 原理：在反应体系加入荧光探针，荧光探针两端连有荧光基团（R）和抑制荧光发出的淬灭基团（Q），完整的荧光探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光。随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）。 引物1 引物2 R Q DNA聚合酶 DNA 聚合酶 引物1 引物2 R Q R Q 变性 复性 延伸 思考1： 1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成几个荧光分子？ 任务二：检测禽流感病毒载量的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 我们重点来看qPCR。它的原理是在反应体系加入探针，探针两端连有荧光基团（R）和抑制荧光发出的淬灭基团Q，当探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收，PCR扩增时，TaqDNA聚合酶在合成子链的同时将探针催化降解。使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，R基团发出荧光，并且随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，最后通过实时检测荧光信号强度，就可得Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）。 R Q 1＋2＋4＝7(个)荧光分子 第一轮扩增 第二轮扩增 第三轮扩增 R Q R Q R Q R Q R Q R Q 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 Taqman探针、引物、原料有限 2.Ct值越小说明什么问题？ 3.扩增到最后阶段荧光强度出现平台期的原因有哪些？ 思考： 原理：在反应体系加入Taqman探针，Taqman探针两端连有荧光基团（R）和抑制荧光发出的淬灭基团（Q），完整的Taqman探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数）。 平台期 Ct值越小，原始模板数越多 （或Ct值越小，说明病毒核酸浓度越高） 任务二：检测禽流感病毒载量的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 荧光强度主要与扩增次数、病毒初始数量有关 资料1：干扰素可干扰病毒复制，但在体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨酸（UGC）替换为丝氨酸（AGC），则可延长保存时间。 当务之急：赶紧治鸽子！ 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 任务三：治疗禽流感病毒感染的策略 既然确诊了是禽流感病毒感染 mRNA 模板链 天然干扰素对应的部分基因： 转录 天然干扰素部分氨基酸序列： …… …… 半胱氨酸 翻译 UGC TGC ACG 模板链 改造后应得的基因序列： mRNA 改造后干扰素部分氨基酸序列： 转录 翻译 …… …… 丝氨酸 AGC AGC TCG 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 资料1：干扰素可干扰病毒复制，但在体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨酸（UGC）替换为丝氨酸（AGC），则可延长保存时间。 定点突变 模板链 天然干扰素对应的部分基因： TGC ACG 模板链 改造后应得的基因序列： AGC TCG 大引物PCR 由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行改造，最终还必须通过改造基因来完成。 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 定点突变 改造前的基因序列： G C 改造后的基因序列： A T 大引物PCR技术：大引物PCR 技术是利用第一次PCR 产生一段带突变的DNA片段，作为”超大引物“,再进行第二次PCR ，最终获得定点突变的完整目的基因。其实质就是第一轮的产物作为第二轮的引物。 常规下游引物 PCR 1 PCR 2 常规上游引物 PCR 3 诱变引物 A A T A T T 大引物 G C 根据待突变DNA 的拟突变位点设计突变上游引物及常规下游引物(或突变下游引物及常规上游引物)，利用设计出的一对引物进行第一次PCR，产物是带有突变位点的大引物。设计待突变DNA 的常规上游引物，利用常规上游引物及第一步PCR 得到的大引物中的下游大引物进行第二次PCR，产物是拟突变位点被突变的目的DNA。 任务三：治疗禽流感病毒感染的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 第一轮扩增 T A 第二轮扩增 PCR1 诱变引物 A 引物1 拟突变位点 T A 引物2 模板链 T A 大引物① 大引物② 第一轮扩增产物 第二轮扩增产物 引物1 诱变引物 A A T A A 诱变引物 A 引物1 诱变引物 A 引物1 活动②：探索改造干扰素基因的过程 A A T 任务三：治疗禽流感病毒感染的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 第二轮扩增 PCR2 改造后的干扰素 改造后的mRNA （UGC→AGC） AGC 翻译 A T 已突变位点 模板链 第二轮扩增产物 第一轮扩增 引物 . 大引物 . 模板链 T A 第一轮扩增产物 拟突变位点 T A 活动②：探索改造干扰素基因的过程 ② 2 T 大引物② 引物2 T A T T 引物2 T 大引物② 翻译 引物2 T 大引物② T T T A 与社会联系：禽流感灭活疫苗需历经毒种选育、病毒灭活等多道工序，生产过程严守生物安全规范。由于疫苗针对特定毒株研制，加之病毒变异速度快，一旦发生抗原变异，疫苗防护效果便会大幅衰减，为疫情防控带来不小挑战。 方案1：改造病毒基因 方案2：开发DNA疫苗 方案3：…… 任务四：预防禽流感病毒感染的策略 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 科学家的困扰： 如何研发安全、广谱通用的疫苗？ 流感病毒由致病性传染源变为预防性疫苗。 资料2：流感病毒的抗原有H和N两类。某科研团队基于融合蛋白的思路，利用融合PCR技术，尝试制造H、N融合蛋白的DNA疫苗，以期更好地预防禽流感病毒。 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 任务四：预防禽流感病毒感染的策略 H基因 N基因 PCR1 扩增 PCR2 扩增 引物3 引物4 PCR3 扩增 H-N融合基因 引物2 引物1 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ AAA T T T T T T AAA AAA T T T H’ 基因 N’ 基因 互补 1.应分别选择H’和N’基因的哪条链做模板扩增得到融合基因？ 头脑风暴 需要根据HN需融合的部分,分别设计引物2、3，引物2 的末端与引物3的末端有部分序列互补。根据A 片段和B 片段非融合的部分，分别设计常规引物1、4。在两个体系中分别PCR 扩增A 和B 片段，得到产物A’和B’。用第一次PCR 的产物A’和B’进行融合PCR，得到融合基因，此时A’和B’片段互为引物和模板。以融合基因为模板，用引物1、引物4进行第三次PCR，扩增出大量融合基因。 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 ⑤ ⑦ T T T AAA AAA T T T ⑥ ⑧ ⑦ ⑧ N’ 基因 AAA T T T ⑤ ⑥ H’ 基因 T T T AAA 采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 H基因 N基因 PCR1 扩增 PCR2 扩增 引物3 引物4 PCR3 扩增 PCR4 扩增 H-N融合基因 引物4 引物1 引物2 引物1 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ AAA T T T T T T AAA AAA T T T H’ 基因 N’ 基因 ⑥ ⑧ AAA T T T 2.应分别选什么引物用来大量扩增H-N融合基因？ 3.在H基因和N基因融合的过程中，起搭桥作用的是 两种引物？ 头脑风暴 消灭传染源 切断传播途径 保护易感动物 从传染病防控角度梳理预防禽流感病毒感染的策略 活动③ 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 本 课 小 结 检测禽流感病毒基因 (RT-PCR、qPCR) 改造干扰素基因序列 (大引物PCR) 融合不同的基因片段 (融合PCR) PCR技术 变性 复性 延伸 应用 原理、过程 DNA的半保留复制 病毒感染的诊断 治疗禽流感病毒感染 开发疫苗预防病毒感染 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 巩固练习 1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是(　　)。 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 A．引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关 C．Taq DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端 D．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶 解析：反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B错误 B 巩固练习 2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因A进行定点诱变，回答下列问题。 ①第一次PCR中，至少需要___个循环才能获得相应的大引物模板。 ②通过第一次PCR获得的大引物②是以_________引物延伸得到的DNA链为模板。 ③在第二次PCR中，要获得带有诱变位点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的______（填“①”或“②”）。 2 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 突变上游 ② 常规下游引物 巩固练习 3.融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 C 解析：PCR扩增时，子链的延伸方向是5'- 3’，a、d两条链中间碱基互补配对，两者可互作模板和引物，实现融合基因的扩增，C错误 A.引物2需添加与引物3部分互补的序列 B.除图示外，融合PCR还需dNTP以及缓冲液等 C.重叠延伸时，两条链分别为b、c，两者互相作模板 D.重叠延伸时，两条链重叠部位互相作为另一条链的引物 课后作业 1.必做 对本节课学的这几种PCR技术进行归纳总结（要求：具体原理、过程，不同PCR技术的异同点，各种PCR技术的应用等） 2.选做 ①查阅资料，寻找治疗病毒感染的其他策略并与同学交流分享（要求：方案+生物学原理） ②查阅资料，归纳整理流感病毒除了用于制备疫苗以外的应用（要求：作用+生物学原理） 情境引入 检测基因 改造基因 融合基因 巩固提升 $