专题16 基因工程（期末真题汇编，四川专用）高二生物下学期人教版

**基本信息** 聚焦高中生物基因工程专题，汇编四川多地期末试题，覆盖工具、操作程序、应用三大核心考点，结合CRISPR技术、蛋白质工程等前沿情境，强调科学思维与实验探究。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选题|32题|限制酶作用、PCR原理、DNA粗提取鉴定|以链霉菌改造、CRISPR-Cas9等科研情境命题，考查基础概念辨析| |解答题|14题|载体构建、引物设计、蓝白斑筛选|通过重叠延伸PCR、转基因抗虫棉等案例，综合考查实验设计与结果分析能力|

专题16 基因工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具、DNA的粗提取与鉴定 考点02 基因工程的基本操作程序 考点02 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具、DNA的粗提取与鉴定 一、单选题 1．B 2．C 3．D 4．A 5．D 6．B 7．D 8．A 9．D 10．D 11．D 12．C 13．D 二、解答题 14．(1) Mun Ⅰ Xho Ⅰ RNA聚合酶 (2) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） P3 5' GAATTC (3) 大小和构象 提高 (4) 白色 重组质粒中不含有LacZ基因，不能编码产生β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．D 2．C 3．C 4．C 5．D 6．B 二、解答题 7．(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 引物过短，特异性较低 5’-TAAAGCTGTTCCCTGCAA-3’ (2) 2 a和d 1和4 (3) 标记基因、复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位 (4)使细胞处于一种能吸收外界周围环境中DNA分子的生理状态 8．(1)激活 Taq 酶（或为 Taq 酶提供激活环境 ） (2) MunI和XmaI CAATTGTCTGTTGAAT CCCGGGCCTGGATGAT (3) 潮霉素 卡那霉素 (4)抗原-抗体杂交 9．(1) 逆转录 ②③ 5＇端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 2N+1-2 (2) BamHⅠ和SalⅠ GCG (3) Ca²⁺ 氨苄青霉素和X－gal 白 10．(1) 化学合成 无启动子、内含子等序列 提高浓度，两端形成不同黏性末端或目的基因两端有不同种限制性酶识别序列 (2)5’GCTAACCTAGTG3’ (3)被RNA聚合酶识别并结合，起始转录过程 (4) 感受态 卡那霉素 羧苄青霉素 潮霉素 转基因受体细胞 (5)利用抗原-抗体杂交技术检测是否合成了脱水素 (6) 草莓全套的遗传物质 脱水素基因 三、实验题 11．(1) 引物1、引物4 琼脂糖凝胶电泳 (2) HindⅢ、PstI 防止目的基因和质粒自身环化；保证Fatl基因和eGFP基因都正常表达等 (3)利用显微注射将含有Fat1基因的重组质粒注入动物细胞 (4) PCR、抗原-抗体杂交等 不能 空载体导入也会使细胞发绿色荧光 12．(1) 复性，目的是使引物与模板DNA充分结合 31m (2) 复制原点 A-T RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (3) AAGCTT b链为转录的模板链，根据转录方向，与a链结合的引物5'端靠近终止子，应选用HindⅢ的识别序列AAGCTT (4) 抗原—抗体杂交 重组质粒缺少启动子和终止子，无法正常转录 13．(1) 简并性 逆转录 (2) XhoI MunI CTCGAGCCTTTCAGCTCA (3) 氨苄青霉素和 X - gal 目的基因插入破坏lacZ基因，无法合成 β - 半乳糖苷酶 (4)大肠杆菌无内质网、高尔基体，不能对胰岛素原加工（切去 C 肽段 ） (5)设计预期的蛋白质结构 14．(1) 限制酶和DNA连接酶 热稳定DNA聚合/Taq 耐高温 (2) Hind Ⅲ和Xba Ⅰ F₁ 和R₁ F₃ 和R₃ 尖孢镰刀菌胁迫下，野生型百合的pL启动子活性高于栽培种百合的bL启动子，使L基因大量表达 (3)设计与栽培种百合bL启动子中特定序列互补的sgRNA，构建CRISPR/Cas9表达载体；将载体导入栽培种百合细胞，诱导其基因编辑；筛选出bL启动子被编辑为具有高活性的植株（或替换为pL启动子的植株） 地 城 考点03 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 一、单选题 1．D 2．B 3．C 4．C 5．A 6．A 7．B 8．D 9．D 10．B 11．D 12．C 13．B 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题16 基因工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具、DNA的粗提取与鉴定 考点02 基因工程的基本操作程序 考点02 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具、DNA的粗提取与鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·四川绵阳·期末)链霉菌是抗生素的主要产生者。科学家期望通过基因工程改造链霉菌，提高其活性物质的表达量。下列说法正确的是（　　） A．在基因工程的基本操作过程中，只能通过PCR获取目的基因 B．为避免目的基因与载体反向连接，可用2种限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段 C．若选用的限制酶识别序列为5'-↓GATC-3'，切割后产生的是平末端 D．若通过蛋白质工程获得新的抗生素，第一步操作应该是获取目的基因 2．(24-25高二下·四川南充·期末)几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示）如下表所示。据表推测，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 A．限制酶使特定核苷酸序列特定部位的磷酸二酯键断开 B．BamHⅠ和Bel Ⅰ识别的核苷酸序列都能被Sau3A Ⅰ识别 C．SmaⅠ切割DNA 片段后形成的黏性末端，可用E.coli DNA连接酶连接 D．BamHⅠ切割产生的DNA片段能与BelⅠ切割产生的DNA片段相连接 3．(24-25高二下·四川泸州·期末)由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E，下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述错误的是（　　） A．不直接用载体P来构建基因表达载体，是因它缺少目的基因表达所需的启动子和终止子 B．可以选择EcoRV对载体P进行酶切，再用T4DNA连接酶连接目的基因和载体P C．为使载体E与目的基因正确连接，可选XhoⅠ和PstI对重组载体P和载体E进行酶切 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明目的基因在受体细胞中已成功表达 4．(24-25高二下·四川凉山州·期末)某同学拟用限制酶（酶1-酶4）等将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列关于重组表达载体构建的方案，合理且效率最高的是（    ）    A．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接 B．质粒和目的基因都用酶2切割，用E．coliDNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coliDNA连接酶连接 D．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接 5．(24-25高二下·四川绵阳·期末)图是家庭版DNA的粗提取的过程。若该实验得到的DNA鉴定效果不明显，则可能的原因不包括（　　） A．实验所选用的材料中DNA含量较低 B．实验过程中酒精未预冷时，DNA被降解 C．粗提取的DNA中含有较多的杂质 D．鉴定时所用甲紫溶液失效，且未沸水浴加热 6．(24-25高二下·四川成都蓉城联盟·期末)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．经粗提取得到的DNA用二苯胺鉴定呈蓝色，菠菜可以用作提取材料 B．当温度上升到72℃时，耐高温的DNA聚合酶使脱氧核苷酸连接到引物的5'端 C．PCR反应体系中脱氧核苷酸（dNTP）既是DNA扩增的原料，又为该过程提供能量 D．利用电泳对DNA进行鉴定时，要留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 7．(24-25高二下·四川广元·期末)XhoI和SalI是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．泳道①是使用SalI处理后的酶切产物的电泳结果 B．每种酶切割DNA的部位是特定核苷酸之间的磷酸二酯键 C．泳道②最上方条带是XhoI处理后最大的DNA片段 D．同时使用SalI和XhoI处理，酶切产物的电泳结果为7个条带 8．(23-24高二下·河南商丘商师联盟·期末)“工欲善其事，必先利其器”，基因工程需用到多种工具。下列关于基因工程的基本工具的说法，错误的是（    ） A．限制酶将DNA分子水解为脱氧核糖核苷酸 B．限制酶主要从原核生物中分离纯化 C．被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的 D．动植物病毒、噬菌体也可以用作基因工程中的载体 9．(24-25高二下·四川广安·期末)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA．用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒粗提取和鉴定的叙述，不正确的是（　　） A．可利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精的原理初步分离DNA和蛋白质 B．用预冷的酒精溶液析出DNA可防止DNA的结构被破坏 C．通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 D．根据电泳结果推测质粒上分别有一个限制酶Ⅰ和Ⅲ的切割位点，有两个限制酶Ⅱ切割位点 10．(24-25高二下·四川遂宁·期末)下列关于DNA粗提取和鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．二苯胺试剂可以作为鉴定DNA种类的试剂，使用时需要用到沸水加热 B．PCR利用热变性原理和DNA的半保留复制原理在体内外进行DNA扩增 C．DNA分子被电泳缓冲液中的核酸染料染色后，能直接利用肉眼观察到 D．可根据待电泳的DNA分子大小对凝胶所用琼脂糖溶液的浓度进行调整 11．(24-25高二下·四川凉山州·期末)DNA的粗提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中的重要程序，下列叙述正确的是（    ） A．DNA不溶于NaCl溶液，但可以溶于酒精 B．PCR扩增过程中，缓冲液中需要加入Ca2+以激活DNA聚合酶 C．对PCR扩增得到的DNA进行电泳后，加入核酸染料在紫外灯下进行观察 D．电泳过程中，DNA相对分子质量越小，移动的速度越快 12．(24-25高二下·四川凉山州·期末)2020年诺贝尔化学奖授予在CRISPR/Cas9基因编辑技术领域作出贡献的两名女科学家。基因组编辑CRISPR-Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的向导RNA构成，在向导RNA引导下，Cas9蛋白与靶序列结合并将DNA双链切断，从而完成对目的基因的编辑。下列叙述错误的是（    ） A．推测向导RNA序列越短，越容易导致编辑位点出错 B．将基因组编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德 C．Cas9蛋白的作用与DNA连接酶相同 D．基因编辑作物推广需通过生态安全性和伦理审查 13．(24-25高二下·四川南充·期末)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”的实验，说法正确的是（    ）    A．加入溶液甲的目的是溶解上清液中的DNA B．溶液乙为二苯胺试剂，加入后立即呈蓝色 C．该实验不可用蛙的成熟红细胞代替实验材料 D．粗提取物与双缩脲试剂也会发生显色反应 二、解答题 14．(24-25高二下·四川达州普通高中·期末)为了探究X蛋白的特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质粒中LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3、P4表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)据图1分析，应选用四种限制酶中的_______和_______切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。在表达过程中，启动子是______识别并结合的部位。 (2)利用PCR技术获取X蛋白基因时，在反应体系中，除了应加入缓冲液、Mg2+、X蛋白基因所在模板DNA、四种脱氧核苷酸外，还必须加入________和足量的两种引物。引物的设计是PCR中特别重要的一个环节，为保证X蛋白基因能正确插入载体，除选择引物P1外，还需要选择引物______（填“P2”或“P3”或“P4”），并在该引物_______（填“5'”或“3'”）端增加碱基序列5'-_______-3'。 (3)琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，主要与不同DNA分子的______有关。对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减少非特异性条带的产生，可适当_____（填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。 (4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，可将重组质粒与经Ca+处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为_______的菌落为目标菌落，原因是______。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．(24-25高二下·四川广元·期末)为改良棉花抗虫性，科研人员将苏云金杆菌（Bt）的Cry1Ac基因与棉花叶绿体基因表达载体连接，导入棉花体细胞。下列叙述错误的是（　　） A．选择叶绿体基因作为目的基因载体，可避免花粉传播造成的基因污染 B．构建表达载体时需在CrylAc基因两端添加启动子和终止子以调控转录 C．显微注射法适用于动物细胞，而农杆菌转化法适合双子叶植物幼嫩组织 D．以Cry1Ac基因转录的mRNA作为模板进行PCR扩增，可获得大量目的基因 2．(24-25高二下·四川凉山州·期末)研究人员利用农杆菌转化法将大豆中的耐盐碱基因（GsERF6基因）转入水稻细胞中，培育高表达GsERF6基因的耐盐碱水稻，图甲为研究人员构建的GsERF6基因表达载体，其中新霉素基因是用于筛选转化的植物细胞的标记基因；图乙为研究人员对转化的植物细胞进行目的基因检测的电泳图谱，其中M：DNAmarker；-：阴性对照；+：阳性对照；1：转基因水稻DNA。下列叙述错误的是（    ）    A．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上 B．阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6 C．新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的同一条链上 D．据电泳图推断目的基因片段大小约为1000bp，尚需测序以确定其是否为目的基因 3．(24-25高二下·四川广元·期末)PCR引物的3端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法正确的是（　　） A．图示环节所需的温度比上一个环节高 B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到5'端 C．耐高温的DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成 D．经过1个循环后，获得的子代DNA的两条单链长短相同 4．(24-25高二下·四川绵阳·期末)质粒K中含有的β-半乳糖苷酶基因。将质粒K导入大肠杆菌细胞后，编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal，产生蓝色物质，使平板中出现蓝色菌落，如下图所示。某课题组以该质粒为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（　　） A．若X-gal高温敏感，应在培养基高压蒸汽灭菌后，再加入X-gal B．若筛选平板中不含X-gal，则生长出的白色菌落不能确定为目的基因所表达的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．该筛选法只能确定编码β-半乳糖苷酶的基因被破坏，而不能确定是目的基因的表达 5．(24-25高二下·四川绵阳·期末)甲植物因细胞核中具有特异性DNA序列(a)而具有耐盐碱效应；乙植物因细胞质中具有特异性DNA序列(b)而具有高产效应。科研人员将甲、乙两种植物体细胞杂交，获得了耐盐碱、高产再生植株，并通过PCR技术来鉴定。已知M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。下列有关叙述错误的是（　　） A．植物体细胞杂交技术打破了生殖隔离，实现了远缘杂交育种 B．鉴定时，提取、纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板 C．总DNA加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；同理扩增序列b D．产物电泳后，若分别在凝胶中均出现预期的2个条带，可确定再生植株来自杂种细胞 6．(24-25高二下·四川达州普通高中·期末)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，某科研人员采用农杆菌转化法将甜蛋白基因（含有1178个碱基对）导入番茄，希望能提高番茄甜味，改善果实品质。甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切位点如图1、2所示；提取培育出的转基因番茄细胞中的DNA，依据甜蛋白基因两端的特异性序列设计引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，结果如图3。下列叙述错误的是（    ） A．PCR扩增甜蛋白基因时，应该根据基因两端的3'端序列设计引物 B．选择限制酶XbaI和EcoRI切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA片段 C．可用含有卡那霉素的培养基对成功导入表达载体的农杆菌进行筛选 D．仅由图3电泳结果不能判断1、2、3、4号转基因番茄是否培育成功 二、解答题 7．(24-25高二下·四川乐山·期末)金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）是由金黄色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的细菌毒素，是一种强效的免疫激活剂。在对改造后的病毒SEA基因进行DNA测序时，发现其第133位点碱基发生了点突变，由A变为G（A→G）。现采用重叠延伸PCR定点诱变技术纠正在克隆SEA基因过程中发生的点突变，流程见下图。 (1)上述过程中会用到4种引物，引物的作用是_____。一般引物序列不能过短，原因是_____。为了实现突变纠正，引物2和引物3需部分碱基序列配对，引物2碱基序列为：（划线处为需配对序列，大写处为需纠正碱基）。请写出引物3需配对的碱基序列_____。 (2)上述过程中经过PCR1和PCR2步骤，得到的产物经过变性和杂交后会得到_____种杂交产物，_____链（填图中标号）配对的杂交产物可直接进行一代扩增得到SEA基因。若通过电泳鉴定得到SEA基因并回收后进行PCR3，该过程需要选择引物_____（填图中标号）进行扩增。 (3)若要将得到的SEA基因导入受体细胞，最核心的工作是构建基因表达载体。基因表达载体除含有目的基因以外，还有_____、终止子和位于基因上游的启动子。启动子的作用是_____。 (4)将表达载体导入受体细胞时，若选择某大肠杆菌作为受体细胞，则需要Ca2+处理。该试剂处理的目的是_____。 8．(24-25高二下·四川泸州·期末)我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入棉花细胞培育出了转基因抗虫棉。请回答下列问题： (1)利用PCR技术获得了大量Bt基因，PCR反应需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是_____。 (2)Bt基因A端和B端的部分序列如图所示，为了使Bt基因正确插入到Ti质粒中，设计引物时需要在A端和B端的引物的5＇端分别添加图中_____限制酶的识别序列。结合目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列（至少写16个碱基）。 引物1（A端的引物）：5＇_____3＇，引物2（B端的引物）：5＇_____3＇。 (3)据图分析，用Ca2+处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加_____的培养基中筛选得到含基因表达载体的农杆菌，再将重组农杆菌侵染棉花愈伤组织，在添加_____的培养基中筛选出成功将Bt基因整合到染色体DNA上的棉花植株。 (4)可以在分子水平上采用_____的方法来检测Bt基因是否成功表达。 9．(24-25高二下·四川遂宁·期末)粒细胞集落刺激因子（G-CSF）主要由巨噬细胞等细胞产生，是一种能促进血细胞生成的蛋白质类药物。科学家利用图中质粒构建基因表达载体并将其导入大肠杆菌，获得生产重组人G-CSF的工程菌，以期解决G-CSF药源不足且昂贵的难题，请回答下列问题： （注：LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，这种以颜色不同为依据直接筛选含基因表达载体菌体的方法称为“蓝白斑”法。图中几种限制酶的识别序列和切割位点为：EcoRⅠ：5'—G↓AATTC—3'，SmaⅠ：5'—CCC↓GGG—3'，BamHⅠ：5'—G↓GATCC—3'，SalⅠ：5'—G↓TCGAC—3'。） (1)获取G-CSF基因：从人体巨噬细胞中提取总RNA后，通过____过程获得cDNA。据图1分析，PCR扩增G-CSF基因时所需的引物组合是____，在其中一种引物的____（填“3'端”或“5'端”）需添加BamHⅠ识别序列和启动子序列。启动子的作用是____。G-CSF基因片段扩增N次，需消耗引物共____个。 (2)构建基因表达载体：为确保G-CSF基因正确插入图2的载体中，需选择的限制酶组合是____。假设G-CSF基因a链的碱基序列为5'—TTTGAGACC……—3'，启动子a链的碱基序列为5'—GCTGCATG—3'，分析G-CSF基因上游引物从5'到3'方向的编号为第1、8、18的三个碱基分别是____（填写字母）。 (3)将目的基因导入受体细胞：先用____处理受体细胞，然后将大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了____的培养基上筛选出____色的菌落即为工程菌。 10．(24-25高二下·四川射洪中学·期末)低温冻害是草莓冬季生产关键期的主要气象灾害。为了培育出抗冻草莓，研究人员获得了青稞的抗冻物质脱水素的编码序列，构建重组DNA后，以农杆菌转化法介导最终培育得到抗冻草莓。下图是基因表达载体，下表是几种常见抗生素的作用机理。 注：T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似 抗生素种类 抗生素作用机理 潮霉素 作用于细菌、动植物细胞，抑制核糖体作用 卡那霉素 链霉素 羧苄青霉素 抑制细菌细胞壁合成，杀死细菌；分解产物是生长素和萘乙酸，可以刺激愈伤组织的增殖 请回答相关问题： (1)获取目的基因：根据脱水素的编码序列，先通过_______方法获得脱水素基因，该方法得到的基因与青稞基因组文库中的脱水素基因结构上的区别主要是_______；为了提高目的基因与载体的连接效率，从目的基因的角度分析，可以采取哪些措施？_______（答出1点即可）。 (2)构建基因表达载体：脱水素基因（其部分序列如图1所示），基因表达载体上的限制酶识别序列如图所示（如图2所示）已知脱水素除含有ECORⅠ和HindⅢ识别位点外，无其他限制酶识别位点。PCR扩增脱水素基因，需要合成的引物1的碱基序列为_______。 限制酶 EcoRⅠ HindⅢ BamHI SacⅠ 识别序列及切割位点 G↓ATTTC A↓AGCTT G↓GATCC G↓CTAAC (3)该基因表达载体缺少一个重要组件启动子，其作用是_______。 (4)受体细胞的转化与筛选。将重组Ti质粒导入处于_______的农杆菌后，需要先用含有_______的选择培养基对其进行筛选，然后将阳性农杆菌与草莓叶片共培养。完成转化后，需要先后使用_______和_______作为除菌剂和筛选剂，前者既能及时杀死农杆菌，又能最大限度地减少对刚转化形成的受体细胞的影响，后者可实现对_______的筛选。 (5)要检测脱水素基因是否成功表达，请说出利用的方法_______（答出1点）。 (6)转基因植株的再生和检测。含有目的基因的草莓叶片经过脱分化过程，叶片边缘形成愈伤组织，该组织经后续处理能够得到抗冻草莓幼苗，根本原因是由于愈伤组织细胞中含有_______和_______。 三、实验题 11．(24-25高二下·四川南充·期末)哺乳动物因缺失Fatl基因，无法合成ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶，进而导致无法自身合成ω-3多不饱和脂肪酸。科研工作者利用转基因技术将秀丽隐杆线虫的Fat1基因导入猪体内，以提高猪肉中ω-3多不饱和脂肪酸的含量，满足人们的需求。具体操作如下，eGFP基因可表达出绿色荧光蛋白。回答下列问题：    (1)利用PCR仪扩增Fatl基因时，选择的最佳引物是___________；常采用___________（方法）来鉴定PCR产物。 (2)为了将Fatl基因插入到载体中，扩增Fatl基因时，需在两种引物上分别加上___________两种限制酶的识别序列，选择其原因是___________。 (3)将构建好的Fat1基因表达载体导入猪的成纤维细胞最常用的一种方法是___________。 (4)将基因表达载体导入猪的成纤维细胞后，可采用___________技术从分子水平检测Fat1基因是否导入成功。若处理后的猪成纤维细胞检测到绿色荧光，________（填“能”或“不能”）代表目的基因导入成功，理由是___________。 12．(24-25高二下·四川广安·期末)哺乳动物体内一定含量的ω-3多不饱和脂肪酸（LCPUA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1，培育转fat-1基因家兔，其部分流程如图所示。请据图回答下列问题： (1)利用PCR扩增fat-1基因时，PCR的每次循环一般可分为三步，其中理论温度最低一步及其主要目的是________。若用PCR扩增fat-1基因时，初始fat-1基因的数量为m个，与a链结合的引物数：与b链结合的引物数=1：50，该体系扩增进行5轮循环后，与a链结合的引物刚好耗尽，则与a链结合的引物数量等于________条。 (2)在PEB-fat-1重组质粒中，确保重组质粒能在受体细胞中扩增的元件是________，该元件所在区域的序列容易解旋成单链，据此推测该区域中________碱基对所占的比例较高；质粒上启动子的作用是________。 (3)在构建PEB-fat-1重组质粒时，为确保fat-1基因按正确的方向插入，需要双酶切，还需要对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为b链，与b链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC（EcoRⅠ），则与a链结合的引物5'端需添加的限制酶识别序列为________，理由是________。 (4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用________技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，可能的原因是________。 13．(24-25高二下·四川广元·期末)科学家利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素有AB法和BCA法两种方法。图1展示了前胰岛素原的加工过程，图2为所用质粒及目的基因部分结构。请据图分析并回答下列问题： (1)AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，密码子的________使得AB法合成的两种DNA片段均有多种可能序列。BCA法是利用胰岛B细胞的mRNA通过_______（过程）得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再切去C肽段。 (2)构建基因表达载体时，为使目的基因与载体正确连接，可选择图2中的限制酶________、______来切割质粒和目的基因。已知胰岛素基因左端碱基序列，设计PCR引物时需添加该限制酶识别序列，若胰岛素基因左端①处的碱基序列为5'-CCTTTCAGCTCA-3'，则其中一种引物序列为5'__________3'。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，重组质粒导入大肠杆菌后，为筛选成功导入重组质粒的菌落，培养基中需添加_______。利用蓝白斑筛选，含重组质粒的菌落呈白色，原因是_________。 (4)从大肠杆菌中获取的胰岛素需进一步加工才能有活性，原因是________。 (5)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→________→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 14．(24-25高二下·四川眉山·期末)百合具有观赏、食用和药用等多种价值。在种植过程中栽培种百合极易受到尖孢镰刀菌侵染感病而影响产量和品质，人们发现野生百合却对尖孢镰刀菌具有极强的抗病性。科研人员开展了相关研究，研究发现栽培种百合和野生型百合都含有抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，但当受到病原体侵染时，野生型百合的L基因大量表达，栽培种百合的L基因难以表达。为此科研人员对 L 基因开展了更深入的研究，两种百合的 L 基因及其上游的启动子和下游的终止子结构如图一（F1～F4和 R1～R4表示相应的引物）。图二是一种 Ti 质粒的结构示意图，其中基因 gus 编码 GUS 酶，GUS 酶活性可反映启动子活性。请回答： (1)基因工程中涉及的酶有___________，PCR 扩增 DNA 所需的酶是___________，该酶具有___________的特点。 (2)研究病原微生物对 L 的启动子活性的影响。从图一所示结构中分别获取 pL 和 bL，首先选用___________酶切，分别与相同限制酶酶切的 Ti 质粒连接，再分别导入烟草。用 PCR 技术检测 pL 和 bL 导入是否成功时，应选用的引物分别是___________、___________，随机选取 2 组转基因成功的烟草（A1、A2，每组都包含有 pL 和 bL 导入成功的烟草）进行病原微生物尖孢镰刀菌胁迫，结果如图三。根据图三结果分析，野生型百合和栽培种百合对尖孢镰刀菌抗性差异的原因是___________。 (3)CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的 Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导 RNA(sgRNA)引导下，切割 DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。根据上述研究成果，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：___________。 地 城 考点03 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 一、单选题 1．(24-25高二下·四川广安·期末)干扰素是动物体内合成的一种糖蛋白，体外很难保存。如将干扰素分子的一个半胱氨酸改造成丝氨酸，体外-70°C下可以保存半年，下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，有关叙述正确的是（　　） A．干扰素是具有干扰细菌复制作用的糖蛋白，被广泛应用于治疗细菌感染性疾病 B．对天然干扰素的改造是通过直接对干扰素分子进行半胱氨酸替换来实现的 C．新的干扰素基因在大肠杆菌体内正常表达可得到预期的新的干扰素 D．蛋白质空间结构复杂是蛋白质工程实施难度大的重要原因 2．(24-25高二下·四川南充·期末)甲酸脱氢酶（FDH）是将CO2还原为甲酸的重要生物催化剂，但其催化活性和热稳定性仍存在一定的局限。研究者们提出利用蛋白质工程改FDH性能的策略。下列叙述错误的是（    ） A．新FDH的预期功能，是合成和改造FDH基因的主要依据 B．改造后的FDH基因需要加上起始密码子等调控元件才能表达 C．可利用基因的定点突变技术进行碱基替换，从而实现氨基酸序列的改变 D．具有优异性能的FDH突变体，为解决温室效应和能源危机提供了新思路 3．(24-25高二下·四川宜宾·期末)天然胰岛素易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员发现，将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，可有效抑制胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述错误的是（　　） A．该过程属于蛋白质工程，最终还要通过改造或合成基因来完成 B．研发速效胰岛素产品的基本思路是从胰岛素的预期功能出发 C．常用显微注射法将改造后的速效胰岛素基因导入大肠杆菌作为工程菌 D．第二代基因工程可生产出自然界不存在的蛋白质，使用时需注意其安全性 4．(24-25高二下·四川遂宁·期末)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发产品，如速效胰岛素、酶制剂、微生物农药，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（    ） A．天然蛋白是生物在长期进化过程中形成的，能满足特定物种和人类的需要 B．生产速效胰岛素过程改变了相应基因，也改变了胰岛素的氨基酸种类和数量 C．生产耐高温T4溶菌酶与二硫键的形成有关，需要用到基因的定点突变技术 D．生产微生物农药可直接改造a，或者直接由b开始经过①－c－②过程来实现 5．(24-25高二下·四川成都蓉城联盟·期末)天然蛋白质是生物在长期进化中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，不一定完全符合人类生产和生活需要。对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的，下列有关叙述正确的是（　　） A．经改造的枯草杆菌蛋白酶在洗涤工业和丝绸工业的应用，说明蛋白质工程的研究和应用有助于酶制剂产业的发展 B．对蛋白质进行二硫键还原处理改变原有蛋白质的结构属于蛋白质工程 C．蛋白质工程最终获得的是非天然蛋白质，所以只能通过合成目的基因来实现 D．从理论上讲，应用基因的定点突变技术只能实现改变目标蛋白质中特定位点单个氨基酸的种类 6．(24-25高二下·四川乐山·期末)天然胰岛素制剂易形成二聚体或六聚体，皮下注射后需逐渐解离为单体才能发挥作用，延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发出的速效胰岛素类似物，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（　　） A．利用蛋白质工程生产速效胰岛素类似物要从推测a的结构入手 B．①过程是转录，蛋白质工程的目标是对基因结构进行分子设计 C．从图中可以看出，蛋白质工程的基本思路与中心法则是相同的 D．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 7．(24-25高二下·四川泸州·期末)T4溶菌酶（A0）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程将对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键。获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程和基因工程都能生产出自然界中不存在的蛋白质 B．AO和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因 C．检测高温环境下A1的活性时应先将A1与底物在常温混合后置于高温环境 D．改造后T4溶菌酶可在高温条件下更加有效地溶解细菌和真菌的细胞壁 8．(23-24高二下·四川绵阳·期末)研究人员利用 CRISPR 基因编辑技术，成功修复了人类早期胚胎中肥厚心肌病相关的基因MYBPC3的突变，且定向非常准确，未出现“脱靶”效应。这项研究在攻克用基因组编辑技术治疗人类遗传病的若干技术问题的同时，也引起了一些伦理方面的争论。下列相关叙述错误的是（    ） A．用该技术编辑少量的细胞就可对某些遗传病进行治疗 B．使用该技术修复的心肌细胞可以用于心脏治疗性克隆 C．该技术潜藏着难以预测的、巨大的不确定性和风险性 D．随着技术成熟，可以设计“完美婴儿”，促进人类进步 9．(24-25高二下·四川遂宁·期末)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔的应用前景，下列相关叙述正确的是（    ） A．利用乳腺生物反应器制备药用蛋白时，只需要将目的基因导入乳腺细胞即可表达获得 B．培育转基因植物时，用电刺激处理受体细胞可增加细胞壁通透性，利于重组质粒导入 C．在同等养殖条件下，转入外源生长激素基因的鲤鱼的生长繁殖速率比非转基因鲤鱼高 D．将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌或酵母菌的基因组中生产的凝乳酶活性可能不同 10．(23-24高二下·四川凉山州·期末)“黑寡妇”蜘蛛吐出的丝强过钢丝，用其吐出的丝织成的布比制造防弹背心所用纤维的强度高很多。科学家把“黑寡妇”蜘蛛体内蜘蛛丝蛋白基因，导入到山羊细胞内，培育出转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器，获得了坚韧程度极强的蜘蛛丝蛋白，取名为“生物钢”，操作过程如下。下列说法错误的是（　　）    A．丝蛋白基因会伴随受体细胞分裂而自我复制 B．可用PCR 等技术检测目的基因是否表达 C．“蜘蛛羊”乳腺生物反应器生产的“生物钢”不会造成环境污染 D．乳腺生物反应器具有产量高、成本低、产品质量好和易提取等优点 11．(24-25高二下·四川泸州·期末)苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白与豇豆胰蛋白酶抑制剂杀虫机理不同，后者能特异性与棉铃虫的胰蛋白酶结合。在转Bt蛋白基因抗虫棉作物种植区发现棉铃虫种群抗性基因频率显著上升。下列有关叙述错误的是（　　） A．Bt抗虫蛋白与豇豆胰蛋白酶抑制剂可能只会造成棉铃虫死亡而对人畜无害 B．为防止转基因花粉的传播，可将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入棉花细胞 C．种植含两种基因的转基因棉花可减缓棉铃虫种群抗性基因频率上升的速度 D．将转基因棉花与普通棉花混种会加快棉铃虫种群抗性基因频率上升的速度 12．(24-25高二下·四川南充·期末)研究者将抗虫融合基因cv与耐草甘膦基因ce构建在同一T-DNA中，并利用农杆菌转化法导入水稻细胞，培育出了抗虫耐除草剂的转基因水稻。下列叙错误的是（    ） A．农杆菌Ti质粒上的T-DNA，能整合到受体细胞的染色体DNA上 B．转基因水稻种植时可减少农药的使用，进而降低农药对环境的污染 C．将转基因水稻与普通水稻间行种植的主要目的是增加基因的多样性 D．转基因水稻获批上市后，必须严格实行标识制度，保证消费者的知情权 13．(24-25高二下·四川广元·期末)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面展示出了广阔的应用前景。下列叙述错误的是（　　） A．我国转基因抗虫棉的成功培育，实现了基因由微生物向植物的定向转移 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，可培育出产低乳糖牛乳的奶牛 C．通过构建基因工程菌，可利用发酵技术大量生产加工转化糖浆所需的淀粉酶 D．膀胱生物反应器优于乳腺生物反应器的方面包括不受性别、发育时期等限制 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题16 基因工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具、DNA的粗提取与鉴定 考点02 基因工程的基本操作程序 考点02 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具、DNA的粗提取与鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·四川绵阳·期末)链霉菌是抗生素的主要产生者。科学家期望通过基因工程改造链霉菌，提高其活性物质的表达量。下列说法正确的是（　　） A．在基因工程的基本操作过程中，只能通过PCR获取目的基因 B．为避免目的基因与载体反向连接，可用2种限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段 C．若选用的限制酶识别序列为5'-↓GATC-3'，切割后产生的是平末端 D．若通过蛋白质工程获得新的抗生素，第一步操作应该是获取目的基因 【答案】B 【详解】A、获取目的基因的方法包括PCR扩增、从基因组文库中直接分离、化学合成法等，并非只能通过PCR，A错误； B、使用两种不同的限制酶切割载体和目的基因，可产生不同的黏末端，确保目的基因定向插入载体，避免反向连接，B正确； C、识别序列5'-↓GATC-3'的切割位点在G前，切割后产生的是黏性末端（如Sau3AⅠ酶切后形成5'-GATC-3'的黏性末端），而非平末端，C错误； D、蛋白质工程的第一步是根据预期蛋白质的功能设计结构，而非直接获取目的基因，D错误。 故选B。 2．(24-25高二下·四川南充·期末)几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示）如下表所示。据表推测，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 A．限制酶使特定核苷酸序列特定部位的磷酸二酯键断开 B．BamHⅠ和Bel Ⅰ识别的核苷酸序列都能被Sau3A Ⅰ识别 C．SmaⅠ切割DNA 片段后形成的黏性末端，可用E.coli DNA连接酶连接 D．BamHⅠ切割产生的DNA片段能与BelⅠ切割产生的DNA片段相连接 【答案】C 【分析】限制性核酸内切酶主要作用于DNA分子的磷酸二酯键，用同种核酸内切酶处理不同的DNA分子后产生相同的黏性末端，黏性末端之间的碱基可以进行互补配对，在DNA连接酶的作用下能够连接。 【详解】A、限制酶通过识别特定核苷酸序列，断开磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端，A正确； B、BamHⅠ的识别序列为GGATCC，BclⅠ为TGATCA，均包含Sau3AⅠ的识别序列GATC，因此两者均可被Sau3AⅠ识别，B正确； C、SmaⅠ切割后产生平末端，平末端需T4 DNA连接酶，C错误； D、BamHⅠ切割后黏性末端为GATC，BclⅠ为GATC，两者互补，可通过连接酶连接，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·四川泸州·期末)由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E，下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述错误的是（　　） A．不直接用载体P来构建基因表达载体，是因它缺少目的基因表达所需的启动子和终止子 B．可以选择EcoRV对载体P进行酶切，再用T4DNA连接酶连接目的基因和载体P C．为使载体E与目的基因正确连接，可选XhoⅠ和PstI对重组载体P和载体E进行酶切 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明目的基因在受体细胞中已成功表达 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】A、由图可知，不直接选择P构建基因表达载体是因为它不含启动子与终止子，A正确； BC、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，连接平末端只能用T4DNA连接酶，BC正确； D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。 故选D。 4．(24-25高二下·四川凉山州·期末)某同学拟用限制酶（酶1-酶4）等将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列关于重组表达载体构建的方案，合理且效率最高的是（    ）    A．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接 B．质粒和目的基因都用酶2切割，用E．coliDNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coliDNA连接酶连接 D．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接 【答案】A 【分析】重组DNA技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，A符合题意； B、质粒和目的基因都用酶2切割，用E. coli DNA连接酶连接，该操作可以构建目的基因表达载体，但可能会导致目的基因反向连接和目的基因和质粒的自身环化，因而效率低，B不符合题意； C、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，C不符合题意； D、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，D不符合题意。 故选A。 5．(24-25高二下·四川绵阳·期末)图是家庭版DNA的粗提取的过程。若该实验得到的DNA鉴定效果不明显，则可能的原因不包括（　　） A．实验所选用的材料中DNA含量较低 B．实验过程中酒精未预冷时，DNA被降解 C．粗提取的DNA中含有较多的杂质 D．鉴定时所用甲紫溶液失效，且未沸水浴加热 【答案】D 【分析】DNA 在不同浓度的NaCI溶液中溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，而在0.015mol/L的NaCI溶液中溶解度较高，DNA不溶于酒精，而细胞中 的许多其他物质可溶于酒精溶液，利用这些特性，可以提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A \实验材料中DNA含量低，提取的DNA少，会使鉴定效果不明显，可能是DNA鉴定效果不明显的原因，A不符合题意； B、酒精未预冷，相应酶的活性相对较高，可能会导致DNA被降解，可能是DNA鉴定效果不明显的原因，B不符合题意； C、粗提取的 DNA 含较多杂质，会干扰鉴定，使鉴定效果不明显，可能是DNA鉴定效果不明显的原因，B不符合题意； D、甲紫溶液不是 DNA 鉴定的试剂，可能不是DNA鉴定效果不明显的原因，D符合题意。 故选D。 6．(24-25高二下·四川成都蓉城联盟·期末)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．经粗提取得到的DNA用二苯胺鉴定呈蓝色，菠菜可以用作提取材料 B．当温度上升到72℃时，耐高温的DNA聚合酶使脱氧核苷酸连接到引物的5'端 C．PCR反应体系中脱氧核苷酸（dNTP）既是DNA扩增的原料，又为该过程提供能量 D．利用电泳对DNA进行鉴定时，要留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 【答案】B 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、DNA用二苯胺鉴定呈蓝色，新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花或猪肝均可作为提取DNA的实验材料，A正确； B、当温度上升到72℃时，耐高温的DNA聚合酶使脱氧核苷酸连接到引物的3'端，B错误； C、PCR反应体系中脱氧核苷酸（dNTP）是DNA扩增的原料，其水解为PCR反应提供能量，C正确； D、利用电泳对DNA进行鉴定时，要留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物，D正确。 故选B。 7．(24-25高二下·四川广元·期末)XhoI和SalI是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．泳道①是使用SalI处理后的酶切产物的电泳结果 B．每种酶切割DNA的部位是特定核苷酸之间的磷酸二酯键 C．泳道②最上方条带是XhoI处理后最大的DNA片段 D．同时使用SalI和XhoI处理，酶切产物的电泳结果为7个条带 【答案】D 【详解】A 、SalⅠ 有 3 个酶切位点，切割后产生 4 种片段，与泳道①条带数匹配，A 正确； B、限制酶切割 DNA 特定核苷酸间的磷酸二酯键，B 正确； C 、XhoⅠ 有 2 个酶切位点，切割后产生 3 种片段，泳道②最上方条带是最大 DNA 片段，C 正确； D、同时用 SalⅠ 和 XhoⅠ 处理，SalⅠ 切 3 处、XhoⅠ 切 2 处，共产生 6 个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带，如果其中有片段分子大小相同，则条带数目小于6条，D错误。 故选D。 8．(23-24高二下·河南商丘商师联盟·期末)“工欲善其事，必先利其器”，基因工程需用到多种工具。下列关于基因工程的基本工具的说法，错误的是（    ） A．限制酶将DNA分子水解为脱氧核糖核苷酸 B．限制酶主要从原核生物中分离纯化 C．被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的 D．动植物病毒、噬菌体也可以用作基因工程中的载体 【答案】A 【分析】限制酶能够识别DNA中特定的核苷酸序列，切割的部位是核苷酸之间的磷酸二酯键，从而将DNA分子切成两段，出现黏性末端或平末端。 【详解】A、限制酶作用于DNA分子的磷酸二酯键，将DNA切割成特定片段（黏性末端或平末端），而非彻底水解为脱氧核糖核苷酸。彻底水解DNA需要DNA酶，A错误； B、限制酶主要来源于原核生物，是原核生物防御外源DNA入侵的机制，B正确； C、天然质粒通常需经过人工改造（如添加标记基因、限制酶切位点等）才能作为载体使用，C正确； D、除质粒外，动植物病毒（如腺病毒）、噬菌体（如λ噬菌体衍生物）也可作为基因工程的载体，D正确。 故选A。 9．(24-25高二下·四川广安·期末)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA．用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒粗提取和鉴定的叙述，不正确的是（　　） A．可利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精的原理初步分离DNA和蛋白质 B．用预冷的酒精溶液析出DNA可防止DNA的结构被破坏 C．通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 D．根据电泳结果推测质粒上分别有一个限制酶Ⅰ和Ⅲ的切割位点，有两个限制酶Ⅱ切割位点 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、和构象等有关。电泳技术可以根据相对分子质量大小把不同的DNA分开，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖凝胶电泳中移动速率越慢。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此可用此原理初步分离DNA和蛋白质，A正确； B、低温可抑制酶的活性，因此用预冷的酒精溶液析出DNA可防止DNA的结构被破坏，B正确； C、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，电泳结果中的这些条带通常需要在紫外线下观察和照射才能显示出来，因此需要紫外灯照射，C正确； D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，限制酶Ⅲ处理后有两个条带，说明质粒上有两个限制酶Ⅲ切割位点，D错误。 故选D。 10．(24-25高二下·四川遂宁·期末)下列关于DNA粗提取和鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．二苯胺试剂可以作为鉴定DNA种类的试剂，使用时需要用到沸水加热 B．PCR利用热变性原理和DNA的半保留复制原理在体内外进行DNA扩增 C．DNA分子被电泳缓冲液中的核酸染料染色后，能直接利用肉眼观察到 D．可根据待电泳的DNA分子大小对凝胶所用琼脂糖溶液的浓度进行调整 【答案】D 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、二苯胺试剂用于鉴定DNA的存在，在沸水浴条件下呈现蓝色，但无法区分不同种类的DNA，A错误； B、PCR技术利用热变性原理（高温使DNA解链）和半保留复制原理，但该过程完全在体外进行，B错误； C、电泳后的DNA片段需用核酸染料（如溴化乙锭）染色，并在紫外灯下观察荧光条带，肉眼无法直接看到，C错误； D、琼脂糖凝胶浓度影响DNA迁移速率，DNA分子较大时需用低浓度凝胶以便分离，较小则用高浓度凝胶，因此需根据DNA分子大小调整凝胶浓度，D正确。 故选D。 11．(24-25高二下·四川凉山州·期末)DNA的粗提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中的重要程序，下列叙述正确的是（    ） A．DNA不溶于NaCl溶液，但可以溶于酒精 B．PCR扩增过程中，缓冲液中需要加入Ca2+以激活DNA聚合酶 C．对PCR扩增得到的DNA进行电泳后，加入核酸染料在紫外灯下进行观察 D．电泳过程中，DNA相对分子质量越小，移动的速度越快 【答案】D 【详解】A、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，不溶于酒精，A错误； B、真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活，因此，PCR反应缓冲液中一般需要加入Mg2+以激活DNA聚合酶，B错误； C、配制凝胶时加入核酸染料，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合后，再进行电泳，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，C错误。 D、在琼脂糖凝胶中，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA相对分子质量越小，移动的速度越快，D正确。 故选D。 12．(24-25高二下·四川凉山州·期末)2020年诺贝尔化学奖授予在CRISPR/Cas9基因编辑技术领域作出贡献的两名女科学家。基因组编辑CRISPR-Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的向导RNA构成，在向导RNA引导下，Cas9蛋白与靶序列结合并将DNA双链切断，从而完成对目的基因的编辑。下列叙述错误的是（    ） A．推测向导RNA序列越短，越容易导致编辑位点出错 B．将基因组编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德 C．Cas9蛋白的作用与DNA连接酶相同 D．基因编辑作物推广需通过生态安全性和伦理审查 【答案】C 【详解】A、由于非基因编辑对象也可能含有与向导RNA配对的碱基序列，故向导RNA的序列越短，越容易导致编辑对象出错而造成“脱靶”，A正确； B、治疗性克隆以疾病治疗为目的（如器官移植），不涉及胚胎发育成个体，符合伦理规范，B正确； C、Cas9蛋白切割DNA双链，属于限制酶功能；DNA连接酶催化磷酸二酯键形成，两者作用相反，C错误； D、基因编辑作物可能影响生态系统稳定性，且涉及伦理争议，需严格审查，D正确。 故选C。 13．(24-25高二下·四川南充·期末)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”的实验，说法正确的是（    ）    A．加入溶液甲的目的是溶解上清液中的DNA B．溶液乙为二苯胺试剂，加入后立即呈蓝色 C．该实验不可用蛙的成熟红细胞代替实验材料 D．粗提取物与双缩脲试剂也会发生显色反应 【答案】D 【详解】A、溶液甲为预冷的酒精溶液，DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，加入溶液甲的目的是析出上清液中的DNA，A错误； B、DNA溶液加入二苯胺试剂必须在沸水浴条件下才呈现蓝色，B错误； C、蛙的成熟红细胞有细胞核，内有DNA分子，可代替实验材料，C错误； D、粗提物中会有少量蛋白质，能与双缩脲试剂也会发生显色反应，D正确。 故选D。 二、解答题 14．(24-25高二下·四川达州普通高中·期末)为了探究X蛋白的特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质粒中LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3、P4表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)据图1分析，应选用四种限制酶中的_______和_______切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。在表达过程中，启动子是______识别并结合的部位。 (2)利用PCR技术获取X蛋白基因时，在反应体系中，除了应加入缓冲液、Mg2+、X蛋白基因所在模板DNA、四种脱氧核苷酸外，还必须加入________和足量的两种引物。引物的设计是PCR中特别重要的一个环节，为保证X蛋白基因能正确插入载体，除选择引物P1外，还需要选择引物______（填“P2”或“P3”或“P4”），并在该引物_______（填“5'”或“3'”）端增加碱基序列5'-_______-3'。 (3)琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，主要与不同DNA分子的______有关。对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减少非特异性条带的产生，可适当_____（填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。 (4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，可将重组质粒与经Ca+处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为_______的菌落为目标菌落，原因是______。 【答案】(1) Mun Ⅰ Xho Ⅰ RNA聚合酶 (2) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） P3 5' GAATTC (3) 大小和构象 提高 (4) 白色 重组质粒中不含有LacZ基因，不能编码产生β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 【详解】（1）据图可知，Sal I位于终止子外，也不能选用，EcoR I和Mun I、EcoR I和Xho Ⅰ均会切掉Cry2基因，故只能选用Mun I和Xho Ⅰ切割质粒，产生不同的黏性末端，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。在表达过程中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。 （2）利用PCR技术获取X蛋白基因，需要在反应体系中加入缓冲液、Mg2+、X蛋白基因所在模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、足量的两种引物。根据图中X蛋白基因的编码链的方向及质粒中启动子方向可知，需要将编码链的5′端靠近启动子，由于X蛋白基因中含有Mun Ⅰ的酶切位点，所以不能用Mun Ⅰ进行切割，但是EcoR I与Mun Ⅰ切割产生的黏性末端相同，所以可以在设计引物的时候添加EcoRI的识别序列（-GAATTC-），同时也不能选用含有Sal I识别序列的引物，所以还需要选择引物P3，并在其5'端增加碱基序列5'-GAATTC-3'。 （3）不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同，所以可以通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来。可适当提高PCR中复性过程的温度，可减少引物和模板不完全配对现象，从而减少非特异性条带的产生。 （4）分析题意可知，LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，重组质粒中导入了目的基因，则重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生的β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质，培养一段时间后，培养基中颜色为白色的菌落为目标菌落。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．(24-25高二下·四川广元·期末)为改良棉花抗虫性，科研人员将苏云金杆菌（Bt）的Cry1Ac基因与棉花叶绿体基因表达载体连接，导入棉花体细胞。下列叙述错误的是（　　） A．选择叶绿体基因作为目的基因载体，可避免花粉传播造成的基因污染 B．构建表达载体时需在CrylAc基因两端添加启动子和终止子以调控转录 C．显微注射法适用于动物细胞，而农杆菌转化法适合双子叶植物幼嫩组织 D．以Cry1Ac基因转录的mRNA作为模板进行PCR扩增，可获得大量目的基因 【答案】D 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半 保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与 反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、 叶绿体基因组属于细胞质遗传，花粉中几乎不含叶绿体，因此将目的基因导入叶绿体可避免通过花粉传播造成基因污染，A正确； B、基因表达载体需要包含启动子和终止子以调控基因的转录，因此构建载体时需在Cry1Ac基因两端添加这些调控序列，B正确； C、显微注射法适用于动物细胞（如受精卵），而农杆菌转化法主要适用于双子叶植物和部分单子叶植物的幼嫩组织（因受伤部位易被农杆菌感染），C正确； D、PCR扩增需以DNA为模板，而mRNA需通过逆转录生成cDNA后才能作为模板进行扩增。直接以mRNA为模板无法进行PCR，D错误。 故选D。 2．(24-25高二下·四川凉山州·期末)研究人员利用农杆菌转化法将大豆中的耐盐碱基因（GsERF6基因）转入水稻细胞中，培育高表达GsERF6基因的耐盐碱水稻，图甲为研究人员构建的GsERF6基因表达载体，其中新霉素基因是用于筛选转化的植物细胞的标记基因；图乙为研究人员对转化的植物细胞进行目的基因检测的电泳图谱，其中M：DNAmarker；-：阴性对照；+：阳性对照；1：转基因水稻DNA。下列叙述错误的是（    ）    A．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上 B．阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6 C．新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的同一条链上 D．据电泳图推断目的基因片段大小约为1000bp，尚需测序以确定其是否为目的基因 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，A正确； B、实验的目的是对转化的植物细胞进行目的基因检测，阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6，B正确； C、转录的方向从启动子到终止子，结合图可知，新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的不同链上，C错误； D、根据阳性对照组电泳结果可知，目的基因的长度大约为1000bp，1号电泳结果与阳性对照组相同，说明其长度与目的基因相同，但要确定是否是目的基因，还需要进行测序，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·四川广元·期末)PCR引物的3端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法正确的是（　　） A．图示环节所需的温度比上一个环节高 B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到5'端 C．耐高温的DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成 D．经过1个循环后，获得的子代DNA的两条单链长短相同 【答案】C 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在体外复制特定的DNA的核酸合成技术。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Tag 酶）。 【详解】A、图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A错误； B、在PCR扩增中，脱氧核苷酸只能连接在3'端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端，B错误； C、耐高温的 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）能够催化相邻脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，从而将 dNTP 连接起来，合成新的 DNA 链，C正确； D、经过 1 个循环后，获得的子代 DNA 中，一条链是原来的模板链，另一条链是新合成的链，由于引物结合位置等因素，两条单链长短不一定相同，D错误。 故选C。 4．(24-25高二下·四川绵阳·期末)质粒K中含有的β-半乳糖苷酶基因。将质粒K导入大肠杆菌细胞后，编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal，产生蓝色物质，使平板中出现蓝色菌落，如下图所示。某课题组以该质粒为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（　　） A．若X-gal高温敏感，应在培养基高压蒸汽灭菌后，再加入X-gal B．若筛选平板中不含X-gal，则生长出的白色菌落不能确定为目的基因所表达的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．该筛选法只能确定编码β-半乳糖苷酶的基因被破坏，而不能确定是目的基因的表达 【答案】C 【详解】A、高压蒸汽灭菌法温度较高，若X-gal高温敏感，为避免其失活，应在培养基高压蒸汽灭菌后，冷却到适宜温度时再加入X-gal ，A正确； B、筛选平板中不含X-gal，就无法通过是否产生蓝色菌落来判断β−半乳糖苷酶基因是否被破坏（从而无法判断是否导入重组质粒 ），所以生长出的白色菌落不能确定为目的基因所表达的菌株，B正确； C、质粒K中含卡那霉素抗性基因和β−半乳糖苷酶基因两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落，说明β−半乳糖苷酶基因被破坏（插入了目的基因 ），但不能直接确定目的基因一定表达，因为目的基因可能导入但未表达，C错误； D、该筛选法是依据β−半乳糖苷酶能否分解X-gal产生蓝色物质来判断，只能确定编码β−半乳糖苷酶的基因是否被破坏（若破坏则不能产生蓝色菌落 ），而不能确定目的基因是否表达，因为目的基因表达与否不影响β−半乳糖苷酶基因是否被破坏这一筛选依据，D正确。 故选C。 5．(24-25高二下·四川绵阳·期末)甲植物因细胞核中具有特异性DNA序列(a)而具有耐盐碱效应；乙植物因细胞质中具有特异性DNA序列(b)而具有高产效应。科研人员将甲、乙两种植物体细胞杂交，获得了耐盐碱、高产再生植株，并通过PCR技术来鉴定。已知M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。下列有关叙述错误的是（　　） A．植物体细胞杂交技术打破了生殖隔离，实现了远缘杂交育种 B．鉴定时，提取、纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板 C．总DNA加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；同理扩增序列b D．产物电泳后，若分别在凝胶中均出现预期的2个条带，可确定再生植株来自杂种细胞 【答案】D 【详解】A、植物体细胞杂交技术可以将不同种的植物细胞融合，打破了生殖隔离，实现了远缘杂交育种，A正确； B、PCR需以总DNA为模板，总DNA包含核DNA和细胞质DNA，B正确； C、序列a（核DNA）和b（质DNA）需分别用M1/M2和N1/N2引物扩增，需分两次PCR反应，C正确； D、每个PCR反应仅扩增一个目标序列，应各出现1个条带，而非2个条带，若两次PCR均成功，总条带数为2，D错误。 故选D。 6．(24-25高二下·四川达州普通高中·期末)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，某科研人员采用农杆菌转化法将甜蛋白基因（含有1178个碱基对）导入番茄，希望能提高番茄甜味，改善果实品质。甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切位点如图1、2所示；提取培育出的转基因番茄细胞中的DNA，依据甜蛋白基因两端的特异性序列设计引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，结果如图3。下列叙述错误的是（    ） A．PCR扩增甜蛋白基因时，应该根据基因两端的3'端序列设计引物 B．选择限制酶XbaI和EcoRI切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA片段 C．可用含有卡那霉素的培养基对成功导入表达载体的农杆菌进行筛选 D．仅由图3电泳结果不能判断1、2、3、4号转基因番茄是否培育成功 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、PCR扩增时，引物需与模板链的3'端结合以启动子链沿延伸，因此应根据基因两端的3'端序列设计引物，A正确； B、若选择XbaⅠ和EcoRⅠ切割：甜蛋白基因会被完整切割（XbaⅠ切左侧，EcoRⅠ切右侧），但质粒中XbaⅠ和EcoRⅠ的切割位点位于启动子和终止子之间，切割后插入目的基因会导致目的基因反接，无法正常转录，正确选择应为XbaⅠ和HindⅢ，能使目的基因与载体正确连接，B错误； C、Ti质粒含卡那霉素抗性基因，可作为标记基因，成功导入表达载体的农杆菌能在含卡那霉素的培养基上存活，从而实现筛选，C正确； D、图3电泳结果仅能说明转基因番茄中含有甜蛋白基因片段，但无法证明该基因是否转录和翻译（即是否表达出甜蛋白），因此不能直接判断培育成功，D正确。 故选B。 二、解答题 7．(24-25高二下·四川乐山·期末)金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）是由金黄色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的细菌毒素，是一种强效的免疫激活剂。在对改造后的病毒SEA基因进行DNA测序时，发现其第133位点碱基发生了点突变，由A变为G（A→G）。现采用重叠延伸PCR定点诱变技术纠正在克隆SEA基因过程中发生的点突变，流程见下图。 (1)上述过程中会用到4种引物，引物的作用是_____。一般引物序列不能过短，原因是_____。为了实现突变纠正，引物2和引物3需部分碱基序列配对，引物2碱基序列为：（划线处为需配对序列，大写处为需纠正碱基）。请写出引物3需配对的碱基序列_____。 (2)上述过程中经过PCR1和PCR2步骤，得到的产物经过变性和杂交后会得到_____种杂交产物，_____链（填图中标号）配对的杂交产物可直接进行一代扩增得到SEA基因。若通过电泳鉴定得到SEA基因并回收后进行PCR3，该过程需要选择引物_____（填图中标号）进行扩增。 (3)若要将得到的SEA基因导入受体细胞，最核心的工作是构建基因表达载体。基因表达载体除含有目的基因以外，还有_____、终止子和位于基因上游的启动子。启动子的作用是_____。 (4)将表达载体导入受体细胞时，若选择某大肠杆菌作为受体细胞，则需要Ca2+处理。该试剂处理的目的是_____。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 引物过短，特异性较低 5’-TAAAGCTGTTCCCTGCAA-3’ (2) 2 a和d 1和4 (3) 标记基因、复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位 (4)使细胞处于一种能吸收外界周围环境中DNA分子的生理状态 【分析】重叠延伸PCR定点诱变技术重是一种常用的定点诱变技术，通过设计特异性引物，在PCR扩增过程中引入目标突变（或纠正已有突变），最终获得含特定序列的DNA片段。核心步骤包括：设计引物、第一轮PCR（扩增含重叠区的两段片段）、变性与杂交、第二轮PCR（扩增完整目的基因）。 【详解】（1）引物是一小段单链DNA，其作用是 使DNA聚合酶能够从引物的 3’端开始连接脱氧核苷酸。引物序列过短会导致其与模板DNA的结合特异性低，容易发生非特异性结合，从而影响PCR扩增的准确性。根据引物2基因序列（5’-AAGTCTGAATTGCAGGGAACAGCTTTAG-3’），引物3需要与划线序列互补配对，且方向为5’到3’，因此引物3的序列为5’-TAAAGCTGTTCCCTGCAA-3’。 （2）由图可知，经过PCR1得到a链和b链，PCR2得到c链和b链，经变性和杂交后可得到a和d，b和c形成的杂交产物。配对的杂交产物子链需要进一部延伸得到完整的SEA基因，而子链延伸方向为5’到3’方向，因此a和d配对的杂交产物可直接进行一代扩增得到SEA基因。PCR3的目的是扩增完整的 SEA 基因，需选择覆盖目的基因两端的引物，即引物1和引物4。 （3）基因表达载体的组成除目的基因外，还需标记基因（用于筛选含重组载体的细胞）、终止子和启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动目的基因转录出mRNA。 （4）Ca²⁺处理大肠杆菌的目的是使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 8．(24-25高二下·四川泸州·期末)我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入棉花细胞培育出了转基因抗虫棉。请回答下列问题： (1)利用PCR技术获得了大量Bt基因，PCR反应需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是_____。 (2)Bt基因A端和B端的部分序列如图所示，为了使Bt基因正确插入到Ti质粒中，设计引物时需要在A端和B端的引物的5＇端分别添加图中_____限制酶的识别序列。结合目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列（至少写16个碱基）。 引物1（A端的引物）：5＇_____3＇，引物2（B端的引物）：5＇_____3＇。 (3)据图分析，用Ca2+处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加_____的培养基中筛选得到含基因表达载体的农杆菌，再将重组农杆菌侵染棉花愈伤组织，在添加_____的培养基中筛选出成功将Bt基因整合到染色体DNA上的棉花植株。 (4)可以在分子水平上采用_____的方法来检测Bt基因是否成功表达。 【答案】(1)激活 Taq 酶（或为 Taq 酶提供激活环境 ） (2) MunI和XmaI CAATTGTCTGTTGAAT CCCGGGCCTGGATGAT (3) 潮霉素 卡那霉素 (4)抗原-抗体杂交 【分析】先通过 PCR 扩增获得含 Bt 基因的 PCR 产物，利用限制酶切割载体与该产物，经连接构建含 Bt 基因的重组 Ti 质粒；再借助农杆菌，将重组 Ti 质粒的 T - DNA（含 Bt 基因等 ）转入植物细胞，使 Bt 基因整合到植物细胞染色体 DNA 上；最后通过植物组织培养技术，让被转化的植物细胞脱分化、再分化，发育成含 Bt 基因、具备相应特性（如抗虫 ）的转基因生物棉植株。 【详解】（1）PCR反应中，Taq酶（热稳定DNA聚合酶 ）发挥作用需要Mg2+，Mg2+能激活Taq酶，为其提供适宜的催化环境，保证DNA 扩增反应顺利进行 。所以PCR反应缓冲溶液中添加Mg2+的作用是激活Taq酶。 （2）要将TmAFP基因插入Ti质粒，需用限制酶切割目的基因和质粒，使二者产生相同黏性末端便于连接。从图中可知，Ti质粒上T-DNA区域的MunI和XmaI限制酶切割位点可用于插入目的基因，因为NheI会破坏所有标记基因，EcoRI会破坏启动子序列，所以选择剩下两种限制酶。 引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而进行DNA子链的合成。引物1设计A端引物要引入MunI限制酶识别序列。已知MunI识别序列为5′-CAATTG-3′，且要和下端链互补配对，所以引物1（A端的引物）为5′-CAATTGTCTGTTGAAT-3′。 引物2设计B端引物要引入XmaI限制酶识别序列。XmaI识别序列为5′-CCCGGG-3′，且要和上面的链碱基互补配对，所以引物2（B端的引物）为5′-CCCGGGCCTGGATGAT-3′。 （3）用Ca2+处理农杆菌获得感受态细胞，与基因表达载体混合转化后，在添加潮霉素的培养基中筛选，因载体含潮霉素抗性基因，可得到含基因表达载体的农杆菌 。重组农杆菌侵染棉花愈伤组织后，在添加卡那霉素的培养基中筛选，可得到成功将Bt基因整合到染色体DNA 上的棉花植株，因T−DNA 整合后，卡那霉素抗性基因被破坏，在含卡那霉素的培养基上不长的就是重组质粒。 （4）分子水平检测 Bt 基因表达用抗原-抗体杂交法。基因表达包括转录和翻译，检测Bt基因是否成功表达，即检测是否产生相应的毒蛋白（Bt基因表达产物 ）。抗原-抗体杂交技术利用抗原与抗体的特异性结合，若有杂交带出现，说明目的基因成功表达出蛋白质，所以在分子水平上采用抗原 - 抗体杂交的方法检测，故答案为抗原-抗体杂交。 9．(24-25高二下·四川遂宁·期末)粒细胞集落刺激因子（G-CSF）主要由巨噬细胞等细胞产生，是一种能促进血细胞生成的蛋白质类药物。科学家利用图中质粒构建基因表达载体并将其导入大肠杆菌，获得生产重组人G-CSF的工程菌，以期解决G-CSF药源不足且昂贵的难题，请回答下列问题： （注：LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，这种以颜色不同为依据直接筛选含基因表达载体菌体的方法称为“蓝白斑”法。图中几种限制酶的识别序列和切割位点为：EcoRⅠ：5'—G↓AATTC—3'，SmaⅠ：5'—CCC↓GGG—3'，BamHⅠ：5'—G↓GATCC—3'，SalⅠ：5'—G↓TCGAC—3'。） (1)获取G-CSF基因：从人体巨噬细胞中提取总RNA后，通过____过程获得cDNA。据图1分析，PCR扩增G-CSF基因时所需的引物组合是____，在其中一种引物的____（填“3'端”或“5'端”）需添加BamHⅠ识别序列和启动子序列。启动子的作用是____。G-CSF基因片段扩增N次，需消耗引物共____个。 (2)构建基因表达载体：为确保G-CSF基因正确插入图2的载体中，需选择的限制酶组合是____。假设G-CSF基因a链的碱基序列为5'—TTTGAGACC……—3'，启动子a链的碱基序列为5'—GCTGCATG—3'，分析G-CSF基因上游引物从5'到3'方向的编号为第1、8、18的三个碱基分别是____（填写字母）。 (3)将目的基因导入受体细胞：先用____处理受体细胞，然后将大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了____的培养基上筛选出____色的菌落即为工程菌。 【答案】(1) 逆转录 ②③ 5＇端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 2N+1-2 (2) BamHⅠ和SalⅠ GCG (3) Ca²⁺ 氨苄青霉素和X－gal 白 【分析】基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）从人体巨噬细胞中提取总RNA后，通过逆转录过程获得cDNA。据图1分析，DNA 复制方向是从 5'端到 3'端，要扩增 G - CSF 基因，根据图 1 中基因的方向，所需的引物组合是②③，因为 DNA 聚合酶只能从 5'→3'方向延伸 DNA 链，所以要在其中一种引物（这里以与模板链 3'端互补的引物为例）的 5'端需添加 BamHⅠ识别序列和启动子序列 。启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA 。PCR 技术扩增目的基因，扩增 N 次后，DNA 总数为2N个，新合成的 DNA 链数为2N+1- 2条，由于每条新链（合成的链）都需要一个引物，所以需消耗引物共2N+1- 2个。 （2）为确保 G - CSF 基因正确插入图 2 的载体中，结合图1和图2，要保证目的基因能正确表达，需选择的限制酶组合是 BamHⅠ和 SalⅠ。已知 G - CSF 基因 a 链的碱基序列为 5'-TTTGAGACC……-3'，启动子 a 链的碱基序列为 5'—GCTGCATG - 3'，上游引物要与模板链（这里是启动子和 G - CSF 基因连接后的模板链）3'端互补配对，还需要添加 BamHⅠ的识别序列，所以 G - CSF 基因上游引物的碱基序列为5'—GGATCCGCTGCATGTTTG—3'，所以 G - CSF 基因上游引物从 5°到 3'方向的编号为第 1、8、18 的三个碱基分别是 G、C、G。 （3）将目的基因导入大肠杆菌等微生物细胞时，先用Ca2+处理受体细胞，使其成为感受态细胞 。图 2 质粒中含有抗氨苄青霉素基因，所以要将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X－gal的培养基上筛选。由于用 BamHⅠ和 SalⅠ切割质粒后破坏了 LacZ 基因，含有重组质粒的大肠杆菌不能产生β - 半乳糖苷酶，不能催化无色物质 X - gal 产生蓝色物质，所以筛选出白色的菌落即为工程菌。 10．(24-25高二下·四川射洪中学·期末)低温冻害是草莓冬季生产关键期的主要气象灾害。为了培育出抗冻草莓，研究人员获得了青稞的抗冻物质脱水素的编码序列，构建重组DNA后，以农杆菌转化法介导最终培育得到抗冻草莓。下图是基因表达载体，下表是几种常见抗生素的作用机理。 注：T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似 抗生素种类 抗生素作用机理 潮霉素 作用于细菌、动植物细胞，抑制核糖体作用 卡那霉素 链霉素 羧苄青霉素 抑制细菌细胞壁合成，杀死细菌；分解产物是生长素和萘乙酸，可以刺激愈伤组织的增殖 请回答相关问题： (1)获取目的基因：根据脱水素的编码序列，先通过_______方法获得脱水素基因，该方法得到的基因与青稞基因组文库中的脱水素基因结构上的区别主要是_______；为了提高目的基因与载体的连接效率，从目的基因的角度分析，可以采取哪些措施？_______（答出1点即可）。 (2)构建基因表达载体：脱水素基因（其部分序列如图1所示），基因表达载体上的限制酶识别序列如图所示（如图2所示）已知脱水素除含有ECORⅠ和HindⅢ识别位点外，无其他限制酶识别位点。PCR扩增脱水素基因，需要合成的引物1的碱基序列为_______。 限制酶 EcoRⅠ HindⅢ BamHI SacⅠ 识别序列及切割位点 G↓ATTTC A↓AGCTT G↓GATCC G↓CTAAC (3)该基因表达载体缺少一个重要组件启动子，其作用是_______。 (4)受体细胞的转化与筛选。将重组Ti质粒导入处于_______的农杆菌后，需要先用含有_______的选择培养基对其进行筛选，然后将阳性农杆菌与草莓叶片共培养。完成转化后，需要先后使用_______和_______作为除菌剂和筛选剂，前者既能及时杀死农杆菌，又能最大限度地减少对刚转化形成的受体细胞的影响，后者可实现对_______的筛选。 (5)要检测脱水素基因是否成功表达，请说出利用的方法_______（答出1点）。 (6)转基因植株的再生和检测。含有目的基因的草莓叶片经过脱分化过程，叶片边缘形成愈伤组织，该组织经后续处理能够得到抗冻草莓幼苗，根本原因是由于愈伤组织细胞中含有_______和_______。 【答案】(1) 化学合成 无启动子、内含子等序列 提高浓度，两端形成不同黏性末端或目的基因两端有不同种限制性酶识别序列 (2)5’GCTAACCTAGTG3’ (3)被RNA聚合酶识别并结合，起始转录过程 (4) 感受态 卡那霉素 羧苄青霉素 潮霉素 转基因受体细胞 (5)利用抗原-抗体杂交技术检测是否合成了脱水素 (6) 草莓全套的遗传物质 脱水素基因 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取。方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）分析题意可知，若已知脱水素的编码序列，可以通过化学合成的方法获得脱水素基因；该方法得到的目的基因只有编码序列，故与基因文库中获取的基因结构上的主要区别是无启动子、内含子等非编码序列；为了提高目的基因与载体的连接效率，从基因的角度分析，可以采取提高浓度，两端形成不同黏性末端或目的基因两端有不同种限制性酶识别序列等措施。 （2）已知脱水素基因内部含有EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别位点，因此不能选用这两个酶；根据转录方向及基因表达载体上的终止子位置判断，引物1的5’端应加上SacⅠ的识别序列。因此引物1的碱基序列为5’GCTAACCTAGTG3’。 （3）该基因表达载体缺少启动子，启动子的功能为被RNA酶识别并结合，起始转录过程。 （4）将目的基因导入农杆菌等微生物细胞之前，需将微生物用钙离子处理，使其处于感受态；为进行初步筛选，可将农杆菌置于卡那霉素培养基上进行筛选，由于卡那霉素能够作用于细菌、动植物细胞，抑制核糖体作用，而质粒上含有卡那霉素抗性基因，可据此筛选阳性质粒；分析题意，此后加入的抗生素需要能及时杀死农杆菌，又能最大限度的减少对刚转化形成的受体细胞的影响，则需要加入的是羧苄青霉素；据图分析，重组质粒的T-DNA含有潮霉素抗性基因，因此选用潮霉素作为除菌剂，由于农杆菌已经不含潮霉素抗性基因，因此可以实现对于含目的基因的植物细胞的筛选。 （5）抗冻草莓转基因成功的标志是草莓细胞中合成了脱水素，因此要检测脱水素基因是否成功表达，可以用抗原-抗体杂交检测是否合成了脱水素。 （6）脱分化后的愈伤组织能够经过处理获得抗冻草莓幼苗，其中利用了组织培养技术，原理为植物细胞具有全能性，根本原因是愈伤组织中含有草莓全套的遗传物质；能够表现为抗冻，说明草莓种含有脱水素基因。 三、实验题 11．(24-25高二下·四川南充·期末)哺乳动物因缺失Fatl基因，无法合成ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶，进而导致无法自身合成ω-3多不饱和脂肪酸。科研工作者利用转基因技术将秀丽隐杆线虫的Fat1基因导入猪体内，以提高猪肉中ω-3多不饱和脂肪酸的含量，满足人们的需求。具体操作如下，eGFP基因可表达出绿色荧光蛋白。回答下列问题：    (1)利用PCR仪扩增Fatl基因时，选择的最佳引物是___________；常采用___________（方法）来鉴定PCR产物。 (2)为了将Fatl基因插入到载体中，扩增Fatl基因时，需在两种引物上分别加上___________两种限制酶的识别序列，选择其原因是___________。 (3)将构建好的Fat1基因表达载体导入猪的成纤维细胞最常用的一种方法是___________。 (4)将基因表达载体导入猪的成纤维细胞后，可采用___________技术从分子水平检测Fat1基因是否导入成功。若处理后的猪成纤维细胞检测到绿色荧光，________（填“能”或“不能”）代表目的基因导入成功，理由是___________。 【答案】(1) 引物1、引物4 琼脂糖凝胶电泳 (2) HindⅢ、PstI 防止目的基因和质粒自身环化；保证Fatl基因和eGFP基因都正常表达等 (3)利用显微注射将含有Fat1基因的重组质粒注入动物细胞 (4) PCR、抗原-抗体杂交等 不能 空载体导入也会使细胞发绿色荧光 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）对于PCR扩增，引物需要与目的基因两端的序列互补配对，相比于引物2和引物3，引物1和引物4片段更长，特异性更高，因此最佳引物是引物1和引物4。 鉴定PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳的方法，不同大小的DNA片段在凝胶中电泳的速率不同，从而可以对PCR产物进行鉴定。 （2） 观察，为了将Fatl基因插入到载体中，扩增Fatl基因时，需在两种引物上分别加上HindⅢ、PstI两种限制酶的识别序列。 选择这两种限制酶的原因是：用这两种限制酶切割载体和目的基因，能产生不同的黏性末端，便于载体和目的基因定向连接，防止载体和目的基因自身环化，保证Fatl基因和eGFP基因都正常表达等。 （3）将构建好的基因表达载体导入动物细胞（猪的成纤维细胞）最常用的方法是显微注射法。 （4）从分子水平检测目的基因是否导入成功，PCR、抗原-抗体杂交等。 若处理后的猪成纤维细胞检测到绿色荧光，不能代表目的基因导入成功。理由是：绿色荧光蛋白基因（eGFP基因）与目的基因（Fatl基因）一起构建在表达载体上，检测到绿色荧光只能说明表达载体导入成功，不能确定目的基因是否导入成功 ，空载体导入也会使细胞发绿色荧光。 12．(24-25高二下·四川广安·期末)哺乳动物体内一定含量的ω-3多不饱和脂肪酸（LCPUA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1，培育转fat-1基因家兔，其部分流程如图所示。请据图回答下列问题： (1)利用PCR扩增fat-1基因时，PCR的每次循环一般可分为三步，其中理论温度最低一步及其主要目的是________。若用PCR扩增fat-1基因时，初始fat-1基因的数量为m个，与a链结合的引物数：与b链结合的引物数=1：50，该体系扩增进行5轮循环后，与a链结合的引物刚好耗尽，则与a链结合的引物数量等于________条。 (2)在PEB-fat-1重组质粒中，确保重组质粒能在受体细胞中扩增的元件是________，该元件所在区域的序列容易解旋成单链，据此推测该区域中________碱基对所占的比例较高；质粒上启动子的作用是________。 (3)在构建PEB-fat-1重组质粒时，为确保fat-1基因按正确的方向插入，需要双酶切，还需要对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为b链，与b链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC（EcoRⅠ），则与a链结合的引物5'端需添加的限制酶识别序列为________，理由是________。 (4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用________技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，可能的原因是________。 【答案】(1) 复性，目的是使引物与模板DNA充分结合 31m (2) 复制原点 A-T RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (3) AAGCTT b链为转录的模板链，根据转录方向，与a链结合的引物5'端靠近终止子，应选用HindⅢ的识别序列AAGCTT (4) 抗原—抗体杂交 重组质粒缺少启动子和终止子，无法正常转录 【分析】本题围绕转基因家兔培育（基因工程 ） 展开，考查 PCR 原理、基因表达载体元件功能、酶切位点设计及基因表达检测，需关联基因工程核心步骤（扩增、载体构建、检测 ）与分子生物学基础。 【详解】（1）PCR 循环的三步是变性（高温解旋 ）、复性（中温，引物结合模板 ）、延伸（高温，子链合成 ）。复性温度最低 ，目的是让引物与模板 DNA 互补配对结合 。初始 fat-1 基因数量为 m ，与 a 链结合的引物数 : b 链引物数 = 1:50 。设与 a 链结合的引物数为 x ，则 b 链引物数为 50x 。PCR 扩增 5 轮，a 链引物耗尽，根据 PCR 指数扩增（每轮 DNA 数量翻倍 ），5 轮后总 DNA 数为 m×25 。因 a 链引物与 a 链模板配对，每扩增 1 次消耗 1 个 a 链引物，最终 a 链引物数 x=m×(25−1)+1=31m。 （2）基因表达载体中，复制原点确保质粒在受体细胞中自主复制 。A-T 碱基对含 2 个氢键，比 G-C（3 个 ）更易解旋，故该区域 A-T 比例高 。RNA 聚合酶结合位点，驱动转录：启动子是 RNA 聚合酶识别、结合的部位 ，启动基因转录为 mRNA 。 （3）fat-1 基因转录模板是 b 链，转录方向由启动子→终止子。与 a 链结合的引物 5’端靠近终止子，需选质粒上终止子附近的酶切位点（HindⅢ 识别 AAGCTT ）。b 链为模板链，引物设计需匹配载体酶切位点，使 fat-1 基因按 “启动子→fat-1 基因→终止子” 方向插入，故 a 链引物 5’端添加 HindⅢ 识别序列 。 （4） 检测蛋白质（LCPUFA 合成酶 ）用抗原 - 抗体杂交 技术（特异性结合 ）。若基因已插入但无表达，可能是重组质粒未含启动子、终止子 ，导致 fat-1 基因无法转录 / 翻译 。 13．(24-25高二下·四川广元·期末)科学家利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素有AB法和BCA法两种方法。图1展示了前胰岛素原的加工过程，图2为所用质粒及目的基因部分结构。请据图分析并回答下列问题： (1)AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，密码子的________使得AB法合成的两种DNA片段均有多种可能序列。BCA法是利用胰岛B细胞的mRNA通过_______（过程）得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再切去C肽段。 (2)构建基因表达载体时，为使目的基因与载体正确连接，可选择图2中的限制酶________、______来切割质粒和目的基因。已知胰岛素基因左端碱基序列，设计PCR引物时需添加该限制酶识别序列，若胰岛素基因左端①处的碱基序列为5'-CCTTTCAGCTCA-3'，则其中一种引物序列为5'__________3'。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，重组质粒导入大肠杆菌后，为筛选成功导入重组质粒的菌落，培养基中需添加_______。利用蓝白斑筛选，含重组质粒的菌落呈白色，原因是_________。 (4)从大肠杆菌中获取的胰岛素需进一步加工才能有活性，原因是________。 (5)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→________→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 【答案】(1) 简并性 逆转录 (2) XhoI MunI CTCGAGCCTTTCAGCTCA (3) 氨苄青霉素和 X - gal 目的基因插入破坏lacZ基因，无法合成 β - 半乳糖苷酶 (4)大肠杆菌无内质网、高尔基体，不能对胰岛素原加工（切去 C 肽段 ） (5)设计预期的蛋白质结构 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 【详解】（1）密码子的简并性（一种氨基酸可对应多种密码子 ），使 AB 法合成的 DNA 片段有多种可能序列。 BCA 法利用胰岛 B 细胞的 mRNA，通过逆转录 合成胰岛素基因（以 RNA 为模板合成 DNA ）。 （2）根据图2，对于目的基因，SalI和NheI的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoI和MunI和EcoRI中选择；同时质粒上EcoRI的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择XhoI和MunI两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoI和MunI的识别序列。在设计PCR引物时需要添加限制酶XhoI和MunI的识别序列，根据两种酶在质粒上的位置上可知，XhoI的识别序列需要添加在目的基因左侧、MunI的识别序列需要添加在目的基因右侧，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为5'-CCTTTCAGCTCA-3'，由于DNA合成时，新链的延伸方向是：5'→3'，即其中一种引物与模板链3'端（①处互补的位置）碱基互补配对，同时该引物序列需要包含XhoI的识别序列，所以其中一种引物设计的序列是5'-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3'。 （3）将目的基因的插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落即为所需重组质粒。 （4）大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体 ，无法对胰岛素原进行加工（切去 C 肽段 ），故需体外进一步处理才有活性。 （5）蛋白质工程流程：从预期功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到脱氧核苷酸序列（基因 ）。 14．(24-25高二下·四川眉山·期末)百合具有观赏、食用和药用等多种价值。在种植过程中栽培种百合极易受到尖孢镰刀菌侵染感病而影响产量和品质，人们发现野生百合却对尖孢镰刀菌具有极强的抗病性。科研人员开展了相关研究，研究发现栽培种百合和野生型百合都含有抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，但当受到病原体侵染时，野生型百合的L基因大量表达，栽培种百合的L基因难以表达。为此科研人员对 L 基因开展了更深入的研究，两种百合的 L 基因及其上游的启动子和下游的终止子结构如图一（F1～F4和 R1～R4表示相应的引物）。图二是一种 Ti 质粒的结构示意图，其中基因 gus 编码 GUS 酶，GUS 酶活性可反映启动子活性。请回答： (1)基因工程中涉及的酶有___________，PCR 扩增 DNA 所需的酶是___________，该酶具有___________的特点。 (2)研究病原微生物对 L 的启动子活性的影响。从图一所示结构中分别获取 pL 和 bL，首先选用___________酶切，分别与相同限制酶酶切的 Ti 质粒连接，再分别导入烟草。用 PCR 技术检测 pL 和 bL 导入是否成功时，应选用的引物分别是___________、___________，随机选取 2 组转基因成功的烟草（A1、A2，每组都包含有 pL 和 bL 导入成功的烟草）进行病原微生物尖孢镰刀菌胁迫，结果如图三。根据图三结果分析，野生型百合和栽培种百合对尖孢镰刀菌抗性差异的原因是___________。 (3)CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的 Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导 RNA(sgRNA)引导下，切割 DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。根据上述研究成果，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：___________。 【答案】(1) 限制酶和DNA连接酶 热稳定DNA聚合/Taq 耐高温 (2) Hind Ⅲ和Xba Ⅰ F₁ 和R₁ F₃ 和R₃ 尖孢镰刀菌胁迫下，野生型百合的pL启动子活性高于栽培种百合的bL启动子，使L基因大量表达 (3)设计与栽培种百合bL启动子中特定序列互补的sgRNA，构建CRISPR/Cas9表达载体；将载体导入栽培种百合细胞，诱导其基因编辑；筛选出bL启动子被编辑为具有高活性的植株（或替换为pL启动子的植株） 【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）基因工程中涉及的酶有限制酶和DNA连接酶，PCR 扩增 DNA 所需的酶是热稳定DNA聚合酶，该酶具有耐高温的特点。 （2）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，同时满足去掉质粒上的启动子，应用质粒两侧的酶，因此选用限制酶HindⅢ、Xba Ⅰ进行酶切。用 PCR 技术检测 pL 和 bL 导入是否成功时，应选用的引物分别是F₁ 和R₁、F₃ 和R₃。尖孢镰刀菌胁迫下，野生型百合的pL启动子活性高于栽培种百合的bL启动子，使L基因大量表达，因此野生型百合和栽培种百合对尖孢镰刀菌抗性有差异。 （3）设计与栽培种百合bL启动子中特定序列互补的sgRNA，构建CRISPR/Cas9表达载体；将载体导入栽培种百合细胞，诱导其基因编辑；筛选出bL启动子被编辑为具有高活性的植株 地 城 考点03 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 一、单选题 1．(24-25高二下·四川广安·期末)干扰素是动物体内合成的一种糖蛋白，体外很难保存。如将干扰素分子的一个半胱氨酸改造成丝氨酸，体外-70°C下可以保存半年，下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，有关叙述正确的是（　　） A．干扰素是具有干扰细菌复制作用的糖蛋白，被广泛应用于治疗细菌感染性疾病 B．对天然干扰素的改造是通过直接对干扰素分子进行半胱氨酸替换来实现的 C．新的干扰素基因在大肠杆菌体内正常表达可得到预期的新的干扰素 D．蛋白质空间结构复杂是蛋白质工程实施难度大的重要原因 【答案】D 【详解】A、干扰素是抗病毒的糖蛋白（干扰病毒复制 ），而非抗细菌→ 不能用于治疗细菌感染性疾病， A错误； B、蛋白质工程需通过改造基因实现蛋白质改造（不能直接改造蛋白质分子，因体外改造后无法遗传 ）→ 对天然干扰素的改造是通过基因编辑（替换半胱氨酸对应的密码子 ），而非直接替换氨基酸，B错误； C、干扰素是糖蛋白，糖基化修饰需内质网、高尔基体等细胞器。大肠杆菌是原核生物，无这些细胞器，无法完成糖基化→ 新的干扰素基因在大肠杆菌中表达的产物无活性，C错误； D、蛋白质工程需先解析蛋白质的空间结构（如用 X 射线衍射 ），再设计改造。由于蛋白质空间结构复杂（难以精准预测和设计 ），导致蛋白质工程实施难度大， D正确； 故选D。 2．(24-25高二下·四川南充·期末)甲酸脱氢酶（FDH）是将CO2还原为甲酸的重要生物催化剂，但其催化活性和热稳定性仍存在一定的局限。研究者们提出利用蛋白质工程改FDH性能的策略。下列叙述错误的是（    ） A．新FDH的预期功能，是合成和改造FDH基因的主要依据 B．改造后的FDH基因需要加上起始密码子等调控元件才能表达 C．可利用基因的定点突变技术进行碱基替换，从而实现氨基酸序列的改变 D．具有优异性能的FDH突变体，为解决温室效应和能源危机提供了新思路 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。所以要利用蛋白质工程钙造FDH性能，应依据新FDH的预期功能，合成和改造FDH基因，A正确； B、起始密码子位于mRNA上，属于翻译的起始信号，改造后的FDH基因需要加上启动子等调控元件才能表达，B错误； C、基因定点突变技术通过替换特定碱基改变对应的密码子，从而改变氨基酸序列，导致该基因转录出的mRNA上密码子改变，从而改变氨基酸序列，C正确； D、改进后的FDH催化活性和热稳定性高，可高效催化CO2还原为甲酸，有助于减少温室气体并生产能源物质，D正确。 故选B。 3．(24-25高二下·四川宜宾·期末)天然胰岛素易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员发现，将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，可有效抑制胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述错误的是（　　） A．该过程属于蛋白质工程，最终还要通过改造或合成基因来完成 B．研发速效胰岛素产品的基本思路是从胰岛素的预期功能出发 C．常用显微注射法将改造后的速效胰岛素基因导入大肠杆菌作为工程菌 D．第二代基因工程可生产出自然界不存在的蛋白质，使用时需注意其安全性 【答案】C 【分析】蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 【详解】A、蛋白质工程通过修改基因来改变蛋白质结构，最终需通过改造或合成基因实现，A正确； B、蛋白质工程的基本思路是从预期功能出发设计结构，再推导基因序列，B正确； C、大肠杆菌作为原核生物，常用Ca²⁺处理法（感受态转化法）导入重组质粒，显微注射法用于动物细胞（如受精卵），C错误； D、第二代基因工程（蛋白质工程）可创造自然界不存在的蛋白质，可能存在潜在风险，需注意安全性，D正确。 故选C。 4．(24-25高二下·四川遂宁·期末)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发产品，如速效胰岛素、酶制剂、微生物农药，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（    ） A．天然蛋白是生物在长期进化过程中形成的，能满足特定物种和人类的需要 B．生产速效胰岛素过程改变了相应基因，也改变了胰岛素的氨基酸种类和数量 C．生产耐高温T4溶菌酶与二硫键的形成有关，需要用到基因的定点突变技术 D．生产微生物农药可直接改造a，或者直接由b开始经过①－c－②过程来实现 【答案】C 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要，其核心是基因工程。 流程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→定向改造或生产人类所需的蛋白质。 【详解】A、天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定符合人类生产和生活的需求，由此，蛋白质工程迅速崛起，A错误； B、利用蛋白质工程生产速效胰岛素，需合成新的胰岛素基因，改造好的目的基因需要通过基因工程转入受体细胞，因此改变了胰岛素的氨基酸数量，但并未改变氨基酸种类，B错误； C、生产耐高温 T4溶菌酶确实涉及基因定点突变技术 ，通过改造特定基因实现二硫键的形成从而提高耐热性，C正确； D、a是蛋白质，生产微生物农药不可直接改造a，蛋白质工程的流程：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构(a)→推测应有氨基酸序列(b)→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)→转录(①)形成mRNA(c)→翻译(②)获得所需要的蛋白质，D错误。 故选C。 5．(24-25高二下·四川成都蓉城联盟·期末)天然蛋白质是生物在长期进化中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，不一定完全符合人类生产和生活需要。对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的，下列有关叙述正确的是（　　） A．经改造的枯草杆菌蛋白酶在洗涤工业和丝绸工业的应用，说明蛋白质工程的研究和应用有助于酶制剂产业的发展 B．对蛋白质进行二硫键还原处理改变原有蛋白质的结构属于蛋白质工程 C．蛋白质工程最终获得的是非天然蛋白质，所以只能通过合成目的基因来实现 D．从理论上讲，应用基因的定点突变技术只能实现改变目标蛋白质中特定位点单个氨基酸的种类 【答案】A 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需求。 【详解】A、蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶，可见蛋白质工程的研究和应用有助于酶制剂产业的发展，例如枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，常被用于洗涤工业和丝绸工业等，A正确； B、对蛋白质进行二硫键还原处理是指断裂蛋白质中的二硫键，是破坏蛋白质天然结构的技术手段，不属于对基因进行操作的蛋白质工程，B错误； C、蛋白质工程是通过改造或合成基因，来改造现有蛋白，或制造一种新的蛋白质，C错误； D、基因定点突变技术可以对碱基进行替换、增添等改造，从理论上讲，由于密码子的简并性可能不改变目标蛋白质中特定位点单个氨基酸的种类，也可能是实现目标蛋白质中特定位点氨基酸的替换等，甚至可能使蛋白质中氨基酸数目增多或减少等，D错误。 故选A。 6．(24-25高二下·四川乐山·期末)天然胰岛素制剂易形成二聚体或六聚体，皮下注射后需逐渐解离为单体才能发挥作用，延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发出的速效胰岛素类似物，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（　　） A．利用蛋白质工程生产速效胰岛素类似物要从推测a的结构入手 B．①过程是转录，蛋白质工程的目标是对基因结构进行分子设计 C．从图中可以看出，蛋白质工程的基本思路与中心法则是相同的 D．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 【答案】A 【分析】蛋白质工程的流程：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构(a)→推测应有氨基酸序列(b)→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)→转录(①)形成mRNA(c)→翻译(②)获得所需要的蛋白质。 【详解】 A、蛋白质工程中，首先根据预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构，因此利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从设计预期的蛋白质结构(a)入手，A正确； B、蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，B错误； C、蛋白质工程是根据具有相应功能的蛋白质结构推测氨基酸序列，进而推测出脱氧核苷酸序列，因此中心法则与蛋白质工程的基本途径相反，C错误； D、当前限制蛋白质工程发展的关键因素是蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往很复杂，人们对蛋白质的高级结构了解太少，D错误。 故选A。 7．(24-25高二下·四川泸州·期末)T4溶菌酶（A0）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程将对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键。获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程和基因工程都能生产出自然界中不存在的蛋白质 B．AO和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因 C．检测高温环境下A1的活性时应先将A1与底物在常温混合后置于高温环境 D．改造后T4溶菌酶可在高温条件下更加有效地溶解细菌和真菌的细胞壁 【答案】B 【详解】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【分析】A、蛋白质工程通过改造基因生产自然界不存在的蛋白质，而基因工程只能生产天然存在的蛋白质，A错误； B、A1因第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，导致空间结构与A0不同，直接影响热稳定性，B正确； C、检测高温下A1活性时，若先在常温混合再高温处理，酶可能在高温下迅速失活，无法准确测定活性。正确方法应为将酶与底物在高温下直接反应，C错误； D、T4溶菌酶主要作用于细菌细胞壁（肽聚糖），对真菌细胞壁（几丁质）无效，D错误。 故选B。 8．(23-24高二下·四川绵阳·期末)研究人员利用 CRISPR 基因编辑技术，成功修复了人类早期胚胎中肥厚心肌病相关的基因MYBPC3的突变，且定向非常准确，未出现“脱靶”效应。这项研究在攻克用基因组编辑技术治疗人类遗传病的若干技术问题的同时，也引起了一些伦理方面的争论。下列相关叙述错误的是（    ） A．用该技术编辑少量的细胞就可对某些遗传病进行治疗 B．使用该技术修复的心肌细胞可以用于心脏治疗性克隆 C．该技术潜藏着难以预测的、巨大的不确定性和风险性 D．随着技术成熟，可以设计“完美婴儿”，促进人类进步 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、由题意可知，该技术定向非常精确，未出现“脱靶”效应，故只需要编辑少量的细胞就可以对遗传病进行治疗，A正确； B、该技术能帮助修复人类早期胚胎中与肥厚性心肌病相关的基因MYBPC3的突变，即使用该技术修复的心肌细胞可以用于心脏治疗性克隆，B正确； C、由于外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，因此有时候会出现一些人们意想不到的后果，潜藏着难以预测的、巨大的不确定性和风险，C正确； D、利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期得到“完美婴儿”，已经涉及到新生命的诞生，会造成生物技术安全与伦理问题，D错误。 故选D。 9．(24-25高二下·四川遂宁·期末)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔的应用前景，下列相关叙述正确的是（    ） A．利用乳腺生物反应器制备药用蛋白时，只需要将目的基因导入乳腺细胞即可表达获得 B．培育转基因植物时，用电刺激处理受体细胞可增加细胞壁通透性，利于重组质粒导入 C．在同等养殖条件下，转入外源生长激素基因的鲤鱼的生长繁殖速率比非转基因鲤鱼高 D．将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌或酵母菌的基因组中生产的凝乳酶活性可能不同 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、利用乳腺生物反应器时，需将目的基因导入受精卵而非乳腺细胞，因为只有受精卵能发育为个体，使目的基因在乳腺中特异性表达。若仅导入乳腺细胞，无法稳定遗传且无法持续产生产物，A错误； B、培育转基因植物时，常用农杆菌转化法或基因枪法导入重组质粒。电刺激法（电穿孔法）多用于微生物或动物细胞，B错误； C、外源生长激素基因的表达可促进转基因鲤鱼生长，但繁殖速率受性腺发育、能量分配等因素影响，过量生长激素可能抑制生殖能力，因此生长速率高≠繁殖速率高，C错误； D、大肠杆菌（原核）与酵母菌（真核）的蛋白质加工系统不同，酵母菌可能对凝乳酶进行正确折叠和修饰，而大肠杆菌无法完成，导致酶活性差异，D正确。 故选D。 10．(23-24高二下·四川凉山州·期末)“黑寡妇”蜘蛛吐出的丝强过钢丝，用其吐出的丝织成的布比制造防弹背心所用纤维的强度高很多。科学家把“黑寡妇”蜘蛛体内蜘蛛丝蛋白基因，导入到山羊细胞内，培育出转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器，获得了坚韧程度极强的蜘蛛丝蛋白，取名为“生物钢”，操作过程如下。下列说法错误的是（　　）    A．丝蛋白基因会伴随受体细胞分裂而自我复制 B．可用PCR 等技术检测目的基因是否表达 C．“蜘蛛羊”乳腺生物反应器生产的“生物钢”不会造成环境污染 D．乳腺生物反应器具有产量高、成本低、产品质量好和易提取等优点 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、丝蛋白基因已导入羊的受精卵中，所以丝蛋白基因会伴随受体细胞分裂而自我复制，A正确； B、可用丝蛋白基因探针与该羊口腔上皮细胞mRNA杂交，检测目的基因是否表达，B错误； C、“蜘蛛羊”乳腺生物反应器生产的“生物钢”，可以被生物降解，不会造成环境污染，C正确； D、乳腺生物反应器具有产量高、成本低、产品质量好和易提取等优点，D正确。 故选B。 11．(24-25高二下·四川泸州·期末)苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白与豇豆胰蛋白酶抑制剂杀虫机理不同，后者能特异性与棉铃虫的胰蛋白酶结合。在转Bt蛋白基因抗虫棉作物种植区发现棉铃虫种群抗性基因频率显著上升。下列有关叙述错误的是（　　） A．Bt抗虫蛋白与豇豆胰蛋白酶抑制剂可能只会造成棉铃虫死亡而对人畜无害 B．为防止转基因花粉的传播，可将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入棉花细胞 C．种植含两种基因的转基因棉花可减缓棉铃虫种群抗性基因频率上升的速度 D．将转基因棉花与普通棉花混种会加快棉铃虫种群抗性基因频率上升的速度 【答案】D 【分析】目的基因的检测和表达： 1、首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 2、其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。 3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。 4、有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 【详解】A、由于苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白与红豆胰蛋白酶抑制剂杀虫机理是针对棉铃虫的，比如红豆胰蛋白酶抑制剂能特异性与棉铃虫的胰蛋白酶结合，所以有可能只会造成棉铃虫死亡而对人畜无害，A正确； B、将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入棉花细胞，α-淀粉酶基因表达产物可能会影响花粉的正常功能，从而防止转基因花粉的传播，B正确； C、种植含两种基因（Bt蛋白基因和红豆胰蛋白酶抑制剂基因）的转基因棉花，棉铃虫要同时对两种不同作用机理的抗虫物质产生抗性难度较大，所以可减缓棉铃虫种群抗性基因频率上升的速度，C正确； D、将转基因棉花与普通棉花混种，会为棉铃虫提供一些没有抗虫物质的生存环境，使不具有抗性的棉铃虫也能存活，这样就会减缓棉铃虫种群抗性基因频率上升的速度，而不是加快，D错误。 故选D。 12．(24-25高二下·四川南充·期末)研究者将抗虫融合基因cv与耐草甘膦基因ce构建在同一T-DNA中，并利用农杆菌转化法导入水稻细胞，培育出了抗虫耐除草剂的转基因水稻。下列叙错误的是（    ） A．农杆菌Ti质粒上的T-DNA，能整合到受体细胞的染色体DNA上 B．转基因水稻种植时可减少农药的使用，进而降低农药对环境的污染 C．将转基因水稻与普通水稻间行种植的主要目的是增加基因的多样性 D．转基因水稻获批上市后，必须严格实行标识制度，保证消费者的知情权 【答案】C 【详解】A、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，这是农杆菌转化法的关键步骤，A正确； B、抗虫转基因水稻可减少杀虫剂使用，耐除草剂特性允许使用特定除草剂，从而减少其他除草剂的使用，降低环境污染，B正确； C、将转基因水稻与普通水稻间行种植的主要目的是评估其生长情况及环境影响，而非增加基因多样性，C错误； D、我国对转基因产品实行标识制度，要求明确标注转基因成分，保障消费者知情权，D正确。 故选C。 13．(24-25高二下·四川广元·期末)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面展示出了广阔的应用前景。下列叙述错误的是（　　） A．我国转基因抗虫棉的成功培育，实现了基因由微生物向植物的定向转移 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，可培育出产低乳糖牛乳的奶牛 C．通过构建基因工程菌，可利用发酵技术大量生产加工转化糖浆所需的淀粉酶 D．膀胱生物反应器优于乳腺生物反应器的方面包括不受性别、发育时期等限制 【答案】B 【详解】A、抗虫棉的Bt毒蛋白基因来自苏云金杆菌，属于微生物基因向植物的转移，且基因工程能实现定向改造，A正确； B、将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞无法直接培育出稳定产低乳糖牛乳的个体，正确方法是将该基因与乳腺特异性启动子连接后导入受精卵，使转基因奶牛在乳汁中表达乳糖酶，B错误； C、淀粉酶可将淀粉水解为葡萄糖，用于生产转化糖浆，构建基因工程菌通过发酵生产淀粉酶是可行技术，C正确； D、膀胱生物反应器可从尿液中收集产物，不受性别和发育阶段限制，而乳腺反应器仅限雌性哺乳期，D正确。 故选B。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $