专题03 基因工程（3大考点）（期末真题汇编，山东专用）高二生物下学期

**基本信息** 山东多地高二下期末基因工程专题汇编，覆盖重组DNA工具、DNA粗提取与PCR及电泳、基因工程操作与蛋白质工程三大高频考点，以实验情境和技术应用为核心，突出科学思维与探究实践。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选题|较多|引物设计、限制酶作用、PCR原理|结合电泳结果分析引物特异性（如济南期末题）| |多选题|较少|重叠延伸PCR、基因表达载体构建|考查引物设计与酶切位点选择（如滨州期末题）| |解答题|适中|Ti质粒构建、双重选择系统|综合载体构建与筛选（如聊城期末同源重组题）|

专题03 基因工程 3大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 DNA的粗提取、PCR和电泳鉴定 考点03 基因工程的基本操作程序与应用和蛋白质工程 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·山东济南·期末）研究人员根据含有S基因的DNA序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，引物与DNA结合位点如甲图所示。为选出正确和有效的引物，以含有S基因的DNA为模板进行PCR后，将获得的产物进行电泳，电泳结果如乙图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．能特异性扩增S基因目的片段的引物组合为F1-R1 B．4种引物中可用于特异性扩增目的片段的引物是F1、R1和R2 C．通常情况下，扩增所用的引物越短，引物特异性越低 D．在F1和R1的5'端添加的限制酶序列最好避免产生相同的黏性末端 【答案】B 【分析】电泳是利用带电粒子在电场中会向相反电极移动的特性，对混合物中不同组分进行分离的技术。混合物中的不同组分在电场中因迁移速度差异而逐渐分开，最终形成可观察的条带，实现分离和鉴定。 【详解】A、从电泳结果乙图来看，只有引物组合F1 - R1扩增出了单一的目的条带（符合特异性扩增的特点），所以能特异性扩增S基因目的片段的引物组合为F1 - R1，A正确；   B、由乙图可知，F1 - R1能特异性扩增目的片段，F1 - R2、F2 - R1不能特异性扩增目的片段（出现多条带或无对应条带），所以4种引物中可用于特异性扩增目的片段的引物是F1和R1，B错误；    C、通常情况下，引物越短，与DNA模板链结合的特异性就越低，因为短引物可能会在DNA的多个位置结合，C正确；    D、如果在F1和R1的5'端添加的限制酶序列产生相同的黏性末端，那么在构建基因表达载体等后续操作中，目的基因可能会自身环化或者反向连接等，不利于基因工程的操作，所以最好避免产生相同的黏性末端，D正确。    故选B。 2．（24-25高二下·山东济南·期末）大肠杆菌β -半乳糖苷酶（Z酶）可催化底物（X - gal）水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，lacZ'编码Z酶氨基端的一个片段（称为α -肽），该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知α -肽、不含α -肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用甲、乙构建目的基因的表达载体，下列相关叙述正确的是（    ） 图中AmpR是氨苄青霉素抗性基因；Sal I、Hind Ⅲ是限制酶识别序列 A．就筛选功能而言，AmpR是标记基因，lacZ基因不是标记基因 B．使用限制酶SalⅠ切割质粒和目的基因所在DNA，仅考虑目的基因和质粒两两连接，在DNA连接酶的作用下可出现3种连接产物 C．为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，受体大肠杆菌中编码α -肽的DNA序列缺失，其他序列正常 D．重组质粒转化后的大肠杆菌先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，再原位影印到含X - gal的培养基上，选出蓝色菌落中即含有含目的基因的重组质粒 【答案】C 【详解】A、AmpR是标记基因，lacZ基因也是标记基因，β -半乳糖苷酶（Z酶）可催化底物（X - gal）水解产生蓝色物质，A错误。 B、SalⅠ切割质粒限制酶SalⅠ切割质粒和目的基因所在DNA，仅考虑目的基因和质粒两两连接，在DNA连接酶的作用下可出现2种连接产物，一种正向拼接产物，一种反向拼接产物，B错误； C、α -肽、不含α -肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，受体大肠杆菌中编码α -肽的DNA序列缺失，其他序列正常，这样导入正常质粒的会因有完整lacZ基因表达出有活性的Z酯，在含X - gal的培养基上形成蓝色菌落，而导入重组质粒的因lacZ基因中\alpha -肽编码序列被破坏，不能形成有活性的Z酯，在含X - gal的培养基上形成白色菌落，C正确。 D、重组质粒转化后的大肠杆菌先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出含有质粒（包括重组质粒和正常质粒 ）的大肠杆菌；再经影印到含X - gal的培养基上，应选出白色菌落（重组质粒中lacZ基因被破坏，不能产生有活性的Z酯，不能将X - gal水解产生蓝色物质 ）才是含有目的基因的重组质粒，D错误。 故选C。 3．（24-25高二下·山东枣庄·期末）下图是一种特殊的限制性内切核酸酶BbsⅠ。这种酶包含两个部分，一个部分识别6个特定的核苷酸序列，另一个部分可以切割双链DNA产生末端，作用原理如图1所示。下列叙述错误的是（    ） A．限制酶主要从原核生物中分离纯化出来 B．理论上该酶切割后可以产生256种黏性末端 C．图2序列被BbsⅠ完全作用后，可以得到两种DNA片段 D．用BbsI同时处理目的基因和载体不一定实现目的基因与载体的定向连接 【答案】C 【分析】本题围绕限制性内切核酸酶 BbsⅠ 的作用机制与应用展开，需结合限制酶的来源、识别序列的多样性、切割后产物的特点及基因工程中的定向连接，判断选项正误，落实 “科学思维（逻辑推理、模型分析 ）”“社会责任（生物技术应用 ）” 素养，理解限制酶在基因工程中的核心作用。 【详解】A、限制酶主要从原核生物中分离纯化（原核生物用限制酶抵御外源 DNA 入侵 ），A正确； B、BbsⅠ 识别 6 个核苷酸序列，切割部分含 4 个 N，每个 N 有 4 种可能 ，理论上识别序列种类为 44=256 种；且切割产生黏性末端，每种识别序列对应一种黏性末端， 可产生 256 种黏性末端，B正确； C、识别限制酶切割位点：BbsⅠ 的识别序列为5′−GAAGAC−3′（及互补链3′−CTTCTG−5′ ），在图 2 DNA 序列中查找该特定序列，图 2 序列中存在2处BbsⅠ 的识别序列 ，如下图所示： 限制酶切割 2 次，会将 DNA 分子切成3 个片段 ，C错误； D、BbsⅠ切割部位的碱基（NNNN）不具有特异性，载体和基因切割后的粘性末端很可能不能互补配对，D正确。 故选C。 二、解答题 4．（24-25高二下·山东临沂·期末）土壤盐渍化影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入普通水稻中，培育出了耐盐碱水稻新品种。具体操作流程及可能用到的限制酶如下图，①~⑦表示操作过程，其中Bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。已知AUG为起始密码子，UAA、UAG、UGA为终止密码子。 限制酶 Ⅰ Ⅰ Ⅰ 识别位点及切割位点（5’→3’） (1)过程①、②利用的酶有________，已知OsMYB56基因两端不含限制酶识别序列，为与载体连接可在该引物的________端添加相应的识别序列，结合图中信息分析，过程②扩增OsMYB56基因时图中右侧使用的引物序列为________________（从5＇端向3＇端方向写出前12个碱基）。 (2)根据基因表达载体的结构组成推测，Ti质粒中CaMV35S的功能是________；基因表达载体中，OsMYB56基因和Bar基因转录模板链________（填“是”或“否”）为Ti质粒的同一条链，其中Bar基因转录的模板链为________（填“a链”或“b链”）。 (3)过程④导入根瘤农杆菌常用的方法是________，筛选含有重组质粒的根瘤农杆菌时，应分别先后使用含________的选择培养基筛选，预期结果是________________。 【答案】(1) 逆转录酶和Taq 酶 5' TGATCACTATCC (2) RNA聚合酶识别和结合的位点 是 b (3) 感受态细胞法 四环素、氨苄青霉素 在含四环素培养基上能生长，在含氨苄青霉素培养基上不能生长 【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使耐高温的DNA聚合酶沿引物的3'端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等元件。 【详解】（1）过程①是反转录 PCR，反转录是以RNA为模板利用逆转录酶合成DNA的过程，即过程①利用反转录PCR以总RNA为模板扩增获得cDNA。过程②是利用cDNA为模板扩增OsMYB56基因的过程，该过程利用的酶是热稳定DNA聚合酶，即Taq酶。据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶Sac I和BclⅠ，在进行PCR操作时，引物分别要与基因两条链的3'端碱基序列互补配对结合，因此过程②利用cDNA为模板扩增OsMYB56基因时使用的两种引物的序列为（左侧）5'-GAGCTCATGAGA-3'、（右侧）5'-TGATCACTATCC-3'。为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，是在引物的5'端加上了限制酶识别序列。 （2） 基因表达载体的结构应该包括启动子、终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可知CaMV35S是启动子，功能是RNA聚合酶识别和结合的位点。RNA聚合酶的移动方向是从启动子移向终止子，故两个基因编码链方向相反，但是OsMYB56基因和Bar基因转录模板链是Ti质粒的同一条链。RNA聚合酶的移动方向代表转录的方向，具体来说，RNA聚合酶沿DNA的3′端向5′端移动，因此Bar基因转录的模板链为b链。 （3）一般采用感受态细胞法将表达载体导入农杆菌，通常利用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。 据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶SacI和BcII。据图可知，限制酶SacI和BcII破坏了Ampr（氨苄青霉素抗性基因），只保留了四环素抗性基因（Tetr），为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加四环素的选择培养基上培养，再使用含氨苄青霉素的培养基。预期结果是在含四环素培养基上能生长，在含氨苄青霉素培养基上不能生长。 地 城 考点02 DNA的粗提取、PCR和电泳鉴定 一、单选题 1．（24-25高二下·山东滨州·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“PCR及电泳鉴定”实验。下列说法正确的是（    ） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集 B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，Mg2+浓度越高，酶活性越大 C．待分离的DNA分子质量越大，电泳后距离点样孔越远 D．DNA电泳指示剂需要加入到凝固之前的琼脂糖凝胶中 【答案】A 【分析】DNA的粗提取和鉴定的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液中。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 【详解】A、DNA在冷酒精中溶解度低，析出白色丝状物后，离心可收集沉淀的DNA，A正确； B、Mg²+是Taq DNA聚合酶的激活剂，但浓度过高会抑制酶活性，并非浓度越高活性越大，B错误； C、电泳中，DNA分子量越小，迁移速率越快，距离点样孔越远，C错误； D、电泳指示剂（如溴酚蓝）应加入样品中，而非凝固前的凝胶中，D错误。 故选A。 2．（24-25高二下·山东济南·期末）关于“DNA粗提取与鉴定”（实验1）、“DNA片段的扩增及电泳鉴定实验”（实验2）下列说法正确的是（    ） A．实验1中，DNA粗提取时加入95％冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集 B．实验1中，DNA分子在2mol/LNaCl溶液中与二苯胺混匀，加热后可反应生成蓝色化合物 C．实验2中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时，加样前应先接通电源 D．实验2中，凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA分子结合，用于观察电泳进程 【答案】B 【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性；（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色； 2、DNA粗提取和鉴定的过程：（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可，如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜，例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；（3）去除滤液中的杂质；（4）DNA的析出与鉴定：粗提取的DNA与二苯胺试剂，混合均匀后变蓝。 【详解】A、实验1中，加入95%冷酒精使DNA析出后，可通过离心快速沉淀DNA。因此“不能用离心法收集”的说法错误，A错误； B、实验1中，DNA在2mol/L NaCl溶液中溶解度较高，此时加入二苯胺试剂并沸水浴加热，DNA会与二苯胺反应生成蓝色化合物。此描述符合实验操作和显色原理，B正确； C、实验2中，凝胶电泳的正确步骤是加样后再接通电源，以形成电场驱动DNA迁移。若先通电再加样，可能导致样品扩散，C错误； D、实验2中，凝胶载样缓冲液的指示剂（如溴酚蓝）仅用于标记电泳进程，其本身不与DNA结合。结合DNA的试剂通常是荧光染料（如EB），D错误。 故选B。 3．（24-25高二下·山东淄博·期末）关于 “DNA 片段的扩增及电泳鉴定” 实验,下列说法正确的是（    ） A．PCR 反应体系中一般要添加钙离子用于激活体系中相应的酶 B．PCR 实验中使用的移液器、微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压灭菌处理 C．利用微波炉将琼脂糖加热至熔化后, 即时加入适量的核酸染料混匀, 再倒入模具 D．将 PCR 产物与含有指示剂的凝胶载样缓冲液混合,然后注入凝胶加样孔内 【答案】D 【分析】电泳的原理：待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、性状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 【详解】A、PCR反应体系中需要的是Mg2+作为Taq DNA聚合酶的激活剂，而非钙离子，A错误； B、移液器属于精密仪器，不能高压灭菌，实验中通常使用一次性灭菌枪头和离心管，B错误； C、核酸染料（如溴化乙锭）需在琼脂糖溶液冷却至约60℃时加入，高温会破坏染料或增加有害物质挥发风险，C错误； D、电泳前需将PCR产物与含指示剂的载样缓冲液混合，以增加样品密度并追踪电泳进程，操作正确，D正确。 故选D。 4．（24-25高二下·山东菏泽·期末）研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，从而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoI酶切割后电泳，结果如图所示。下列说法错误的是（    ） A．2号加样孔中的样品是未经ApoI酶切的PCR产物 B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI酶失活导致 C．测序比对3号和4号条带可获得缺失的碱基序列 D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关 【答案】B 【详解】A、A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，而甲的1号加样孔有三个条带，说明1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果，是未经酶切的 PCR 产物，A正确； B、根据乙的1号加样孔用ApoI酶切割后电泳的产物可知，该个体的基因型为aa，由于a基因不能被ApoI酶切，因此出现乙个体两个加样孔条带一致的情况，B错误； C、相比A基因，a基因缺失了32个碱基对，因此4是a基因，3是A基因，测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列，C正确； D、DNA分子在电泳中迁移速率受凝胶浓度（影响分子筛作用 ）、DNA分子大小（分子量小的迁移快 ）等影响，D正确。 故选B。 5．（24-25高二下·山东德州·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物”实验，下列说法错误的是（　　） A．DNA粗提取实验所用的研磨液中含有抑制DNA酶活性的物质 B．DNA鉴定过程中，DNA的活性会丧失 C．凝胶载样缓冲液中的指示剂可使DNA在紫外灯下被检测出来 D．若PCR过程中复性温度过低，电泳时可能会出现非特异性条带 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的实验原理：（1）DNA的溶解性：①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。（3）DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 【详解】A、DNA粗提取实验中，研磨液通常含有洗涤剂（溶解细胞膜）和NaCl（溶解DNA），同时可能含有EDTA（抑制DNA酶活性），防止DNA被降解，A正确； B、DNA鉴定使用二苯胺试剂需沸水浴，高温导致DNA双螺旋结构解开（变性），失去复制或转录能力（活性丧失），B正确； C、凝胶载样缓冲液中的指示剂（如溴酚蓝）仅用于指示电泳进程，DNA的检测需依赖荧光染料（如EB）在紫外灯下显色，C错误； D、PCR复性温度过低会导致引物与非目标序列结合，产生非特异性扩增产物，电泳时出现额外条带，D正确。 故选C。 6．（24-25高二下·山东泰安·期末）某科研小组进行了如下实验：称取30g洋葱切碎，充分研磨后过滤得到滤液，将滤液放置几分钟后取上清液，加入酒精溶液，此时溶液中出现了白色丝状物，用玻璃棒搅拌后卷起丝状物，经二苯胺鉴定后得出丝状物是DNA的结论。下列说法正确的是（　　） A．新鲜的菠菜或鸡血按照上述实验操作也可以得到相同的实验结果 B．滤液应放于常温下静置几分钟后取上清液 C．上清液中应加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液 D．鉴定时应将丝状物溶于0.4mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺溶液后沸水浴 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、鸡血做实验材料提取DNA时，应将鸡血放置于蒸馏水中，让鸡血细胞吸水涨破，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，与题干中获取细胞内物质的方法有所差异，A错误； B、滤液应放于4℃冰箱下静置几分钟后取上清液，B错误； C、在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，C正确； D、鉴定时应将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺溶液后沸水浴，D错误。 故选C。 7．（24-25高二下·山东临沂·期末）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（    ） A．提取DNA时，可将研磨液进行离心处理，DNA在沉淀中 B．将DNA丝状物溶于NaCl后，加入二苯胺试剂即会呈现蓝色 C．凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA大小和构象均有关 D．琼脂糖溶液倒入模具前需加入适量的凝胶载样缓冲液并混匀 【答案】C 【分析】DNA 不溶于酒精，在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，二苯胺试剂可用于鉴定 DNA，在沸水浴条件下会呈现蓝色。在电泳过程中，DNA 分子的迁移速率受到多种因素影响。 【详解】A、提取DNA时，离心后细胞碎片等杂质会沉淀，而DNA主要存在于上清液中，需后续通过改变盐浓度或加入酒精使其沉淀，A错误； B、将DNA丝状物溶于NaCl后，加入二苯胺试剂在沸水浴条件下才会显蓝色，常温下无法直接显色，B错误； C、凝胶电泳中，DNA迁移速率受凝胶浓度（影响孔径大小）、DNA分子大小（小分子迁移快）及构象（线状、环状等）共同影响，C正确； D、凝胶载样缓冲液用于与DNA样品混合后点样，而非加入琼脂糖溶液中。制备凝胶时无需加入缓冲液，D错误。 故选C。 8．（24-25高二下·山东威海·期末）关于DNA分子的粗提取及DNA片段的电泳鉴定，下列说法正确的是（    ） A．可利用DNA能溶于酒精而某些蛋白质不溶于酒精的原理初步分离DNA与蛋白质 B．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小呈正相关 D．电泳鉴定PCR产物时还需留一个加样孔加入标准参照物 【答案】D 【详解】A、DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精，而某些蛋白质可溶，因此酒精用于沉淀DNA而非初步分离，A错误； B、若仅设置阳性对照（如已知DNA溶液），能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，B错误； C、电泳中DNA迁移速率与分子大小呈负相关（小片段迁移快），C错误； D、电泳鉴定时需加入标准DNA片段（Marker）作为参照，以确定PCR产物的大小，D正确。 故选D。 9．（24-25高二下·山东威海·期末）重叠延伸PCR是一种能够在体外实现不同来源DNA片段定向重组的技术。具体原理是：通过利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，借助重叠链的延伸将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，其过程如下图所示。下列说法错误的是（    ） A．PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同 B．PCR3反应体系中经变性和复性后的DNA单链理论上有4种结合的可能 C．重叠链延伸生成融合基因时需要加入引物 D．PCR4中需要添加的引物是引物1和4 【答案】C 【详解】 A、PCR1 扩增 A 基因，PCR2 扩增 B 基因，二者模板分别是 A 基因和 B 基因，引物是针对 A 基因和 B 基因设计的不同引物，所以 PCR1 与 PCR2 反应体系中的模板与引物种类不同，A 正确；    B 、PCR3 反应体系中有来自 PCR1 和 PCR2 的产物，经变性和复性后，DNA 单链理论上有 4 种结合可能：PCR1 产物的两条单链结合、PCR2 产物的两条单链结合、PCR1 产物的一条单链与 PCR2 产物的一条单链正向结合、PCR1 产物的一条单链与 PCR2 产物的一条单链反向结合，B 正确；    C、重叠链延伸生成融合基因时，利用的是 PCR1 和 PCR2 产物的重叠链，不需要额外加入引物，C 错误； D、PCR4 是对融合基因进行扩增，要扩增完整的融合基因，需要添加的引物是引物 1 和 4，D 正确。 故选C。 10．（24-25高二下·山东聊城·期末）反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图所示。下列说法正确的是（    ） A．应选择引物2和引物3进行PCR扩增 B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关 C．PCR产物不含EcoRI的酶切位点 D．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 【答案】B 【详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A错误； B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性的温度也越高；DNA 聚合酶的延伸速度相对固定，扩增片段越长，所需延伸时间越长，B正确； C、对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，PCR产物包含位置序列末端的EcoRI的酶切位点，C错误； D、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，D错误。 故选B。 二、多选题 11．（24-25高二下·山东滨州·期末）下图所示为以1个DNA为模板进行PCR，第一轮复性环节的示意图，其中引物F、R的5'端均添加有6个碱基的限制酶识别序列。下列说法正确的是（    ） A．图示环节所需的温度是PCR 3个环节中最低的 B．经过多轮PCR后，形成的双链等长DNA分子均为985bp C．F与R不能出现可以配对的碱基，以免形成引物二聚体 D．若进行n轮循环，共需引物F 2n－1个 【答案】ABD 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、图示为复性过程，PCR技术中，复性温度是最低的，A正确； B、经过多轮PCR后，形成的双链等长DNA分子均为973+6+6=985bp，B正确； C、F与R不能出现过多可以配对的碱基，否则容易形成引物二聚体，但不是不能出现可以配对的碱基，C错误； D、子链的延伸需要引物，且需要的两种引物的数目是相同的，若进行n轮循环，则会产生2n个DNA分子，每个DNA分子有两条链，则新形成的子链的数目为2×2n-2，则需要引物F的数目为 2n－1个，D正确。 故选ABD。 12．（24-25高二下·山东菏泽·期末）蛛丝有超强韧性，科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中，获得乳腺生物反应器，在基因工程中可通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术检测目的基因是否导入受体细胞。下列说法错误的是（    ） A．PCR过程中为了减少非特异性扩增，可增加引物长度且适当降低复性温度 B．科学家将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．在凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．如果电泳结果显示羊体细胞中含有蛛丝蛋白基因，则其乳汁中含有蛛丝蛋白 【答案】ACD 【详解】A、PCR过程中，增加引物长度可提高特异性，但降低复性温度会促进引物与非目标序列结合，导致非特异性扩增增加，A错误； B、乳腺生物反应器的构建需将目的基因与乳腺组织特异性启动子等调控元件重组，确保目的基因在乳腺细胞中表达，B正确； C、核酸染料通常直接加入凝胶中，而非载样缓冲液，载样缓冲液主要含指示剂（如溴酚蓝），C错误； D、电泳结果显示羊体细胞中含有蛛丝蛋白基因，并不意味着其乳汁中都含有蛛丝蛋白，是否表达出蛛丝蛋白还需进一步鉴定（利用抗原-抗体杂交方法进行鉴定），D错误。 故选ACD。 13．（24-25高二下·山东东营·期末）利用小球藻生产生物柴油，具有广阔的开发利用前景。科学家从酵母菌中提取DGAT基因（DGAT：二酸甘油酰基转移酶，合成油脂重要基因），导入到小球藻中增强小球藻油脂代谢途径，最终获得高产油脂小球藻。已知质粒上EcoRI酶切位点与XbaI酶切位点间最短间隔为300bp。下列说法正确的是（　　） A．扩增产物的长度决定PCR延伸的时间，引物的G/C含量决定复性的温度 B．若采用PCR技术对一个DGAT基因进行扩增，则复制n代共需要引物2n+1-2个 C．pB121载体中使用酵母菌的启动子可让DGAT基因在小球藻中更好表达 D．由电泳结果可知a为构建成功的重组质粒，b为未连接目的基因的空质粒 【答案】ABD 【详解】A、PCR过程分为变性、复性、延伸三步。延伸时间由Taq酶的延伸速率和扩增产物（目的基因）的长度决定。片段越长，Taq酶需要的延伸时间越久（因为要合成更长的子链）。 复性温度与引物的G - C含量正相关。G - C碱基对含3个氢键，A - T含2个氢键；G - C含量越高，引物与模板结合越稳定，因此需要更高的复性温度来保证引物与模板特异性结合，A正确； B、PCR扩增目的基因时，引物作用是“启动子链延伸”，每个新合成的DNA链都需要引物。 假设初始为1个双链DGAT基因，复制n代后，DNA总数为2n个。每个DNA分子有2条链，其中新合成的链数为2 ×2n − 2 =2n+1  −2（总链数减去原始模板的2条链），则复制n代共需要引物2n+1-2个，B正确； C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有物种特异性。酵母菌的启动子是为酵母菌基因表达优化的，小球藻的RNA聚合酶可能无法识别酵母菌的启动子，无法驱动DGAT基因高效转录。若要让DGAT基因在小球藻中更好表达，应使用小球藻自身的启动子（或适合小球藻的启动子），C错误； D、电泳的核心原理是“分子量越小，迁移速率越快”。  重组质粒：插入目的基因后，分子量比空质粒大（空质粒无目的基因插入）。 空质粒：分子量小，电泳时迁移速率更快，条带更靠下；重组质粒分子量更大，迁移速率更慢，条带更靠上。 结合电泳图，  a条带靠上（分子量更大），为插入目的基因的重组质粒；  b条带靠下（分子量更小），为未连接目的基因的空质粒，D正确。 故选ABD。 14．（24-25高二下·山东泰安·期末）拟南芥中RGL1酶作为E3泛素连接酶（AtRZF1）的抑制因子在植物耐干旱适应中发挥着重要作用。研究发现，AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性。研究人员采用融合PCR技术（原理如下图所示）将RGL1酶基因和AtRZF1基因连接起来构建融合基因以研究两种基因的相互作用。下列说法错误的是（　　） A．RGL1酶在植物耐干旱适应过程中起到正调控作用 B．图中第一阶段经过1次PCR循环即可获得双链等长的DNA C．图中第二阶段构建融合基因时能够起到“搭桥融合”作用的引物有4种 D．PCR技术操作过程中的每个循环都需经历两次降温和一次升温 【答案】BCD 【分析】PCR技术的PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，其原理为DNA复制，该过程的进行首先要有一段已知核苷酸序列的目的基因以便合成一对引|物，其过程为：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上：中温延伸：合成子链。 【详解】A、已知AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性，而RGL1酶是AtRZF1的抑制因子，即RGL1酶抑制AtRZF1的作用，AtRZF1功能丧失耐旱性提高，故RGL1酶在植物耐干旱适应过程中起到正调控作用，A正确； B、DNA复制为半保留复制，图中第一阶段至少需经过2次PCR循环才可获得双链等长的DNA片段，B错误； C、 在图中第二阶段构建融合基因时，引物2、引物3（这2个引物的碱基可以互补配对）能起到将RGL1酶基因和AtRZF1基因“搭桥融合”的作用，不是4种，C错误；    D、PCR技术操作过程中的每个循环（变性、复性、延伸）都需经历两次升温和一次降温，D错误。 故选BCD。 三、解答题 15．（24-25高二下·山东聊城·期末）花椰菜是人们喜爱的蔬菜，但黑腐病是困扰花椰菜种植的一大问题，研究人员希望通过植物体细胞杂交的方式，让花椰菜获得黑芥的黑腐病抗性基因。回答下列问题。 (1)研究者通过如图1的过程，获得再生植株。 ①需要使用________（试剂）对花椰菜、黑芥组织进行消毒，消毒的目的是_______。 ②图中（a）处应填写_______，细胞融合成功的标志是_______。 (2)获得再生植株后，研究者利用各种手段进行筛选和鉴定。 ①研究者提取再生植株细胞的DNA，用特定引物进行PCR后，进一步电泳鉴定，结果如图2。X1、X2、X3是不同植株的测定结果，其中确定是杂种植株的是________，X1中包含全部来自花椰菜的特征性片段，但仅包含部分来自黑芥的特征性片段，其原因是_______。 ②筛选出杂种植株之后，需要鉴定其黑腐病抗性相对于原花椰菜植株是否提升，方法是_______。 【答案】(1) 酒精和次氯酸钠溶液 避免杂菌污染 原生质体 再生出细胞壁 (2) X1和X2 在杂种植株形成过程中，黑芥的某些染色体片段可能发生丢失 将杂种植株和原花椰菜栽培在含有黑腐病菌的相同环境中，比较两者的抗性 【分析】植物体细胞杂交是指将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。诱导原生质体融合的方法：物理法（离心、振动、电激等）和化学法（聚乙二醇等）。 【详解】（1）①植物组织培养过程中使用酒精和次氯酸钠溶液对花椰菜、黑芥组织进行消毒，对花椰菜、黑芥组织进行消毒的目的是避免杂菌污染。 ②分析流程图可知，在用PEG诱导融合之前，应首先去除植物细胞壁以制备原生质体，故a处是制备花椰菜和黑芥的原生质体；植物细胞（原生质体）融合成功的标志是再生出细胞壁。 （2）①根据图谱分析，X1和X2个体含有黑芥和花椰菜两种类型的蛋白质，说明是杂种细胞，而X3个体只有花椰菜中的蛋白质，说明不是杂种细胞；X1中包含全部来自花椰菜的特征性片段，但仅包含部分来自黑芥的特征性片段，其原因是在细胞融合过程中来自黑芥的染色体随机丢失，或者是由于基因间的相互作用，导致其不能表达。 ②筛选出杂种植株之后，需要鉴定其黑腐病抗性相对于原花椰菜植株是否提升，方法是：将杂种植株和原花椰菜栽培在含有 黑腐病菌的环境中，比较两者的抗性。 16．（24-25高二下·山东聊城·期末）同源重组技术结合tet-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。如图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。回答下列问题。 (1)过程①PCR除需要加入耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、Mg2+、引物外，还需加入_______，其中引物的作用是________。 (2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需分别在引物5'端添加限制酶______的识别序列；若sacB基因扩增5代，则需要引物P1_______个。 (3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种_____的生理状态。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加_____。 (4)如图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度可推测PCR产物的长度，因此可判断泳道_____对应的菌株可能转化成功。过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5'端分别添加_______基因两端的同源序列。 (5)过程⑦中，在含有四环素和X-gal的培养基中出现了_______色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tet'-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加________。 【答案】(1) 模板DNA（或质粒1） 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) BamHI、EcoRI 31 (3) 能吸收周围环境中DNA分子 四环素 (4) 4、5、7 LacZ (5) 白 蔗糖和X-gal 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）过程①PCR除需要加入耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、Mg2+、引物外，还需加入模板DNA，其中引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）HindⅢ会破坏tetr基因，XmaⅠ会破坏复制原点，为保证sacB基因和质粒2定向连接，应用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ切割目的基因和质粒，引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，因此设计引物P1、P2时，需在引物5'端添加限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，若sacB基因扩增5代，则需要引物P1的个数为：25-1=31。 （3）过程③为将目的基因导入受体细胞，导入目的基因时，首先用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。重组质粒的标记基因为tetr（四环素抗性基因），筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加四环素。 （4）sacB基因是目的基因，sacB基因中含有2071bp，4、5、7的电泳结果接近（或大于）2071bp，说明4、5、7对应的菌株中含有目的基因，说明泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功。引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，目的基因（tetr-sacB）两端均为LacZ基因，因此需在引物5′端分别添加LacZ基因两端的同源序列。 （5）LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，过程⑦为筛选LacZ基因敲除菌株，因此，若LacZ基因被敲除，则在含有四环素和X-gal培养基中出现白色菌落。sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，则添加X-gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X-gal可筛选LacZ基因回补菌株。 17．（24-25高二下·山东淄博·期末）研究表明,镉(Cd)可降低叶绿素含量,抑制植物生长。金属硫蛋白 MT3 是人体中参与重金属解毒的主要蛋白,研究人员构建 融合基因表达载体, 利用烟草探究 MT3 能否富集 ,减弱 对植物的毒害作用。EGFP 是增强型绿色荧光蛋白,图甲表示 基因序列和载体部分结构。 MT3基因单链(cDNA):上游 5’-ATGGACCCTGAGACC．.....AGCTGCTGCCAGTGA-3’ 下游 (1) 对 MT3 基因进行 PCR 扩增时,需要使用的酶是_____,其作用是_____。图甲中所示的 MT3 基因序列为_____(填“模板链”“非模板链”)。 (2) 已知 SalI 酶识别序列为 5'-GTCGAC-3',EcoRV 酶识别序列为 5'-GATATC-3'。 在构建融合基因表达载体时,扩增 MT3 基因所需要的下游引物序列为: _____ (包括添加的限制酶识别序列,共写出 12 个碱基)。 (3)将融合基因表达载体转入农杆菌中,一般先用_____(填物质)处理使农杆菌容易吸收载体,再将转化后的农杆菌置于含_____的培养基中培养,便于筛选含重组质粒的农杆菌。用筛选后的农杆菌侵染烟草,一段时间后对烟草蛋白质进行抗体检测,电泳结果如图乙。其中细胞系_____成功表达出 MT3-EGFP 融合蛋白。 (4)用 的 溶液对野生烟草和转基因烟草植株进行处理,分别测定叶片叶绿素及 Cd 的含量,结果如图丙,由该结果可以得出的结论是_____。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶/TaqDNA聚合酶 催化合成（延伸）DNA子链 非模板链 (2)GATATCCTGGCA (3) Ca2+ 壮观霉素 2 (4)MT3可富集（增加，提高等）Cd，减少（减弱，降低等）Cd对植物的毒害作用 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1）Taq DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成，用于DNA子链的合成，一般在PCR反应体系中需要加入Taq DNA聚合酶；图示DNA单链为5'ATG…3'，与mRNA中5' AUG…3'相对应，AUG为起始密码子，因此该单链为基因编码链，非模板链。 （2）结合图甲可知，扩增MT3基因时，需要在基因的下游添加EcoRV序列5'-GATATC-3'，编码链下游TGA对应mRNA上终止密码子UGA，MT3基因与EGFP构建融合基因，需要去除MT3基因中编码终止密码子的序列，即扩增的MT3基因下游序列为5'-CTGGCA…-3'，再添加上EcoRV序列5'-GATATC-3'，因此对应的序列为5'GATATCCTGGCA3'。 （3）Ca2+处理农杆菌可以增大细胞膜的通透性，使其容易接受外来DNA分子；由于重组质粒中含有Spe（壮观霉素基因），因此将转化后的农杆菌置于含壮观霉素的培养基中培养；野生型中仅含MT3，可与MT3抗体结合，因此对应的条带为MT3，而融合蛋白 MT3-EGFP分子量应大于MT3，更加靠近点样孔附近，因此细胞系2出现了相应的条带，而细胞系1没有，故细胞系2成功表达出 MT3-EGFP 融合蛋白。 （4）结合图示可知，用Cd处理，转基因烟草中Cd含量大于野生型，说明MT3可富集（增加，提高等）Cd，在有Cd处理情况下，转基因烟草中叶绿素含量大于野生型，且两者均小于未用Cd处理，说明在有Cd的情况下MT3可以提高叶绿素含量，减少（减弱，降低等）Cd对植物的毒害作用。 地 城 考点03 基因工程的基本操作程序与应用和蛋白质工程 一、单选题 1．（24-25高二下·山东滨州·期末）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入黄瓜可提高黄瓜甜味。下图表示甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶酶切位点。下列说法错误的是（    ） A．基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作 B．为保证甜蛋白基因正确插入，可用限制酶Xba I和EcoR I切割目的基因及质粒 C．T - DNA的作用是携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上 D．为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测 【答案】B 【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切制的原则：不能破坏目的基因；不能破坏抗性基因(至少保留一个)；最好选择两种限制酶分别切制质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时防止目的基因和质粒的自身环化。 【详解】A、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，即基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作，A正确； B、目的基因内有BamH I识别序列，因此不能选择BamH I切目的基因，目的基因左侧只能选择限制酶Xba I切制。由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶Hind Ⅲ，若用Xba I和EcoR I处理切制甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误； C、T - DNA是可以转移的DNA，其作用能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，故能携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上，C正确； D、目的基因的检测可以采用PCR技术或核酸分子杂交；为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测，D正确。 故选B。 2．（24-25高二下·山东滨州·期末）通过蛋白质工程将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。下列说法错误的是（    ） A．改造AmyS1从预期蛋白质的功能出发 B．AmyS2是一种自然界中不存在的蛋白质 C．将AmyS1改造为AmyS2是通过直接改变AmyS1的氨基酸序列实现的 D．蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系是该技术的基础 【答案】C 【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程是从预期蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列，进而合成符合要求的蛋白质。所以改造 AmyS1 是从预期蛋白质的功能出发，A正确； B、AmyS2 是通过蛋白质工程改造得到的，是自然界中不存在的蛋白质，B正确； C、将AmyS1改造为AmyS2是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，而不是直接改变AmyS1的氨基酸序列，C错误； D、蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系是蛋白质工程的基础，只有了解这些关系，才能进行有效的蛋白质改造，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·山东滨州·期末）某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法错误的是（    ） A．制备的膀胱生物反应器，只有在膀胱细胞中才能表达W蛋白基因 B．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白需用相同的启动子 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 D．将含有W蛋白基因的表达载体导入山羊受精卵中可使用显微注射法 【答案】B 【分析】膀胱生物反应器有着和乳腺生物反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易，不会对动物造成伤害。与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物性别和年龄的限制。 【详解】A、膀胱生物反应器中，W蛋白基因需与膀胱上皮细胞特异性启动子结合，因此只能在膀胱细胞中表达，A正确； B、乳腺生物反应器使用乳腺特异性启动子，而膀胱生物反应器需用膀胱特异性启动子，两者启动子不同，B错误； C、乳腺生物反应器需雌性个体且处于泌乳期，而膀胱反应器可从任何性别和年龄个体的尿液中获取产物，C正确； D、显微注射法是动物转基因常用方法，导入受精卵可实现目的基因的稳定遗传，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·山东济南·期末）天然胰岛素B链的第20—29位氨基酸是胰岛素分子聚合的关键区域，聚合后的胰岛素活性会降低。科研人员利用蛋白质工程将B28位脯氨酸替换为天冬氨酸从而有效抑制胰岛素聚合。下列有关说法错误的是（    ） A．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础 B．该技术需对天然胰岛素的氨基酸序列直接进行操作，进而定向改变B28位脯氨酸 C．上述胰岛素的改造过程涉及中心法则中遗传信息的流向 D．可用基因组编辑技术来辅助完成目标碱基的替换 【答案】B 【详解】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【分析】A、蛋白质工程以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过修饰或合成基因来改造蛋白质，A正确； B、蛋白质工程并非直接操作氨基酸序列，而是通过修改基因中的碱基序列来间接改变氨基酸，B错误； C、改造胰岛素需设计并合成相应DNA，涉及“蛋白质→DNA→mRNA→蛋白质”的遗传信息流动，符合中心法则，C正确； D、基因组编辑技术可精准替换目标碱基，实现氨基酸的定向替换，D正确。 故选B。 5．（24-25高二下·山东东营·期末）关于生物技术的安全性与伦理问题，下列说法错误的是（　　） A．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 B．将α-淀粉酶基因转入植物中可防止转基因花粉的传播 C．生殖性克隆人研究不能丰富人类基因的多样性 D．应该运用科学的方法控制并合理使用生物技术 【答案】A 【分析】1、生物技术安全性问题包括食物安全、生物安全、环境安全三个方面。 2、伦理问题主要在克隆人的问题上出现争议，中国政府对待克隆人一再强调“四不原则”，即不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验，但不反对治疗性克隆。 3、生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的一类武器。 【详解】A、生物武器通常指微生物、毒素、重组致病菌等，但干扰素是细胞分泌的具有抗病毒作用的蛋白质，属于治疗药物，并非生物武器成分，A错误； B、转入α-淀粉酶基因可使花粉中的淀粉被分解，导致花粉失去活性，从而防止传播，B正确； C、生殖性克隆通过核移植技术复制个体，基因与供体一致，不会增加基因多样性，C正确； D、合理控制和使用生物技术符合伦理规范，D正确。 故选A。 6．（24-25高二下·山东东营·期末）研究发现，果聚蔗糖酶（LSase）第404位氨基酸与其热稳定性密切相关。为提升LSase的热稳定性，科研人员以野生型LSase基因为模板，设计引物改变LSase第404位氨基酸对应的碱基序列，实现对氨基酸的定点替换，相关流程如图所示。已知大肠杆菌含有20种合成蛋白质的氨基酸，F和R代表突变引物，DpnI能特异性的水解甲基化的DNA。下列说法错误的是（　　） A．若要选出热稳定性最强的LSase，至少需要设计19对突变引物 B．推测混合处理是让质粒发生变性与复性，新合成的子链未甲基化 C．对突变质粒进行进一步扩增时，可继续使用突变引物F和R D．采用琼脂糖凝胶电泳技术不能区分出原始质粒与突变质粒 【答案】C 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的筛选和获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、已知大肠杆菌含有20种合成蛋白质的氨基酸，若要对LSase的第404位氨基酸进行替换，由于密码子的简并性，一种氨基酸可能由多种密码子编码，但为了确保能替换成所有可能的氨基酸，至少需要设计19种图示突变引物（因为要替换掉原来的氨基酸，所以是20 -1=19种），A正确； B、由图可知，混合处理后，新合成的子链与模板链分离，新合成的子链与子链组合成突变质粒，原来的模板链组合成原始质粒，故推测该过程是为了让质粒变性和复性，DpnI能特异性的水解甲基化的DNA，去除原始质粒，故推测新合成的子链未甲基化，B正确； C、F和R突变引物存在互补序列，不能用F和R对突变质粒进行进一步扩增，C错误； D、原始质粒经过碱基的替换后形成突变质粒，二者的碱基数目相同，不能用琼脂糖凝胶电泳技术进行区分，D正确。 故选C。 7．（24-25高二下·山东德州·期末）为培育能表达 SGF14a - GFP 融合蛋白的转基因拟南芥，研究人员所构建的重组质粒部分结构如图。下列说法错误的是（　　） A．启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，但不是转录的起始位点 B．为确定 GFP 基因是否定向插入，可选用引物 F1和 R2进行 PCR 鉴定 C．用引物 F2和 R2对转基因拟南芥的 DNA 进行 PCR 可判断重组质粒是否成功导入 D．可通过转基因拟南芥细胞能否发出绿色荧光来判断融合基因是否成功表达 【答案】C 【详解】A、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA，而转录的起始位点是DNA链上开始合成RNA的第一个核苷酸的位置，启动子位于转录起始位点的上游，所以启动子不是转录的起始位点，A正确； B、若要确定GFP基因是否定向插入，可根据GFP基因两侧的序列设计引物。由图可知，引物F1和R2分别位于GFP基因的两侧，若用引物F1和R2进行PCR鉴定，若能扩增出相应的片段，则说明GFP基因已定向插入，B正确； C、用引物F2和R2对转基因拟南芥的DNA进行PCR扩增时，无论重组质粒是否成功导入，只要拟南芥细胞中存在与引物F2和R2配对的序列，就可能扩增出相应的片段，所以不能仅通过用引物F2和R2对转基因拟南芥的DNA进行PCR来判断重组质粒是否成功导入，C错误； D、GFP基因表达后会发出绿色荧光，若转基因拟南芥细胞能发出绿色荧光，说明SGF14a−GFP融合基因成功表达出了SGF14a−GFP融合蛋白，D正确。 故选C。 8．（24-25高二下·山东临沂·期末）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确； B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确； C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。 故选C。 9．（24-25高二下·山东威海·期末）下图为研发疫苗的几种方式，其中重组质粒的受体细胞为大肠杆菌，疫苗Ⅱ和疫苗Ⅲ分别为RNA疫苗和DNA疫苗。下列说法错误的是（    ） A．制备工程菌时一般先用Ca2+处理大肠杆菌 B．重组质粒可在工程菌拟核DNA之外独立存在 C．相较于传统的灭活病毒疫苗，疫苗Ⅰ因不能在人体内增殖而安全性更高 D．疫苗Ⅱ和疫苗Ⅲ发挥作用均需经转录和翻译过程 【答案】D 【详解】A、制备工程菌时一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使得大肠杆菌处于容易吸收周围DNA分子的状态 ，A正确； B、重组质粒是独立于拟核DNA之外的环状DNA分子，能在工程菌中独立存在并复制等，B正确； C、疫苗I是S抗原蛋白，不能在人体内增殖，相对于传统灭活病毒疫苗，安全性更高，C正确； D、疫苗Ⅱ是RNA疫苗，进入人体可直接翻译产生抗原蛋白，疫苗Ⅲ是DNA疫苗，需经过转录和翻译产生抗原蛋白，D错误。 故选D。 10．（24-25高二下·山东聊城·期末）生物技术在给生活带来进步的同时也引起了人们对其安全性的关注及对伦理道德的讨论。下列对生物技术安全性与伦理问题的说法，正确的是（    ） A．α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使卵细胞失去活性，从而防止基因污染 B．设计试管婴儿与普通试管婴儿的区别在于前者在植入前要对胚胎进行性别鉴定 C．生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类等，具有致病能力强、攻击范围广的特点 D．治疗性克隆利用细胞核全能性通过有性生殖产生特定细胞、组织和器官来治疗疾病 【答案】C 【分析】生物武器是利用生物战剂杀伤人员、牲畜、毁坏植物的武器。生物武器又是生物制剂、载体和分散手段的综合利用。生物武器自诞生以来，给人类的生存安全构成了严重威胁。生物武器种类：包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等。 【详解】A、科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉传播造成基因污染，A错误； B、设计试管婴儿与普通试管婴儿的区别在于前者需进行胚胎植入前遗传学诊断（PGD），而非仅性别鉴定，B错误； C、生物武器有多种类型，包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类等，生物武器的致病能力强、攻击范围广，因而会给人类的生存安全构成了严重威胁，C正确； D、治疗性克隆通过核移植技术（无性生殖）培育组织器官，而非有性生殖，D错误。 故选C。 二、多选题 11．（24-25高二下·山东聊城·期末）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列说法错误的是（    ） A．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 B．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况 【答案】AC 【详解】A、这些基因在叶绿体外合成，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，A错误； B、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1基因和EcCAT基因的启动子启动转录的方向不同，因此OsGLOl、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板，B正确； C、卡那霉素不在T-DNA上，应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞，C错误； D、可用抗原-抗体杂交技术检测是否有相应的蛋白质产生，从而检测四种酶在转基因棉花中的表达情况，D正确。 故选AC。 12．（24-25高二下·山东枣庄·期末）天然β—淀粉酶由484个氨基酸构成。研究发现，利用PCR技术对天然β—淀粉酶基因进行改造，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。下列叙述正确的是（    ） A．引物②中含突变碱基，利用引物②和引物③通过PCR可以获得改造基因 B．选择正确的引物进行PCR扩增，可以在第三轮循环获得改造后的基因 C．通过基因定点突变技术，获得耐热性提升的β—淀粉酶，属于蛋白质工程 D．经过N轮循环，可以得到2N－2N个突变基因 【答案】AC 【分析】根据模板链的方向可知，目的基因转录的方向为从左向右。 【详解】A、PCR扩增引物之间的DNA片段，根据转录的方向和脱氧核苷酸连接在引物的3'端，所以应该选择引物②和③，引物②扩增出来的对应模板链，所以在②中进行碱基替换，A正确； B、选择正确的引物②和③进行PCR扩增，可以在第二轮循环就可以获得改造后的基因，B错误； C、通过基因定点突变技术，通过改造基因达到改造蛋白质的目的，获得耐热性提升的β—淀粉酶，属于蛋白质工程，C正确； D、经过N轮循环，共有2N个DNA分子，共有三种类型的DNA分子：含最初母链的2个DNA分子，突变基因，以该DNA下链为模板复制出的子链再作为模板扩增出的DNA分子（第二次扩增开始出现，每次增加1个，即N-1个），故含突变位点的DNA数目为2N－2-（N-1）=2N－N-1，D错误。 故选AC。 三、解答题 13．（24-25高二下·山东滨州·期末）多环芳烃是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌导入重组质粒，制备多环芳烃生物传感器，为环境污染治理提供新方法。部分信息如图所示。 (1)启动子的作用是________，nahR和mrfp转录的模板链________（填“是”或“否”）为DNA分子的同一条链。除图1标出的结构外，该重组质粒还需具备的结构有________（答出2点）。 (2)环境中存在多环芳烃时，________基因表达的调控蛋白与之结合，激活________启动子，________基因表达，菌体发出红色荧光，发出荧光后，红色荧光蛋白可以很快被降解。 (3)环羟基化双加氧酶基因（baaA）编码的环羟基化双加氧酶可以降解多环芳烃，baaA与mrfp连接成融合基因，则可利用同一个启动子同时驱动两个基因的表达，实现对多环芳烃的动态检测和清除。现欲通过PCR判定两基因是否融合成功，应选择图2中的引物组合是________。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但大肠杆菌菌株本身会造成水源安全隐患。已知Bc1基因表达毒蛋白可使工程菌致死，Bc2基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效。科学家将Bc1、Bc2两个基因插入原有序列中，使多环芳烃被耗尽时菌株即启动“自毁”。则Bc1、Bc2两个基因分别插入图3中的________、________位点。 【答案】(1) RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因的转录 否 标记基因、复制原点 (2) nahR Ps（多环芳烃诱导型） mrfp (3)引物1和3 (4) B F 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因的转录出mRNA，从图中可以看到，nahR和mrfp转录方向相反，所以转录的模板链不是DNA分子的同一条链。重组质粒除图中标出的结构外，还应具备复制原点（保证重组质粒能在宿主细胞中自我复制）、标记基因（便于筛选含有重组质粒的受体细胞，如抗生素抗性基因等）。 （2）由图可知，环境中存在多环芳烃时，会与nahR基因表达的调控蛋白结合，从而激活Ps启动子，mrfp基因表达，使菌体发出红色荧光，发出荧光后，红色荧光蛋白可以很快被降解。 （3）PCR技术要求引物与模板链的3'端互补配对，且DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链，要判定baaA基因与mrfp基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合，引物1和引物3可以分别与融合基因中baaA基因的 3' 端和mrfp基因的 3' 端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3。 （4）Bc2基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在多环芳烃存在时工程菌正常生存，Bc2应插入在Ps启动子之后，即图中的F位点，这样在多环芳烃存在时，Ps启动子启动，Bc2基因表达抗毒素蛋白，Bc1基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当多环芳烃被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，Bc1应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B位点。 14．（24-25高二下·山东济南·期末）成熟的番茄果实因细胞壁中的多聚半乳糖醛酸被PG基因（图甲所示）编码的多聚半乳糖醛酸酶分解，使果实变软，不耐贮藏。为获得耐贮藏番茄，科研人员构建反义PG基因重组载体，利用农杆菌转化法导入番茄细胞，成功获得PG基因沉默的转基因品种，具体过程如图乙所示。 (1)完成图乙中③过程需要的条件有_______，其中每次循环包含_______等步骤。若番茄细胞内PG基因以其b链为模板表达，依据图中PG基因碱基序列及限制酶的信息，完成③过程的两种引物的碱基序列（写前10个碱基即可）:5'—_______—3 ，5 —_______—3 。 (2)转基因番茄的培育中，完成③—⑤过程，至少共需要_______种酶，过程④中用E8启动子替换Ti质粒上的原有启动子的目的是_______。 (3)利用农杆菌转化法将反义PG基因重组载体导入番茄细胞的原理是_______。图中⑥过程可用含有_______（答“抗生素种类”）的培养基筛选成功转化的大豆细胞。 (4)反义PG基因重组载体导入受体细胞后，目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性，需通过检测与鉴定才能知道，可采用_______技术检测番茄植株的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出mRNA。通过个体生物学水平的鉴定发现，转基因番茄比普通番茄贮存时间明显延长，推测其机理是_______。 【答案】(1) 模板、四种脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、（缓冲液） 变性、复性、延伸 CTCGAGCAGT AGATCTATCG (2) 6 在番茄果实中驱动目的基因反义PG基因特异性表达 (3) 将反义PG基因拼接到农杆菌中Ti质粒上的T-DNA上，利用其特性将目的基因转移到被侵染的番茄细胞中，并将其整合到该细胞的染色体上 潮霉素 (4) PCR 反义PG基因转录出的mRNA与番茄内PG基因转录出的mRNA进行碱基互补配对，形成了双链RNA，从而阻断了多聚半乳糖醛酸酶酶基因的翻译过程，使多聚半乳糖醛酸不被分解，番茄不变软 【分析】图中：①表示逆转录过程，②表示DNA的复制，③表示PCR，④将质粒上的启动子替换成E8启动子，⑤表示构建基因表达载体，⑥表示把目的基因导入受体细胞。 【详解】（1）③表示PCR，需要模板、四种脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、（缓冲液）等条件。 每次循环包含变性、复性和延伸等操作。 根据Ti质粒上的限制酶识别序列可知，应该选择限制酶BamHⅠ和SalⅠ进行切割，又因为目的基因内部有这两种酶的识别序列，故不能用这种酶切割目的基因，根据图中限制酶的识别序列可知，可以用同尾酶XhoⅠ和BglⅡ分别替代SalⅠ和BamHⅠ切割目的基因，故需要在目的基因的两端加上这两种酶的识别序列。 若番茄细胞内PG基因以其b链为模板表达，则目的基因需要以a链为模板进行转录，即转录的方向为从左向右，结合质粒中的启动子、终止子及两种酶的位置可知，需要在目的基因的左侧加上BglⅡ的识别序列，右侧加上XhoⅠ的识别序列，故在进行PCR扩增时，左侧引物的序列为AGATCTATCG，右侧引物的序列为CTCGAGCAGT。 （2）③表示PCR，该过程需要耐高温的DNA聚合酶催化，④将质粒上的启动子替换成E8启动子，该过程需要XhoⅠ和BamHⅠ对质粒进行切割，且需要DNA聚合酶将E8启动子连接在载体上，⑤表示构建基因表达载体，该过程需要用XhoⅠ和BglⅡ切割目的基因，需要用SalⅠ和BamHⅠ切割质粒，再用DNA连接酶把目的基因和质粒连接起来，③→⑤共需要6种酶的催化。E8启动子是番茄果实中特异性表达的基因的启动子，用其替代Ti质粒上的原有启动子，可以在番茄果实中驱动目的基因反义PG基因特异性表达。 （3）农杆菌转化法是将反义PG基因拼接到农杆菌中Ti质粒上的T-DNA上，利用其特性将目的基因转移到被侵染的番茄细胞中，并将其整合到该细胞的染色体上。由于T-DNA上含有潮霉素的抗性基因，⑥过程可用含有潮霉素的培养基筛选成功转化的大豆细胞，含目的基因的大豆细胞可以在该培养基上存活。 （4）可以提取转基因番茄染色体上的DNA或番茄果实中的mRNA逆转录出DNA，再用PCR进行检测目的基因是否插入番茄的染色体DNA及是否转录出mRNA。反义PG基因转录出的mRNA与番茄内PG基因转录出的mRNA进行碱基互补配对，形成了双链RNA，从而阻断了多聚半乳糖醛酸酶酶基因的翻译过程，使多聚半乳糖醛酸不被分解，番茄不变软，故转基因番茄比普通番茄贮存时间明显延长。 15．（24-25高二下·山东菏泽·期末）科研人员将胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）基因插入含胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因的表达载体中，使其在棉花细胞中表达NaPI-StPinlA融合蛋白，过程如图1所示。请回答下列问题： (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为______。已知StPinlA基因上无限制酶的识别序列，据图1分析，为了使扩增后的StPinlA基因与NaPI基因正确连接形成融合基因，用PCR技术扩增StPinlA基因时，需要设计合适的引物，引物P2包含的碱基序列为5'-______（写出12个碱基序列）-3'，同时应选用限制酶______对NaPITi质粒进行切割。对获得的NaPI-StPinlA融合基因进行扩增，可选择图1中的一对引物是______。 (2)融合基因启动子的作用是______，为使连接后的NaPI-StPinlA融合基因能够表达，设计时剔除NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列，目的是______。 (3)将构建好的重组Ti质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有______的固体培养基上，选择出生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养，在愈伤组织阶段取细胞A、B、C、D中的DNA，特异性扩增后的电泳结果如图2所示，其中成功导入NaPI-StPinlA融合基因的细胞是______。 【答案】(1) 复制原点 GAATTCTCTCCG EcoRI和HindIII P1、P4 (2) RNA 聚合酶识别和结合的部位，可驱动融合基因转录 确保融合蛋白能够连续翻译 (3) 卡那霉素 C 【分析】分析题意可知，实验目的时为了将胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因插入胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因的表达载体中，并对棉花进行共同转化，使其在棉花细胞中表达NaPI-StPinlA融合蛋白，从而获得转基因植株。分析题图可知，StPinlA要插入到NaPI的后面形成融合基因。 【详解】（1） 质粒能在宿主细胞中复制依赖于复制原点，因此 Ti 质粒上与其在农杆菌中复制能力相关的结构为复制原点。StPinlA基因上无限制酶的识别序列，为了使扩增后的StPinlA基因能够与Ti质粒上的NaPI基因正确连接，用PCR技术扩增StPinlA基因时，需要设计合适的加端引物，依据图1及表的信息推测，StPinlA要插入到NaPI的后面形成融合基因，且转录链的3'端应与启动子接近，故在切割Ti质粒时需要用限制酶EcoRI和HindIII，故引物P2包含的碱基序列为5'-GAATTCTCTCCG-3'。对获得的NaPI-StPinlA融合基因进行扩增，上游引物选P1，下游引物选P4。 （2） 启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，可驱动融合基因转录。为了使连接后的重组基因NaPI-StPinlA能够表达出融合蛋白，应剔除NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列。 （3） Ti质粒上游卡那霉素抗性基因，将构建好的重组Ti质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有卡那霉素的固体培养基上，从而选择出生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养。在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA进行PCR和凝胶电泳，此操作的目的是检测重组基因NaPI-StPinlA是否导入，取细胞A、 B、C、D中的DNA扩增后的电泳结果如图2所示，由于NaPI基因长度为462bp，StPinlA基因长度为750bp，融合基因长度大约为462+750=1212bp，其中成功导入重组基因NaPI-StPinlA的细胞是C。 16．（24-25高二下·山东东营·期末）研究发现，玉米G基因启动子自然突变株系BT-1中G基因的表达量较野生型显著降低，从而表现出对玉米穗腐病（病原菌需破坏植物细胞壁侵入细胞内部汲取营养）较强的抗性。研究G基因与玉米穗腐病的关系，对培育抗玉米穗腐病玉米品种具有重要意义。相关信息如下图所示。回答下列问题。 部分目的基因序列：5'CTACGTTAGCACG……CGATCCGTAATCAT3′ 注：LB/RB：T-DNA边界序列；图中所示目的基因序列是逆转录得到的单链；ATG对应起始密码子；TAG对应终止密码子。 以下为限制酶识别序列及切割位点： Acc65I：5'-G↓GTACC-3′  KpnI：5'-GGTAC↓C-3′  NheI：5'-G↓CTAGC-3'  BamHI：5'-G↓GATCC-3′  SpeI：5'-A↓CTAGT-3' (1)PCR技术扩增G基因过程中与解旋酶作用相同的步骤是______。检测发现G基因中只有一个限制酶（KpnI）识别序列，载体、目的基因及限制酶相关信息如上所示。若要保证G基因的正确连接，可在G基因上游添加________限制酶识别序列，则目的基因上游扩增引物序列应为5'_______3'（写出10个碱基）。 (2)将构建好的G基因过表达载体导入到农杆菌中时，首先用Ca2+处理农杆菌，处理的目的是________。含重组质粒的农杆菌侵染野生型玉米愈伤组织时，培养基中应添加_______抗生素进行筛选，目的是_______。 (3)培养获得G基因过表达植株OE-1后，科研人员又创制了G基因敲除株系KO-1。用穗腐病病原菌分别侵染不同玉米株系后，发现BT-1及KO-1株系中果胶、纤维素含量较野生型及OE-1显著升高，且表现出对穗腐病较强抗性。从结构与功能角度分析G基因与玉米穗腐病抗性之间的关系及作用机制______。 【答案】(1) 高温变性 BamHI GGATCCATGA (2) 使农杆菌处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态 潮霉素 筛选成功导入载体的玉米愈伤组织细胞 (3)G基因抑制玉米植株中果胶和纤维素的合成，降低细胞壁的结构强度，使细胞壁保护作用弱，易被病原菌侵入，从而降低玉米对穗腐病的抗性 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）PCR中高温变性使DNA解旋，与解旋酶作用相同；检测发现玉米G基因中只有一个限制酶（KpnI）识别序列，则目的基因不能使用限制酶（KpnI）切割，避免破坏目的基因，载体也不能用 KpnI切割，NheI和SpeI切割后会产生相同的黏性末端，要保证正确连接，结合载体酶切位点和目的基因序列，可在G基因上游添加BamHI识别序列，根据目的基因单链序列和BamHI识别序列（5'-G↓GATCC-3′ ），与限制酶KpnI（5'-GGTAC↓C-3′）产生相同的黏性末端，便于连接。引物序列:5'- GGATCCATGA-3'，其中 前6个碱基GGATCC 是BamHI识别 序列，ATG对应起始密码子。 （2）Ca2+处理农杆菌使其成为感受态细胞，使农杆菌处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态；重组质粒含潮霉素抗性基因，故培养基中应添加潮霉素可筛选成功导入载体的玉米愈伤组织细胞。 （3）用穗腐病病原菌分别侵染不同玉米株系后，发现BT-1及KO-1株系中果胶、纤维素含量较野生型及OE-1显著升高，G基因表达量降低，会使果胶、纤维素含量升高，细胞壁结构更坚固，能抵御病原菌侵染，增强对穗腐病抗性；G基因过表达则相反，使植株对穗腐病抗性减弱，故可知G基因抑制玉米植株中果胶和纤维素的合成，降低细胞壁的结构强度，使细胞壁保护作用弱，易被病原菌侵入，从而降低玉米对穗腐病的抗性。 17．（24-25高二下·山东泰安·期末）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindⅢ、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 (1)Luc基因载体上有一段P2A序列（表达产物为2A肽），其功能如图3所示，据此推测P2A的作用________。 (2)形成vtg-Luc基因重组载体时，为确保vtg基因正向连接，应选用限制酶________切割Luc基因载体。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′________3′。（写出已知的所有碱基序列） (3)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含________的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是________。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的________，待发育成熟后，往水体中添加_______进行检测。 【答案】(1)使基因1和基因2的表达产物（融合蛋白）发生切割，形成两个独立的蛋白质 (2) BclI、HindIII 5'-TGATCAAACTAT-3' (3) 卡那霉素 vtg基因只在肝脏中特异性表达 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【分析】基因工程的步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）从图3可以看到，基因1-P2A-基因2转录翻译后形成的融合蛋白，在2A肽的作用下切割成蛋白1和蛋白2。所以据此推测P2A的作用是使基因1和基因2的表达产物（融合蛋白）发生切割，形成两个独立的蛋白质 。 （2） 由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，确保vtg基因正向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BclI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。对于引物1，根据PCR技术中引物与模板链碱基互补配对原则，且引物1是与图1中vtg基因的模板链（已知序列）的3'端互补配对，并且在引物1的5'端需加上限制酶BclI的序列，所以引物1包含的碱基序列为5' - TGATCAAACTAT - 3' 。 （3） Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。Luc基因为荧光素酶基因，待发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素进行检测，因为雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，若某个重组载体导入的斑马鱼能发出荧光，就说明该导入的酶切片段中含有能与E蛋白结合的序列，从而启动了Luc基因的表达 。 18．（24-25高二下·山东威海·期末）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌以处理重金属废水。 (1)提取枣树细胞的总RNA，经反转录获得总cDNA，再利用PCR技术选择性扩增MT基因的cDNA（图甲），此过程需要用到的工具酶有______。图甲A位点和B位点分别是MTcDNA中对应起始密码子和终止密码子的位置，扩增MTcDNA时选用的引物为______。反应过程中的引物长度通常为20～30个核苷酸，所用的引物越长，扩增效率越______。扩增产物常用______（填具体方法）来鉴定。 (2)Tm值（熔解温度或退火温度）是指DNA双链解聚为单链时所需的温度，常用计算公式为：Tm=4℃×（G+C）+2℃×（A+T），其中碱基表示单链中对应的碱基个数。若引物6与其模板链的嵌合区共含20个碱基对，其中鸟嘌呤有9个，则嵌合区的Tm值为______℃。 (3)图乙质粒中未标出的必要元件是______。结合图甲～丙分析，为保证构建基因表达载体时MT基因与质粒的正确连接，扩增MT基因时，应在相应引物的______端分别添加限制酶______的识别序列。 (4)将重组质粒导入处理后的大肠杆菌获得工程菌，经培养后测得工程菌中MT蛋白的表达量是对照组的7倍，为进一步检验工程菌能否应用于生产实践，还需要在个体水平测定______。 【答案】(1) 逆转录酶、Taq酶 4和5 低 琼脂糖凝胶电泳法 (2)58℃ (3) 标记基因 5' BamHI和HindIII（或BglII和HindIII） (4)MT工程菌吸附重金属的能力 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心 步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子 和标记基因等。(3）将目的基因导入受体细胞; (4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了 mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成 蛋白质—抗原—抗体杂交技术；个体水平上的鉴定： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）RNA先经反转录获得总cDNA，再利用PCR技术选择性扩增MT基因的cDNA（图甲），此过程需要用到的工具酶有逆转录酶、Taq酶。密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达（即保证扩增出的序列能编码起始密码子和终止密码子），一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，且DNA聚合酶从能将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3’端，故选择引物5和引物4。反应过程中的引物长度通常为20～30个核苷酸，所用的引物越长，扩增效率越低。扩增产物常用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定。 （2）若引物6与其模板链的嵌合区共含20个碱基对，其中鸟嘌呤有9个，碱基表示单链中对应的碱基个数，在单链中，G+C=9，A+T=11，Tm=4℃×（G+C）+2℃×（A+T）=4×9+2×11=58℃ 。 （3）图乙质粒中未标出的必要元件是标记基因，为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，应在相应引物的5'端选择BamHI和HindIII（或BglII和HindIII）对MT基因的cDNA和质粒进行切割。 （4）为进一步检验工程菌能否应用于生产实践，还需要在个体水平测定MT工程菌吸附重金属的能力。 19．（24-25高二下·山东枣庄·期末）将苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白基因转入棉花可以获得抵抗棉铃虫的抗虫棉。但转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，与其他蛋白相互作用，导致棉花产量下降。C蛋白能结合纤维素，科研人员将编码C蛋白的C基因与Bt基因连接构建融合基因，导入棉花细胞，能够使抗虫蛋白在细胞壁积累，解决了抗虫蛋白高表达造成的低产问题。实验流程如图所示： 限制酶 BamHI BclI NcoI SphI 识别序列和切割位点 5´－G↓GATCC－3´ 5´－T↓GATCA－3´ 5´－C↓GATGG－3´ 5´－GCATG↓C－3´ (1)将C基因和Bt基因融合需要形成______键。为了保证融合基因能够正常表达出融合蛋白，需要将C基因中____________序列去掉。 (2)为筛选出正确连接的融合基因，可选择图中的引物______（填序号）进行PCR。PCR扩增的反应体系中还应该加入____________（至少两种）。 (3)根据图中酶切后融合基因的黏性末端，在构建基因表达载体时需选用______限制酶对质粒进行切割。先用______处理农杆菌，再将重组质粒导入其中，最后用含______的培养基筛选出转化成功的棉花细胞。 【答案】(1) 磷酸二酯键 终止密码子对应的 (2) 1和4 耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、缓冲液（答出两种即可） (3) SphI和BamHI Ca2+ 潮霉素 【分析】1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）将C基因和Bt基因进行拼接需要形成磷酸二酯键，为了保证融合基因能够正常表达出融合蛋白，需要将C基因中的终止密码子序列去掉。 （2）将C基因和Bt基因进行拼接首先分别用引物1和引物2扩增C基因，引物3和4扩增B基因，再将两种PCR产物进行高温变性，低温复性，即可得到含C-Bt融合基因的产物；其中引物2与引物3局部碱基互补配对，得到的融合基因用引物1和4进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系中还应该加入耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、缓冲液。 （3）C基因的上游末端序列是端序列是5'-CATG-3'，正好是SphⅠ限制酶的黏性末端，Bt基因的下游末端序列是5'-GATC-3'，正好是BclI限制酶的黏性末端。在构建基因表达载体时需选用SphI和BamHI，这样才能确保目的基因与载体定向拼接。农杆菌转化法中将表达载体导入农杆菌需要用Ca2+处理农杆菌，然后用含有重组表达载体的农杆菌去侵染棉花细胞。根据图示可知，只有潮霉素的抗性基因在T-DNA上，可以转移到棉花细胞的DNA中，所以在培养基中添加潮霉素，如果含有目的基因的T-DNA成功整合到棉花细胞的染色体DNA上，则能在该培养基上生长。 20．（24-25高二下·山东德州·期末）G基因能提高大豆的光能利用率，研究发现G蛋白可能是通过与A蛋白结合来发挥作用。科研人员欲利用酵母双杂交技术验证该发现，该技术的原理是AD蛋白与BD蛋白结合在一起时，能够与酵母细胞中LacZ基因启动子上游激活序列结合，启动LacZ基因表达，LacZ基因表达产物能催化培养基中X - gal形成蓝色物质，如图1所示。构建重组质粒2所用质粒及相关限制酶的识别序列如图2所示。 (1)进行酵母双杂交技术时，________（填“需要”或“不需要”）将酵母菌原有的BD - AD结合途径阻断，重组质粒1中色氨酸合成基因的作用是________。 (2)已知A - AD融合基因模板链的部分序列为5'—TACCCACATCTA……CGTTC - CACGCTG—3'。为保证该融合基因正确拼接到质粒上，据图2分析，扩增该融合基因时应选用的引物序列为5'—________—3'和5'—________—3'（写出12个碱基）。扩增时，缓冲液中Mg2+的作用是________。 (3)为实现检测目的，培养酵母细胞所用培养基成分的特点是________。若酵母细胞在培养基上形成________菌落，则说明G蛋白与A蛋白发生了结合。 (4)为使实验更加严谨，还应设计3组对照组：对照组1的重组质粒1、2上分别携带BD基因和AD基因，对照组2和对照组3的重组质粒上携带的目的基因是________、________。 【答案】(1) 需要 用于在不含色氨酸的缺陷培养基上筛选携带该质粒的酵母细胞 (2) 5'—CTGCAGTACCCA—3' 5'—GAATTCCAGCGT—3' 激活Taq DNA聚合酶 (3) 不加色氨酸和亮氨酸，加如X‑gal 蓝色 (4) G-BD融合基因和AD基因 BD基因和A-AD融合基因 【分析】基因工程（重组DNA技术）的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）为了避免原有BD - AD结合途径对实验造成干扰，酵母双杂交实验须先阻断酵母自身BD‐AD的结合途径。由图可知，酵母细胞不能合成其生存所必需的色氨酸和亮氨酸，重组质粒1上携带的色氨酸合成基因可使缺陷型酵母细胞在不含色氨酸的培养基上仍能生长，从而用于在不含色氨酸的缺陷培养基上筛选携带该质粒的酵母细胞，视为转化成功。 （2）根据图中质粒的酶切位点，由于Xba I会破坏亮氨酸融合基因（作为标记基因），所以构建基因表达载体时应选 Eco RI与Pst I，已知A - AD融合基因模板链的部分序列为5'—TACCCACATCTA……CGTTC - CACGCTG—3'，则转录方向为从右向左。为保证该融合基因正确拼接到质粒上，模板链的5'端加Pst酶切位点，模板链的3'端加EcoRI的酶切位。即扩增该融合基因时应选用的引物序列为5'—CTGCAGTACCCA—3'和5'—GAATTCCAGCGT—3'。PCR扩增时，Mg²⁺离子的作用是激活Taq DNA聚合酶。 已知A - AD融合基因模板链的部分序列为5'—TACCCACATCTA……CGTTC - CACGCTG—3'，则转录方向为从右向左。为保证该融合基因正确拼接到质粒上，模板链的5'端加Pst酶切位点，模板链的3'端加EcoRI的酶切位。即扩增该融合基因时应选用的引物序列为5'—CTGCAGTACCCA—3'和5'—GAATTCCAGCGT—3'。 （3）酵母菌本身缺乏色氨酸和亮氨酸合成能力，所以培养基中不补充相应氨基酸，就只能使带有合成基因的重组菌株存活，LacZ基因表达产物能催化培养基中X - gal形成蓝色物质，所以应加入X‑gal，通过LacZ基因表达产物将菌落染成蓝色，从而达到筛选重组质粒的作用。菌落变蓝表示G蛋白与A蛋白结合并激活了LacZ基因。 （4）为排除单独的G蛋白或A蛋白自身就能激活LacZ基因，产生假阳性，对照组1的重组质粒1、2上携带的目的基因分别是BD基因和AD基因（分别表达BD蛋白、AD蛋白），对照组2的重组质粒1、2上携带的目的基因分别是G-BD融合基因和AD基因（分别表达G蛋白和BD蛋白、AD蛋白），对照组3的重组质粒1、2上携带的目的基因分别是BD基因和A-AD融合基因（分别表达BD蛋白、A蛋白和AD蛋白）；若观察到实验组（可同时表达G蛋白、BD蛋白、A蛋白和AD蛋白）菌落为蓝色（说明成功激活LacZ基因），对照组菌落为白色（说明LacZ基因没有激活），则表明G蛋白能够与A蛋白发生相互作用。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 3大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 DNA的粗提取、PCR和电泳鉴定 考点03 基因工程的基本操作程序与应用和蛋白质工程 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·山东济南·期末）研究人员根据含有S基因的DNA序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，引物与DNA结合位点如甲图所示。为选出正确和有效的引物，以含有S基因的DNA为模板进行PCR后，将获得的产物进行电泳，电泳结果如乙图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．能特异性扩增S基因目的片段的引物组合为F1-R1 B．4种引物中可用于特异性扩增目的片段的引物是F1、R1和R2 C．通常情况下，扩增所用的引物越短，引物特异性越低 D．在F1和R1的5'端添加的限制酶序列最好避免产生相同的黏性末端 2．（24-25高二下·山东济南·期末）大肠杆菌β -半乳糖苷酶（Z酶）可催化底物（X - gal）水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，lacZ'编码Z酶氨基端的一个片段（称为α -肽），该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知α -肽、不含α -肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用甲、乙构建目的基因的表达载体，下列相关叙述正确的是（    ） 图中AmpR是氨苄青霉素抗性基因；Sal I、Hind Ⅲ是限制酶识别序列 A．就筛选功能而言，AmpR是标记基因，lacZ基因不是标记基因 B．使用限制酶SalⅠ切割质粒和目的基因所在DNA，仅考虑目的基因和质粒两两连接，在DNA连接酶的作用下可出现3种连接产物 C．为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，受体大肠杆菌中编码α -肽的DNA序列缺失，其他序列正常 D．重组质粒转化后的大肠杆菌先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，再原位影印到含X - gal的培养基上，选出蓝色菌落中即含有含目的基因的重组质粒 3．（24-25高二下·山东枣庄·期末）下图是一种特殊的限制性内切核酸酶BbsⅠ。这种酶包含两个部分，一个部分识别6个特定的核苷酸序列，另一个部分可以切割双链DNA产生末端，作用原理如图1所示。下列叙述错误的是（    ） A．限制酶主要从原核生物中分离纯化出来 B．理论上该酶切割后可以产生256种黏性末端 C．图2序列被BbsⅠ完全作用后，可以得到两种DNA片段 D．用BbsI同时处理目的基因和载体不一定实现目的基因与载体的定向连接 二、解答题 4．（24-25高二下·山东临沂·期末）土壤盐渍化影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入普通水稻中，培育出了耐盐碱水稻新品种。具体操作流程及可能用到的限制酶如下图，①~⑦表示操作过程，其中Bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。已知AUG为起始密码子，UAA、UAG、UGA为终止密码子。 限制酶 Ⅰ Ⅰ Ⅰ 识别位点及切割位点（5’→3’） (1)过程①、②利用的酶有________，已知OsMYB56基因两端不含限制酶识别序列，为与载体连接可在该引物的________端添加相应的识别序列，结合图中信息分析，过程②扩增OsMYB56基因时图中右侧使用的引物序列为________________（从5＇端向3＇端方向写出前12个碱基）。 (2)根据基因表达载体的结构组成推测，Ti质粒中CaMV35S的功能是________；基因表达载体中，OsMYB56基因和Bar基因转录模板链________（填“是”或“否”）为Ti质粒的同一条链，其中Bar基因转录的模板链为________（填“a链”或“b链”）。 (3)过程④导入根瘤农杆菌常用的方法是________，筛选含有重组质粒的根瘤农杆菌时，应分别先后使用含________的选择培养基筛选，预期结果是________________。 地 城 考点02 DNA的粗提取、PCR和电泳鉴定 一、单选题 1．（24-25高二下·山东滨州·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“PCR及电泳鉴定”实验。下列说法正确的是（    ） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集 B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，Mg2+浓度越高，酶活性越大 C．待分离的DNA分子质量越大，电泳后距离点样孔越远 D．DNA电泳指示剂需要加入到凝固之前的琼脂糖凝胶中 2．（24-25高二下·山东济南·期末）关于“DNA粗提取与鉴定”（实验1）、“DNA片段的扩增及电泳鉴定实验”（实验2）下列说法正确的是（    ） A．实验1中，DNA粗提取时加入95％冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集 B．实验1中，DNA分子在2mol/LNaCl溶液中与二苯胺混匀，加热后可反应生成蓝色化合物 C．实验2中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时，加样前应先接通电源 D．实验2中，凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA分子结合，用于观察电泳进程 3．（24-25高二下·山东淄博·期末）关于 “DNA 片段的扩增及电泳鉴定” 实验,下列说法正确的是（    ） A．PCR 反应体系中一般要添加钙离子用于激活体系中相应的酶 B．PCR 实验中使用的移液器、微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压灭菌处理 C．利用微波炉将琼脂糖加热至熔化后, 即时加入适量的核酸染料混匀, 再倒入模具 D．将 PCR 产物与含有指示剂的凝胶载样缓冲液混合,然后注入凝胶加样孔内 4．（24-25高二下·山东菏泽·期末）研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，从而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoI酶切割后电泳，结果如图所示。下列说法错误的是（    ） A．2号加样孔中的样品是未经ApoI酶切的PCR产物 B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI酶失活导致 C．测序比对3号和4号条带可获得缺失的碱基序列 D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关 5．（24-25高二下·山东德州·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物”实验，下列说法错误的是（　　） A．DNA粗提取实验所用的研磨液中含有抑制DNA酶活性的物质 B．DNA鉴定过程中，DNA的活性会丧失 C．凝胶载样缓冲液中的指示剂可使DNA在紫外灯下被检测出来 D．若PCR过程中复性温度过低，电泳时可能会出现非特异性条带 6．（24-25高二下·山东泰安·期末）某科研小组进行了如下实验：称取30g洋葱切碎，充分研磨后过滤得到滤液，将滤液放置几分钟后取上清液，加入酒精溶液，此时溶液中出现了白色丝状物，用玻璃棒搅拌后卷起丝状物，经二苯胺鉴定后得出丝状物是DNA的结论。下列说法正确的是（　　） A．新鲜的菠菜或鸡血按照上述实验操作也可以得到相同的实验结果 B．滤液应放于常温下静置几分钟后取上清液 C．上清液中应加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液 D．鉴定时应将丝状物溶于0.4mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺溶液后沸水浴 7．（24-25高二下·山东临沂·期末）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（    ） A．提取DNA时，可将研磨液进行离心处理，DNA在沉淀中 B．将DNA丝状物溶于NaCl后，加入二苯胺试剂即会呈现蓝色 C．凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA大小和构象均有关 D．琼脂糖溶液倒入模具前需加入适量的凝胶载样缓冲液并混匀 8．（24-25高二下·山东威海·期末）关于DNA分子的粗提取及DNA片段的电泳鉴定，下列说法正确的是（    ） A．可利用DNA能溶于酒精而某些蛋白质不溶于酒精的原理初步分离DNA与蛋白质 B．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小呈正相关 D．电泳鉴定PCR产物时还需留一个加样孔加入标准参照物 9．（24-25高二下·山东威海·期末）重叠延伸PCR是一种能够在体外实现不同来源DNA片段定向重组的技术。具体原理是：通过利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，借助重叠链的延伸将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，其过程如下图所示。下列说法错误的是（    ） A．PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同 B．PCR3反应体系中经变性和复性后的DNA单链理论上有4种结合的可能 C．重叠链延伸生成融合基因时需要加入引物 D．PCR4中需要添加的引物是引物1和4 10．（24-25高二下·山东聊城·期末）反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图所示。下列说法正确的是（    ） A．应选择引物2和引物3进行PCR扩增 B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关 C．PCR产物不含EcoRI的酶切位点 D．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 二、多选题 11．（24-25高二下·山东滨州·期末）下图所示为以1个DNA为模板进行PCR，第一轮复性环节的示意图，其中引物F、R的5'端均添加有6个碱基的限制酶识别序列。下列说法正确的是（    ） A．图示环节所需的温度是PCR 3个环节中最低的 B．经过多轮PCR后，形成的双链等长DNA分子均为985bp C．F与R不能出现可以配对的碱基，以免形成引物二聚体 D．若进行n轮循环，共需引物F 2n－1个 12．（24-25高二下·山东菏泽·期末）蛛丝有超强韧性，科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中，获得乳腺生物反应器，在基因工程中可通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术检测目的基因是否导入受体细胞。下列说法错误的是（    ） A．PCR过程中为了减少非特异性扩增，可增加引物长度且适当降低复性温度 B．科学家将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．在凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．如果电泳结果显示羊体细胞中含有蛛丝蛋白基因，则其乳汁中含有蛛丝蛋白 13．（24-25高二下·山东东营·期末）利用小球藻生产生物柴油，具有广阔的开发利用前景。科学家从酵母菌中提取DGAT基因（DGAT：二酸甘油酰基转移酶，合成油脂重要基因），导入到小球藻中增强小球藻油脂代谢途径，最终获得高产油脂小球藻。已知质粒上EcoRI酶切位点与XbaI酶切位点间最短间隔为300bp。下列说法正确的是（　　） A．扩增产物的长度决定PCR延伸的时间，引物的G/C含量决定复性的温度 B．若采用PCR技术对一个DGAT基因进行扩增，则复制n代共需要引物2n+1-2个 C．pB121载体中使用酵母菌的启动子可让DGAT基因在小球藻中更好表达 D．由电泳结果可知a为构建成功的重组质粒，b为未连接目的基因的空质粒 14．（24-25高二下·山东泰安·期末）拟南芥中RGL1酶作为E3泛素连接酶（AtRZF1）的抑制因子在植物耐干旱适应中发挥着重要作用。研究发现，AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性。研究人员采用融合PCR技术（原理如下图所示）将RGL1酶基因和AtRZF1基因连接起来构建融合基因以研究两种基因的相互作用。下列说法错误的是（　　） A．RGL1酶在植物耐干旱适应过程中起到正调控作用 B．图中第一阶段经过1次PCR循环即可获得双链等长的DNA C．图中第二阶段构建融合基因时能够起到“搭桥融合”作用的引物有4种 D．PCR技术操作过程中的每个循环都需经历两次降温和一次升温 三、解答题 15．（24-25高二下·山东聊城·期末）花椰菜是人们喜爱的蔬菜，但黑腐病是困扰花椰菜种植的一大问题，研究人员希望通过植物体细胞杂交的方式，让花椰菜获得黑芥的黑腐病抗性基因。回答下列问题。 (1)研究者通过如图1的过程，获得再生植株。 ①需要使用________（试剂）对花椰菜、黑芥组织进行消毒，消毒的目的是_______。 ②图中（a）处应填写_______，细胞融合成功的标志是_______。 (2)获得再生植株后，研究者利用各种手段进行筛选和鉴定。 ①研究者提取再生植株细胞的DNA，用特定引物进行PCR后，进一步电泳鉴定，结果如图2。X1、X2、X3是不同植株的测定结果，其中确定是杂种植株的是________，X1中包含全部来自花椰菜的特征性片段，但仅包含部分来自黑芥的特征性片段，其原因是_______。 ②筛选出杂种植株之后，需要鉴定其黑腐病抗性相对于原花椰菜植株是否提升，方法是_______。 16．（24-25高二下·山东聊城·期末）同源重组技术结合tet-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。如图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。回答下列问题。 (1)过程①PCR除需要加入耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、Mg2+、引物外，还需加入_______，其中引物的作用是________。 (2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需分别在引物5'端添加限制酶______的识别序列；若sacB基因扩增5代，则需要引物P1_______个。 (3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种_____的生理状态。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加_____。 (4)如图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度可推测PCR产物的长度，因此可判断泳道_____对应的菌株可能转化成功。过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5'端分别添加_______基因两端的同源序列。 (5)过程⑦中，在含有四环素和X-gal的培养基中出现了_______色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tet'-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加________。 17．（24-25高二下·山东淄博·期末）研究表明,镉(Cd)可降低叶绿素含量,抑制植物生长。金属硫蛋白 MT3 是人体中参与重金属解毒的主要蛋白,研究人员构建 融合基因表达载体, 利用烟草探究 MT3 能否富集 ,减弱 对植物的毒害作用。EGFP 是增强型绿色荧光蛋白,图甲表示 基因序列和载体部分结构。 MT3基因单链(cDNA):上游 5’-ATGGACCCTGAGACC．.....AGCTGCTGCCAGTGA-3’ 下游 (1) 对 MT3 基因进行 PCR 扩增时,需要使用的酶是_____,其作用是_____。图甲中所示的 MT3 基因序列为_____(填“模板链”“非模板链”)。 (2) 已知 SalI 酶识别序列为 5'-GTCGAC-3',EcoRV 酶识别序列为 5'-GATATC-3'。 在构建融合基因表达载体时,扩增 MT3 基因所需要的下游引物序列为: _____ (包括添加的限制酶识别序列,共写出 12 个碱基)。 (3)将融合基因表达载体转入农杆菌中,一般先用_____(填物质)处理使农杆菌容易吸收载体,再将转化后的农杆菌置于含_____的培养基中培养,便于筛选含重组质粒的农杆菌。用筛选后的农杆菌侵染烟草,一段时间后对烟草蛋白质进行抗体检测,电泳结果如图乙。其中细胞系_____成功表达出 MT3-EGFP 融合蛋白。 (4)用 的 溶液对野生烟草和转基因烟草植株进行处理,分别测定叶片叶绿素及 Cd 的含量,结果如图丙,由该结果可以得出的结论是_____。 地 城 考点03 基因工程的基本操作程序与应用和蛋白质工程 一、单选题 1．（24-25高二下·山东滨州·期末）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入黄瓜可提高黄瓜甜味。下图表示甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶酶切位点。下列说法错误的是（    ） A．基因表达载体的构建是培育转基因黄瓜的核心工作 B．为保证甜蛋白基因正确插入，可用限制酶Xba I和EcoR I切割目的基因及质粒 C．T - DNA的作用是携带甜蛋白基因进入黄瓜细胞并整合到其染色体DNA上 D．为确定甜蛋白基因是否导入黄瓜细胞，可用PCR技术进行检测 2．（24-25高二下·山东滨州·期末）通过蛋白质工程将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。下列说法错误的是（    ） A．改造AmyS1从预期蛋白质的功能出发 B．AmyS2是一种自然界中不存在的蛋白质 C．将AmyS1改造为AmyS2是通过直接改变AmyS1的氨基酸序列实现的 D．蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系是该技术的基础 3．（24-25高二下·山东滨州·期末）某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法错误的是（    ） A．制备的膀胱生物反应器，只有在膀胱细胞中才能表达W蛋白基因 B．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白需用相同的启动子 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 D．将含有W蛋白基因的表达载体导入山羊受精卵中可使用显微注射法 4．（24-25高二下·山东济南·期末）天然胰岛素B链的第20—29位氨基酸是胰岛素分子聚合的关键区域，聚合后的胰岛素活性会降低。科研人员利用蛋白质工程将B28位脯氨酸替换为天冬氨酸从而有效抑制胰岛素聚合。下列有关说法错误的是（    ） A．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础 B．该技术需对天然胰岛素的氨基酸序列直接进行操作，进而定向改变B28位脯氨酸 C．上述胰岛素的改造过程涉及中心法则中遗传信息的流向 D．可用基因组编辑技术来辅助完成目标碱基的替换 5．（24-25高二下·山东东营·期末）关于生物技术的安全性与伦理问题，下列说法错误的是（　　） A．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 B．将α-淀粉酶基因转入植物中可防止转基因花粉的传播 C．生殖性克隆人研究不能丰富人类基因的多样性 D．应该运用科学的方法控制并合理使用生物技术 6．（24-25高二下·山东东营·期末）研究发现，果聚蔗糖酶（LSase）第404位氨基酸与其热稳定性密切相关。为提升LSase的热稳定性，科研人员以野生型LSase基因为模板，设计引物改变LSase第404位氨基酸对应的碱基序列，实现对氨基酸的定点替换，相关流程如图所示。已知大肠杆菌含有20种合成蛋白质的氨基酸，F和R代表突变引物，DpnI能特异性的水解甲基化的DNA。下列说法错误的是（　　） A．若要选出热稳定性最强的LSase，至少需要设计19对突变引物 B．推测混合处理是让质粒发生变性与复性，新合成的子链未甲基化 C．对突变质粒进行进一步扩增时，可继续使用突变引物F和R D．采用琼脂糖凝胶电泳技术不能区分出原始质粒与突变质粒 7．（24-25高二下·山东德州·期末）为培育能表达 SGF14a - GFP 融合蛋白的转基因拟南芥，研究人员所构建的重组质粒部分结构如图。下列说法错误的是（　　） A．启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，但不是转录的起始位点 B．为确定 GFP 基因是否定向插入，可选用引物 F1和 R2进行 PCR 鉴定 C．用引物 F2和 R2对转基因拟南芥的 DNA 进行 PCR 可判断重组质粒是否成功导入 D．可通过转基因拟南芥细胞能否发出绿色荧光来判断融合基因是否成功表达 8．（24-25高二下·山东临沂·期末）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 9．（24-25高二下·山东威海·期末）下图为研发疫苗的几种方式，其中重组质粒的受体细胞为大肠杆菌，疫苗Ⅱ和疫苗Ⅲ分别为RNA疫苗和DNA疫苗。下列说法错误的是（    ） A．制备工程菌时一般先用Ca2+处理大肠杆菌 B．重组质粒可在工程菌拟核DNA之外独立存在 C．相较于传统的灭活病毒疫苗，疫苗Ⅰ因不能在人体内增殖而安全性更高 D．疫苗Ⅱ和疫苗Ⅲ发挥作用均需经转录和翻译过程 10．（24-25高二下·山东聊城·期末）生物技术在给生活带来进步的同时也引起了人们对其安全性的关注及对伦理道德的讨论。下列对生物技术安全性与伦理问题的说法，正确的是（    ） A．α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使卵细胞失去活性，从而防止基因污染 B．设计试管婴儿与普通试管婴儿的区别在于前者在植入前要对胚胎进行性别鉴定 C．生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类等，具有致病能力强、攻击范围广的特点 D．治疗性克隆利用细胞核全能性通过有性生殖产生特定细胞、组织和器官来治疗疾病 二、多选题 11．（24-25高二下·山东聊城·期末）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列说法错误的是（    ） A．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 B．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况 12．（24-25高二下·山东枣庄·期末）天然β—淀粉酶由484个氨基酸构成。研究发现，利用PCR技术对天然β—淀粉酶基因进行改造，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。下列叙述正确的是（    ） A．引物②中含突变碱基，利用引物②和引物③通过PCR可以获得改造基因 B．选择正确的引物进行PCR扩增，可以在第三轮循环获得改造后的基因 C．通过基因定点突变技术，获得耐热性提升的β—淀粉酶，属于蛋白质工程 D．经过N轮循环，可以得到2N－2N个突变基因 三、解答题 13．（24-25高二下·山东滨州·期末）多环芳烃是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌导入重组质粒，制备多环芳烃生物传感器，为环境污染治理提供新方法。部分信息如图所示。 (1)启动子的作用是________，nahR和mrfp转录的模板链________（填“是”或“否”）为DNA分子的同一条链。除图1标出的结构外，该重组质粒还需具备的结构有________（答出2点）。 (2)环境中存在多环芳烃时，________基因表达的调控蛋白与之结合，激活________启动子，________基因表达，菌体发出红色荧光，发出荧光后，红色荧光蛋白可以很快被降解。 (3)环羟基化双加氧酶基因（baaA）编码的环羟基化双加氧酶可以降解多环芳烃，baaA与mrfp连接成融合基因，则可利用同一个启动子同时驱动两个基因的表达，实现对多环芳烃的动态检测和清除。现欲通过PCR判定两基因是否融合成功，应选择图2中的引物组合是________。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但大肠杆菌菌株本身会造成水源安全隐患。已知Bc1基因表达毒蛋白可使工程菌致死，Bc2基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效。科学家将Bc1、Bc2两个基因插入原有序列中，使多环芳烃被耗尽时菌株即启动“自毁”。则Bc1、Bc2两个基因分别插入图3中的________、________位点。 14．（24-25高二下·山东济南·期末）成熟的番茄果实因细胞壁中的多聚半乳糖醛酸被PG基因（图甲所示）编码的多聚半乳糖醛酸酶分解，使果实变软，不耐贮藏。为获得耐贮藏番茄，科研人员构建反义PG基因重组载体，利用农杆菌转化法导入番茄细胞，成功获得PG基因沉默的转基因品种，具体过程如图乙所示。 (1)完成图乙中③过程需要的条件有_______，其中每次循环包含_______等步骤。若番茄细胞内PG基因以其b链为模板表达，依据图中PG基因碱基序列及限制酶的信息，完成③过程的两种引物的碱基序列（写前10个碱基即可）:5'—_______—3 ，5 —_______—3 。 (2)转基因番茄的培育中，完成③—⑤过程，至少共需要_______种酶，过程④中用E8启动子替换Ti质粒上的原有启动子的目的是_______。 (3)利用农杆菌转化法将反义PG基因重组载体导入番茄细胞的原理是_______。图中⑥过程可用含有_______（答“抗生素种类”）的培养基筛选成功转化的大豆细胞。 (4)反义PG基因重组载体导入受体细胞后，目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性，需通过检测与鉴定才能知道，可采用_______技术检测番茄植株的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出mRNA。通过个体生物学水平的鉴定发现，转基因番茄比普通番茄贮存时间明显延长，推测其机理是_______。 15．（24-25高二下·山东菏泽·期末）科研人员将胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）基因插入含胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因的表达载体中，使其在棉花细胞中表达NaPI-StPinlA融合蛋白，过程如图1所示。请回答下列问题： (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为______。已知StPinlA基因上无限制酶的识别序列，据图1分析，为了使扩增后的StPinlA基因与NaPI基因正确连接形成融合基因，用PCR技术扩增StPinlA基因时，需要设计合适的引物，引物P2包含的碱基序列为5'-______（写出12个碱基序列）-3'，同时应选用限制酶______对NaPITi质粒进行切割。对获得的NaPI-StPinlA融合基因进行扩增，可选择图1中的一对引物是______。 (2)融合基因启动子的作用是______，为使连接后的NaPI-StPinlA融合基因能够表达，设计时剔除NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列，目的是______。 (3)将构建好的重组Ti质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有______的固体培养基上，选择出生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养，在愈伤组织阶段取细胞A、B、C、D中的DNA，特异性扩增后的电泳结果如图2所示，其中成功导入NaPI-StPinlA融合基因的细胞是______。 16．（24-25高二下·山东东营·期末）研究发现，玉米G基因启动子自然突变株系BT-1中G基因的表达量较野生型显著降低，从而表现出对玉米穗腐病（病原菌需破坏植物细胞壁侵入细胞内部汲取营养）较强的抗性。研究G基因与玉米穗腐病的关系，对培育抗玉米穗腐病玉米品种具有重要意义。相关信息如下图所示。回答下列问题。 部分目的基因序列：5'CTACGTTAGCACG……CGATCCGTAATCAT3′ 注：LB/RB：T-DNA边界序列；图中所示目的基因序列是逆转录得到的单链；ATG对应起始密码子；TAG对应终止密码子。 以下为限制酶识别序列及切割位点： Acc65I：5'-G↓GTACC-3′  KpnI：5'-GGTAC↓C-3′  NheI：5'-G↓CTAGC-3'  BamHI：5'-G↓GATCC-3′  SpeI：5'-A↓CTAGT-3' (1)PCR技术扩增G基因过程中与解旋酶作用相同的步骤是______。检测发现G基因中只有一个限制酶（KpnI）识别序列，载体、目的基因及限制酶相关信息如上所示。若要保证G基因的正确连接，可在G基因上游添加________限制酶识别序列，则目的基因上游扩增引物序列应为5'_______3'（写出10个碱基）。 (2)将构建好的G基因过表达载体导入到农杆菌中时，首先用Ca2+处理农杆菌，处理的目的是________。含重组质粒的农杆菌侵染野生型玉米愈伤组织时，培养基中应添加_______抗生素进行筛选，目的是_______。 (3)培养获得G基因过表达植株OE-1后，科研人员又创制了G基因敲除株系KO-1。用穗腐病病原菌分别侵染不同玉米株系后，发现BT-1及KO-1株系中果胶、纤维素含量较野生型及OE-1显著升高，且表现出对穗腐病较强抗性。从结构与功能角度分析G基因与玉米穗腐病抗性之间的关系及作用机制______。 17．（24-25高二下·山东泰安·期末）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindⅢ、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 (1)Luc基因载体上有一段P2A序列（表达产物为2A肽），其功能如图3所示，据此推测P2A的作用________。 (2)形成vtg-Luc基因重组载体时，为确保vtg基因正向连接，应选用限制酶________切割Luc基因载体。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′________3′。（写出已知的所有碱基序列） (3)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含________的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是________。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的________，待发育成熟后，往水体中添加_______进行检测。 18．（24-25高二下·山东威海·期末）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌以处理重金属废水。 (1)提取枣树细胞的总RNA，经反转录获得总cDNA，再利用PCR技术选择性扩增MT基因的cDNA（图甲），此过程需要用到的工具酶有______。图甲A位点和B位点分别是MTcDNA中对应起始密码子和终止密码子的位置，扩增MTcDNA时选用的引物为______。反应过程中的引物长度通常为20～30个核苷酸，所用的引物越长，扩增效率越______。扩增产物常用______（填具体方法）来鉴定。 (2)Tm值（熔解温度或退火温度）是指DNA双链解聚为单链时所需的温度，常用计算公式为：Tm=4℃×（G+C）+2℃×（A+T），其中碱基表示单链中对应的碱基个数。若引物6与其模板链的嵌合区共含20个碱基对，其中鸟嘌呤有9个，则嵌合区的Tm值为______℃。 (3)图乙质粒中未标出的必要元件是______。结合图甲～丙分析，为保证构建基因表达载体时MT基因与质粒的正确连接，扩增MT基因时，应在相应引物的______端分别添加限制酶______的识别序列。 (4)将重组质粒导入处理后的大肠杆菌获得工程菌，经培养后测得工程菌中MT蛋白的表达量是对照组的7倍，为进一步检验工程菌能否应用于生产实践，还需要在个体水平测定______。 19．（24-25高二下·山东枣庄·期末）将苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白基因转入棉花可以获得抵抗棉铃虫的抗虫棉。但转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，与其他蛋白相互作用，导致棉花产量下降。C蛋白能结合纤维素，科研人员将编码C蛋白的C基因与Bt基因连接构建融合基因，导入棉花细胞，能够使抗虫蛋白在细胞壁积累，解决了抗虫蛋白高表达造成的低产问题。实验流程如图所示： 限制酶 BamHI BclI NcoI SphI 识别序列和切割位点 5´－G↓GATCC－3´ 5´－T↓GATCA－3´ 5´－C↓GATGG－3´ 5´－GCATG↓C－3´ (1)将C基因和Bt基因融合需要形成______键。为了保证融合基因能够正常表达出融合蛋白，需要将C基因中____________序列去掉。 (2)为筛选出正确连接的融合基因，可选择图中的引物______（填序号）进行PCR。PCR扩增的反应体系中还应该加入____________（至少两种）。 (3)根据图中酶切后融合基因的黏性末端，在构建基因表达载体时需选用______限制酶对质粒进行切割。先用______处理农杆菌，再将重组质粒导入其中，最后用含______的培养基筛选出转化成功的棉花细胞。 20．（24-25高二下·山东德州·期末）G基因能提高大豆的光能利用率，研究发现G蛋白可能是通过与A蛋白结合来发挥作用。科研人员欲利用酵母双杂交技术验证该发现，该技术的原理是AD蛋白与BD蛋白结合在一起时，能够与酵母细胞中LacZ基因启动子上游激活序列结合，启动LacZ基因表达，LacZ基因表达产物能催化培养基中X - gal形成蓝色物质，如图1所示。构建重组质粒2所用质粒及相关限制酶的识别序列如图2所示。 (1)进行酵母双杂交技术时，________（填“需要”或“不需要”）将酵母菌原有的BD - AD结合途径阻断，重组质粒1中色氨酸合成基因的作用是________。 (2)已知A - AD融合基因模板链的部分序列为5'—TACCCACATCTA……CGTTC - CACGCTG—3'。为保证该融合基因正确拼接到质粒上，据图2分析，扩增该融合基因时应选用的引物序列为5'—________—3'和5'—________—3'（写出12个碱基）。扩增时，缓冲液中Mg2+的作用是________。 (3)为实现检测目的，培养酵母细胞所用培养基成分的特点是________。若酵母细胞在培养基上形成________菌落，则说明G蛋白与A蛋白发生了结合。 (4)为使实验更加严谨，还应设计3组对照组：对照组1的重组质粒1、2上分别携带BD基因和AD基因，对照组2和对照组3的重组质粒上携带的目的基因是________、________。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 重组DNA技术的基本工具 考点1 题号 1 2 3 答案 B C C 4.【答案】(1) 逆转录酶和Taq 酶 5' TGATCACTATCC (2) RNA聚合酶识别和结合的位点 是 b (3) 感受态细胞法 四环素、氨苄青霉素 在含四环素培养基上能生长，在含氨苄青霉素培养基上不能生长 DNA的粗提取、PCR和电泳鉴定 考点2 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A B D B C C C D C B 题号 11 12 13 14 答案 ABD ACD ABD BCD 15.【答案】(1) 酒精和次氯酸钠溶液 避免杂菌污染 原生质体 再生出细胞壁 (2) X1和X2 在杂种植株形成过程中，黑芥的某些染色体片段可能发生丢失 将杂种植株和原花椰菜栽培在含有黑腐病菌的相同环境中，比较两者的抗性 16.【答案】(1) 模板DNA（或质粒1） 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) BamHI、EcoRI 31 (3) 能吸收周围环境中DNA分子 四环素 (4) 4、5、7 LacZ (5) 白 蔗糖和X-gal 17.【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶/TaqDNA聚合酶 催化合成（延伸）DNA子链 非模板链 (2)GATATCCTGGCA (3) Ca2+ 壮观霉素 2 (4)MT3可富集（增加，提高等）Cd，减少（减弱，降低等）Cd对植物的毒害作用 基因工程的基本操作程序与应用和蛋白质工程 考点3 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 B C B B A C C C D C 题号 11 12 答案 AC AC 13.【答案】(1) RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因的转录 否 标记基因、复制原点 (2) nahR Ps（多环芳烃诱导型） mrfp (3)引物1和3 (4) B F 14.【答案】(1) 模板、四种脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、（缓冲液） 变性、复性、延伸 CTCGAGCAGT AGATCTATCG (2) 6 在番茄果实中驱动目的基因反义PG基因特异性表达 (3) 将反义PG基因拼接到农杆菌中Ti质粒上的T-DNA上，利用其特性将目的基因转移到被侵染的番茄细胞中，并将其整合到该细胞的染色体上 潮霉素 (4) PCR 反义PG基因转录出的mRNA与番茄内PG基因转录出的mRNA进行碱基互补配对，形成了双链RNA，从而阻断了多聚半乳糖醛酸酶酶基因的翻译过程，使多聚半乳糖醛酸不被分解，番茄不变软 15.【答案】(1) 复制原点 GAATTCTCTCCG EcoRI和HindIII P1、P4 (2) RNA 聚合酶识别和结合的部位，可驱动融合基因转录 确保融合蛋白能够连续翻译 (3) 卡那霉素 C 16.【答案】(1) 高温变性 BamHI GGATCCATGA (2) 使农杆菌处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态 潮霉素 筛选成功导入载体的玉米愈伤组织细胞 (3)G基因抑制玉米植株中果胶和纤维素的合成，降低细胞壁的结构强度，使细胞壁保护作用弱，易被病原菌侵入，从而降低玉米对穗腐病的抗性 17.【答案】(1)使基因1和基因2的表达产物（融合蛋白）发生切割，形成两个独立的蛋白质 (2) BclI、HindIII 5'-TGATCAAACTAT-3' (3) 卡那霉素 vtg基因只在肝脏中特异性表达 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 18.【答案】(1) 逆转录酶、Taq酶 4和5 低 琼脂糖凝胶电泳法 (2)58℃ (3) 标记基因 5' BamHI和HindIII（或BglII和HindIII） (4)MT工程菌吸附重金属的能力 19.【答案】(1) 磷酸二酯键 终止密码子对应的 (2) 1和4 耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、缓冲液（答出两种即可） (3) SphI和BamHI Ca2+ 潮霉素 20.【答案】(1) 需要 用于在不含色氨酸的缺陷培养基上筛选携带该质粒的酵母细胞 (2) 5'—CTGCAGTACCCA—3' 5'—GAATTCCAGCGT—3' 激活Taq DNA聚合酶 (3) 不加色氨酸和亮氨酸，加如X‑gal 蓝色 (4) G-BD融合基因和AD基因 BD基因和A-AD融合基因 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $