专题04 基因工程（期末真题汇编，安徽专用）高二生物下学期

专题04 基因工程 2大高频考点概览 考点01 基因工程操作技术 考点02 基因工程应用及蛋白质工程 地 城 考点01 基因工程操作技术 一、 单选题 1. C 2. A 3. D 4. D 二、非选择题 5．(1) 逆转录/反转录 变性、复性和延伸 2n-1 (2) 引物2和引物3 b (3) 5' Alu Ⅰ、Hind Ⅱ (4) 乳腺蛋白基因的启动子/乳腺中特异表达的基因的启动子 显微注射法 6．(1) Taq酶 Mg2+  5′ SnaB Ⅰ、Avr Ⅱ (2) 是 构建基因表达载体 DNA连接酶 (3) Bgl Ⅱ 卡那霉素 抗原-抗体分子杂交 (4)甲醇 7．(1)该细胞的染色体DNA上 (2) 5＇ BamHⅠ (3) 能吸收周围环境中DNA分子 新霉素和β-葡萄糖苷酸 白色菌落 8．(1) RNA聚合酶 从右到左 (2) I 5' HindⅢ (3) 显微注射 受精卵 (4)细胞存活且不显现绿色荧光（细胞不显绿色荧光） 9．(1) 碱基互补配对 限制 (2) 标记 筛选出含有基因敲除载体的水稻细胞 农杆菌转化法 (3) 愈伤组织 生长素 (4)能精准地对水稻特定基因进行编辑/可直接针对目标基因操作/定向改变水稻的性状/可克服传统杂交育种周期长（合理即可） 10．(1)抗生素 (2) EcoRI 5' (3) （特异性）受体 抗原-抗体分子杂交 11．(1) 大肠杆菌缺乏切除内含子的机制 肝脏 模板DNA 耐高温的DNA聚合酶 (2) 限制酶Sau3A Ⅰ切割目的基因会破坏目的基因 BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ (3) 抗原-抗体杂交 HSA蛋白质不能正常表达 12．(1) 动物细胞核 克隆 (2) 雌性 克隆牛的性别与核供体牛相同，只有供核牛为雌性，才能构建乳腺生物反应器（合理即可） (3) 5'-ATGAAGCTGTGCTTA-3' 5'-TTAATCCTTGAATCG-3' (4) 5' NdeI和BamHI 乳腺中特异性表达的启动子 13．(1)EcoRⅠ、HindⅢ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 14．(1) 提供能量 DNA聚合酶发挥作用时需要一小段双链核酸启动 (2) 5′ HindⅢ、BamHI (3) CaCl2/Ca2+/钙离子 外源DNA进入细胞 (4) 卡那霉素/kanr 氨苄青霉素/ampr 甲 15．(1) 引物和脱氧核苷酸 复性 (2) 5´ 端 AGATCT BamHⅠ和 EcoRⅠ (3) T-DNA 染色体DNA 2 再分化 16．(1)防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全 (2) 3'-UCGUA…CAUGGA-5' 限制性内切核酸 磷酸二酯 (3) 短 sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错，造成脱靶，故RNA的序列越短脱靶率越高。 (4) XmaI和BglⅡ 使用这两种酶切割质粒可产生与改良基因两端相同的黏性末端 (5)插入的改良基因可以正常表达 (6) Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子 (7) 不一定 若农杆菌细胞中导入的是未携带改良基因的质粒，其只要含氨苄青霉素抗性基因，也能在含氨苄青霉素的培养基中生长 (8)生长素和细胞分裂素的比例不同 17．(1) 替换 引物2、引物3 蛋白质 5'端 激活耐高温的DNA聚合酶 (2) Xma I和Bgl Ⅱ 作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞 (3) Ca2+ 白色 (4) 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度 地 城 考点02 基因工程应用及蛋白质工程 一、 单选题 1. D 2. D 3. C 4. A 5. C 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题04 基因工程 2大高频考点概览 考点01 基因工程操作技术 考点02 基因工程应用及蛋白质工程 地 城 考点01 基因工程操作技术 一、单选题 1．（24-25高二下·安徽合肥·期末）下列关于DNA的粗提取和鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可用NaCl提取DNA B．可以用哺乳动物成熟的红细胞替代鸡血红细胞进行实验 C．DNA不溶于酒精，部分蛋白质溶于酒精，可用酒精初步分离DNA和部分蛋白质 D．二苯胺试剂可以鉴定DNA，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色 【答案】C 【分析】1、DNA的粗提取和鉴定实验的关键在于利用DNA的物理化学性质将其从细胞中分离出来并进行初步确认。粗提取是指提取物中除了含有DNA外，还含有少量的其他产物（如RNA和蛋白质等），由此需要进行鉴定实验来确认DNA，因在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，由此选用二苯胺试剂作为鉴定试剂。 2、原理一是DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。依据该原理，向上清液中加入预冷的酒精溶液（体积分数为 95%），DNA因不溶解而析出，即可用酒精初步分离DNA与蛋白质。 3、原理二是DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的NaCl溶液（该浓度的NaCl溶液能使DNA溶解）。依据该原理，对所得的丝状物或沉淀物进行DNA的鉴定实验，将丝状物或沉淀物溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入定量的二苯胺试剂，混合均匀后，沸水加热溶液颜色的变化。 【详解】A、DNA提取的关键步骤是将所选材料切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨，目的是为了将细胞中的DNA释放出来。此外，研磨液的制备需要多种化学物质（如NaCl、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸等），NaCl是DNA提取的“辅助角色”，必须与多种试剂协同，A错误； B、本实验的目的是提取DNA，鸡血红细胞因含细胞核、DNA含量高，且便于获取，是本实验的常用材料。哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，不含DNA，不能作为本实验的材料，B错误； C、用酒精初步分离DNA和部分蛋白质也是本实验的核心步骤，其原理是DNA不溶于酒精，部分蛋白质溶于酒精，C正确； D、DNA的鉴定方法是二苯胺试剂在沸水浴条件下与DNA发生蓝色的反应，该显色反应必须要满足沸水浴条件，D错误。 故选C。 2．（24-25高二下·安徽芜湖·期末）下图为不同限制酶的识别序列及切割位点（↓表示切割位点），下列叙述错误的是（    ） A．用EcoRI切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需断开的磷酸二酯键有2个 B．用BglIⅡ切出的目的基因与BamHI切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开 C．酶切时需要控制好温度、酶浓度、pH等因素 D．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 【答案】A 【详解】A、用EcoRI切割DNA分子中部获得一个目的基因时，目的基因两端都需要切割，每切割一次断开2个磷酸二酯键，所以共需断开4个磷酸二酯键，A错误； B、BglⅡ和BamHⅠ切割后产生的黏性末端相同，用BglⅡ切出的目的基因与BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA分子中不存在这两种酶的识别序列，所以不能再被这两种酶切开，B正确； C、酶的活性受温度、pH等因素影响，所以酶切时需要控制好温度、酶浓度、pH等因素，C正确； D、限制酶具有特异性，图示4种限制酶均只能识别和切割DNA分子中特定的核苷酸序列，不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列，D正确。 故选A。 3．（24-25高二下·安徽阜阳·期末）某研究者将绿色荧光蛋白基因B整合到野生型小鼠A基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得A-B基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（    ） A．若利用PCR技术确定B基因是否正向连接，可使用引物1和引物2 B．若启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶的识别和结合 C．图乙中2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是A-B基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，不能区分新生小鼠是杂合子还是纯合子 【答案】D 【详解】A、使用引物1和引物2扩增，不能确定B基因是否正向连接，B基因正向连接和反向连接，扩增后电泳是一样的结果，A错误； B、若启动子发生甲基化修饰，则可以抑制RNA聚合酶的识别和结合，B错误； C、由图甲可知，野生型小鼠无 B 基因，用引物 1 和引物 2 进行 PCR 不能扩增出相应片段，2 号条带无相应扩增片段，所以 2 号条带的小鼠是野生型；A - B 基因纯合子小鼠用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩增出的都是大片段，4 号条带不全是大片段，所以 4 号条带的小鼠不是 A - B 基因纯合子，C错误； D、若用引物1和引物3进行PCR扩增，只能确定小鼠含有A—B基因，不能区分新生小鼠是杂合子还是纯合子，D正确。 故选D。 4．（24-25高二下·安徽蚌埠·期末）乙肝基因工程疫苗（乙肝病毒外壳蛋白）的生产过程如图所示，其中质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中 LacZ 基因编码产生的酶可以分解培养基中的 X - gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。下列相关分析错误的是（　　） A．过程①选择 BamHⅠ和 EcoRⅠ切割目的基因和质粒，可避免目的基因反向连接 B．过程②将重组质粒导入大肠杆菌前通常需用适宜浓度的 CaCl2溶液处理大肠杆菌 C．筛选大肠杆菌的培养基中需要添加青霉素和 X - gal，便于重组质粒的筛选 D．成功导入目的基因的大肠杆菌在含青霉素和 X - gal 的培养基上的菌落呈蓝色 【答案】D 【详解】A、由图可知，BamHI和EcoRI的酶切位点在目的基因两侧，用BamHI和EcoRI来切割含有目的基因的DNA片段可以获得完整的目的基因，且质粒上也存在这两种酶的识别位点，因此过程①应该选择BamHI和EcoRI来切割目的基因和质粒，可避免目的基因和质粒反向连接，A正确； B、过程②是将重组质粒导入大肠杆菌，需要用CaCl2处理大肠杆菌，增大其细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确； C、质粒中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。LacZ基因内部含有BamHI的酶切位点，构建重组质粒时，目的基因的插入导致lacZ基因被破坏，因此在添加X-gal的培养基上，含重组质粒的大肠杆菌菌落呈现白色，导入空载质粒的大肠杆菌菌落显蓝色，没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不含青霉素抗性基因，不能在含有青霉素的培养基上生存，因此筛选含重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入X-gal和青霉素，便于重组质粒的筛选，C正确； D、BamHI破坏了质粒上的LacZ基因，若添加X-gal的培养基上的大肠杆菌菌落呈现白色，则说明大肠杆菌成功导入重组质粒，D错误。 故选D。 二、非选择题 5．（24-25高二下·安徽合肥·期末）生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。图1是通过基因工程将人的生长激素基因导入大肠杆菌中生产生长激素的过程，图2是基因工程中所用到的质粒，图3是通过PCR获取和扩增目的基因。请回答下列问题：    (1)图1通过______过程得到目的基因A后，通过③过程进行PCR扩增。该技术一般要经历30次循环，每次循环可以分为______三步。如果开始的A基因只有一个，则第n次循环需要引物______对。 (2)若利用图3过程获取和扩增A基因，需要选择的一对引物是______。图3中的基因表达时，______（填“a”或“b”）链作为转录的模板链。 (3)要使A基因能正确与图2中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的______端分别增加相应的限制酶的酶切位点。分析图2和图3，为了防止目的基因的反向连接，可在目的基因的上、下游分别添加______（填限制酶名称）的识别序列。 (4)利用乳腺生物反应器批量生产药物时，科学家将A基因与______等重组在一起，利用______方法导入哺乳动物受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物。 【答案】(1) 逆转录/反转录 变性、复性和延伸 2n-1 (2) 引物2和引物3 b (3) 5' Alu Ⅰ、Hind Ⅱ (4) 乳腺蛋白基因的启动子/乳腺中特异表达的基因的启动子 显微注射法 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由RNA→DNA的过程是逆转录过程，故图1中的目的基因是由mRNA经过逆转录过程获得的；PCR的一个循环要经历变性、复性和延伸三个步骤；第n次复制是从n-1次结束开始的，第n-1次结束后的基因有2n-1个，每个基因复制1次需要1对引物，第n次复制需要2n-1对引物。 （2）DNA分子中，游离的磷酸端是5'端，游离的羟基端是3'端，由于需要在引物的3'端延伸子链，因此选择引物2和引物3；图中转录方向是从左到右，-OH位于链的3‘端，磷酸基团位于5’端，转录从基因模板链的3‘端→5’端，因此图3中的基因表达时b链作为转录的模板链。 （3）由于子链沿着5'→3'的方向延伸，为保证准确复制，需要在所选引物的5'端分别增加相应的限制酶的酶切位点；转录方向是向右的，所以基因A在连接图2载体时，上游应靠近启动子，下游靠近终止子，而图2中不能选EcoR Ⅰ酶切割质粒，会破坏复制原点，为了防止目的基因的反向连接，所以应该在目的基因上游添加Alu Ⅰ酶识别序列，下游添加Hind Ⅱ酶识别序列。 （4）目的基因要只在乳腺细胞表达，需要将基因A与乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，利用显微流向法导入哺乳动物受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物。 6．（24-25高二下·安徽黄山·期末）乙型病毒性肝炎（乙肝）是一种严重危害人类健康的传染病。注射乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的有效方法。研究人员利用巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗主要成分HBsAg蛋白的过程如下图所示。回答下列问题 限制酶 识别序列及酶的切位点（5'-3'） SnaB I …TAC↓GTA… Avr Ⅱ …C↓CTAGG… Sac I …CTCGA↓G… Bgl Ⅱ …A↓GATCT… 注：巴斯德毕赤酵母菌能将甲醇作为其唯一碳源,此时AOX1基因[5'AOXI和3'AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]受到诱导而表达。 (1)利用PCR技术获取和扩增HBsAg基因，除向反应体系中加入乙肝病毒DNA、四种脱氧核苷酸和两种引物外，还需加入________，并且需要在含_________（填离子）的缓冲液中进行。在设计两种引物时，在两种引物的________（填“3'”或“5'”）端需分别添加________（填限制酶名称）的识别序列，从而使HBsAg基因能正确插到pPIC9K质粒中。 (2)pPIC9K质粒上的5'AOX1________（是/不是）转录的起始位点。过程①称为________，该过程需要用到的酶有限制酶和_________。 (3)过程②用限制酶_________来切割重组质粒获得重组DNA片段，然后将重组DNA片段重组入巴斯德毕赤酵母菌染色体，若要确定巴斯德毕赤酵母菌是否成功转化，应向培养基中加入________进行培养筛选，转化后的酵母菌是否产生HBsAg蛋白，可用________的方法进行检测。 (4)转化成功的酵母菌在后期培养时需向培养基中添加_______以维持其生活，同时诱导 HBsAg基因表达。 【答案】(1) Taq酶 Mg2+  5′ SnaB Ⅰ、Avr Ⅱ (2) 是 构建基因表达载体 DNA连接酶 (3) Bgl Ⅱ 卡那霉素 抗原-抗体分子杂交 (4)甲醇 【分析】分析题图，图中质粒含有SnaB Ⅰ、Avr Ⅱ、Bgl Ⅱ和Sac Ⅰ限制酶切割位点，其中Sac I切点位于启动子上，Bgl Ⅱ切点位于终止子上，要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ切割质粒，要获取含有5’AOX1--3’AOX1段基因，应选用限制酶Bgl Ⅱ来切割，切割后5’AOX1--3’AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培养基中加入卡那霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。 【详解】（1）利用PCR技术进行扩增时，反应体系中需要加入模板、四种脱氧核苷酸、引物和Taq酶，并且需要在含有Mg2+的缓冲液中进行。若要对HBsAg基因进行获取和扩增，需在引物的5′端添加限制酶识别序列。图中质粒含有SnaB Ⅰ、Avr Ⅱ、Bgl Ⅱ和Sac Ⅰ4种限制酶切割位点，其中Sac Ⅰ的切割位点位无启动子上，Bgl Ⅱ的切割位点位于启动子之前和终止子之后，故只能用限制酶SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ（识别的序列在启动子与终止子之间）切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的位置接上SnaB Ⅰ、Avr Ⅱ限制酶识别序列，从而使HBsAg基因能正确插到pPIC9K质粒中。 （2）质粒上的启动子作为RNA聚合酶识别结合的位点，可以驱动基因转录，5'AOX1作为启动子，是转录的起点。过程①是HBsAg基因与pPIC9K质粒重组的过程，即构建基因表达载体过程，该过程需要DNA连接酶连接目的基因的质粒。 （3）重组DNA片段的两侧分别是5'AOX1和3'AOX1，因此应用BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA片段。重组DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，该基因为标记基因，所以要确定巴斯德毕赤酵母菌是否成功转化，应向培养基中加入卡那霉素进行筛选。检测转化后的酵母菌是否产生HBsAg蛋白，可用抗原-抗体杂交技术进行检测。 （4）根据“巴斯德毕赤酵母菌能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因[5'AOX1和3'AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]受到诱导而表达”可知，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。 7．（24-25高二下·安徽阜阳·期末）丙酮酸羧化酶（PEP）是控制油菜中蛋白质与油脂比例的关键酶。PEP反义基因是指反向连接在启动子之后的PEP基因，其在转录时的模板链为PEP基因模板链的互补链。PEP反义基因可抑制PEP基因的表达，提高油菜籽中的油脂含量。图甲为某种质粒的结构，其中npt-Ⅱ为新霉素抗性基因，gus基因控制合成的酶能使β-葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶，图乙为PEP基因的结构。 回答下列问题： (1)图甲质粒中的T-DNA可转移到被侵染的细胞，并将其整合到________。 (2)为方便将PEP反义基因与质粒连接，一般可采用PCR技术将限制酶的识别序列连接到引物上，由图甲、乙可知，与PEP基因下游结合的引物________（填“3＇”或“5＇”）端中应加上________（填“BamHⅠ”或“SacⅠ”）识别序列。 (3)在转化农杆菌时，使用BamHⅠ、SacⅠ限制酶等工具参与构建的PEP反义基因表达载体，导入处于________的生理状态的农杆菌中。培养一段时间后，涂布到含有的________平板上，最终在平板上长出白色和蓝色两种菌落，其中符合要求的是________。 【答案】(1)该细胞的染色体DNA上 (2) 5＇ BamHⅠ (3) 能吸收周围环境中DNA分子 新霉素和β-葡萄糖苷酸 白色菌落 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。将目的基因导入植物细胞的方法长采用农杆菌转化法。农杆菌的Ti质粒上有一段T - DNA（可转移DNA），当农杆菌感染植物细胞时，T - DNA能转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上。 【详解】（1）在基因工程中，图甲质粒中的T - DNA可转移到被侵染的细胞，并将其整合到受体细胞染色体的DNA上。这是农杆菌转化法的原理基础，通过T - DNA的这种特性，可将目的基因整合到受体细胞的基因组中稳定遗传和表达。 （2）在DNA复制过程中，子链是从5′端向3′端延伸的。要将PEP反义基因与质粒连接，构建基因表达载体，根据图甲中质粒上启动子2的方向以及限制酶的位置，为了保证PEP反义基因能在启动子2的驱动下正确转录，与PEP基因下游结合的引物5′端中应加上BamHⅠ识别序列。因为如果在3′端加识别序列，无法实现正确的连接和转录方向。 （3） 将基因表达载体导入农杆菌时，农杆菌需要处于感受态，感受态的农杆菌容易吸收周围环境中的DNA分子。由于质粒中含有npt - Ⅱ新霉素抗性基因，所以培养一段时间后，涂布到含有新霉素的平板上，能筛选出导入了质粒（包括重组质粒和普通质粒）的农杆菌。又因为gus基因控制合成的酶能使β - 葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，而构建PEP反义基因表达载体时会破坏gus基因，所以导入重组质粒（含有PEP反义基因）的农杆菌不能使β - 葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，故平板上含有新霉素和β-葡萄糖苷酸，符合要求的是白色菌落。 8．（24-25高二下·安徽滁州·期末）哺乳动物体内一定含量的 ω-3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中获取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1（如图1），成功构建基因表达载体（如图2），并培育出转fat-1基因家兔。已知fat-1基因的b链为模板链。新霉素抗性基因是一种抗G418抗生素的抗性基因，其表达产物可保护细胞免受毒害。 请回答下列问题： (1)启动子是_________的识别和结合部位。图中fat-1基因转录的方向是________（填“从左到右”或“从右到左”）。 (2)fat-1基因左侧没有限制酶酶切位点，需在PCR技术扩增时，通过设计引物时在引物_______（填“I”“Ⅱ”“Ⅲ”或“IV”）的_____（填“5'”或“3'”）端插入_______的酶切位点，以便后面正确构建基因表达载体。 (3)基因表达载体构建完成后，通常采用_________的方法导入家兔_________细胞中。 (4)为筛选成功导入重组质粒的家兔细胞，在含有G418的培养基中培养，若观察到________，说明重组质粒成功导入。 【答案】(1) RNA聚合酶 从右到左 (2) I 5' HindⅢ (3) 显微注射 受精卵 (4)细胞存活且不显现绿色荧光（细胞不显绿色荧光） 【分析】基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定，其中基因表达载体的构建为核心步骤，目前常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供 DNA 模板，分别与两条模板链结合的 2 种引物，4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 DNA复制在体外反复进行。结合图文信息可知，目的基因是fat-1基因，受体细胞是家兔细胞。载体含有多个限制酶切割位点（如HindⅢ、BamHI、EcoRI），特殊的标记基因（如新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因）便于重组DNA分子的筛选。 【详解】（1）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。 结合图1可知—OH代表3'端，—P代表5'端，即作为模板链的b链从左向右的方向为5'→3'，其转录方向由RNA聚合酶决定，即由5'→3'方向延伸，转录方向从右到左，新转录出的RNA从左向右的方向为3'→5'。 （2）为排除空载和防止自身环化、反向连接，本实验采用双酶切法即利用HindⅢ和EcoRI两种酶切割目的基因和载体。本题目的基因只有EcoRI的酶切位点，没有HindⅢ的酶切位点，这可利用PCR技术扩增来实现目的基因带有HindⅢ和EcoRI酶切位点。在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，即DNA聚合酶的延伸方向为5'→3'，a链从左向右的方向为3'→5'，因此选择引物I。为了在目的基因上添加新的酶切位点，必须将酶切位点的核苷酸序列添加到PCR引物的 5' 端。引物的 3' 端必须与模板DNA（要扩增的目的基因）严格互补配对，这是保证扩增特异性的关键。引物的 5' 端不直接参与与模板DNA的互补配对，因此，在引物的 5' 端添加额外的序列（如酶切位点、保护碱基、启动子序列等）不会干扰DNA聚合酶的延伸功能，这些添加的序列在PCR过程中会被直接复制到最终扩增产物的两端。 （3）受体细胞有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的，将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。其中，将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。 （4）重组质粒因带有新霉素抗性基因、没有绿色荧光蛋白基因，可产生抗G418抗生素，能在含有G418的培养基中存活，但不能发出绿色荧光。 9．（24-25高二下·安徽马鞍山·期末）我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得有香味的水稻，其工作原理如下图所示，回答下列问题。 (1)sgRNA能与Cas9蛋白形成复合物，进而识别并切割Badh2基因，sgRNA识别Badh2基因的原理是______。Cas9/sgRNA复合物具有类似______酶的功能。 (2)基因敲除载体中的潮霉素抗性基因为______基因，其作用是______，将该载体导入水稻细胞常用的方法是______。 (3)含有基因敲除载体的水稻细胞经脱分化形成______。在诱导形成试管苗的过程中，需要添加一定比例的细胞分裂素和______。 (4)与传统杂交育种相比，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育有香味水稻的优势是______（答出两点即可）。 【答案】(1) 碱基互补配对 限制 (2) 标记 筛选出含有基因敲除载体的水稻细胞 农杆菌转化法 (3) 愈伤组织 生长素 (4)能精准地对水稻特定基因进行编辑/可直接针对目标基因操作/定向改变水稻的性状/可克服传统杂交育种周期长（合理即可） 【分析】利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术培育香味水稻时，先构建含潮霉素抗性标记基因的载体，借农杆菌转化法导入水稻细胞。sgRNA 与 Cas9 蛋白形成复合物，依碱基互补配对识别并切割香味抑制基因 Badh2 。含载体的水稻细胞经脱分化成愈伤组织，在细胞分裂素和生长素调控下再分化成试管苗。该技术通过精准编辑基因，打破传统育种局限，定向获得有香味水稻，实现从基因改造到植株培育的生产流程 。 【详解】（1）sgRNA是RNA，Badh2基因为DNA序列，二者可通过碱基互补配对原则结合，实现识别。Cas9/sgRNA 复合物能切割Badh2 基因（特定DNA 序列 ），而限制酶的功能就是识别特定DNA 序列并切割，所以该复合物类似限制酶 。 （2）潮霉素抗性基因在基因工程中作为标记基因 ，用于筛选成功导入载体的细胞。因为潮霉素能抑制植物细胞生长，只有含潮霉素抗性基因的细胞，才能在含潮霉素的培养基中存活，所以作用是筛选出含基因敲除载体的水稻细胞。将基因表达载体导入植物细胞（水稻细胞）常用的方法是农杆菌转化法，利用农杆菌的侵染特性将载体导入细胞。 （3）水稻细胞脱分化的结果是形成愈伤组织 （一团未分化的薄壁细胞），这是植物组织培养的基本过程。在植物组织培养中，诱导试管苗（再分化）需要一定比例的细胞分裂素和生长素 ，二者协同调控分化方向，所以填生长素。 （4）CRISPR/Cas9 基因编辑技术属于基因工程范畴，与传统杂交育种相比：它能精准识别并编辑特定基因，实现定向改造；无需像杂交育种那样经历漫长的杂交、筛选过程，可缩短育种周期；直接针对目标基因操作，能定向改变水稻性状，优势显著。 10．（24-25高二下·安徽合肥·期末）2024年5月16日，上海交通大学联合多家单位，在Cell上发表论文，报告了一项应用新型慢病毒（改造自人类免疫缺陷病毒—HIV）载体技术治疗重度输血依赖的β-地中海贫血的安全性和有效性研究结果。其技术流程大致如下： (1)培养患者造血干细胞时，为防止杂菌污染，需在培养液中添加适量_______。 (2)构建慢病毒载体时需用到转移质粒（如图1），转移质粒上的5'端LTR和3'端LTR序列能将这两段之间的基因插入到受体细胞的基因组中，该序列对于慢病毒的基因组转录，逆转录和整合进入宿主细胞的基因组是必须的。图1中RRE、cPPT/CTS等组件能提高外源基因整合到受体细胞的效率。 构建重组转移质粒时，可以选择图中的_____限制酶切开质粒，同时在β-珠蛋白基因扩增时所需的引物______端（填3'或5'）添加相应限制酶的识别序列和相应的额外保护碱基。 (3)慢病毒载体与患者造血干细胞表面的__________结合进入细胞，将目的基因整合到基因组DNA中。一段时间后，通过______技术，筛选能正常表达β-珠蛋白的受体细胞。 【答案】(1)抗生素 (2) EcoRI 5' (3) （特异性）受体 抗原-抗体分子杂交 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）动物细胞培养过程中，为防止杂菌污染，需在培养液中添加适量抗生素。 （2）构建重组转移质粒时，可以选择图中的EcoRI限制酶切开质粒，另外两种酶会破坏载体上的标记基因或其它结构；子链从引物的3'端开始延伸，在扩增时需要在引物得到5'端加上相应的限制酶序列。 （3）慢病毒载体与患者造血干细胞表面的特异性受体结合，进入细胞；检测β-珠蛋白，可以采用抗原-抗体分子杂交技术。 11．（24-25高二下·安徽合肥·期末）人血清白蛋白(HSA)主要在肝脏中合成，具有重要的医用价值。为制备大量的HSA，以基因工程技术获取重组HSA的两条途径如图1所示：图2为获取的含有目的基因(HSA基因) 的DNA片段，Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ为三种限制酶, 图中箭头所指为三种限制酶的酶切位点；图3是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图4是Ti质粒结构示意图。回答下列问题： (1)从人体细胞中直接提取的HSA基因，导入到大肠杆菌细胞中不能表达，原因可能是______。为了获得能在大肠杆菌细胞中表达的 HSA 基因，可从人体的_________细胞中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA（双链），再利用PCR进行扩增，该过程需向反应体系中加入__________、___________、4种脱氧核苷酸、引物和Mg2+。 (2)构建基因表达载体时，不能选择限制酶Sau3A Ⅰ，原因是_________，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应选择限制酶Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ切割质粒，选择限制酶___________充分切割目的基因。 (3)为了检测水稻胚乳细胞中是否合成了HSA蛋白，可用____________方法；若胚乳细胞中含有HSA基因，但是检测不到HSA蛋白，可能的原因是____________。 【答案】(1) 大肠杆菌缺乏切除内含子的机制 肝脏 模板DNA 耐高温的DNA聚合酶 (2) 限制酶Sau3A Ⅰ切割目的基因会破坏目的基因 BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ (3) 抗原-抗体杂交 HSA蛋白质不能正常表达 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的筛选和获取、构建基因表达载体、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）从人体细胞直接提取的HSA基因含有内含子等序列，大肠杆菌缺乏切除内含子的机制，故导入到大肠杆菌细胞中不能表达。人血清白蛋白基因（HSA）主要在肝脏中合成，为了获得能在大肠杆菌中表达的HSA基因，可从人体的肝脏细胞中提取mRNA，通过反转录获得cDNA（双链）。PCR反应体系的主要成分应该包含：4种脱氧核苷酸、引物、Mg2﹢、模板DNA、耐高温的DNA聚合酶。 （2）限制酶Sau3A Ⅰ切割目的基因会破坏目的基因，故不能选择限制酶Sau3A Ⅰ切割目的基因。为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ切割质粒。Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ的黏性末端相同，故采用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ充分切割目的基因。 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质，可采用抗原-抗体杂交技术，故为了检测水稻胚乳细胞中是否合成了HSA蛋白，可采用抗原—抗体杂交的方法，若胚乳细胞中含有HAS基因，但是检测不到HSA蛋白，这是由于HSA蛋白质不能正常表达，可能的原因是目的基因前后的启动子和终止子设计不理想，导致目的基因不能正常表达。 12．（24-25高二下·安徽·期末）人血清白蛋白（HSA）是一种临床常见的生物制剂，其主要用于流失血液量的快速补充、维持血管内的水分平衡。科学家将HSA基因导入奶牛细胞，利用现代生物技术构建乳腺生物反应器以生产药用HSA，相关培育过程如图1所示。回答下列问题。    (1)图1所示技术培育出动物个体，这体现了________的全能性，所培育出的小牛称为转基因_______。 (2)图1中核供体牛的性别为________，原因是________。 (3)已知HSA基因的部分碱基序列为：5′-ATGAAGCTGTGCTTA…（中间省略500bp）…CGATTCAAGGATTAA-3'，欲通过PCR技术扩增该碱基序列，现需设计一对引物。（要求：引物长度为15bp并按5'到3'注明方向） 引物1：________；引物2：_________。 (4)图2是质粒限制酶酶切图谱，已知HSA基因上不含质粒的限制酶识别序列。为构建重组质粒，在扩增HSA基因时，应在两种引物的________端分别添加 填图2中的序列）的识别序列。在保证质粒结构完整性的前提下，为使HSA基因能在乳腺细胞中表达，应将该基因与_________的启动子重组在一起。 【答案】(1) 动物细胞核 克隆 (2) 雌性 克隆牛的性别与核供体牛相同，只有供核牛为雌性，才能构建乳腺生物反应器（合理即可） (3) 5'-ATGAAGCTGTGCTTA-3' 5'-TTAATCCTTGAATCG-3' (4) 5' NdeI和BamHI 乳腺中特异性表达的启动子 【分析】1、核移植技术核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，获得重构胚，使其完成分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制，最终得到的转基因动物是克隆动物； 2、科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。 【详解】（1）①表示将HSA基因导入受体细胞，②表示动物细胞培养获得单个细胞，③表示核植技术，⑥表示胚胎移植技术。核移植技术的原理是动物细胞核具有全能性；培育出的小牛称为转基因克隆。 （2）克隆动物的性别取决于供核个体，供核个体为荷斯坦奶牛细胞，故图1中核供体牛的性别为雌性。 （3）引物与目的基因的3'端碱基互补配对，故一条引物应该与序列5'-ATGAAGCTGTGCTTA-3'相同，另一条引物与序列5'-CGATTCAAGGATTAA-3'互补，故为5'-TTAATCCTTGAATCG-3'。 （4）在扩增HSA基因时，应在两种引物的5'添加限制酶，因为DNA聚合酶只能在3'端延伸子链DNA。限制酶选择的时候不能破坏启动子，终止子，复制原点，以及标记基因，而且为了防止目的基因与运载体随意拼接和自身环化，只能选择NdeI和BamHI切割目的基因和表达载体。为使HSA基因能在乳腺细胞中表达，应将该基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起。 13．（24-25高二下·安徽合肥·期末）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 【答案】(1)EcoRⅠ、HindⅢ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分，所以应选引物S-F和P-R。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图1可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+15×50=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，SOD-ELP50组加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 14．（24-25高二下·安徽芜湖·期末）环境中常检出残留的四环素类抗生素，研究者采用基因工程技术构建出一种能高效降解四环素的工程菌。将四环素降解酶基因text导入大肠杆菌，筛选后得到工程菌，可通过发酵工程大量生产四环素降解酶并应用于生产实践。回答下列问题： (1)利用PCR获取目的基因PCR体系中dNTP除作为DNA复制的原料外，还有_______的作用。不管体内还是体外，DNA复制时均需要引物，其原因是______。 (2)构建重组DNA分子为将目的基因按照正确的方向插入质粒，PCR时在引物的_______端添加特定限制酶的识别序列。据图可知，在目的基因左右侧的引物上分别添加限制酶________的识别序列。 (3)将重组DNA分子导入受体细胞细菌转化效率很低，可将大肠杆菌置于低温、低浓度的_____溶液，成为感受态细胞，最后进行短暂的热刺激，促进_______。 (4)检测目的基因及其表达产物 可采用“插入失活”原理，筛选出含重组DNA的大肠杆菌。将经转化后的大肠杆菌通过稀释涂布平板法接种于含______的固体培养基（甲培养皿）中，然后通过灭菌绒布将菌种平移接种至含______的固体培养基（乙培养皿）中，经培养比对后，可在_______培养皿中挑选出工程菌。 【答案】(1) 提供能量 DNA聚合酶发挥作用时需要一小段双链核酸启动 (2) 5′ HindⅢ、BamHI (3) CaCl2/Ca2+/钙离子 外源DNA进入细胞 (4) 卡那霉素/kanr 氨苄青霉素/ampr 甲 【分析】第一张图为基因工程相关质粒与 PCR 流程关联图 ，图中左侧呈现四环素降解酶基因的线性结构，标注了转录方向，清晰展示基因的起始与终止区域；右侧是环状质粒示意图，质粒上有启动子、终止子、复制原点，以及氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因，还标注了 限制酶切割位点，呈现出基因工程中载体的基本结构，用于后续与目的基因构建重组 DNA ，体现从目的基因获取到载体构建的基因工程核心环节关联 。第二张图为工程菌筛选 “插入失活” 流程关联图 ，先是经转化后的细菌接种到甲培养皿，接着用灭菌绒布平行接种到乙培养皿，呈现 “影印培养” 操作流程。该图用于展示利用 “插入失活” 原理筛选含重组 DNA 工程菌的过程，通过甲、乙培养皿不同抗生素环境，实现对重组菌的筛选，直观呈现从转化菌接种到筛选鉴定的实验步骤。 【详解】（1）PCR 体系里 dNTP（脱氧核苷三磷酸 ），其结构含高能磷酸键，水解可释放能量，为 DNA 复制提供能量，同时作为原料合成新 DNA 链 。DNA 聚合酶的特性是不能从头合成 DNA 链，得依赖引物提供 3’-OH 末端，才能将 dNTP 连接到引物上延伸 DNA 链，不管体内体外复制，都需引物启动这一过程 。 （2）DNA 复制时子链从 5’→3’方向延伸，引物与模板链 3’端结合，所以要在引物的 5’端添加限制酶识别序列，保证目的基因正确方向插入质粒 。观察质粒图，为避免破坏标记基因，结合目的基因转录方向，选择 HindⅢ 和 BamHⅠ 两种限制酶，在目的基因两侧引物 5’端分别添加它们的识别序列，这样切割后能让目的基因与质粒正确连接 。 （3）将大肠杆菌置于低温、低浓度 CaCl₂溶液，会使细胞膜通透性改变，细胞成为感受态，便于吸收外源 DNA 。短暂热刺激能让细胞膜出现间隙，促进重组 DNA（外源 DNA ）进入细胞，提高转化效率 。 （4）重组质粒构建时，目的基因插入会破坏 ampᵣ（氨苄青霉素抗性基因 ），保留 kanᵣ（卡那霉素抗性基因 ），所以先将转化后的菌接种到含卡那霉素的甲培养基，筛选出含质粒（包括重组和空载 ）的菌 。再用灭菌绒布影印到含氨苄青霉素的乙培养基，重组质粒因 ampᵣ被破坏，在乙培养基不能生长，空载质粒因 ampᵣ完整可生长 。对比甲、乙培养基，甲中有、乙中无的菌落，就是含重组 DNA 的工程菌，所以在甲培养皿挑选 。 15．（24-25高二下·安徽合肥·期末）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中 S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题： (1)在 DNA 聚合酶、引物、模板 DNA 和脱氧核苷酸中，随着 PCR 反应进行，分子数量逐渐减少的是______。模板与引物在 PCR 反应的______阶段开始结合。 (2)图中标识了载体和 S 基因中限制酶的切割位点。为将 S 基因正确插入载体，PCR 扩增S基因时需在引物的______（填“5´端”或“3´端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是 5´-______-3´，切割载体时应选用的两种限制酶是______，PCR 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含 S 基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带 S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中的______进入愈伤组织细胞，将 S 基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的______上，抗性基因______可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经______形成芽、 根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【答案】(1) 引物和脱氧核苷酸 复性 (2) 5´ 端 AGATCT BamHⅠ和 EcoRⅠ (3) T-DNA 染色体DNA 2 再分化 【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 【详解】（1）在 DNA 聚合酶、引物、模板 DNA 和脱氧核苷酸中，随着 PCR 反应进行，分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。PCR 一般分为变性、复性和延伸三步，其中模板与引物在 PCR反应的复性阶段开始结合。 （2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的 5´端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有 BamHⅠ、EcoRⅠ和 XbaⅠ的识别序列，而 S 基因内部含有 XbaⅠ、NdeⅠ和 BamHⅠ的识别序列，要用 BamHⅠ、EcoRⅠ或 XbaⅠ切割载体，又不能用 XbaⅠ、NdeⅠ或 BamHⅠ切割 S 基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用 BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体，用 BamHⅠ的同尾酶 Bgl Ⅱ和 EcoRⅠ切割 S 基因，故 PCR 扩增 S 基因时需在上游引物添加的碱基序列是 5´-AGATCT-3´。 （3）T-DNA 属于可转移 DNA，用携带 S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中 T-DNA 进入愈伤组织细胞，将 S 基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体 DNA上，抗性基因 1 位于 T-DNA 外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因 2 位于 T-DNA 内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 16．（24-25高二下·安徽宣城·期末）I近年来现代生物技术飞速发展，以下是两种现代生物技术的流程图，请据图回答： (1)研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是______。 (2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5'-AGCAT…GTACCT-3'。则设计的向导RNA中相应的序列应为______。Cas9蛋白相当于______酶、可催化______键断裂。 (3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现脱靶几率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越_______（填“长”或“短”），基因编辑的脱靶率越高，原因是______。 Ⅱ普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。回答下列问题： (4)将改良基因和农杆菌的Ti质粒连接时，需用限制性内切核酸酶______对Ti质粒进行切割，选用上述酶进行切割的理由是______。 (5)图1中构建的基因表达载体，改良基因的上下游序列需具备启动子和终止子，以确保_______。 (6)将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用______处理农杆菌，使细胞处于一种____________的生理状态，从而易于重组Ti质粒导入。 (7)在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中______（填“一定”或“不一定”）含有改良基因，原因是_______、 (8)图2中愈伤组织经过程形成转基因水稻苗，培养基2与培养基3的区别是________。 【答案】(1)防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全 (2) 3'-UCGUA…CAUGGA-5' 限制性内切核酸 磷酸二酯 (3) 短 sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错，造成脱靶，故RNA的序列越短脱靶率越高。 (4) XmaI和BglⅡ 使用这两种酶切割质粒可产生与改良基因两端相同的黏性末端 (5)插入的改良基因可以正常表达 (6) Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子 (7) 不一定 若农杆菌细胞中导入的是未携带改良基因的质粒，其只要含氨苄青霉素抗性基因，也能在含氨苄青霉素的培养基中生长 (8)生长素和细胞分裂素的比例不同 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因），因此细菌细胞内存在CRISPR-Cas9系统可通过切割外源DNA使之失效，防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全。 （2）向导RNA与目标基因的碱基序列应互补，且两条链方向相反，因此若目标基因序列为 5′−AGCAT⋯⋅⋅⋅GTACCT−3′ ，则设计的向导RNA中相应的序列应为3′−UCGUA⋅⋅⋅⋅⋅⋅CAUGGA−5′。Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因），因此Cas9蛋白相当于限制性内切核酸酶，可催化磷酸二酯键的断裂。 （3）由于其他DNA序列也含有与向导RNA互补配对的序列，sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错，造成脱靶，故RNA的序列越短脱靶率越高。 （4）根据改良基因两侧的黏性末端可知，将改良基因和农杆菌的Ti质粒连接时，需用限制性内切核酸酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ对农杆菌的Ti质粒进行切割，选用上述酶进行切割质粒可产生与改良基因两端相同的黏性末端。 （5）图1中构建的基因表达载体，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，其中目的基因的上下游序列需具备启动子和终止子，以确保插入的改良基因可以正常表达。 （6）将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用Ca2+处理处理农杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 （7）基因表达载体上含有标记基因氨苄青霉素抗性基因，可便于重组DNA的筛选，但由于农杆菌细胞只要含氨苄青霉素抗性基因，即使不含改良基因，也能在含氨苄青霉素的培养基中生长，故在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中不一定含有改良基因。 （8）分析题图2可知，愈伤组织经再分化过程形成转基因水稻苗，培养基2的目的是获得愈伤组织，培养基3的目的是获得转基因水稻，在配制这两个培养基时所用的生长素和细胞分裂素的比例不同 。 17．（24-25高二下·安徽宿州·期末）水蛭素（Hirudin）可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。如图表示改造Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。请据图回答： (1)图中利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对的________（填“增添”“缺失”或“替换”），需要在_（填引物）中设计特定的碱基，从而对Hirudin基因进行改造以获得改良的Hirudin蛋白，这种技术操作属于_____工程。设计引物时常需添加保护碱基以提高酶切效率，保护碱基最好添加在引物的________（填“5'端”或“3'端”）。PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，作用是_______。 (2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11与Hirudin改良基因高效连接，应选用_________对pCLY11进行酶切。质粒pCLY11中neor的作用是_______。 (3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌菌落应呈______（填颜色）。 (4)PCR产物一般通过_______来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与_______（至少写两个）有关。 【答案】(1) 替换 引物2、引物3 蛋白质 5'端 激活耐高温的DNA聚合酶 (2) Xma I和Bgl Ⅱ 作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞 (3) Ca2+ 白色 (4) 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度 【分析】图中通过在引物2和3上加上突变序列达到对水蛭素进行定点诱变的目的，通过对目的基因的改造，达到改造水蛭素的目的，该操作属于蛋白质工程。 【详解】（1）从图中可以看出，利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对，改变了基因的碱基序列，属于碱基对的替换，因为引物与模板链互补配对进行扩增，要在基因内部引入特定碱基对实现替换，需要在引物2和引物3中设计特定的碱基，这种通过对基因进行改造从而获得改良蛋白质的技术操作属于蛋白质工程，它是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计，然后通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。设计引物时常需添加保护碱基以提高酶切效率，保护碱基最好添加在引物的 5′端，这样既不影响引物与模板的特异性结合，且便于后续酶切处理。PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶。 （2） Hirudin改良基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶Xma I和Bgl Ⅱ切割产生的黏性末端能与Hirudin改良基因的黏性末端碱基互补，要想把Hirudin改良基因与质粒pCLY11（运载体）拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶Xma I和Bgl Ⅱ切割，质粒pCLY11中neor是新霉素抗性基因，其作用是作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞，在含有新霉素的培养基中，只有含有重组质粒（含有neor）的细胞才能存活。 （3） 若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用Ca2+（或CaCl2）处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态。由于重组质粒构建时破坏了mlacZ基因（表达产物会使细胞呈蓝色，否则细胞呈白色），所以所选的工程菌菌落应呈白色。 （4）一般用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度有关。 地 城 考点02 基因工程应用及蛋白质工程 一、单选题 1．（24-25高二下·安徽合肥·期末）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。下列相关叙述，错误的是（    ） A．改造后的干扰素的功能与天然干扰素不是完全不同 B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换 C．改造后的干扰素基因仍需导入受体细胞完成表达过程 D．蛋白质工程，是指以基因结构规律及其与生物的功能的关系为基础的 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求，它是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 【详解】A、改造后的干扰素由于氨基酸序列改变，导致结构改变，从而延长体外保存时间，但其仍具有干扰病毒复制的功能，即改造后的干扰素与天然干扰素的功能不是完全不同，A正确； B、比较半胱氨酸和丝氨酸的密码子，若第二个碱基由G替换为C，就可引起氨基酸的替换，所以基因上发生定点突变（C→G），可实现基因的改造，B正确； C、基因的表达需要众多物质和结构的参与，还需要细胞呼吸提供能量，故改造后的干扰素基因仍需导入受体细胞完成表达过程，C正确； D、蛋白质工程的目的是根据人们对蛋白质的功能需求改造或制造蛋白质，理论基础是蛋白质的结构与功能相适应，D错误。 故选D。 2．（24-25高二下·贵州黔西南·期中）下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是（    ） A．将某药用蛋白基因导乳腺细胞中，获得乳腺生物反应器 B．基因工程是在细胞水平上进行设计和操作的 C．只要目的基因进入受体细胞，就能成功实现稳定存在和表达 D．蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率 【答案】D 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】A、将某药用蛋白基因导入受精卵中，获得乳腺生物反应器，A错误； B、基因工程是在分子水平上进行设计和操作的，B错误； C、目的基因进入受体细胞不一定能成功的实现表达，还需要做进一步的检测和鉴定，C错误； D、蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率，D正确。 故选D。 3．（23-24高二下·安徽·期末）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但在温度较高时易失去活性，科学家研究发现，若将其第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性。下列相关叙述错误的是（    ） A．T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构 B．提高T4溶菌酶耐热性的过程属于蛋白质工程的范畴 C．引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是氨基酸序列的变化 D．替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，直接操作对象是T4溶菌酶基因 【答案】C 【分析】蛋白质工程是以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、蛋白质的结构决定功能，T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构，A正确； B、若将T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性，属于蛋白质工程范畴，B正确； C、引起T4溶菌酶空间结构改变的根本原因是对T4溶菌酶耐热性的相关基因进行了改造，基因碱基序列发生改变，C错误； D、替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，属于蛋白质工程，蛋白质工程操作的对象为基因，故直接操作对象是T4溶菌酶基因，D正确。 故选C。 4．（24-25高二下·安徽芜湖·期末）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述，正确的是（    ） A．治疗性克隆也会面临伦理问题，所以要对治疗性克隆有效监控和严格审查 B．转基因玉米油的包装上必须标有“转基因”标识和危害 C．利用基因编辑技术设计试管婴儿，以获得免疫艾滋病的基因编辑婴儿 D．转基因作物的目的基因不会通过花粉扩散到野生植物中造成基因污染 【答案】A 【详解】A、治疗性克隆虽不直接用于生殖，但涉及人类胚胎的利用，可能引发伦理争议，因此需严格监控和审查，A正确； B、我国规定转基因产品需标注“转基因”标识，但无需标明“危害”，B错误； C、利用基因编辑技术设计试管婴儿来获得免疫艾滋病的基因编辑婴儿，存在严重伦理问题，违反了人类伦理道德准则，目前这种做法是被严格禁止的，C错误； D、转基因作物的目的基因可能会通过花粉扩散到野生植物中，与野生植物杂交，从而造成基因污染，D错误。 故选A。 5．（24-25高二下·安徽·期末）某企业正在研发一种耐95℃高温的纤维素酶，其可用于生物燃料生产。下列方案最能体现蛋白质工程“设计非天然蛋白质”特性的是（　　） A．从深海热泉菌中分离出天然耐热纤维素酶基因后，直接转入大肠杆菌中表达 B．对中温纤维素酶进行定点改造，引入二硫键以增强酶的热稳定性 C．用计算机设计全新的α/β折叠结构，在人工合成相关基因后通过酵母菌表达 D．将不同来源的纤维素酶片段随机拼接，从中筛选出高温活性突变体 【答案】C 【分析】蛋白质工程是指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。 【详解】A、从深海热泉菌中分离出天然耐热纤维素酶基因后直接转入大肠杆菌中表达，这只是基因工程的操作，是将天然存在的蛋白质基因进行表达，并没有对蛋白质进行设计改造，不符合蛋白质工程“设计非天然蛋白质”的特性，A错误； B、对中温纤维素酶进行定点改造，引入二硫键以增强酶的热稳定性，这虽然是对蛋白质进行了改造，但仍然是基于天然存在的中温纤维素酶进行的改造，不是设计全新的非天然蛋白质，B错误； C、用计算机设计全新的α/β折叠结构，在人工合成相关基因后通过酵母菌表达，这是从全新的蛋白质结构设计出发，通过人工合成基因来表达出非天然的蛋白质，最能体现蛋白质工程“设计非天然蛋白质”的特性，C正确； D、将不同来源的纤维素酶片段随机拼接，从中筛选出高温活性突变体，这更多的是一种随机的组合筛选，不是有针对性地设计全新的蛋白质结构，不符合蛋白质工程设计非天然蛋白质的理念，D错误。 故选C。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题04 基因工程 2大高频考点概览 考点01 基因工程操作技术 考点02 基因工程应用及蛋白质工程 地 城 考点01 基因工程操作技术 一、单选题 1．（24-25高二下·安徽合肥·期末）下列关于DNA的粗提取和鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可用NaCl提取DNA B．可以用哺乳动物成熟的红细胞替代鸡血红细胞进行实验 C．DNA不溶于酒精，部分蛋白质溶于酒精，可用酒精初步分离DNA和部分蛋白质 D．二苯胺试剂可以鉴定DNA，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色 2．（24-25高二下·安徽芜湖·期末）下图为不同限制酶的识别序列及切割位点（↓表示切割位点），下列叙述错误的是（    ） A．用EcoRI切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需断开的磷酸二酯键有2个 B．用BglIⅡ切出的目的基因与BamHI切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开 C．酶切时需要控制好温度、酶浓度、pH等因素 D．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 3．（24-25高二下·安徽阜阳·期末）某研究者将绿色荧光蛋白基因B整合到野生型小鼠A基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得A-B基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（    ） A．若利用PCR技术确定B基因是否正向连接，可使用引物1和引物2 B．若启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶的识别和结合 C．图乙中2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是A-B基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，不能区分新生小鼠是杂合子还是纯合子 4．（24-25高二下·安徽蚌埠·期末）乙肝基因工程疫苗（乙肝病毒外壳蛋白）的生产过程如图所示，其中质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中 LacZ 基因编码产生的酶可以分解培养基中的 X - gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。下列相关分析错误的是（　　） A．过程①选择 BamHⅠ和 EcoRⅠ切割目的基因和质粒，可避免目的基因反向连接 B．过程②将重组质粒导入大肠杆菌前通常需用适宜浓度的 CaCl2溶液处理大肠杆菌 C．筛选大肠杆菌的培养基中需要添加青霉素和 X - gal，便于重组质粒的筛选 D．成功导入目的基因的大肠杆菌在含青霉素和 X - gal 的培养基上的菌落呈蓝色 二、非选择题 5．（24-25高二下·安徽合肥·期末）生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。图1是通过基因工程将人的生长激素基因导入大肠杆菌中生产生长激素的过程，图2是基因工程中所用到的质粒，图3是通过PCR获取和扩增目的基因。请回答下列问题：    (1)图1通过______过程得到目的基因A后，通过③过程进行PCR扩增。该技术一般要经历30次循环，每次循环可以分为______三步。如果开始的A基因只有一个，则第n次循环需要引物______对。 (2)若利用图3过程获取和扩增A基因，需要选择的一对引物是______。图3中的基因表达时，______（填“a”或“b”）链作为转录的模板链。 (3)要使A基因能正确与图2中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的______端分别增加相应的限制酶的酶切位点。分析图2和图3，为了防止目的基因的反向连接，可在目的基因的上、下游分别添加______（填限制酶名称）的识别序列。 (4)利用乳腺生物反应器批量生产药物时，科学家将A基因与______等重组在一起，利用______方法导入哺乳动物受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物。 6．（24-25高二下·安徽黄山·期末）乙型病毒性肝炎（乙肝）是一种严重危害人类健康的传染病。注射乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的有效方法。研究人员利用巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗主要成分HBsAg蛋白的过程如下图所示。回答下列问题 限制酶 识别序列及酶的切位点（5'-3'） SnaB I …TAC↓GTA… Avr Ⅱ …C↓CTAGG… Sac I …CTCGA↓G… Bgl Ⅱ …A↓GATCT… 注：巴斯德毕赤酵母菌能将甲醇作为其唯一碳源,此时AOX1基因[5'AOXI和3'AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]受到诱导而表达。 (1)利用PCR技术获取和扩增HBsAg基因，除向反应体系中加入乙肝病毒DNA、四种脱氧核苷酸和两种引物外，还需加入________，并且需要在含_________（填离子）的缓冲液中进行。在设计两种引物时，在两种引物的________（填“3'”或“5'”）端需分别添加________（填限制酶名称）的识别序列，从而使HBsAg基因能正确插到pPIC9K质粒中。 (2)pPIC9K质粒上的5'AOX1________（是/不是）转录的起始位点。过程①称为________，该过程需要用到的酶有限制酶和_________。 (3)过程②用限制酶_________来切割重组质粒获得重组DNA片段，然后将重组DNA片段重组入巴斯德毕赤酵母菌染色体，若要确定巴斯德毕赤酵母菌是否成功转化，应向培养基中加入________进行培养筛选，转化后的酵母菌是否产生HBsAg蛋白，可用________的方法进行检测。 (4)转化成功的酵母菌在后期培养时需向培养基中添加_______以维持其生活，同时诱导 HBsAg基因表达。 7．（24-25高二下·安徽阜阳·期末）丙酮酸羧化酶（PEP）是控制油菜中蛋白质与油脂比例的关键酶。PEP反义基因是指反向连接在启动子之后的PEP基因，其在转录时的模板链为PEP基因模板链的互补链。PEP反义基因可抑制PEP基因的表达，提高油菜籽中的油脂含量。图甲为某种质粒的结构，其中npt-Ⅱ为新霉素抗性基因，gus基因控制合成的酶能使β-葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶，图乙为PEP基因的结构。 回答下列问题： (1)图甲质粒中的T-DNA可转移到被侵染的细胞，并将其整合到________。 (2)为方便将PEP反义基因与质粒连接，一般可采用PCR技术将限制酶的识别序列连接到引物上，由图甲、乙可知，与PEP基因下游结合的引物________（填“3＇”或“5＇”）端中应加上________（填“BamHⅠ”或“SacⅠ”）识别序列。 (3)在转化农杆菌时，使用BamHⅠ、SacⅠ限制酶等工具参与构建的PEP反义基因表达载体，导入处于________的生理状态的农杆菌中。培养一段时间后，涂布到含有的________平板上，最终在平板上长出白色和蓝色两种菌落，其中符合要求的是________。 8．（24-25高二下·安徽滁州·期末）哺乳动物体内一定含量的 ω-3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中获取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1（如图1），成功构建基因表达载体（如图2），并培育出转fat-1基因家兔。已知fat-1基因的b链为模板链。新霉素抗性基因是一种抗G418抗生素的抗性基因，其表达产物可保护细胞免受毒害。 请回答下列问题： (1)启动子是_________的识别和结合部位。图中fat-1基因转录的方向是________（填“从左到右”或“从右到左”）。 (2)fat-1基因左侧没有限制酶酶切位点，需在PCR技术扩增时，通过设计引物时在引物_______（填“I”“Ⅱ”“Ⅲ”或“IV”）的_____（填“5'”或“3'”）端插入_______的酶切位点，以便后面正确构建基因表达载体。 (3)基因表达载体构建完成后，通常采用_________的方法导入家兔_________细胞中。 (4)为筛选成功导入重组质粒的家兔细胞，在含有G418的培养基中培养，若观察到________，说明重组质粒成功导入。 9．（24-25高二下·安徽马鞍山·期末）我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得有香味的水稻，其工作原理如下图所示，回答下列问题。 (1)sgRNA能与Cas9蛋白形成复合物，进而识别并切割Badh2基因，sgRNA识别Badh2基因的原理是______。Cas9/sgRNA复合物具有类似______酶的功能。 (2)基因敲除载体中的潮霉素抗性基因为______基因，其作用是______，将该载体导入水稻细胞常用的方法是______。 (3)含有基因敲除载体的水稻细胞经脱分化形成______。在诱导形成试管苗的过程中，需要添加一定比例的细胞分裂素和______。 (4)与传统杂交育种相比，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育有香味水稻的优势是______（答出两点即可）。 10．（24-25高二下·安徽合肥·期末）2024年5月16日，上海交通大学联合多家单位，在Cell上发表论文，报告了一项应用新型慢病毒（改造自人类免疫缺陷病毒—HIV）载体技术治疗重度输血依赖的β-地中海贫血的安全性和有效性研究结果。其技术流程大致如下： (1)培养患者造血干细胞时，为防止杂菌污染，需在培养液中添加适量_______。 (2)构建慢病毒载体时需用到转移质粒（如图1），转移质粒上的5'端LTR和3'端LTR序列能将这两段之间的基因插入到受体细胞的基因组中，该序列对于慢病毒的基因组转录，逆转录和整合进入宿主细胞的基因组是必须的。图1中RRE、cPPT/CTS等组件能提高外源基因整合到受体细胞的效率。 构建重组转移质粒时，可以选择图中的_____限制酶切开质粒，同时在β-珠蛋白基因扩增时所需的引物______端（填3'或5'）添加相应限制酶的识别序列和相应的额外保护碱基。 (3)慢病毒载体与患者造血干细胞表面的__________结合进入细胞，将目的基因整合到基因组DNA中。一段时间后，通过______技术，筛选能正常表达β-珠蛋白的受体细胞。 11．（24-25高二下·安徽合肥·期末）人血清白蛋白(HSA)主要在肝脏中合成，具有重要的医用价值。为制备大量的HSA，以基因工程技术获取重组HSA的两条途径如图1所示：图2为获取的含有目的基因(HSA基因) 的DNA片段，Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ为三种限制酶, 图中箭头所指为三种限制酶的酶切位点；图3是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图4是Ti质粒结构示意图。回答下列问题： (1)从人体细胞中直接提取的HSA基因，导入到大肠杆菌细胞中不能表达，原因可能是______。为了获得能在大肠杆菌细胞中表达的 HSA 基因，可从人体的_________细胞中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA（双链），再利用PCR进行扩增，该过程需向反应体系中加入__________、___________、4种脱氧核苷酸、引物和Mg2+。 (2)构建基因表达载体时，不能选择限制酶Sau3A Ⅰ，原因是_________，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应选择限制酶Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ切割质粒，选择限制酶___________充分切割目的基因。 (3)为了检测水稻胚乳细胞中是否合成了HSA蛋白，可用____________方法；若胚乳细胞中含有HSA基因，但是检测不到HSA蛋白，可能的原因是____________。 12．（24-25高二下·安徽·期末）人血清白蛋白（HSA）是一种临床常见的生物制剂，其主要用于流失血液量的快速补充、维持血管内的水分平衡。科学家将HSA基因导入奶牛细胞，利用现代生物技术构建乳腺生物反应器以生产药用HSA，相关培育过程如图1所示。回答下列问题。    (1)图1所示技术培育出动物个体，这体现了________的全能性，所培育出的小牛称为转基因_______。 (2)图1中核供体牛的性别为________，原因是________。 (3)已知HSA基因的部分碱基序列为：5′-ATGAAGCTGTGCTTA…（中间省略500bp）…CGATTCAAGGATTAA-3'，欲通过PCR技术扩增该碱基序列，现需设计一对引物。（要求：引物长度为15bp并按5'到3'注明方向） 引物1：________；引物2：_________。 (4)图2是质粒限制酶酶切图谱，已知HSA基因上不含质粒的限制酶识别序列。为构建重组质粒，在扩增HSA基因时，应在两种引物的________端分别添加 填图2中的序列）的识别序列。在保证质粒结构完整性的前提下，为使HSA基因能在乳腺细胞中表达，应将该基因与_________的启动子重组在一起。 13．（24-25高二下·安徽合肥·期末）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 14．（24-25高二下·安徽芜湖·期末）环境中常检出残留的四环素类抗生素，研究者采用基因工程技术构建出一种能高效降解四环素的工程菌。将四环素降解酶基因text导入大肠杆菌，筛选后得到工程菌，可通过发酵工程大量生产四环素降解酶并应用于生产实践。回答下列问题： (1)利用PCR获取目的基因PCR体系中dNTP除作为DNA复制的原料外，还有_______的作用。不管体内还是体外，DNA复制时均需要引物，其原因是______。 (2)构建重组DNA分子为将目的基因按照正确的方向插入质粒，PCR时在引物的_______端添加特定限制酶的识别序列。据图可知，在目的基因左右侧的引物上分别添加限制酶________的识别序列。 (3)将重组DNA分子导入受体细胞细菌转化效率很低，可将大肠杆菌置于低温、低浓度的_____溶液，成为感受态细胞，最后进行短暂的热刺激，促进_______。 (4)检测目的基因及其表达产物 可采用“插入失活”原理，筛选出含重组DNA的大肠杆菌。将经转化后的大肠杆菌通过稀释涂布平板法接种于含______的固体培养基（甲培养皿）中，然后通过灭菌绒布将菌种平移接种至含______的固体培养基（乙培养皿）中，经培养比对后，可在_______培养皿中挑选出工程菌。 15．（24-25高二下·安徽合肥·期末）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中 S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题： (1)在 DNA 聚合酶、引物、模板 DNA 和脱氧核苷酸中，随着 PCR 反应进行，分子数量逐渐减少的是______。模板与引物在 PCR 反应的______阶段开始结合。 (2)图中标识了载体和 S 基因中限制酶的切割位点。为将 S 基因正确插入载体，PCR 扩增S基因时需在引物的______（填“5´端”或“3´端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是 5´-______-3´，切割载体时应选用的两种限制酶是______，PCR 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含 S 基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带 S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中的______进入愈伤组织细胞，将 S 基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的______上，抗性基因______可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经______形成芽、 根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 16．（24-25高二下·安徽宣城·期末）I近年来现代生物技术飞速发展，以下是两种现代生物技术的流程图，请据图回答： (1)研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是______。 (2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5'-AGCAT…GTACCT-3'。则设计的向导RNA中相应的序列应为______。Cas9蛋白相当于______酶、可催化______键断裂。 (3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现脱靶几率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越_______（填“长”或“短”），基因编辑的脱靶率越高，原因是______。 Ⅱ普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。回答下列问题： (4)将改良基因和农杆菌的Ti质粒连接时，需用限制性内切核酸酶______对Ti质粒进行切割，选用上述酶进行切割的理由是______。 (5)图1中构建的基因表达载体，改良基因的上下游序列需具备启动子和终止子，以确保_______。 (6)将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用______处理农杆菌，使细胞处于一种____________的生理状态，从而易于重组Ti质粒导入。 (7)在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中______（填“一定”或“不一定”）含有改良基因，原因是_______、 (8)图2中愈伤组织经过程形成转基因水稻苗，培养基2与培养基3的区别是________。 17．（24-25高二下·安徽宿州·期末）水蛭素（Hirudin）可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。如图表示改造Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。请据图回答： (1)图中利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对的________（填“增添”“缺失”或“替换”），需要在_（填引物）中设计特定的碱基，从而对Hirudin基因进行改造以获得改良的Hirudin蛋白，这种技术操作属于_____工程。设计引物时常需添加保护碱基以提高酶切效率，保护碱基最好添加在引物的________（填“5'端”或“3'端”）。PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，作用是_______。 (2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11与Hirudin改良基因高效连接，应选用_________对pCLY11进行酶切。质粒pCLY11中neor的作用是_______。 (3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌菌落应呈______（填颜色）。 (4)PCR产物一般通过_______来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与_______（至少写两个）有关。 地 城 考点02 基因工程应用及蛋白质工程 一、单选题 1．（24-25高二下·安徽合肥·期末）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。下列相关叙述，错误的是（    ） A．改造后的干扰素的功能与天然干扰素不是完全不同 B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换 C．改造后的干扰素基因仍需导入受体细胞完成表达过程 D．蛋白质工程，是指以基因结构规律及其与生物的功能的关系为基础的 2．（24-25高二下·贵州黔西南·期中）下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是（    ） A．将某药用蛋白基因导乳腺细胞中，获得乳腺生物反应器 B．基因工程是在细胞水平上进行设计和操作的 C．只要目的基因进入受体细胞，就能成功实现稳定存在和表达 D．蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率 3．（23-24高二下·安徽·期末）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但在温度较高时易失去活性，科学家研究发现，若将其第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性。下列相关叙述错误的是（    ） A．T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构 B．提高T4溶菌酶耐热性的过程属于蛋白质工程的范畴 C．引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是氨基酸序列的变化 D．替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，直接操作对象是T4溶菌酶基因 4．（24-25高二下·安徽芜湖·期末）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述，正确的是（    ） A．治疗性克隆也会面临伦理问题，所以要对治疗性克隆有效监控和严格审查 B．转基因玉米油的包装上必须标有“转基因”标识和危害 C．利用基因编辑技术设计试管婴儿，以获得免疫艾滋病的基因编辑婴儿 D．转基因作物的目的基因不会通过花粉扩散到野生植物中造成基因污染 5．（24-25高二下·安徽·期末）某企业正在研发一种耐95℃高温的纤维素酶，其可用于生物燃料生产。下列方案最能体现蛋白质工程“设计非天然蛋白质”特性的是（　　） A．从深海热泉菌中分离出天然耐热纤维素酶基因后，直接转入大肠杆菌中表达 B．对中温纤维素酶进行定点改造，引入二硫键以增强酶的热稳定性 C．用计算机设计全新的α/β折叠结构，在人工合成相关基因后通过酵母菌表达 D．将不同来源的纤维素酶片段随机拼接，从中筛选出高温活性突变体 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $