专题08 发酵工程与基因工程 （期末真题汇编，湖南专用）高二生物下学期

**基本信息** 聚焦发酵工程与基因工程4大高频考点，汇编湖南多地高二期末真题，突出真实情境应用与实验探究能力考查。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选题|12题|传统发酵技术、微生物培养、目的基因获取、载体构建|结合泡菜制作、噬菌体计数等情境，考查基础原理| |多选题|6题|发酵过程分析、基因工程工具酶|通过菌落特征、酶切位点选择等，体现知识综合应用| |实验/解答题|12题|微生物计数、基因表达载体构建、PCR技术|设计豆汁制作、抗冻基因导入等实验，考查探究实践能力|

专题08 发酵工程与基因工程 4大高频考点概览 考点01 传统发酵技术的应用 考点02 微生物的培养与应用 考点03 目的基因的筛选、获取 考点04 基因表达载体的构建 地 城 考点01 统发酵技术的应用 一、单选题 1．(24-25高二下·湖南怀化·期末)中国的许多传统美食制作过程蕴含了生物发酵技术。下列叙述正确的是（　　） A．泡菜制作过程中，酵母菌将进行无氧呼吸产生乙酸 B．果醋制作过程中，醋酸菌将葡萄糖分解成乳酸 C．米酒制作过程中，将容器密封可以促进酵母菌增殖 D．腐乳制作过程中，除毛霉外还有多种微生物参与发酵 【答案】D 【详解】A、泡菜制作主要依赖乳酸菌的无氧呼吸产生乳酸，而非酵母菌产生乙酸。酵母菌在无氧条件下主要生成酒精和CO₂，A错误； B、醋酸菌在果醋制作中通过有氧呼吸将乙醇转化为乙酸，或直接将葡萄糖分解为乙酸，而非乳酸。乳酸是乳酸菌的代谢产物，B错误； C、酵母菌在有氧条件下增殖，密封容器会抑制其增殖并促进无氧发酵（产酒精）。密封环境无法促进酵母菌增殖，C错误； D、腐乳制作以毛霉为主，但其他微生物（如细菌、酵母菌）也参与发酵，共同分解蛋白质和脂肪，D正确。 故选D。 2．(24-25高二下·湖南郴州·期末)接种是指微生物进入培养基中的过程。一杯牛奶暴露在空气中，会由于微生物落入、生长、繁殖而变质，在此过程中发生了自然接种。图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图解，下列叙述错误的是（　　） A．甲、乙都需要将菌种接种在固体培养基上，并可能观察到单菌落 B．图甲操作过程中需要对接种环进行5次灼烧灭菌 C．图丙所示的结果是由图乙接种方法所得 D．图甲、乙在完成接种后均需要将平板放进恒温培养箱中培养，并将平板倒置 【答案】B 【分析】微生物常见的接种的方法： ①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落； ②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 题图分析：图甲的接种方法是平板划线法，图乙的接种方法为稀释涂布平板法。 【详解】A、据图分析，图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法，二者都需要将菌种接种在固体培养基上，并可能观察到单菌落，A正确； B、图甲为平板划线法，该操作过程中共划了5个区域，因而需要对接种环进行6次灼烧灭菌，B错误； C、图丙的菌落均匀分布，只能由乙种接种方法，即稀释涂布平板法获得，C正确； D、图甲、乙在完成接种后均需要将平板放进恒温培养箱中培养，并将平板倒置，这样可以避免冷凝水滴落到培养基上造成污染，D正确。 故选B。 3．(24-25高二下·湖南衡阳·期末)发酵工程生产谷氨酸制取谷氨酸钠常用到谷氨酸棒状杆菌，利用该菌发酵时需要不断地通入无菌空气。从细胞结构和对氧气的需求分析，生产下列发酵食品所需的主要菌种与谷氨酸棒状杆菌相同的是（　　） A．苹果醋 B．葡萄酒 C．泡菜 D．腐乳 【答案】A 【分析】谷氨酸棒状杆菌是好氧型细菌（原核生物），需在有氧条件下发酵。题目要求选择与其细胞结构（原核细胞）和代谢类型（好氧型）相同的菌种对应的发酵产品。 【详解】A、制作苹果醋，利用的醋酸菌属于原核生物，且为好氧型细菌，与谷氨酸棒状杆菌的细胞结构和对氧气的需求相同，A正确； B、葡萄酒的制作，选用的菌种为兼性厌氧型的酵母菌，酵母菌为真核生物，与谷氨酸棒状杆菌的细胞结构和对氧气的需求不同，B错误； C、制作泡菜，利用的乳酸菌为原核生物，属于厌氧型细菌，与谷氨酸棒状杆菌对氧气的需求不同，C错误； D、腐乳的制作，起主要作用的是毛霉，毛霉为需氧型的真核生物，与谷氨酸棒状杆菌的细胞结构不同，D错误。 故选A。 4．(24-25高二下·湖南邵阳·期末)中国劳动人民用自己勤劳的双手，利用微生物发酵创造许多传统美食，为生活增添了许多滋味，更为现代发酵工程打下了基础。下列叙述正确的是（　　） A．传统发酵过程中所用原材料均需要严格灭菌 B．发酵工程的中心环节为发酵罐内发酵 C．利用乳酸菌制作泡菜的过程中，先通气培养，后密封发酵 D．对发酵液中微生物分离和计数时可采用平板划线的接种方法 【答案】B 【分析】1、发酵与传统发酵技术：(1)发酵：是指人们利用微生物， 在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。(2)传统发酵技术：①概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。②实例：腐乳的制作。 2、发酵工程的基本环节：(1)菌种的选育：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。(2)扩大培养：在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。(3)培养基的配制：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。(4)灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。(5)接种：将菌种接种到发酵罐培养液中。(6)发酵： 这是发酵工程的中心环节。①在发酵过程中，要随时检测培养波中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。②要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。(7)产品的分离、 提纯：①如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后采用过滤沉淀等方法将菌体分离和干燥，即得到产品。②如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。 【详解】A、传统发酵利用的是自然环境中的微生物，原材料通常只需清洗或简单处理，无需严格灭菌，如泡菜制作利用乳酸菌的天然发酵。A错误； B、发酵工程的中心环节是发酵罐内的发酵过程，此阶段通过调控条件使菌种大量繁殖并产生代谢产物。B正确； C、乳酸菌为严格厌氧菌，制作泡菜需全程密封以维持无氧环境，若先通气会抑制其生长并导致杂菌污染。C错误； D、平板划线法用于分离纯化菌种，无法准确计数；微生物计数需用稀释涂布平板法统计菌落数。D错误。 故选B。 5．(24-25高二下·湖南长沙岳麓区湖南师范大学附属中学·期末)井冈霉素是我国科学家发现的一种抗生素，井冈霉素是糖类衍生物，由链霉菌井冈变种（JGs）发酵而来，广泛应用于水稻病害防治。下列相关叙述错误的是（    ） A．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，有利于提高井冈霉素产量 B．提高发酵培养基中营养物质的浓度，可能会影响JGs存活率 C．对JGs发酵过程中活细胞数量进行实时监测最适宜用稀释涂布平板法 D．JGs不含直接编码井冈霉素的基因 【答案】C 【详解】A、扩大培养可增加菌种数量，使其快速进入对数生长期，提高发酵效率，A正确； B、培养基浓度过高会导致渗透压升高，使细胞失水，影响JGs存活率，B正确； C、稀释涂布平板法需培养24~48小时形成菌落，无法实时监测活细胞数量，最适方法应为显微镜直接计数或间接检测（如pH、代谢产物），C错误； D、井冈霉素是糖类衍生物，其合成需多种酶催化，基因通过控制酶合成间接控制井冈霉素合成，而非直接编码该物质，D正确。 故选C。 6．(24-25高二下·湖南岳阳·期末)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。具体做法，在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45-48℃，然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在双层培养基的上层会出现透亮的无菌圆形空斑——噬菌斑，下列有关说法不正确的是（　　） A．底层培养基可以弥补培养皿底部或超净工作台不平，利于后续实验观察 B．上层培养基中琼脂浓度较低，因此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 C．将培养基冷却到45-48℃最主要原因是防止下层固体培养基被液态化 D．底层平板凹凸不平，原因可能是温度过低导致部分培养基已经凝固 【答案】C 【分析】1、双层平板法，先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。 2、双层平板法的优点：①加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象；③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。 【详解】A、底层培养基琼脂含量高（2%），凝固后形成平整基础，弥补培养皿底部或操作台不平，便于上层均匀铺展和观察噬菌斑，A正确； B、上层培养基琼脂浓度较低（1%），质地较软，允许噬菌体扩散范围更大，形成较大的噬斑，便于计数，B正确； C、上层培养基冷却至45-48℃的主要目的是避免高温杀死敏感指示菌，而非防止下层培养基融化（下层琼脂含量高，凝固温度更低，不易被液态化），C错误； D、底层平板凹凸不平可能因倒入培养基时温度过低，导致部分提前凝固而无法均匀铺展，D正确。 故选C。 二、多选题 7．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)桑葚是黄河故道沿线的特色水果之一，可以用来制作桑葚酒和桑葚醋，制作流程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．发酵过程中，甲罐发酵液pH逐渐上升，可通过测量pH变化及时了解发酵情况 B．若发酵过程中甲罐中的发酵液表面出现气泡，无法说明发酵液已被杂菌污染 C．乙罐中醋酸菌与氧气、桑葚酒充分接触有利于提高发酵效率 D．若甲罐中的桑葚酒全部加入乙罐制成桑葚醋，则乙罐需要定期排出CO2 【答案】BC 【分析】在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵；酒精发酵的温度是在18～30℃，pH最好是弱酸性。醋酸菌为好氧型细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；醋酸菌生长的温度是在30～35℃。 【详解】A、甲罐为酒精发酵，产生的CO2会使pH下降，A错误； B、甲罐为酒精发酵，产生的CO2会在发酵液表面出现气泡，无法说明发酵液已经被杂菌污染，B正确； C、醋酸菌为需氧菌，乙罐中的醋酸菌与氧气、桑葚酒充分接触有利于提高发酵效率，C正确； D、醋酸菌利用乙醇生产醋酸的过程中产物是醋酸和水，不产生二氧化碳，D错误。 故选BC。 三、实验题 8．(24-25高二下·湖南长沙天心区长沙长郡中学·期末)北京传统小吃“豆汁”是一种以绿豆为原料，经过一系列制作工艺流程（如下图）得到的一种以酸味为主、掺杂着些许臭味的糊状流体食品。混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，混合浆的沉淀与酸化过程实际属于乳酸发酵，其主要产酸微生物为乳酸菌。某研究小组测定了豆汁制作过程中部分化学成分含量变化的有关数据（如下表）。回答下列问题： 浆状样品 可溶性蛋白/（mg·mL-1） 游离氨基酸/（mg·mL-1） 蛋白酶（U·mL-1） 混合浆 5.60 0.31 1.19 酸浆 1.4 0.51 1.16 (1)混合浆发酵时所需的乳酸菌主要来自_______。以葡萄糖为底物进行乳酸发酵，发酵过程中葡萄糖分子的大部分能量存留在_______中。 (2)欲测定混合浆中活乳酸菌含量的多少，除采用稀释涂布平板法外，还可用显微镜直接计数法，该方法统计的结果一般是______的总和，从而导致数据偏大。 (3)分析表中数据，酸浆I中的可溶性蛋白含量比混合浆低得多，推测其原因是________（答出两点即可）。 (4)相对于传统发酵，发酵工程一般包括菌种的选育和培养，产物的分离和________等环节。为了筛选出产酸能力强的乳酸菌菌种，研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体培养基（添加了质量分数为1．5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，在适宜条件下培养一段时间后，应挑取______的菌落进一步培养筛选。 【答案】(1) 老浆 乳酸 (2)活菌数和死菌数 (3)乳酸菌发酵产生的乳酸使pH值下降，导致可溶性蛋白质变性沉淀；混合浆中的蛋白酶分解了部分可溶性蛋白质 (4) 提纯 透明圈直径与菌落直径比值较大（透明圈相对较大） 【分析】传统发酵食品的制作离不开各种各样的微生物。乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。 【详解】（1） 根据题干信息：混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，则混合浆发酵时所需的乳酸菌主要来自老浆；乳酸菌利用葡萄糖进行无氧呼吸产生乳酸，释放少量能量，发酵过程中葡萄糖分子的大部分能量存留在乳酸中。 （2） 稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。显微镜直接计数法统计的是活菌数和死菌数，导致数据偏大。 （3）乳酸菌发酵产生的乳酸使pH值下降，导致可溶性蛋白质变性沉淀；混合浆中的蛋白酶分解了部分可溶性蛋白质，因此酸浆I中的可溶性蛋白含量比混合浆低得多。 （4）发酵工程一般包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵、产物的分离和提纯等环节。碳酸钙遇酸发生反应会出现透明圈，而产酸能力强的乳酸菌，则透明圈越大，故研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体培养基（添加了质量分数1.5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，在适宜条件下培养一段时间后，应挑取透明圈直径与菌落直径比值较大（透明圈相对较大）的菌落进一步培养筛选。 地 城 考点02 微生物的培养与应用 一、单选题 1．(24-25高二下·湖南雅礼中学·期末)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。具体做法是：在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45~48℃，然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板（见下图）。培养一段时间后，在双层培养基的上层会出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑，根据噬菌斑的数目可计算原液中噬菌体的数量。判断下列正确的是（　　） A．需先调节灭菌后培养基的pH，然后再进行倒平板 B．倒上层平板时需将培养基冷却到45~48℃的最主要原因是防止下层固体培养基被液态化 C．利用双层平板法统计出的噬菌体数量往往比实际值偏大 D．与底层平板相比，上层培养基中琼脂浓度较低的好处是形成的噬菌斑较大，有利于计数 【答案】D 【分析】双层平板法的优点：①加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到弥补；②所形成的全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象；③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。 【详解】A、配制培养基时，要先调pH再灭菌，然后进行倒平板，A错误； B、高温会破坏蛋白质的空间结构，故将培养基冷却至45~48℃最主要的原因是避免高温杀死细菌和噬菌体，B错误； C、在计数时，有可能噬菌体入侵细菌后还未裂解细菌，未形成噬菌斑。因此，利用双层平板法统计出的噬菌体数量往往比实际值偏小，C错误； D、与底层平板相比，上层培养基中琼脂浓度较低的好处是形成的噬菌斑较大，有利于计数，D正确。 故选D。 2．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)富湾绿豆烧酒，香醇甜美，久享盛誉，其色宛如绿豆汤，制作的工艺流程如图所示。相关叙述正确的是（　　） A．蒸稻壳不仅可以去除稻壳中残留的农药、霉烂味还能杀灭一部分杂菌 B．发酵过程中起主要作用的微生物是酵母菌，温度一般控制在30~35℃ C．扩大培养需要采用液体培养基，对培养基灭菌常采用干热灭菌 D．绿豆烧酒的生产流程中，因为没有严格的灭菌操作，发酵过程很容易受杂菌污染 【答案】A 【详解】A、蒸煮可以起到消毒的作用，蒸稻壳的目的除了去除稻壳中残留的农药、霉烂味，还有杀灭一部分杂菌，A正确； B、发酵过程中起主要作用的微生物是酵母菌，温度一般控制在18-30℃，B错误； C、扩大培养需要采用液体培养基，对培养基灭菌常采用湿热灭菌，C错误； D、绿豆烧酒的生产流程中，酵母菌在无氧条件下会产生酒精，并使培养液pH变低，在缺氧和酸性环境条件下酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物因无法适应而受到抑制，该过程虽没有严格的灭菌操作，但发酵过程几乎不会受杂菌污染，D错误。 故选A。 3．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)研究人员利用石油污染滩涂土壤筛选高效降解石油细菌，进行如下图所示的操作（① - ⑤表示不同的菌落）。下列叙述正确的是（　　） A．图中液体培养基和固体培养基成分的唯一不同是后者含有琼脂 B．甲过程采用的接种方法可用于菌体计数，但结果通常偏小 C．菌落①中菌体因不能分解石油而无降解圈产生，其生长不需要碳源 D．乙过程选择菌落③接种到石油培养基，可根据石油剩余量进行降解能力评估 【答案】B 【详解】A、图中液体富集培养基和固体选择培养基成分的不同之处有，后者以石油作为唯一碳源、后者固体培养基中含有琼脂，A错误； B、甲过程采用的是稀释涂布平板法，使用该方法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此该方法用于计数时往往使结果偏小，B正确； C、菌落①周围无降解圈产生，说明其中的菌体不能利用石油这唯一的碳源，很可能是自养型微生物，以CO2作为碳源，C错误； D、乙过程选择菌落⑤（降解圈最大）接种到石油培养基，可根据石油剩余量进行降解能力评估，石油的剩余量越少，则菌种降解能力越强，D错误。 故选B。 4．(24-25高二下·湖南湘潭·期末)酸笋是一种以新鲜竹笋为原料，发酵腌制而成的具有独特发酵酸臭味的笋制品，是风味食品螺顿粉的重要配料。下图为利用乳酸菌，酵母菌、醋酸菌等微生物发酵制作酸笋的工艺流程图，下列有关叙述错误的是（　　）    A．杀青、漂烫步骤是通过高温灭菌避免杂菌污染 B．可以通过诱变育种、基因工程育种等方法进行菌种选择和优化 C．醋酸菌能将酵母菌产生的乙醇氧化为醋酸，进一步丰富酸笋的酸味层次 D．发酵过程中要随时检测培养液中微生物数量，可以利用显微镜进行计数 【答案】A 【分析】统计菌落数目的方法：（1）显微镜直接计数法：①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数； ③缺点：不能区分死菌与活菌。（2）间接计数法（活菌计数法）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 【详解】A、在选材、清洗、切割后进行杀青、漂烫，目的是给材料消毒，而不是灭菌，A错误； B、在发酵工业中，常通过诱变育种（如紫外线、化学诱变）或基因工程改良菌种，提高产酸能力或耐受性，故该工艺流程中可以通过诱变育种、基因工程育种等方法进行菌种选择和优化，B正确； C、参与酸笋发酵的微生物除了乳酸菌，还有酵母菌和醋酸菌，酵母菌将糖类分解产生酒精（乙醇）和二氧化碳，醋酸菌将乙醇氧化为醋酸，进一步丰富酸笋的酸味层次，C正确； D、发酵过程中要随时检测培养液中微生物的数量、产物的浓度等，以了解发酵的进程，显微镜镜检计数可以实时监测培养液中微生物数量，D正确。 故选A。 5．(24-25高二下·湖南湘东教学联盟·期末)微生物稀释涂布平板法的具体操作如图所示，下列操作正确的是（    ） ①涂布器浸在酒精中 ②取0.1mL菌液，滴加到培养基表面 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面 ⑤用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面 ⑥将样品依次等比稀释 ⑦将涂布器放在火焰上灼烧 A．①③⑤⑥⑦ B．①④⑤⑥⑦ C．①②⑤⑥⑦ D．①③④⑥⑦ 【答案】C 【分析】稀释涂布平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。 计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表 一个细胞)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。 【详解】微生物稀释涂布平板操作需要注意无菌操作，利用移液管将菌液转移到培养皿时不能将培养皿盖完全打开，③错误。涂布器刚灼烧完立即用于涂布会杀死菌种，④错误。①②⑤⑥⑦均正确。 故选C。 二、多选题 6．(24-25高二下·湖南怀化·期末)为筛选出淀粉分解菌，研究人员进行了相关实验，结果如下。相关叙述正确的是（　　） 菌种 菌落直径：C/mm 透明圈直径：H/mm 细菌Ⅰ 5.1 11.2 细菌Ⅱ 8.1 13.0 A．本实验中微生物培养基以淀粉作为唯一碳源 B．为形成透明圈，应使用刚果红进行染色处理 C．实验结果表明细菌Ⅰ分解淀粉能力较细菌Ⅱ要强 D．为进一步筛选分解淀粉的细菌，只能使用稀释涂布平板法 【答案】AC 【详解】A、为筛选出淀粉分解菌，应使用淀粉为唯一碳源，A正确； B、淀粉应使用碘液染色，刚果红会与纤维素结合形成红色复合物，B错误； C、透明圈直径/菌落直径比值越大，则分解淀粉能力越强，据表中数据可知，细菌Ⅰ的H/C的值更大，说明其分解能力更强，C正确； D、为进一步筛选细菌可使用平板划线法或稀释涂布平板法，D错误。 故选AC。 7．(24-25高二下·湖南长沙天心区长沙长郡中学·期末)瘤胃纤毛虫是一种能分泌纤维素酶的原生动物，生活在牛羊等反刍动物的瘤胃中。研究人员将纯化的瘤胃纤毛虫接种到含5mL改良培养液（由K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl等组成）的试管中，每天投喂100μL底物悬液（由淀粉和草粉组成），每3～4天换液一次，投喂和换液结束后均需充入某种气体再盖上盖子继续培养。每天进行计数，结果如图所示。相关叙述正确的是（    ） A．可用干热灭菌法对改良培养液进行灭菌处理 B．K2HPO4和KH2PO4共同作用能维持培养液的pH C．投喂和换液结束后充入的可能是CO2，其目的是提供无氧环境 D．将等量瘤胃纤毛虫接种到含10mL改良培养液的试管中，其环境容纳量将上移 【答案】BCD 【分析】灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。 【详解】A、一般用湿热灭菌法对培养液进行灭菌，A错误； B、K2HPO₄和KH2PO₄是缓冲物质，能维持培养液的pH，B正确； C、瘤胃纤毛虫生活在胃内，为无氧环境，投喂和换液结束后充入CO2，其目的是提供生存的无氧环境，C正确； D、将等量瘤胃纤毛虫接种到10mL改良培养液的试管中，与题干相比，增加了5mL改良培养液，其环境容纳量将提高，D正确。 故选BCD。 三、解答题 8．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)科研人员从变质豆浆中分离出腐败菌，并研究乳酸链球菌素对腐败菌的抑制效果，以为豆浆保质提供依据。请结合研究过程回答下列问题： (1)将2种市售豆浆A、B和自制豆浆在无菌操作台上分别装入已灭菌的250mL三角瓶中，密封、37℃条件下，放置7d后，豆浆变质。取变质的豆浆在无菌条件下接种到细菌培养基上，一段时间后，统计各培养基上菌落种类和数量，结果如表： 细菌序列 菌落特征 菌落直径/mm 菌落数/个 豆浆A 豆浆B 自制豆浆 S1 表面有白色绒毛，圆形边缘不规则 5 5 3 7 S2 白色，表面无绒毛，有白色液滴 1-2 18 11 24 S3 白色，表面无绒毛，如同黄色液斑 20-30 11 7 15 从3个样品中各取1mL变质豆浆，用_______进行适度稀释后，取0.1mL样品液滴加到细菌培养基表面，用_________（此工具常使用前采用_______法进行灭菌）使之分布均匀。表中统计的菌落数比往往比活菌的实际数目_________，这是因为__________。细菌培养基通常利用_______法进行灭菌； (2)区分菌落种类的依据是__________。统计菌落时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的种类和数目。 (3)以自制的新鲜豆浆为材料，经相应处理后，在37℃下放置35d后，统计豆浆中腐败菌数量，结果如图。 乳酸链球菌素是一种多肽。 为有效防止豆浆腐败，在生产中乳酸链球菌素的添加量应控制在_________mg·kg-1左右；结果表明，最不能耐受乳酸链球菌素的细菌是_______（填序号）。 【答案】(1) 无菌水 涂布器 灼烧灭菌 少 两个或多个细胞连在一起只形成了一个菌落 高压蒸汽灭菌 (2)菌落的形状、隆起程度和颜色等 (3) 250 S3 【详解】（1）稀释涂布平板法基本操作：用无菌水等比例稀释，取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面，将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、 涂布器冷却后，再进行涂布，用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 稀释涂布平板法用途：常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 常用的消毒和灭菌方法包括湿热灭菌、灼烧灭菌和干热灭菌。其中湿热灭菌是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好，实验室常用的高压蒸汽灭菌锅对细菌培养基进行灭菌。灼烧灭菌是将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。 （2）区分菌落种类的依据是菌落的特征，包括菌落的形状、大小、颜色、表面特征（光滑或粗糙）、边缘特征（如整体或不规则）等。 （3）由图可知，乳酸链球菌素添加量在100-150 mg/kg范围内，三个组的细菌数量随着乳酸链球菌素添加量的增加而减少，并且S3组的细菌减少幅度最大。当乳酸链球菌素添加量至250 mg/kg时，三个组的细菌数量均将至最低值，且三个组的细菌数量不会随着乳酸链球菌素添加量的增加而改变，处于稳定状态。 9．(24-25高二下·湖南长沙芙蓉高级中学·期末)富集培养是微生物学中的最强有力的技术手段之一、主要是利用不同微生物生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其数量大大增加。下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。请分析回答下列问题。 (1)①→④过程所用的培养基均属于_____培养基。 (2)若实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的异化作用类型是_____；振荡培养的另一个目的是_____。 (3)培养基灭菌后待平板凝固后，应倒置放在超净台上，目的是_____。设置⑥的目的是_____。 (4)实验结束时，使用过的培养基应该进行灭菌处理后，才能倒掉，以免_____。 【答案】(1)选择 (2) 需氧型 让目的菌充分利用培养液中的营养物质 (3) 防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发 说明通过选择培养的确得到了欲分离的目标微生物 (4)污染环境或感染操作者 【分析】实验室中筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发。 【详解】（1）①→④过程所用的培养基添加对羟基苯甲酸以筛选能降解酚类化合物的微生物，为选择培养基。 （2）振荡培养的目的之一是增大培养液中溶解氧，对此可推测培养微生物的代谢类型是异养需氧型；目的之二是让目的菌充分利用培养液中的营养物质。 （3）倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发。实验培养的微生物主要是能降解对羟基苯甲酸的微生物，所以⑤中的菌落中大部分是降解对羟基苯甲酸微生物；⑥中没有对羟基苯甲酸，⑦中含有对羟基苯甲酸，所以⑥是起对照作用，对照的目的是说明通过选择培养的确得到了欲分离的目标微生物。 （4）实验结束后，使用过的培养基应进行灭菌处理后，才能倒掉，以免污染环境或感染操作者。灭菌是指用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 四、实验题 10．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)研究人员对某地学校、酒店、健身会所、社区等场所游冰池池水进行抽样检测，其中，对游泳池池水活细菌总数进行检测的实验步骤如下： ①采样瓶的预处理：在采样瓶中加入适量的 Na2S2O3溶液后对采样瓶进行灭菌处理。 ②采样：在客流高峰时段进行采样，采集位置在水下30cm左右，取水500mL。 ③接种：用灭菌吸管吸取水样 1mL，注入灭菌培养皿中。将熔化并冷却至45℃的营养琼脂培养基倒入培养皿内，每皿15mL。立即旋摇培养皿，使水样和培养基充分混匀。重复若干次。 ④培养并计数：待琼脂凝固后翻转培养皿，置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上的菌落数，并求平均值。 请回答下列问题： (1)检测游泳池池水活细菌总数时，不宜用细菌计数板在显微镜下直接计数，原因是_______，容易造成计数结果偏大。 (2)Na2S2O3具有还原性，可消除水样中的余氯。据此分析，步骤①中在采样瓶中添加Na2S2O3溶液对检测的意义是______ (3)为使实验数据更准确，步骤③中还应增加对照组，下列最不宜作对照组的是_______（单选）。 a.15mL营养琼脂培养基 b.1mL无菌水+15mL营养琼脂培养基 c.1mL清水+15mL营养琼脂培养基 (4)步骤④中，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为_______。 (5)不同季度微生物检测结果如表所示，第三季度合格率下降的原因可能包括_______。 季度 检测场馆数 合格场馆数 合格率（%） 一 34 34 100 二 40 38 95 三 399 329 82.5 四 36 36 100 a.气温升高    b.客流量增加    c.检测的场馆数多    d.游泳池氯化时间过长 根据检测结果，要进一步加强第三季度的场馆管理。下列属于提升游泳池水质安全性的合理建议有______。a.增加游泳池水质监测的频次      b.给游泳池装设水循环过滤装置     c.每日在临近开馆前氯化消毒 【答案】(1)显微镜直接计数获得的结果为活菌数和死菌数的总和 (2)避免余氯杀死活菌，使检测结果更加准确 (3)c (4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 (5) ab ab 【分析】统计菌落数目的方法：（1）显微镜直接计数法 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数；③缺点：不能区分死菌与活菌。（2）间接计数法（活菌计数法） ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 【详解】（1）测定培养液中游泳池活细菌总数可以使用稀释涂布平板法进行计数，而显微镜直接计数获得的结果包含活菌和死菌的总数，容易造成计数结果偏大，不宜用细菌计数板在显微镜下直接计数。 （2）氯化消毒后池水中的游离性余氯可保证持续消毒效果，Na2S2O3具有还原性，可消除水样中的残余氯，对游泳池水活细菌总数进行检测，步骤①中在采样瓶中添加Na2S2O3溶液，可以避免残留氯杀菌，使检测结果更加准确。 （3）a、15mL营养琼脂培养基，观察是否有菌落产生，以判断培养基灭菌是否彻底，a不符合题意； b、1mL无菌水+15mL营养琼脂培养基，观察是否有菌落产生，以判断培养基灭菌是否彻底，b不符合题意； c、1mL清水+15mL营养琼脂培养基组，清水中含有微生物，不宜作为对照组，c符合题意。 故选c。 （4）步骤④中，用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 （5）a、气温升高会导致微生物繁殖加快，导致合格率降低，a正确； b、客流量增加，携带的微生物增多，导致合格率降低，b正确； c、由于不同场馆分别计数，故检测的场馆数多不是导致合格率降低的原因，c错误； d、泳池氯化时间过长会杀灭更多的微生物，不是导致合格率降低的原因，d错误。 故选ab。 a、增加游泳池水质监测的频次，可以提升游泳池水质安全，a正确； b、给游泳池装设水循环过滤装置，可以提升游泳池水质安全，b正确； c、每日在临近开馆前氯化消毒，余氯含量过高会影响人体健康，c错误。 故选ab。 地 城 考点03 目的基因的筛选、获取 一、单选题 1．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)利用PCR 既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（　　） A．PCR用的 DNA 聚合酶是一种耐高温酶 B．变性过程中双链DNA 的解开不需要解旋酶 C．复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D．延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸 【答案】D 【分析】PCR技术： 1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR使用的DNA聚合酶（如Taq酶）需耐受高温，因为变性步骤需高温处理，A正确； B、PCR变性通过高温（约95℃）使双链DNA解开，无需解旋酶参与，B正确； C、复性时引物与模板链通过碱基互补配对结合（如A-T、C-G），C正确； D、延伸阶段合成的是DNA链，所需原料为4种脱氧核苷酸（dNTP），而非核糖核苷酸，D错误。 故选D。 2．(24-25高二下·湖南衡阳·期末)研究者设计并合成了核苷酸单链，如图所示，将它们加入含DNA聚合酶、原料等的反应管中，在适宜条件下，两条单链既为引物又为模板，经复性、延伸，得到的双链DNA片段的碱基对数目是（　　） A．91 B．107 C．50 D．57 【答案】A 【分析】利用PCR技术获取目的基因，要求知道目的基因的全部序列或两端的部分序列，通过合成相应的引物，就可以有效的扩增出所需的目的基因。PCR技术的基本过程是变性--退火--延伸。 【详解】观察可知，较长单链3'端的16个碱基与较短单链3'端的16个碱基间可以互补配对结合，然后发挥各自引物和模板的作用，因此得到的双链DNA片段的碱基对数目为57+50—16=91，A正确，BCD错误。 故选A。 二、多选题 3．(23-24高二下·湖南湘西·期末)研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员利用大肠杆菌制备了巨噬细胞表面标志蛋白CD14蛋白，下图为构建目的基因及载体的相关示意图。下列有关叙述正确的是（　　） A．若B链为转录的模板链，则构建基因表达载体时B链的3'端与启动子相连 B．用XhoI和SalI双酶切CD14基因和载体，经DNA连接酶连接后，可用限制酶XhoI和Sal I对CD14 基因的连接方向进行鉴定 C．PCR 扩增CD14基因，DNA聚合酶催化引物的5'端与加入的脱氧核苷酸的3'端形成磷酸二酯键 D．将重组DNA分子导入受体细胞时，可用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于能吸收环境中DNA分子的状态 【答案】ABD 【分析】将目的基因导入受体细胞，因受体细胞不同导入方法也不相同。导入植物细胞常用的方法是：花粉管通道法(我国独创)、基因枪法和农杆菌转化法，导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中；导入原核生物（大肠杆菌）常用Ca2+处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 【详解】A、启动子的作用是启动转录，子链的延伸方向5'到3'，故若B链为转录的模板链，则构建基因表达载体时B链的3'端与启动子相连，A正确； B、可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列），B正确； C、DNA聚合酶催化引物的3'端与加入的脱氧核苷酸的5'端形成磷酸二酯键，C错误； D、将重组DNA分子导入受体细胞时，可用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于能吸收环境中DNA分子的状态，D正确。 故选ABD。 三、解答题 4．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)葡萄糖异构酶（GI）在工业上用于生产高果糖浆，但其最适pH偏高，不适用于工业化生产。研究发现，将葡萄糖异构酶的184位的天冬酰胺（Asn）替换成天冬氨酸（Asp）后，最适pH下降了1个单位，更适合工业化生产条件，如图表示改造葡萄糖异构酶基因（GI基因）及构建基因表达载体的过程。回答下列问题：    (1)将葡萄糖异构酶的184位的天冬酰胺（Asn）替换成天冬氨酸（Asp），需要对GI基因的基本单位进行___（填“增添”“缺失”或“替换”），这种技术操作属于______工程。 (2)改造葡萄糖异构酶基因时，PCR1和PCR2_____（答“能”或“否”）在同一反应体系中进行，原因是________。质粒pCLY11中neor的作用是_______。PCR3反应体系中需要加入的引物是_____。 (3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用________处理大肠杆菌细胞。微生物通常作为基因工程受体细胞的优点有___________（答出两点即可）。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌菌落应呈_________。 【答案】(1) 替换 蛋白质 (2) 否 引物2和引物3可通过碱基互补配对形成双链，影响与模板正常配对 便于重组DNA分子的筛选 引物1和引物4 (3) Ca2+ 微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点 白色 【分析】蛋白质工程是指根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。目的基因的获取可以从基因文库中提取，可以使用PCR进行扩增获得。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 【详解】（1） 题意可知，将葡萄糖异构酶的184位的天冬酰胺（Asn）替换成天冬氨酸（Asp），需进行基因内部碱基对的替换；该过程对蛋白质的结构进行了设计改造，属于蛋白质工程。 （2） 改造葡萄糖异构酶基因时，PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行，因为引物2和引物3可通过碱基互补配对形成双链，影响与模板正常配对。PCR3反应体系中需要加入的引物是引物1和引物4，质粒pCLY11中neor的作用是作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞。 （3）若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用Ca2+（或CaCl2）处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态。微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点，通常作为基因工程受体细胞。由于重组质粒构建时破坏了mlacZ基因（表达产物会使细胞呈蓝色，否则细胞呈白色），所以所选的工程菌菌落应呈白色。 5．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)为研究干旱胁迫基因LEA 对绞股蓝植株中油脂积累的影响机制，科研人员将干旱胁迫基因LEA 与含荧光素酶基因 Luc的质粒结合，构建基因表达载体，并将导入基因表达载体的绞股蓝分生细胞培养成转基因植株甲，在干旱胁迫的环境下培养正常植株和转基因植株甲，检测植物体内油脂合成关键酶—乙酰-CoA 羧化酶基因的表达水平。请回答下列问题： 注：图1表示基因LEA的部分序列；图2表示质粒的部分结构，①②③分别为限制酶EcoRV、XbaI 和 BanHI的酶切位点；图3表示限制酶的识别序列及酶切位点；图4 表示正常植株和转基因植株甲中有关基因的表达水平。 (1)从基因数据库中获取干旱胁迫基因LEA的核苷酸序列信息，设计相应引物并人工合成。据图2、图3分析，需要在两个引物的5'端添加限制酶________________的识别序列，以防止基因 LEA 与质粒发生反向连接。 (2)进行 PCR扩增时，以Y链为模板设计的引物的部分序列为5’________________3’。 (3)将目的基因与质粒连接后构建重组DNA，将验证后的重组DNA导入绞股蓝分生细胞，通常采用农杆菌转化法，该方法的原理是________________。将转化成功的绞股蓝分生细胞接种于培养基中培养，待分化出芽后转入诱导______的培养基中培养至组培苗。 (4)如图4表示正常植株和转基因植株甲中乙酰-CoA羧化酶基因的表达水平。据图分析，干旱胁迫下绞股蓝植株在油脂积累过程中，基因LEA 的影响机制可能是________________。依据该结果不能说明转基因植株的油脂积累量比正常植株高，理由是________________。 【答案】(1)EcoR V和Xba I (2)GATATCATGGGC (3) 农杆菌侵染植物细胞时能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上 生根 (4) 促进乙酰-CoA羧化酶基因的表达，从而使油脂合成增加 油脂合成量增加，分解量未知，可能也增加，因此油脂的积累量不一定比正常植株高。 【分析】1、基因工程的操作步骤： (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； (4)目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶和运载体。 【详解】（1）根据图1可知，转录的方向是从左向右，因此转录以Y链为模板；图2中启动子在左侧，说明基因转录的方向也是从左向右，为了防止目的基因与质粒反向连接，要使目的基因两侧的黏性末端不同，即在目的基因左侧添加EcoR Ⅴ的识别序列，右侧添加Xba Ⅰ的识别序列，不选用BamH Ⅰ的原因是荧光素酶基因Luc中有该酶的酶切位点。 （2）以Y链为模板设计的引物结合在模板的左端，由于目的基因左端要加入EcoR Ⅴ的识别序列，因此该引物的部分序列为5'-GATATCATGGGC-3'。 （3）农杆菌转化法的原理是农杆菌侵染植物细胞时能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。将转化成功的绞股蓝分生细胞接种于培养基中培养，待分化出芽后再转入到生根培养基中生根，再培养至组培苗。 （4）据图4可知，与正常植株相比，转基因植物甲的乙酰-CoA羧化酶基因表达水平明显升高，乙酰-CoA羧化酶是油脂合成关键酶，因此干旱胁迫下绞股蓝植株在油脂积累过程中，基因LEA的影响机制可能是促进乙酰-CoA羧化酶基因的表达，从而使油脂合成增加。由图4仅能推出转基因植株的油脂合成量增加，但分解量未知，油脂的积累量不一定比正常植株高。 6．(24-25高二下·湖南怀化·期末)湖南是杂交水稻研究的摇篮，一粒种子改变了世界，而水稻又是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学家们通过基因工程技术将蓝细菌中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题。 (1)利用PCR技术增目的基因时，PCR反应的缓冲液中需添加的物质有______。通过控制温度变化循环30次之后，理论上DNA分子数会扩增______倍。 (2)表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，仅用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是______。完成构建后，用E酶完全酶切处理，再利用电泳检测试管（图2）中共出现了______个条带，则说明其中包含了重组质粒。 (3)将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的目的是______。（填字母） A．促进受体细胞分裂 B．筛选符合要求的水稻细胞 C．抑制未导入质粒的细胞的生长 D．诱导高效光合相关基因表达 (4)若培养成功的转基因细胞中，少部分目的基因无法表达，可能的原因是______（答出1点即可）。 【答案】(1) DNA模板、（2种）引物、（4种）脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 230 (2) B 4 (3)C (4)目的基因与质粒反向连接导致目的基因无法表达；导入的基因发生了突变；导入的基因发生了甲基化 【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。启动子：启动转录，终止子：终止转录。 【详解】（1）PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。每次循环后目的基因的量可以增加一倍，成指数形式扩增，循环30次会扩增230倍。 （2）表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是B，因为在目的基因的两端有限制酶B的识别序列，质粒也有酶B的识别序列。由于空白质粒上有2个E酶酶切位点，而重组质粒上有3个E酶酶切位点，所以用E酶完全水解后，空白质粒得到2个DNA片段，重组质粒得到3个DNA片段，其中二者有1个DNA片段是一样的，所以共出现4个DNA片段。 （3）在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）可抑制未导入质粒的细胞的生长，从而筛选出含载体的细胞，但含空载体的受体细胞不符合要求，C正确，ABD错误。 故选C。 （4）导入的基因反向连接到质粒、导入的基因发生了突变、导入的基因发生甲基化等，都可能会导致目的基因无法正确表达。 7．(24-25高二下·湖南郴州·期末)番茄不耐寒，冬季容易冻坏，难以储藏。我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtCOR15a，经过一系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。 (1)在培育新品种的过程中，需要用PCR技术扩增AtCOR15a基因，PCR技术中添加的引物指的是__________，除了引物，还需要添加__________酶。 (2)如果要将AtCOR15a基因与质粒构建重组DNA分子，一般采用双酶切法。据图中的酶切位点分析，选用的两种限制酶组合是__________。构建基因表达载体后，图中采用__________法将目的基因导入番茄细胞，最终通过__________技术培育成番茄植株。 (3)为了提高AtCOR15a基因的表达能力，可将AtCOR15a基因与外源强启动子连接，如下图所示。 利用PCR技术检测上述连接是否正确，可选择的引物组合是______(填字母)。 A．①+② B．①+③ C．②+③ D．③+④ 【答案】(1) 能与AtCOR15a基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 耐高温的DNA聚合酶（或“TaqDNA聚合酶”） (2) BamHⅠ和HindⅢ 农杆菌转化 植物组织培养 (3)B 【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建（核心）；第三步；将目的基因导入受体细胞；第四步：目的基因的检测和表达。 【详解】（1）用PCR技术扩增AtCOR15a基因时需要添加引物，引物是能与AtCOR15a基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3' 端开始连接，除了引物，还需要添加耐高温的DNA聚合酶。 （2）为了能筛选重组DNA分子，必须保留抗生素抗性基因（即质粒上的标记基因），不能选择SmaⅠ，若选择EcoRI，则目的基因两端具有相同的黏性末端，目的基因会自身环化，综上分析，采用双酶切法，据图分析选用的两种限制酶组合是Hind Ⅲ和BamHⅠ。将目的基因转移到植物细胞常使用农杆菌转化法，农杆菌侵染番茄细胞后，利用农杆菌转化法将目的基因转移到番茄细胞中，最终通过植物组织培养技术培育成番茄植株。 （3）利用PCR检测连接是否成功，应当将强启动子和AtCOR15a基因都扩增出来，所以可选择的引物组合是①+③，故选B。 8．(24-25高二下·湖南湘东教学联盟·期末)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛应用于治疗病毒感染性疾病。传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞中提取，产量极低，远不能满足需求。科学家常采用基因工程方法从大肠杆菌及酵母菌细胞内获取干扰素。 (1)若利用大肠杆菌生产人干扰素，通过常规PCR技术从人体细胞获取并扩增得到的人干扰素基因_____（填“能”或“不能”）直接作为目的基因。 (2)利用大肠杆菌生产人干扰素，常采用从人体细胞提取mRNA逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术（称之为RT-PCR）。该过程需要加入的物质有_________（至少写出两种）和脱氧核苷酸、缓冲液等。 (3)采用基因工程技术培育转基因大肠杆菌生产人干扰素，所需要的限制酶识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI HindⅢ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA A↓AGCTT T↓CTAGA ↓GATC 据图示信息，应选用限制酶_________切割质粒。为保证干扰素基因正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的_________（填“3'”或“5'”）端添加限制酶________的识别序列。 (4)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加_______（填“四环素”或“青霉素”），培养基乙中应添加________（填“四环素”或“青霉素”），菌落________（填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备干扰素。 【答案】(1)不能 (2)耐高温的DNA聚合酶、逆转录酶、引物等 (3) XbaⅠ和HindⅢ 5′ HindⅢ (4) 四环素 青霉素 3、5 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）（1）不能，因为原核细胞没有真核细胞mRNA的加工系统，无法对含有内含子的基因转录产物进行正确加工。 （2）利用大肠杆菌生产人干扰素，常采用从人体细胞提取mRNA逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术（称之为RT-PCR）。该过程需要加入的物质有耐高温的DNA聚合酶、逆转录酶、引物和脱氧核苷酸、缓冲液等 （3）根据图示信息选择限制酶，质粒上有BclⅠ酶的识别序列，但BclⅠ酶的切割位点不在启动子与终止子序列的中间，不能用；Sau3AⅠ酶虽然在启动子与终止子序列的中间，但Sau3AⅠ酶也能识别并切割BclⅠ酶的识别序列，不能用；故只能用酶XbaⅠ和酶HindⅢ。根据图示信息，b链为编码链，其对应引物位于基因下游，为了保证融合基因与质粒的正向连接，需要在b链对应的引物的5′端添加限制酶HindⅢ的识别序列。 （4）为了筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，需要在培养基甲中添加四环素，因为质粒上的抗性基因是四环素抗性基因，只要导入了载体（普通质粒或重组质粒）的大肠杆菌就能在含有四环素的培养基上生长。在培养基乙中添加青霉素，因为重组质粒中青霉素抗性基因被破坏，青霉素可以杀死导入基因表达载体的大肠杆菌，只有导入了普通质粒的大肠杆菌才能在含有青霉素的培养基上生长。因此，菌落3和5中的大肠杆菌是导入了重组质粒的大肠杆菌，可用来制备干扰素。 四、实验题 9．(24-25高二下·湖南湘潭·期末)在冷冻胁迫中草本植物的细胞膜是首先受到伤害的部位，细胞膜的不可逆伤害是造成冻害的主要原因。SAD（硬脂酰基载体蛋白脱氢酶）基因是调控植物抗冻性的基因之一，是不饱和脂肪酸合成途径中的关键脱氢酶基因。利用脱氢酶将适量的不饱和键引入脂肪酸中，能有效降低冷冻伤害，使膜具有必要的流动性，维持生物膜的正常功能。现利用基因工程技术培育抗冻马铃薯，回答下列问题: 注；图1中A、F、B，R为引物，图2中P为启动子，T为终止子，ori为复制原点，YGFP为黄绿色荧光蛋白基因，HygB”为潮霉素抗性基因，马铃薯在自然状态下不具有潮霉素抗性。 (1)培育过程中首先要对SAD基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是______________。为使SAD基因与载体正确连接，对SAD基因进行PCR扩增时，应选择引物________，在其对应5'端分别添加限制酶______的识别序列。 (2)为了使连接后的重组基因SAD-YGFP能够表达出融合蛋白，设计时应考虑剔除SAD基因中终止密码子对应的碱基序列，剔除SAD基因中终止密码子对应的碱基序列的目的是___________________。 (3)将构建成功的表达载体导入农杆菌，与马铃薯叶片共培养，利用T-DNA____________的特点，可将重组基因SAD-YGFP导入马铃薯叶片细胞。 (4)为探究转化过程中农杆菌侵染时间与转化效率之间的关系，以马铃薯栽培种（De）和野生种（Sc）1cm左右茎段作为受体材料进行了研究。在马铃薯与农杆菌共培养的培养基中添加__________，用于筛选被侵染的马铃薯茎段。将筛选出的马铃薯茎段转移至再生培养基2周后，使用365nm紫外光手电筒照射，______（填“阳性”或“阴性”）转化茎段会呈现黄绿色荧光，否则茎段为红色，观察荧光，并进行记录，计算出不同侵染时间下的转化效率（荧光外植体数量/外植体总数×100%），如图3、4。结果表明:__________________________。 【答案】(1) 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 F、R XbaⅠ、SmaⅠ（这两空要引物和限制酶对应） (2)使拼接在一起的SAD基因转录形成的mRNA中不出现终止密码子，避免YGFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，从而无法合成SAD-YGFP融合蛋白 (3)能转移到被侵染细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上 (4) 潮霉素 阳性 不同侵染时间的转化效率有较大差异，不同的受体材料转化效率也具有差异性（或De的侵染时间为40min时，转化效率最高，Sc的侵染时间为20min时，转化效率最高） 【分析】培育转SAD基因马铃薯主要需要4个步骤：目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在PCR扩增过程中，复性的目的是使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合，这是DNA聚合酶能够沿着模板链延伸合成新的DNA链的前提。对SAD基因进行PCR扩增时，引物与模板链的3'端相结合，引导子链5'端到3'端方向形成。图1中DNA分子的P端为5'端，OH端为3'端，因此PCR扩增时需选择引物F和R。SAD基因转录的方向是从右向左，因此图1中DNA分子中上面的那条链是它的模板链，F端为上游引物，R端为下游引物。载体中P为启动子，T为终止子，在P和T之间有4个限制酶切割位点，EcoR Ⅰ不可以使用，会破坏YGFP基因和终止子，BamH Ⅰ具有2个切割位点，也不可以使用，因此选择Xba Ⅰ和Sma Ⅰ，F端添加Xba Ⅰ限制酶识别序列，R端添加Sma Ⅰ识别序列，可以保证SAD基因与载体的正确连接。 （2）为了使连接后的重组基因SAD-YGFP能够表达出融合蛋白，设计时应考虑剔除SAD基因中终止密码子对应的碱基序列，使拼接在一起的SAD基因转录形成的mRNA中不出现终止密码子，避免YGFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，从而无法合成SAD-YGFP融合蛋白。 （3）将目的基因导入植物细胞，一般选择农杆菌转化法。在与马铃薯叶片共培养时，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以进入到被侵染的细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上，这样可以将SAD-YGFP基因导入马铃薯叶片细胞。 （4）自然状态下，马铃薯不具有潮霉素抗性，农杆菌侵染失败的马铃薯茎段在添加潮霉素的培养基中无法存活。Ti质粒上的潮霉素抗性基因可作为标记基因，用于农杆菌侵染成功马铃薯茎段的筛选。侵染成功后，T-DNA可能整合到受体细胞染色体DNA上，也可能整合失败，因此，再生培养2周后，通过365nm紫外光手电筒照射，阳性转化的外植体会呈现黄绿色荧光（YGFP基因表达的效果），否则茎段为红色，由图3、4可知，不同侵染时间的转化效率是有很大的差异的，而不同的受体材料也是具有差异性（De的侵染时间为40min时，转化效率最高，Sc的侵染时间为20min时，转化效率最高）。 地 城 考点04 基因表达载体的构建 一、单选题 1．(23-24高二下·湖南衡阳衡郡高级中学有限公司·期末)毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，导入大肠杆菌中进行扩增后，再经酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上，其中的T启动子是一种甲醇诱导型启动子。图1、图2中的限制酶酶切位点对应的碱基序列如图3所示。下列说法错误的是（    ） A．利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物A结合的单链是b链 B．科研人员利用限制酶和E.coliDNA连接酶将HBsAg基因正确插入图1所示质粒时，应选用SmaⅠ、BclⅠ酶对质粒进行酶切处理 C．构建重组载体后，导入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，与含空白质粒的大肠杆菌菌落相比，含有重组质粒的菌落具有不能发绿色荧光的特征 D．将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入毕赤酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量 【答案】B 【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基； 2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。 【详解】A、转录的模板链在b链，即b链左侧为3′端，右侧为5′端。利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物是与模板链的3′端结合，因此，引物A结合的单链是b链，A正确； B、在构建重组DNA分子时，需要获得具有相同黏性末端的目的基因和质粒，为保证目的基因的完整性，结合图2分析，需要使用BamHⅠ和XmaⅠ识别并切割。再结合图2目的基因的转录方向以及质粒的转录方向分析，质粒应选择BclⅠ和XmaⅠ进行酶切，因为BamHⅠ和BclⅠ酶切所产生的黏性末端相同，SmaⅠ和XmaⅠ限制酶识别序列是一样的，只是切割位点不一样，因此质粒上SmaⅠ识别序列可以被XmaⅠ酶切，获得和目的基因一端相同的黏性末端。综上所述，质粒上SmaⅠ限制酶识别序列用XmaⅠ酶切，与目的基因用XmaI酶切获得的黏性末端一侧相连；质粒用BclⅠ酶切获得的黏性末端和目的基因用BamHⅠ酶切获得的黏性末端相连，因此科研人员利用限制酶和E.coliDNA连接酶将HBsAg基因正确插入图1所示质粒时，应选用XmaⅠ、BclⅠ酶对质粒进行酶切处理，B错误； C、重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此构建重组载体后，导入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，没有导入质粒和没有导入重组质粒的大肠杆菌均不能存活。空白质粒含有绿色荧光蛋白基因而重组质粒上绿色荧光蛋白基因被破坏，因此不能发绿色荧光，C正确； D、将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入毕赤酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇。加入甲醇的作用有两点：一是提供碳源，促进酵母菌的生长和代谢；二是启动甲醇代谢相关的基因表达，从而启动目的基因的表达，D正确。 故选B。 二、多选题 2．(24-25高二下·湖南岳阳·期末)FSHD是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示，已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。下列说法正确的是（　　） A．DUX4反义基因通过抑制DUX4基因的转录过程来抑制DUX4基因的表达 B．可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入患病组织细胞 C．利用图中信息构建反义基因表达载体时，选择的限制酶应为Hind III和BamHI D．利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测DUX4反义基因是否导入受体细胞 【答案】BC 【详解】A、DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。因此，DUX4反义基因转录的 mRNA可与DUX4基因转录的 mRNA发生碱基互补配对，从而抑制其翻译过程导致DUX4蛋白无法合成，A 错误； B、当受体细胞为动物时可选用显微注射法，该病的治疗为将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的，因此可采用显微注射法将 DUX4反义基因表达载体导入患病组织，B 正确； C、DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，因此DUX4的反义基因的模板链为DUX4基因的编码链，子链延延伸的方向是5'→3'，所以DUX4基因右侧连接启动子，左侧连接终止子，构建DUX4反义基因表达载体，选用的限制酶为Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，C 正确； D 、由于DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，所以DUX4 基因序列制备的引物无法区分 DUX4 基因和反义基因，不能检测反义基因是否导入，D 错误。 故选BC。 3．(24-25高二下·湖南长沙天心区长沙长郡中学·期末)农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白（VIP1-P）激活抗病相关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（    ） A．VF属于分泌蛋白，直接参与其合成过程的细胞器有核糖体、内质网与高尔基体 B．胞内蛋白V2的合成场所是核糖体，合成过程需要由线粒体供能 C．切割后的T-DNA含有两个游离的磷酸基团和两个游离的3′—OH D．农杆菌侵染植物细胞并整合到其染色体DNA上的过程涉及磷酸二酯键的断裂与形成 【答案】CD 【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】AB、农杆菌是细菌，属于原核生物，体内只有核糖体这一细胞器，无内质网、高尔基体与线粒体，所以A、B错误； C、切割后的T-DNA为链状结构，含两个游离的磷酸基团和两个游离的3′—OH，C正确； D、农杆菌侵染植物细胞并整合到其染色体DNA上的过程涉及磷酸二酯键的断裂与形成，D正确。 故选CD。 三、解答题 4．(24-25高二下·湖南长沙第一中学·期末)水稻是二倍体植物，其雄性不育性状由隐性基因控制。科研人员利用图中3个目的基因和质粒构建重组质粒，并将其导入雄性不育水稻中，培育出仅一条染色体上含有目的基因的植株M。植株M自交能产生固定比例的雄性不育株。已知A基因可以恢复雄性不育水稻产生花粉的能力，含有B基因的花粉由于B基因能阻断淀粉储藏而失活，因而能有效阻止转基因花粉的传播。 (1)仅用一种限制酶切割会使A基因以两种不同的方向插入质粒，A基因的表达产物________（填“相同”或“不相同”），其原因是_______。 (2)据图分析，将_______（填“基因A先、基因B后”或“基因B先、基因A后”）插入质粒，应选择限制酶_________处理基因A。 (3)植株M产生的花粉中不含目的基因，原因是植株M形成花粉时，启动子b在_________（填“减I”或“减Ⅱ”）启动了B基因的表达。据此推测，植株M自交，后代的表型及比例为________（不考虑同源染色体之间的交换）。 (4)miRNA基因产生的miRNA可抑制淀粉酶基因的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M时，科研人员将启动子c与miRNA基因连接，并使之随A、B基因一起导入水稻细胞。由此推测将启动子c与miRNA基因连接，其设计依据是启动子c能驱动miRNA基因在种子的________中特异性表达，避免对其他组织造成影响。 【答案】(1) 相同 A基因自带启动子和终止子 (2) 基因B先、基因A后 3 (3) 减Ⅱ 雄性可育：雄性不育=1：1 (4)胚乳 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）仅用一种限制酶切割会使A基因以两种不同的方向插入质粒，由于A基因自带启动子和终止子，所以A基因的表达产物相同。 （2）据图分析，将A、B基因插入质粒时，应先插入B基因，理由是B基因中有限制酶4的切割位点，插入B基因时需要利用限制酶1和2切割目的基因B和质粒，而基因A中含有限制酶2的切割位点，所以应该后用限制酶3处理A基因和质粒。 （3）植株M为杂合子，仅一条染色体上含目的基因（A和B连锁），基因型可表示为AB/ab（A为恢复育性基因，B为花粉失活基因）。减数分裂过程中，启动子b在启动B基因表达应该在同源染色体分离以后，所以减Ⅱ更合理。根据以上推导，含目的基因的次级精母细胞（含AB）因B基因表达导致花粉失活，仅不含目的基因的花粉（ab）可育。卵细胞正常发育，含AB和ab的卵细胞比例为1：1。AB（卵）×ab（花粉）→AaBb（A基因恢复育性，表型为可育）。ab（卵）×ab（花粉）→aabb（无A基因，表型为雄性不育）。所以后代雄性可育：雄性不育=1：1。 （4）miRNA基因产生的miRNA可抑制淀粉酶基因的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M时，科研人员将启动子c与miRNA基因连接，并使之随A、B基因一起导入水稻细胞。由此推测将启动子c与miRNA基因连接，其设计依据是启动子c能驱动miRNA基因在种子的胚乳中特异性表达，避免对其他组织造成影响。 5．(24-25高二下·湖南长沙岳麓区湖南师范大学附属中学·期末)为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1.其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-GTTCCTGGTGTTGGC（50-限制酶b识别序列，50为重复次数）。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶是_____。 (2)步骤②转化时，科研人员一般先用_____处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；转化后的大肠杆菌采用含有_____的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是_____。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与_____结合，驱动转录，翻译（SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是_____（从图2的“A~D”中选填）。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) Ca2+ 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C 【分析】基因工程的基本操作程序： 1、目的基因的获取：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。 2、基因表达载体的构建：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 3、将目的基因导入受体细胞：常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。 4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 【详解】（1） 目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）步骤②转化时，科研人员常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小判断大肠杆菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50中含有重复序列，使用E-F或E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3） RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 6．(23-24高二下·湖南衡阳衡郡高级中学有限公司·期末)人乳头瘤病毒（HPV）是一类DNA病毒，至今已鉴定出200多种HPV类型，持续感染高危型HPV可能引发宫颈癌，尤其是HPV16、HPV18，其检出率在宫颈癌中达到99.7%。2022年8月，九价HPV疫苗的使用人群扩展到9~45岁适龄女性，价格昂贵，并且一针难求。目前科学家将HPV16和HPV18两种病毒的衣壳蛋白L1基因（目的基因）与质粒连接，导入大肠杆菌表达后，就获得了疫苗的有效成分，过程如下图所示，图中的限制酶的识别序列和酶切后的黏性末端均不同。回答下列问题： (1)为构建重组HPV疫苗，科研人员将L1基因插入质粒中，最好选择限制酶____________进行共同切割，原因是________________________。 (2)在构建基因表达载体时要将HPV16和HPV18两种病毒的衣壳蛋白基因L1插入____________和____________之间。 (3)图中启动子为RNA聚合酶结合位点，该处序列应根据____________（填“人宫颈细胞”“乳头瘤病毒”或“大肠杆菌”）的RNA聚合酶的识别序列来设计。 (4)构建好的基因表达载体导入大肠杆菌之前，需要使用______处理大肠杆菌，目的是________________________。重组质粒导入大肠杆菌后，可用添加____________的选择性培养基筛选。 (5)若要检测大肠杆菌是否产生了HPV疫苗，需要用______技术检测。与传统减毒疫苗相比，这样的重组疫苗更安全又有效。从疫苗的组成成分分析，其主要原因是该疫苗不含____________，所以无侵染能力。 【答案】(1) BamHⅠ、HindⅢ BdI切割质粒会同时破坏2个标记基因，不利于重组质粒的筛选，Sau3AⅠ在质粒上没有相关酶切位点 (2) 启动子 终止子 (3)大肠杆菌 (4) Ca2+ 使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 氨苄青霉素 (5) 抗原—抗体杂交 核酸（DNA） 【分析】基因表达载体的结构：启动子：是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动RNA转录；终止子：使转录停止的“信号灯”；标记基因：便于重组DNA分子的筛选；目的基因；复制原点。 【详解】（1）BdI在质粒上的酶切位点不唯一，会破坏两个标记基因，不利于重组质粒的筛选，Sau3AⅠ在质粒上没有相关酶切位点，因此要选用BamHⅠ、HindⅢ，有利于目的基因以正确的方向插入到质粒中。 （2）在构建基因表达载体时要将HPV16和HPV18两种病毒的衣壳蛋白基因L1插入启动子和终止子之间。 （3）大肠杆菌中的启动子序列有利于L1基因在大肠杆菌细胞内表达，所以应该根据大肠杆菌中RNA聚合酶的识别序列来设计。 （4）基因表达载体导入大肠杆菌前，需用Ca2+处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，可以提高转化效率。含有重组质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，能够在含有氨苄青霉素的培养基上存活并繁殖形成菌落。 （5）若要检测大肠杆菌是否产生了HPV疫苗，需要用抗原—抗体杂交技术检测。与传统减毒疫苗相比，这样的重组疫苗更安全又有效。从疫苗的组成成分分析，其主要原因是该疫苗不含核酸（DNA），所以无侵染能力。 7．(23-24高二下·湖南娄底涟源·期末)CRISPR/Cas9 是近年来颇受关注的一种基因编辑系统。该系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA 能识别并与特定的DNA 序列结合，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切 DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9 系统对水稻产量基因（Q基因）进行编辑，请回答下列问题： (1)研究发现，CRISPR/Cas9系统在自然界中仅存在于原核生物中，故需借助_____技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9 蛋白与_____酶的功能相似。 (2)首先依据_____的部分序列设计 DNA 片段A（负责编码相应引导RNA），再将片段A 与含有Cas9 基因的质粒 B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9表达载体（如图所示）。片段A与质粒 B连接需_____酶参与。 (3)将表达载体导入水稻细胞后，_____与水稻细胞的染色体DNA上的靶基因结合，并对其进行编辑，编辑后的基因能够稳定地遗传和表达。 (4)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在“脱靶”现象，即编辑了错误的基因，试从引导RNA 的角度分析脱靶的原因_____。 【答案】(1) 转基因 /DNA重组/基因工程 限制 (2) Q基因 DNA连接 (3)引导RNA (4)其他DNA片段中也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而脱靶/引导RNA序列的特异性不够强 【分析】1、CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。 2、Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用了T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上。 【详解】（1）要将原核生物的基因导入真核生物中并表达，需要利用基因工程技术（或转基因技术或DNA重组技术）。根据题干信息“Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA”，说明Cas9蛋白与限制酶的功能相似。 （2）由于是对水稻产量基因Q基因进行编辑，故首先需要依据Q基因的部分序列设计DNA片段A，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体。片段A与质粒 B连接需DNA连接酶参与。 （3）依据题意，将表达载体导入水稻细胞后，由引导RNA与水稻细胞的染色体DNA上的靶基因结合，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并对其进行编辑，编辑后的。 （4）由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合，从而导致CRISRP/Cas9基因编辑技术会出现编辑对象出错而造成脱靶。 8．(23-24高二下·湖南郴州·期末)胰岛素对治疗糖尿病有积极的作用，为了批量生产人胰岛素，科学家利用基因工程改造大肠杆菌来生产人胰岛素。下图为生产过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，请回答下列问题。    (1)考虑到真核生物和原核生物基因的结构区别，人胰岛素基因扩增应以_______(填“人胰岛素基因”或“人胰岛素 mRNA”)为模板。 (2)不能将人的胰岛素基因直接导入大肠杆菌，而需要先构建基因表达载体的原因是_________________; (3)若胰岛素 基因的编码链(与 模 板链互补的链)首端到末端的序列为5'—ATCTACGCGCTCATCCG……CGCAGCAATGAGTAGCG—3'。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR 引物时，应将限制酶识别序列加在引物_________端。某同学设计如下四种 PCR 引物，其中适合选用的一对引物是_________。 A．5'-CTCGAGGCAAGTCGAGT-3'     B．5'-CTCGAGATCTACGCGCTC-3' C．5'-CAATTGCGCTACTCATTG-3'      D．5'-CAATTGCTTTCAGCTCA-3' (4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。大肠杆菌经钙离子处理后，与重组质粒混合培养一段时间，再接种到添加了_________的培养基上，筛选出_________(颜色)的菌落即为工程菌种。 【答案】(1)人胰岛素 mRNA (2)链状DNA 导入大肠杆菌易被降解；目的基因无法直接在宿主细胞中复制；目的基因无表达所需启动子；由于没有标记基因无法对目的基因进行检测 (3) 5’ BC (4) 氨苄青霉素和X-gal 白色 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 【详解】（1）基因分为编码区和非编码区，真核生物的编码区包含外显子和内含子，因此是间断的、不连续的，原核生物的基因的编码区是连续的 , 利用基因工程改造原核生物大肠杆菌来生产人胰岛素，考虑到真核生物和原核生物基因的结构区别，所以人胰岛素基因扩增应以人胰岛素 mRNA为模板，得到的基因编码区是连续的，在大肠杆菌体内可以正常表达。 （2）因为链状DNA 导入大肠杆菌易被降解；目的基因无法直接在宿主细胞中复制；目的基因无表达所需启动子；由于没有标记基因无法对目的基因进行检测，且基因表达载体含有启动子、终止子、标记基因、复制原点等，所以不能将人的胰岛素基因直接导入大肠杆菌，而需要先构建基因表达载体。 （3）PCR过程中，在引物作用下，耐高温DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链，因此添加限制酶识别序列应该在5'端，这样不影响子链的延伸。由于DNA合成时，新链的延伸方向是5′→3′，即其中一种引物与模板链3′端碱基互补配对，同时该引物序列需要包含XhoⅠ的识别序列，另一种引物则需包含MunⅠ的识别序列，故选BC。 （4）结合图示可知，目的基因插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素（氨苄青霉素抗性基因为标记基因）和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。 9．(23-24高二下·湖南长沙长郡中学·期末)FAST是一种通过种子特异性启动子驱动荧光融合蛋白表达，利用种子荧光快速筛选转基因植株的方法。科研人员将能够在番茄种子中高水平特异性表达的油体蛋白基因SIOLEl与红色荧光蛋白基因TagRFP形成一个嵌合基因SIOLE1-TagRFP，通过基因工程培育并筛选出了转基因番茄，其过程如下图所示。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增嵌合基因SIOLEl-TagRFP时，需要____催化，一般经过变性、复性和____三步，其中复性是指____。 (2)图中构建A____时，首先切割Ti质粒和切割含有嵌合基因的DNA片段常使用两种不同的限制酶，其原因是____。切割时不使用EcoRⅠ的原因是____。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 延伸 在温度为50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (2) 基因表达载体 防止目的基因和Ti质粒拼接时出现目的基因的反向拼接和自身环化现象 避免破坏Ti质粒上的卡那霉素抗性基因 【分析】基因工程的基本工具为限制酶、DNA连接酶和运载体。基因工程的基本操作程序为：获取目的基因、构建基因表达载体、导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1） 利用PCR技术扩增嵌合基因SIOLEl-TagRFP时，需要耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）催化，一般经过变性、复性和延伸三步，其中复性是指在温度为50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （2）A为目的基因表达载体，在构建目的基因表达载体时，为了防止目的基因和Ti质粒拼接时出现目的基因的反向拼接和自身环化现象，在切割Ti质粒和含有嵌合基因的DNA片段时通常使用两种不同的限制酶，这样可以保证目的基因的正确连接，也可避免出现自身环化；EcoRⅠ在卡那霉素抗性基因上有识别序列，因此切割时不使用EcoRⅠ，否则会破坏卡那霉素抗性基因，因为该基因可作为标记基因，用于目的基因的检测。 10．(23-24高二下·湖南湘西·期末)肾纤维化是所有肾脏疾病的共同病理特征，随着肾纤维化的进行性发展，患者的肾功能会逐渐恶化，最终导致肾衰竭。有研究发现，Pmepal（一种跨膜蛋白）在TGF-βⅠ型受体信号传导的控制中发挥作用。利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepal基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系，并探讨Pmepal基因敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响，为研究Pmepal在肾纤维化模型中的作用提供细胞模型。回答下列问题：      (1)据图1、图2分析，sgRNA 识别序列选择在小鼠Pmepal基因组第2个外显子（E2）上（图2），序列为5'-GCCGACACAGCAGGCCAGG-3'，使用__________切割sgRNA基因及pX333质粒，使用__________将两个酶切产物进行连接，获得pX333重组载体。其中，pU6及pCAG序列均为启动子，其作用分别是__________、__________。 (2)将构建好的pX333质粒转染入TCMK1细胞48h后，若观察到细胞出现__________，则说明转染成功且基因成功翻译。 (3)进一步采用某技术分析出转染成功（阳性）的TCMK1细胞，并将其增殖培养，最终获得16个细胞克隆。根据__________序列，设计引物，对这些细胞的Pmepal基因中Cas9靶向位点序列进行PCR扩增，经测序分析发现，16个细胞克隆中，克隆4（KO-4）和克隆16（KO-16）的Pmepal基因Cas9 靶向位点出现序列突变（图3）。经分析，克隆4和克隆16的基因分别因发生了碱基的__________而突变。    【答案】(1) 同种限制性内切核酸酶（同种限制酶） DNA连接酶 驱动sgRNA基因的转录 驱动Cas9基因和荧光蛋白基因的转录 (2)荧光 (3) Pmepal基因中Cas9靶向位点序列中的一段核苷酸 增添和缺失 【分析】基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 【详解】（1）在构建基因表达载体时，首先会用同种限制性内切核酸酶（同种限制酶）切割目的基因和载体（sgRNA基因及pX333质粒），使它们出现相同的切口； 再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处， 这样就形成了一个重组DNA分子。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。因此，pU6及pCAG序列的作用分别是驱动sgRNA基因的转录、驱动Cas9基因和荧光蛋白基因的转录。 （2）据图2可知，若转染成功且基因成功翻译，则荧光蛋白基因会表达出荧光蛋白。因此，将构建好的pX333质粒转染入TCMK1细胞48h后，若观察到细胞出现荧光，则说明转染成功且基因成功翻译。 （3）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，若要对这些细胞的Pmepal基因中Cas9靶向位点序列进行PCR扩增，则要根据Pmepal基因中Cas9靶向位点序列中的一段核苷酸序列设计引物。据图可知，与正常的Pmepal基因相比，克隆4的基因发生了碱基的增添、克隆16的基因发生了碱基的缺失。 11．(23-24高二下·湖南邵阳·期末)胃幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能指导合成其特有的Ipp20蛋白，科研人员培育出转Ipp20基因山羊（将Ipp20基因导入山羊受精卵）利用乳腺生物反应器制备Hp疫苗。所用质粒和Ipp20基因两端序列以及相关限制酶识别序列如下图所示，已知Ipp20基因内部不含MfeⅠ酶切序列而外部两端含有，回答下列问题： 限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ HindⅢ MfeⅠ 识别序列和切割位点(5′—3′) G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT C↓AATTG (1)利用PCR技术扩增目的基因片段，PCR的每次循环包括______和延伸3个阶段，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是______，能够破坏该化学键的酶是______（写出1种即可）。 (2)构建基因表达载体时，一般不选用MfeⅠ对质粒和目的基因进行切割，原因是________________________，如果选择EcoRⅠ和HindⅢ两种酶对目的基因和质粒进行切割，需要在两种引物上分别添加两种限制酶的识别序列，从而扩增出两端带有两种限制酶识别序列的Ipp20基因。依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5′—____________—3′（写出其中1种即可）。 (3)将构建好的基因表达载体通过__________________技术注入到受精卵中，再将受精卵培养成早期胚胎移入受体获得转基因羊，进而培育成转基因羊，转基因羊成功的标志为__________________。 【答案】(1) 变性、复性 氢键 解旋酶（或RNA聚合酶） (2) 目的基因和载体可能自身环化以及反向连接 AAGCTTATGGGC（或GAATTCCTAGTG） (3) 显微注射 转基因山羊乳汁中含有Ipp20蛋白 【分析】1.PCR扩增的过程 （1）变性（90℃ 以上）：DNA受热后解聚为单链。 （2）复性（50℃ 左右）：两条引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸（72℃ 左右）：溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，依据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 2.目的基因导入不同受体细胞的方法 （1）导入植物细胞：农杆菌转化法（主要）、花粉管通道法。 （2）导入动物细胞：显微注射技术。 （3）导入微生物细胞：感受态细胞法。 【详解】（1）利用PCR技术扩增目的基因片段，PCR的每次循环包括变性、复性和延伸3个阶段。引物通过碱基互补配对与模板链DNA结合，因此引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。解旋酶能破坏碱基对之间的氢键（在基因转录时，RNA聚合酶与一段DNA结合，使DNA双链解开，因此，RNA聚合酶也能破坏碱基对之间的氢键）。 （2）同种限制酶切割目的基因和质粒，会使目的基因两端的黏性末端和切割后质粒两端的黏性末端都相同，而发生目的基因和质粒的自身环化以及目的基因和质粒的反向连接。根据Ipp20基因两端序列可知，Ipp20基因两端没有EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列，设计引物时需要在引物的5，端加上限制酶的识别序列，以便PCR扩增目的基因后能够被切割质粒的同种限制酶切割形成相同的黏性末端，结合图中目的基因转录的方向和限制酶识别序列的方向，图中目的基因左侧5，的单链做模板时，引物结合在模板链的3，端，与模板链碱基配对的引物序列为5，—CTAGTG—3，，5，端加上限制酶EcoRⅠ的识别序列5，—GAATTC—3，，最终为5，—GAATTC CTAGTG—3，，同理，目的基因右侧5，的单链做模板时，引物结合在模板链的3，，与模板链碱基配对的引物序列为5，—ATGGGC—3，，5，端加上限制酶Hind Ⅲ的识别序列5，—AAGCTT—3，，最终为5，—AAGCTT ATGGGC—3，。 （3）将重组质粒导入受精卵中，即受体细胞为动物细胞，应使用显微注射技术。转基因成功的标志是目的基因在受体细胞中成功表达，即通过转录、翻译合成蛋白质，因此转基因羊成功的标志为转基因山羊乳汁中含有Ipp20蛋白。 12．(23-24高二下·湖南衡阳衡阳县·期末)我国科学家经多年研究，筛选出高产紫杉醇的细胞，通过植物细胞培养技术可获得大量紫杉醇，实现紫杉醇的工厂化生产。为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下： (1)Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，扩增的前提是________，需要的引物有________（从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段产生2个双链等长的子代Bapt基因片段至少要经过________次循环。 (2)构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞：在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。强启动子能被________识别并结合，驱动基因持续转录。Ti质粒中的T—DNA在培育转基因红豆杉中的作用是________。为使DNA片段能定向插入T—DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是________。 【答案】(1) 要有一段已知目的基因（Bapt基因）的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 BC 3 (2) RNA聚合酶 将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上 NotI和SacI 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增Bapt基因，扩增的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；由于DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，由图1可知，5'端对应的引物分别是B和C；设计的引物决定了扩增产物的长度，第一个循环，引物与模板互补，此时变成两个模板，但因为模板很长，没有什么终止扩增，所以第一个循环扩增出来的新片段很长，第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因，第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，所以当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因，所以至少要3个循环才能产生双链等长子代Bapt基因。 （2）RNA聚合酶识别并与启动子结合，启动转录；Ti质粒中的T-DNA将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上；分析目的基因可知，不可以使用EcoRI、BamHI以及HindIII，所以Ti质粒使用SacI和NotI，为使DNA片段能定向插入T-DNA中，启动子在前，所以在DNA片段的M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotI和SacI。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题08 发酵工程与基因工程 4大高频考点概览 考点01 传统发酵技术的应用 考点02 微生物的培养与应用 考点03 目的基因的筛选、获取 考点04 基因表达载体的构建 地 城 考点01 统发酵技术的应用 一、单选题 1．(24-25高二下·湖南怀化·期末)中国的许多传统美食制作过程蕴含了生物发酵技术。下列叙述正确的是（　　） A．泡菜制作过程中，酵母菌将进行无氧呼吸产生乙酸 B．果醋制作过程中，醋酸菌将葡萄糖分解成乳酸 C．米酒制作过程中，将容器密封可以促进酵母菌增殖 D．腐乳制作过程中，除毛霉外还有多种微生物参与发酵 2．(24-25高二下·湖南郴州·期末)接种是指微生物进入培养基中的过程。一杯牛奶暴露在空气中，会由于微生物落入、生长、繁殖而变质，在此过程中发生了自然接种。图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图解，下列叙述错误的是（　　） A．甲、乙都需要将菌种接种在固体培养基上，并可能观察到单菌落 B．图甲操作过程中需要对接种环进行5次灼烧灭菌 C．图丙所示的结果是由图乙接种方法所得 D．图甲、乙在完成接种后均需要将平板放进恒温培养箱中培养，并将平板倒置 【答案】B 【分析】微生物常见的接种的方法： ①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落； ②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 题图分析：图甲的接种方法是平板划线法，图乙的接种方法为稀释涂布平板法。 3．(24-25高二下·湖南衡阳·期末)发酵工程生产谷氨酸制取谷氨酸钠常用到谷氨酸棒状杆菌，利用该菌发酵时需要不断地通入无菌空气。从细胞结构和对氧气的需求分析，生产下列发酵食品所需的主要菌种与谷氨酸棒状杆菌相同的是（　　） A．苹果醋 B．葡萄酒 C．泡菜 D．腐乳 4．(24-25高二下·湖南邵阳·期末)中国劳动人民用自己勤劳的双手，利用微生物发酵创造许多传统美食，为生活增添了许多滋味，更为现代发酵工程打下了基础。下列叙述正确的是（　　） A．传统发酵过程中所用原材料均需要严格灭菌 B．发酵工程的中心环节为发酵罐内发酵 C．利用乳酸菌制作泡菜的过程中，先通气培养，后密封发酵 D．对发酵液中微生物分离和计数时可采用平板划线的接种方法 5．(24-25高二下·湖南长沙岳麓区湖南师范大学附属中学·期末)井冈霉素是我国科学家发现的一种抗生素，井冈霉素是糖类衍生物，由链霉菌井冈变种（JGs）发酵而来，广泛应用于水稻病害防治。下列相关叙述错误的是（    ） A．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，有利于提高井冈霉素产量 B．提高发酵培养基中营养物质的浓度，可能会影响JGs存活率 C．对JGs发酵过程中活细胞数量进行实时监测最适宜用稀释涂布平板法 D．JGs不含直接编码井冈霉素的基因 6．(24-25高二下·湖南岳阳·期末)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。具体做法，在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45-48℃，然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在双层培养基的上层会出现透亮的无菌圆形空斑——噬菌斑，下列有关说法不正确的是（　　） A．底层培养基可以弥补培养皿底部或超净工作台不平，利于后续实验观察 B．上层培养基中琼脂浓度较低，因此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 C．将培养基冷却到45-48℃最主要原因是防止下层固体培养基被液态化 D．底层平板凹凸不平，原因可能是温度过低导致部分培养基已经凝固 二、多选题 7．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)桑葚是黄河故道沿线的特色水果之一，可以用来制作桑葚酒和桑葚醋，制作流程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．发酵过程中，甲罐发酵液pH逐渐上升，可通过测量pH变化及时了解发酵情况 B．若发酵过程中甲罐中的发酵液表面出现气泡，无法说明发酵液已被杂菌污染 C．乙罐中醋酸菌与氧气、桑葚酒充分接触有利于提高发酵效率 D．若甲罐中的桑葚酒全部加入乙罐制成桑葚醋，则乙罐需要定期排出CO2 三、实验题 8．(24-25高二下·湖南长沙天心区长沙长郡中学·期末)北京传统小吃“豆汁”是一种以绿豆为原料，经过一系列制作工艺流程（如下图）得到的一种以酸味为主、掺杂着些许臭味的糊状流体食品。混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，混合浆的沉淀与酸化过程实际属于乳酸发酵，其主要产酸微生物为乳酸菌。某研究小组测定了豆汁制作过程中部分化学成分含量变化的有关数据（如下表）。回答下列问题： 浆状样品 可溶性蛋白/（mg·mL-1） 游离氨基酸/（mg·mL-1） 蛋白酶（U·mL-1） 混合浆 5.60 0.31 1.19 酸浆 1.4 0.51 1.16 (1)混合浆发酵时所需的乳酸菌主要来自_______。以葡萄糖为底物进行乳酸发酵，发酵过程中葡萄糖分子的大部分能量存留在_______中。 (2)欲测定混合浆中活乳酸菌含量的多少，除采用稀释涂布平板法外，还可用显微镜直接计数法，该方法统计的结果一般是______的总和，从而导致数据偏大。 (3)分析表中数据，酸浆I中的可溶性蛋白含量比混合浆低得多，推测其原因是________（答出两点即可）。 (4)相对于传统发酵，发酵工程一般包括菌种的选育和培养，产物的分离和________等环节。为了筛选出产酸能力强的乳酸菌菌种，研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体培养基（添加了质量分数为1．5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，在适宜条件下培养一段时间后，应挑取______的菌落进一步培养筛选。 地 城 考点02 微生物的培养与应用 一、单选题 1．(24-25高二下·湖南雅礼中学·期末)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。具体做法是：在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45~48℃，然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板（见下图）。培养一段时间后，在双层培养基的上层会出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑，根据噬菌斑的数目可计算原液中噬菌体的数量。判断下列正确的是（　　） A．需先调节灭菌后培养基的pH，然后再进行倒平板 B．倒上层平板时需将培养基冷却到45~48℃的最主要原因是防止下层固体培养基被液态化 C．利用双层平板法统计出的噬菌体数量往往比实际值偏大 D．与底层平板相比，上层培养基中琼脂浓度较低的好处是形成的噬菌斑较大，有利于计数 2．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)富湾绿豆烧酒，香醇甜美，久享盛誉，其色宛如绿豆汤，制作的工艺流程如图所示。相关叙述正确的是（　　） A．蒸稻壳不仅可以去除稻壳中残留的农药、霉烂味还能杀灭一部分杂菌 B．发酵过程中起主要作用的微生物是酵母菌，温度一般控制在30~35℃ C．扩大培养需要采用液体培养基，对培养基灭菌常采用干热灭菌 D．绿豆烧酒的生产流程中，因为没有严格的灭菌操作，发酵过程很容易受杂菌污染 3．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)研究人员利用石油污染滩涂土壤筛选高效降解石油细菌，进行如下图所示的操作（① - ⑤表示不同的菌落）。下列叙述正确的是（　　） A．图中液体培养基和固体培养基成分的唯一不同是后者含有琼脂 B．甲过程采用的接种方法可用于菌体计数，但结果通常偏小 C．菌落①中菌体因不能分解石油而无降解圈产生，其生长不需要碳源 D．乙过程选择菌落③接种到石油培养基，可根据石油剩余量进行降解能力评估 4．(24-25高二下·湖南湘潭·期末)酸笋是一种以新鲜竹笋为原料，发酵腌制而成的具有独特发酵酸臭味的笋制品，是风味食品螺顿粉的重要配料。下图为利用乳酸菌，酵母菌、醋酸菌等微生物发酵制作酸笋的工艺流程图，下列有关叙述错误的是（　　）    A．杀青、漂烫步骤是通过高温灭菌避免杂菌污染 B．可以通过诱变育种、基因工程育种等方法进行菌种选择和优化 C．醋酸菌能将酵母菌产生的乙醇氧化为醋酸，进一步丰富酸笋的酸味层次 D．发酵过程中要随时检测培养液中微生物数量，可以利用显微镜进行计数 5．(24-25高二下·湖南湘东教学联盟·期末)微生物稀释涂布平板法的具体操作如图所示，下列操作正确的是（    ） ①涂布器浸在酒精中 ②取0.1mL菌液，滴加到培养基表面 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面 ⑤用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面 ⑥将样品依次等比稀释 ⑦将涂布器放在火焰上灼烧 A．①③⑤⑥⑦ B．①④⑤⑥⑦ C．①②⑤⑥⑦ D．①③④⑥⑦ 二、多选题 6．(24-25高二下·湖南怀化·期末)为筛选出淀粉分解菌，研究人员进行了相关实验，结果如下。相关叙述正确的是（　　） 菌种 菌落直径：C/mm 透明圈直径：H/mm 细菌Ⅰ 5.1 11.2 细菌Ⅱ 8.1 13.0 A．本实验中微生物培养基以淀粉作为唯一碳源 B．为形成透明圈，应使用刚果红进行染色处理 C．实验结果表明细菌Ⅰ分解淀粉能力较细菌Ⅱ要强 D．为进一步筛选分解淀粉的细菌，只能使用稀释涂布平板法 7．(24-25高二下·湖南长沙天心区长沙长郡中学·期末)瘤胃纤毛虫是一种能分泌纤维素酶的原生动物，生活在牛羊等反刍动物的瘤胃中。研究人员将纯化的瘤胃纤毛虫接种到含5mL改良培养液（由K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl等组成）的试管中，每天投喂100μL底物悬液（由淀粉和草粉组成），每3～4天换液一次，投喂和换液结束后均需充入某种气体再盖上盖子继续培养。每天进行计数，结果如图所示。相关叙述正确的是（    ） A．可用干热灭菌法对改良培养液进行灭菌处理 B．K2HPO4和KH2PO4共同作用能维持培养液的pH C．投喂和换液结束后充入的可能是CO2，其目的是提供无氧环境 D．将等量瘤胃纤毛虫接种到含10mL改良培养液的试管中，其环境容纳量将上移 三、解答题 8．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)科研人员从变质豆浆中分离出腐败菌，并研究乳酸链球菌素对腐败菌的抑制效果，以为豆浆保质提供依据。请结合研究过程回答下列问题： (1)将2种市售豆浆A、B和自制豆浆在无菌操作台上分别装入已灭菌的250mL三角瓶中，密封、37℃条件下，放置7d后，豆浆变质。取变质的豆浆在无菌条件下接种到细菌培养基上，一段时间后，统计各培养基上菌落种类和数量，结果如表： 细菌序列 菌落特征 菌落直径/mm 菌落数/个 豆浆A 豆浆B 自制豆浆 S1 表面有白色绒毛，圆形边缘不规则 5 5 3 7 S2 白色，表面无绒毛，有白色液滴 1-2 18 11 24 S3 白色，表面无绒毛，如同黄色液斑 20-30 11 7 15 从3个样品中各取1mL变质豆浆，用_______进行适度稀释后，取0.1mL样品液滴加到细菌培养基表面，用_________（此工具常使用前采用_______法进行灭菌）使之分布均匀。表中统计的菌落数比往往比活菌的实际数目_________，这是因为__________。细菌培养基通常利用_______法进行灭菌； (2)区分菌落种类的依据是__________。统计菌落时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的种类和数目。 (3)以自制的新鲜豆浆为材料，经相应处理后，在37℃下放置35d后，统计豆浆中腐败菌数量，结果如图。 乳酸链球菌素是一种多肽。 为有效防止豆浆腐败，在生产中乳酸链球菌素的添加量应控制在_________mg·kg-1左右；结果表明，最不能耐受乳酸链球菌素的细菌是_______（填序号）。 9．(24-25高二下·湖南长沙芙蓉高级中学·期末)富集培养是微生物学中的最强有力的技术手段之一、主要是利用不同微生物生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其数量大大增加。下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。请分析回答下列问题。 (1)①→④过程所用的培养基均属于_____培养基。 (2)若实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的异化作用类型是_____；振荡培养的另一个目的是_____。 (3)培养基灭菌后待平板凝固后，应倒置放在超净台上，目的是_____。设置⑥的目的是_____。 (4)实验结束时，使用过的培养基应该进行灭菌处理后，才能倒掉，以免_____。 四、实验题 10．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)研究人员对某地学校、酒店、健身会所、社区等场所游冰池池水进行抽样检测，其中，对游泳池池水活细菌总数进行检测的实验步骤如下： ①采样瓶的预处理：在采样瓶中加入适量的 Na2S2O3溶液后对采样瓶进行灭菌处理。 ②采样：在客流高峰时段进行采样，采集位置在水下30cm左右，取水500mL。 ③接种：用灭菌吸管吸取水样 1mL，注入灭菌培养皿中。将熔化并冷却至45℃的营养琼脂培养基倒入培养皿内，每皿15mL。立即旋摇培养皿，使水样和培养基充分混匀。重复若干次。 ④培养并计数：待琼脂凝固后翻转培养皿，置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上的菌落数，并求平均值。 请回答下列问题： (1)检测游泳池池水活细菌总数时，不宜用细菌计数板在显微镜下直接计数，原因是_______，容易造成计数结果偏大。 (2)Na2S2O3具有还原性，可消除水样中的余氯。据此分析，步骤①中在采样瓶中添加Na2S2O3溶液对检测的意义是______ (3)为使实验数据更准确，步骤③中还应增加对照组，下列最不宜作对照组的是_______（单选）。 a.15mL营养琼脂培养基 b.1mL无菌水+15mL营养琼脂培养基 c.1mL清水+15mL营养琼脂培养基 (4)步骤④中，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为_______。 (5)不同季度微生物检测结果如表所示，第三季度合格率下降的原因可能包括_______。 季度 检测场馆数 合格场馆数 合格率（%） 一 34 34 100 二 40 38 95 三 399 329 82.5 四 36 36 100 a.气温升高    b.客流量增加    c.检测的场馆数多    d.游泳池氯化时间过长 根据检测结果，要进一步加强第三季度的场馆管理。下列属于提升游泳池水质安全性的合理建议有______。a.增加游泳池水质监测的频次      b.给游泳池装设水循环过滤装置     c.每日在临近开馆前氯化消毒 地 城 考点03 目的基因的筛选、获取 一、单选题 1．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)利用PCR 既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（　　） A．PCR用的 DNA 聚合酶是一种耐高温酶 B．变性过程中双链DNA 的解开不需要解旋酶 C．复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D．延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸 2．(24-25高二下·湖南衡阳·期末)研究者设计并合成了核苷酸单链，如图所示，将它们加入含DNA聚合酶、原料等的反应管中，在适宜条件下，两条单链既为引物又为模板，经复性、延伸，得到的双链DNA片段的碱基对数目是（　　） A．91 B．107 C．50 D．57 二、多选题 3．(23-24高二下·湖南湘西·期末)研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员利用大肠杆菌制备了巨噬细胞表面标志蛋白CD14蛋白，下图为构建目的基因及载体的相关示意图。下列有关叙述正确的是（　　） A．若B链为转录的模板链，则构建基因表达载体时B链的3'端与启动子相连 B．用XhoI和SalI双酶切CD14基因和载体，经DNA连接酶连接后，可用限制酶XhoI和Sal I对CD14 基因的连接方向进行鉴定 C．PCR 扩增CD14基因，DNA聚合酶催化引物的5'端与加入的脱氧核苷酸的3'端形成磷酸二酯键 D．将重组DNA分子导入受体细胞时，可用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于能吸收环境中DNA分子的状态 三、解答题 4．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)葡萄糖异构酶（GI）在工业上用于生产高果糖浆，但其最适pH偏高，不适用于工业化生产。研究发现，将葡萄糖异构酶的184位的天冬酰胺（Asn）替换成天冬氨酸（Asp）后，最适pH下降了1个单位，更适合工业化生产条件，如图表示改造葡萄糖异构酶基因（GI基因）及构建基因表达载体的过程。回答下列问题：    (1)将葡萄糖异构酶的184位的天冬酰胺（Asn）替换成天冬氨酸（Asp），需要对GI基因的基本单位进行___（填“增添”“缺失”或“替换”），这种技术操作属于______工程。 (2)改造葡萄糖异构酶基因时，PCR1和PCR2_____（答“能”或“否”）在同一反应体系中进行，原因是________。质粒pCLY11中neor的作用是_______。PCR3反应体系中需要加入的引物是_____。 (3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用________处理大肠杆菌细胞。微生物通常作为基因工程受体细胞的优点有___________（答出两点即可）。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌菌落应呈_________。 5．(24-25高二下·湖南长沙宁乡·期末)为研究干旱胁迫基因LEA 对绞股蓝植株中油脂积累的影响机制，科研人员将干旱胁迫基因LEA 与含荧光素酶基因 Luc的质粒结合，构建基因表达载体，并将导入基因表达载体的绞股蓝分生细胞培养成转基因植株甲，在干旱胁迫的环境下培养正常植株和转基因植株甲，检测植物体内油脂合成关键酶—乙酰-CoA 羧化酶基因的表达水平。请回答下列问题： 注：图1表示基因LEA的部分序列；图2表示质粒的部分结构，①②③分别为限制酶EcoRV、XbaI 和 BanHI的酶切位点；图3表示限制酶的识别序列及酶切位点；图4 表示正常植株和转基因植株甲中有关基因的表达水平。 (1)从基因数据库中获取干旱胁迫基因LEA的核苷酸序列信息，设计相应引物并人工合成。据图2、图3分析，需要在两个引物的5'端添加限制酶________________的识别序列，以防止基因 LEA 与质粒发生反向连接。 (2)进行 PCR扩增时，以Y链为模板设计的引物的部分序列为5’________________3’。 (3)将目的基因与质粒连接后构建重组DNA，将验证后的重组DNA导入绞股蓝分生细胞，通常采用农杆菌转化法，该方法的原理是________________。将转化成功的绞股蓝分生细胞接种于培养基中培养，待分化出芽后转入诱导______的培养基中培养至组培苗。 (4)如图4表示正常植株和转基因植株甲中乙酰-CoA羧化酶基因的表达水平。据图分析，干旱胁迫下绞股蓝植株在油脂积累过程中，基因LEA 的影响机制可能是________________。依据该结果不能说明转基因植株的油脂积累量比正常植株高，理由是________________。 6．(24-25高二下·湖南怀化·期末)湖南是杂交水稻研究的摇篮，一粒种子改变了世界，而水稻又是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学家们通过基因工程技术将蓝细菌中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题。 (1)利用PCR技术增目的基因时，PCR反应的缓冲液中需添加的物质有______。通过控制温度变化循环30次之后，理论上DNA分子数会扩增______倍。 (2)表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，仅用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是______。完成构建后，用E酶完全酶切处理，再利用电泳检测试管（图2）中共出现了______个条带，则说明其中包含了重组质粒。 (3)将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的目的是______。（填字母） A．促进受体细胞分裂 B．筛选符合要求的水稻细胞 C．抑制未导入质粒的细胞的生长 D．诱导高效光合相关基因表达 (4)若培养成功的转基因细胞中，少部分目的基因无法表达，可能的原因是______（答出1点即可）。 7．(24-25高二下·湖南郴州·期末)番茄不耐寒，冬季容易冻坏，难以储藏。我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtCOR15a，经过一系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。 (1)在培育新品种的过程中，需要用PCR技术扩增AtCOR15a基因，PCR技术中添加的引物指的是__________，除了引物，还需要添加__________酶。 (2)如果要将AtCOR15a基因与质粒构建重组DNA分子，一般采用双酶切法。据图中的酶切位点分析，选用的两种限制酶组合是__________。构建基因表达载体后，图中采用__________法将目的基因导入番茄细胞，最终通过__________技术培育成番茄植株。 (3)为了提高AtCOR15a基因的表达能力，可将AtCOR15a基因与外源强启动子连接，如下图所示。 利用PCR技术检测上述连接是否正确，可选择的引物组合是______(填字母)。 A．①+② B．①+③ C．②+③ D．③+④ 8．(24-25高二下·湖南湘东教学联盟·期末)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛应用于治疗病毒感染性疾病。传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞中提取，产量极低，远不能满足需求。科学家常采用基因工程方法从大肠杆菌及酵母菌细胞内获取干扰素。 (1)若利用大肠杆菌生产人干扰素，通过常规PCR技术从人体细胞获取并扩增得到的人干扰素基因_____（填“能”或“不能”）直接作为目的基因。 (2)利用大肠杆菌生产人干扰素，常采用从人体细胞提取mRNA逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术（称之为RT-PCR）。该过程需要加入的物质有_________（至少写出两种）和脱氧核苷酸、缓冲液等。 (3)采用基因工程技术培育转基因大肠杆菌生产人干扰素，所需要的限制酶识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI HindⅢ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA A↓AGCTT T↓CTAGA ↓GATC 据图示信息，应选用限制酶_________切割质粒。为保证干扰素基因正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的_________（填“3'”或“5'”）端添加限制酶________的识别序列。 (4)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加_______（填“四环素”或“青霉素”），培养基乙中应添加________（填“四环素”或“青霉素”），菌落________（填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备干扰素。 四、实验题 9．(24-25高二下·湖南湘潭·期末)在冷冻胁迫中草本植物的细胞膜是首先受到伤害的部位，细胞膜的不可逆伤害是造成冻害的主要原因。SAD（硬脂酰基载体蛋白脱氢酶）基因是调控植物抗冻性的基因之一，是不饱和脂肪酸合成途径中的关键脱氢酶基因。利用脱氢酶将适量的不饱和键引入脂肪酸中，能有效降低冷冻伤害，使膜具有必要的流动性，维持生物膜的正常功能。现利用基因工程技术培育抗冻马铃薯，回答下列问题: 注；图1中A、F、B，R为引物，图2中P为启动子，T为终止子，ori为复制原点，YGFP为黄绿色荧光蛋白基因，HygB”为潮霉素抗性基因，马铃薯在自然状态下不具有潮霉素抗性。 (1)培育过程中首先要对SAD基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是______________。为使SAD基因与载体正确连接，对SAD基因进行PCR扩增时，应选择引物________，在其对应5'端分别添加限制酶______的识别序列。 (2)为了使连接后的重组基因SAD-YGFP能够表达出融合蛋白，设计时应考虑剔除SAD基因中终止密码子对应的碱基序列，剔除SAD基因中终止密码子对应的碱基序列的目的是___________________。 (3)将构建成功的表达载体导入农杆菌，与马铃薯叶片共培养，利用T-DNA____________的特点，可将重组基因SAD-YGFP导入马铃薯叶片细胞。 (4)为探究转化过程中农杆菌侵染时间与转化效率之间的关系，以马铃薯栽培种（De）和野生种（Sc）1cm左右茎段作为受体材料进行了研究。在马铃薯与农杆菌共培养的培养基中添加__________，用于筛选被侵染的马铃薯茎段。将筛选出的马铃薯茎段转移至再生培养基2周后，使用365nm紫外光手电筒照射，______（填“阳性”或“阴性”）转化茎段会呈现黄绿色荧光，否则茎段为红色，观察荧光，并进行记录，计算出不同侵染时间下的转化效率（荧光外植体数量/外植体总数×100%），如图3、4。结果表明:__________________________。 地 城 考点04 基因表达载体的构建 一、单选题 1．(23-24高二下·湖南衡阳衡郡高级中学有限公司·期末)毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，导入大肠杆菌中进行扩增后，再经酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上，其中的T启动子是一种甲醇诱导型启动子。图1、图2中的限制酶酶切位点对应的碱基序列如图3所示。下列说法错误的是（    ） A．利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物A结合的单链是b链 B．科研人员利用限制酶和E.coliDNA连接酶将HBsAg基因正确插入图1所示质粒时，应选用SmaⅠ、BclⅠ酶对质粒进行酶切处理 C．构建重组载体后，导入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，与含空白质粒的大肠杆菌菌落相比，含有重组质粒的菌落具有不能发绿色荧光的特征 D．将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入毕赤酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量 二、多选题 2．(24-25高二下·湖南岳阳·期末)FSHD是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示，已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。下列说法正确的是（　　） A．DUX4反义基因通过抑制DUX4基因的转录过程来抑制DUX4基因的表达 B．可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入患病组织细胞 C．利用图中信息构建反义基因表达载体时，选择的限制酶应为Hind III和BamHI D．利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测DUX4反义基因是否导入受体细胞 3．(24-25高二下·湖南长沙天心区长沙长郡中学·期末)农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白（VIP1-P）激活抗病相关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（    ） A．VF属于分泌蛋白，直接参与其合成过程的细胞器有核糖体、内质网与高尔基体 B．胞内蛋白V2的合成场所是核糖体，合成过程需要由线粒体供能 C．切割后的T-DNA含有两个游离的磷酸基团和两个游离的3′—OH D．农杆菌侵染植物细胞并整合到其染色体DNA上的过程涉及磷酸二酯键的断裂与形成 三、解答题 4．(24-25高二下·湖南长沙第一中学·期末)水稻是二倍体植物，其雄性不育性状由隐性基因控制。科研人员利用图中3个目的基因和质粒构建重组质粒，并将其导入雄性不育水稻中，培育出仅一条染色体上含有目的基因的植株M。植株M自交能产生固定比例的雄性不育株。已知A基因可以恢复雄性不育水稻产生花粉的能力，含有B基因的花粉由于B基因能阻断淀粉储藏而失活，因而能有效阻止转基因花粉的传播。 (1)仅用一种限制酶切割会使A基因以两种不同的方向插入质粒，A基因的表达产物________（填“相同”或“不相同”），其原因是_______。 (2)据图分析，将_______（填“基因A先、基因B后”或“基因B先、基因A后”）插入质粒，应选择限制酶_________处理基因A。 (3)植株M产生的花粉中不含目的基因，原因是植株M形成花粉时，启动子b在_________（填“减I”或“减Ⅱ”）启动了B基因的表达。据此推测，植株M自交，后代的表型及比例为________（不考虑同源染色体之间的交换）。 (4)miRNA基因产生的miRNA可抑制淀粉酶基因的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M时，科研人员将启动子c与miRNA基因连接，并使之随A、B基因一起导入水稻细胞。由此推测将启动子c与miRNA基因连接，其设计依据是启动子c能驱动miRNA基因在种子的________中特异性表达，避免对其他组织造成影响。 5．(24-25高二下·湖南长沙岳麓区湖南师范大学附属中学·期末)为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1.其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-GTTCCTGGTGTTGGC（50-限制酶b识别序列，50为重复次数）。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶是_____。 (2)步骤②转化时，科研人员一般先用_____处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；转化后的大肠杆菌采用含有_____的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是_____。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与_____结合，驱动转录，翻译（SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是_____（从图2的“A~D”中选填）。 6．(23-24高二下·湖南衡阳衡郡高级中学有限公司·期末)人乳头瘤病毒（HPV）是一类DNA病毒，至今已鉴定出200多种HPV类型，持续感染高危型HPV可能引发宫颈癌，尤其是HPV16、HPV18，其检出率在宫颈癌中达到99.7%。2022年8月，九价HPV疫苗的使用人群扩展到9~45岁适龄女性，价格昂贵，并且一针难求。目前科学家将HPV16和HPV18两种病毒的衣壳蛋白L1基因（目的基因）与质粒连接，导入大肠杆菌表达后，就获得了疫苗的有效成分，过程如下图所示，图中的限制酶的识别序列和酶切后的黏性末端均不同。回答下列问题： (1)为构建重组HPV疫苗，科研人员将L1基因插入质粒中，最好选择限制酶____________进行共同切割，原因是________________________。 (2)在构建基因表达载体时要将HPV16和HPV18两种病毒的衣壳蛋白基因L1插入____________和____________之间。 (3)图中启动子为RNA聚合酶结合位点，该处序列应根据____________（填“人宫颈细胞”“乳头瘤病毒”或“大肠杆菌”）的RNA聚合酶的识别序列来设计。 (4)构建好的基因表达载体导入大肠杆菌之前，需要使用______处理大肠杆菌，目的是________________________。重组质粒导入大肠杆菌后，可用添加____________的选择性培养基筛选。 (5)若要检测大肠杆菌是否产生了HPV疫苗，需要用______技术检测。与传统减毒疫苗相比，这样的重组疫苗更安全又有效。从疫苗的组成成分分析，其主要原因是该疫苗不含____________，所以无侵染能力。 7．(23-24高二下·湖南娄底涟源·期末)CRISPR/Cas9 是近年来颇受关注的一种基因编辑系统。该系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA 能识别并与特定的DNA 序列结合，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切 DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9 系统对水稻产量基因（Q基因）进行编辑，请回答下列问题： (1)研究发现，CRISPR/Cas9系统在自然界中仅存在于原核生物中，故需借助_____技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9 蛋白与_____酶的功能相似。 (2)首先依据_____的部分序列设计 DNA 片段A（负责编码相应引导RNA），再将片段A 与含有Cas9 基因的质粒 B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9表达载体（如图所示）。片段A与质粒 B连接需_____酶参与。 (3)将表达载体导入水稻细胞后，_____与水稻细胞的染色体DNA上的靶基因结合，并对其进行编辑，编辑后的基因能够稳定地遗传和表达。 (4)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在“脱靶”现象，即编辑了错误的基因，试从引导RNA 的角度分析脱靶的原因_____。 8．(23-24高二下·湖南郴州·期末)胰岛素对治疗糖尿病有积极的作用，为了批量生产人胰岛素，科学家利用基因工程改造大肠杆菌来生产人胰岛素。下图为生产过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，请回答下列问题。    (1)考虑到真核生物和原核生物基因的结构区别，人胰岛素基因扩增应以_______(填“人胰岛素基因”或“人胰岛素 mRNA”)为模板。 (2)不能将人的胰岛素基因直接导入大肠杆菌，而需要先构建基因表达载体的原因是_________________; (3)若胰岛素 基因的编码链(与 模 板链互补的链)首端到末端的序列为5'—ATCTACGCGCTCATCCG……CGCAGCAATGAGTAGCG—3'。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR 引物时，应将限制酶识别序列加在引物_________端。某同学设计如下四种 PCR 引物，其中适合选用的一对引物是_________。 A．5'-CTCGAGGCAAGTCGAGT-3'     B．5'-CTCGAGATCTACGCGCTC-3' C．5'-CAATTGCGCTACTCATTG-3'      D．5'-CAATTGCTTTCAGCTCA-3' (4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。大肠杆菌经钙离子处理后，与重组质粒混合培养一段时间，再接种到添加了_________的培养基上，筛选出_________(颜色)的菌落即为工程菌种。 9．(23-24高二下·湖南长沙长郡中学·期末)FAST是一种通过种子特异性启动子驱动荧光融合蛋白表达，利用种子荧光快速筛选转基因植株的方法。科研人员将能够在番茄种子中高水平特异性表达的油体蛋白基因SIOLEl与红色荧光蛋白基因TagRFP形成一个嵌合基因SIOLE1-TagRFP，通过基因工程培育并筛选出了转基因番茄，其过程如下图所示。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增嵌合基因SIOLEl-TagRFP时，需要____催化，一般经过变性、复性和____三步，其中复性是指____。 (2)图中构建A____时，首先切割Ti质粒和切割含有嵌合基因的DNA片段常使用两种不同的限制酶，其原因是____。切割时不使用EcoRⅠ的原因是____。 10．(23-24高二下·湖南湘西·期末)肾纤维化是所有肾脏疾病的共同病理特征，随着肾纤维化的进行性发展，患者的肾功能会逐渐恶化，最终导致肾衰竭。有研究发现，Pmepal（一种跨膜蛋白）在TGF-βⅠ型受体信号传导的控制中发挥作用。利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepal基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系，并探讨Pmepal基因敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响，为研究Pmepal在肾纤维化模型中的作用提供细胞模型。回答下列问题：      (1)据图1、图2分析，sgRNA 识别序列选择在小鼠Pmepal基因组第2个外显子（E2）上（图2），序列为5'-GCCGACACAGCAGGCCAGG-3'，使用__________切割sgRNA基因及pX333质粒，使用__________将两个酶切产物进行连接，获得pX333重组载体。其中，pU6及pCAG序列均为启动子，其作用分别是__________、__________。 (2)将构建好的pX333质粒转染入TCMK1细胞48h后，若观察到细胞出现__________，则说明转染成功且基因成功翻译。 (3)进一步采用某技术分析出转染成功（阳性）的TCMK1细胞，并将其增殖培养，最终获得16个细胞克隆。根据__________序列，设计引物，对这些细胞的Pmepal基因中Cas9靶向位点序列进行PCR扩增，经测序分析发现，16个细胞克隆中，克隆4（KO-4）和克隆16（KO-16）的Pmepal基因Cas9 靶向位点出现序列突变（图3）。经分析，克隆4和克隆16的基因分别因发生了碱基的__________而突变。    11．(23-24高二下·湖南邵阳·期末)胃幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能指导合成其特有的Ipp20蛋白，科研人员培育出转Ipp20基因山羊（将Ipp20基因导入山羊受精卵）利用乳腺生物反应器制备Hp疫苗。所用质粒和Ipp20基因两端序列以及相关限制酶识别序列如下图所示，已知Ipp20基因内部不含MfeⅠ酶切序列而外部两端含有，回答下列问题： 限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ HindⅢ MfeⅠ 识别序列和切割位点(5′—3′) G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT C↓AATTG (1)利用PCR技术扩增目的基因片段，PCR的每次循环包括______和延伸3个阶段，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是______，能够破坏该化学键的酶是______（写出1种即可）。 (2)构建基因表达载体时，一般不选用MfeⅠ对质粒和目的基因进行切割，原因是________________________，如果选择EcoRⅠ和HindⅢ两种酶对目的基因和质粒进行切割，需要在两种引物上分别添加两种限制酶的识别序列，从而扩增出两端带有两种限制酶识别序列的Ipp20基因。依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5′—____________—3′（写出其中1种即可）。 (3)将构建好的基因表达载体通过__________________技术注入到受精卵中，再将受精卵培养成早期胚胎移入受体获得转基因羊，进而培育成转基因羊，转基因羊成功的标志为__________________。 12．(23-24高二下·湖南衡阳衡阳县·期末)我国科学家经多年研究，筛选出高产紫杉醇的细胞，通过植物细胞培养技术可获得大量紫杉醇，实现紫杉醇的工厂化生产。为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下： (1)Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，扩增的前提是________，需要的引物有________（从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段产生2个双链等长的子代Bapt基因片段至少要经过________次循环。 (2)构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞：在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。强启动子能被________识别并结合，驱动基因持续转录。Ti质粒中的T—DNA在培育转基因红豆杉中的作用是________。为使DNA片段能定向插入T—DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是________。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题08 发酵工程与基因工程 4大高频考点概览 考点01 传统发酵技术的应用 考点02 微生物的培养与应用 考点03 目的基因的筛选、获取 考点04 基因表达载体的构建 地 城 考点01 统发酵技术的应用 一、单选题 1．D 2．B 3．A 4．B 5．C 6．C 二、多选题 7．BC 三、实验题 8．【答案】(1) 老浆 乳酸 (2)活菌数和死菌数 (3)乳酸菌发酵产生的乳酸使pH值下降，导致可溶性蛋白质变性沉淀；混合浆中的蛋白酶分解了部分可溶性蛋白质 (4) 提纯 透明圈直径与菌落直径比值较大（透明圈相对较大） 地 城 考点02 微生物的培养与应用 一、单选题 1．D 2．A 3．B 4．A 5．C 二、多选题 6．AC 7．BCD 三、解答题 8．【答案】(1) 无菌水 涂布器 灼烧灭菌 少 两个或多个细胞连在一起只形成了一个菌落 高压蒸汽灭菌 (2)菌落的形状、隆起程度和颜色等 (3) 250 S3 9．【答案】(1)选择 (2) 需氧型 让目的菌充分利用培养液中的营养物质 (3) 防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发 说明通过选择培养的确得到了欲分离的目标微生物 (4)污染环境或感染操作者 四、实验题 10．【答案】(1)显微镜直接计数获得的结果为活菌数和死菌数的总和 (2)避免余氯杀死活菌，使检测结果更加准确 (3)c (4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 (5) ab ab 地 城 考点03 目的基因的筛选、获取 一、单选题 1．D 2．A 二、多选题 3．ABD 三、解答题 4．【答案】(1) 替换 蛋白质 (2) 否 引物2和引物3可通过碱基互补配对形成双链，影响与模板正常配对 便于重组DNA分子的筛选 引物1和引物4 (3) Ca2+ 微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点 白色 5．【答案】(1)EcoR V和Xba I (2)GATATCATGGGC (3) 农杆菌侵染植物细胞时能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上 生根 (4) 促进乙酰-CoA羧化酶基因的表达，从而使油脂合成增加 油脂合成量增加，分解量未知，可能也增加，因此油脂的积累量不一定比正常植株高。 6．【答案】(1) DNA模板、（2种）引物、（4种）脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 230 (2) B 4 (3)C (4)目的基因与质粒反向连接导致目的基因无法表达；导入的基因发生了突变；导入的基因发生了甲基化7．【答案】(1) 能与AtCOR15a基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 耐高温的DNA聚合酶（或“TaqDNA聚合酶”） (2) BamHⅠ和HindⅢ 农杆菌转化 植物组织培养 (3)B 8．【答案】(1)不能 (2)耐高温的DNA聚合酶、逆转录酶、引物等 (3) XbaⅠ和HindⅢ 5′ HindⅢ (4) 四环素 青霉素 3、5 四、实验题 9．【答案】(1) 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 F、R XbaⅠ、SmaⅠ（这两空要引物和限制酶对应） (2)使拼接在一起的SAD基因转录形成的mRNA中不出现终止密码子，避免YGFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，从而无法合成SAD-YGFP融合蛋白 (3)能转移到被侵染细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上 (4) 潮霉素 阳性 不同侵染时间的转化效率有较大差异，不同的受体材料转化效率也具有差异性（或De的侵染时间为40min时，转化效率最高，Sc的侵染时间为20min时，转化效率最高） 地 城 考点04 基因表达载体的构建 一、单选题 1．B 二、多选题 2．BC 3．CD 三、解答题 4．【答案】(1) 相同 A基因自带启动子和终止子 (2) 基因B先、基因A后 3 (3) 减Ⅱ 雄性可育：雄性不育=1：1 (4)胚乳 5．【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) Ca2+ 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C 6．【答案】(1) BamHⅠ、HindⅢ BdI切割质粒会同时破坏2个标记基因，不利于重组质粒的筛选，Sau3AⅠ在质粒上没有相关酶切位点 (2) 启动子 终止子 (3)大肠杆菌 (4) Ca2+ 使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 氨苄青霉素 (5) 抗原—抗体杂交 核酸（DNA） 7．【答案】(1) 转基因 /DNA重组/基因工程 限制 (2) Q基因 DNA连接 (3)引导RNA (4)其他DNA片段中也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而脱靶/引导RNA序列的特异性不够强 8．【答案】(1)人胰岛素 mRNA (2)链状DNA 导入大肠杆菌易被降解；目的基因无法直接在宿主细胞中复制；目的基因无表达所需启动子；由于没有标记基因无法对目的基因进行检测 (3) 5’ BC (4) 氨苄青霉素和X-gal 白色 9．【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 延伸 在温度为50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (2) 基因表达载体 防止目的基因和Ti质粒拼接时出现目的基因的反向拼接和自身环化现象 避免破坏Ti质粒上的卡那霉素抗性基因 10．【答案】(1) 同种限制性内切核酸酶（同种限制酶） DNA连接酶 驱动sgRNA基因的转录 驱动Cas9基因和荧光蛋白基因的转录 (2)荧光 (3) Pmepal基因中Cas9靶向位点序列中的一段核苷酸 增添和缺失 11．【答案】(1) 变性、复性 氢键 解旋酶（或RNA聚合酶） (2) 目的基因和载体可能自身环化以及反向连接 AAGCTTATGGGC（或GAATTCCTAGTG） (3) 显微注射 转基因山羊乳汁中含有Ipp20蛋白 12．【答案】(1) 要有一段已知目的基因（Bapt基因）的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 BC 3 (2) RNA聚合酶 将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上 NotI和SacI 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $