2027届高中生物一轮复习讲义 高考共鸣点12　PCR引物的设计、修饰、选择与计算及限制酶、启动子的选择

该高中生物学讲义聚焦PCR引物设计、修饰、选择、计算及限制酶、启动子选择等高考核心考点，按“原理-应用-计算”逻辑梳理知识，通过考点精讲、方法归纳、真题剖析（如山东卷、江苏卷例题）等环节，帮助学生构建基因工程技术的系统认知，突破难点。 资料以科学思维为导向，创新采用“问题链+真题情境”教学法，如通过引物二聚体形成原因分析（例1）、双酶切避免目的基因环化（例2）等实例，培养学生分析解决问题能力。设置分层练习（对点强化、综合提升），配合即时反馈，助力学生高效掌握考点，为教师把控复习节奏提供清晰路径。

高考共鸣点12　PCR引物的设计、修饰、选择与计算及限制酶、启动子的选择 热点1　PCR引物的设计、修饰、选择及相关计算 1.PCR引物的设计和修饰 (1)PCR引物的设计原则 ①引物长度要适宜。一般引物过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。 ②引物内部应避免自身互补。 ③引物之间应避免互补。尤其应避免3′端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。 (2)引物的特异性和修饰 提醒　为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，这是为了保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。 [例1] 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。 ①第1组：_________________________________________________________ __________________________________________________________________； ②第2组：_________________________________________________________ __________________________________________________________________。 答案　①引物Ⅰ与引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 [例2] (2022·山东卷，25节选)为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　(填“3′端”或“5′端”)。 答案　5′端 2.PCR引物的选择 (1)引物的结合方向 [例3] 如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是　　　　　　　　　　；__________________________________________________________________。 答案　5′－ATGCCGTAAGTCCTAC－3′ 5′－TGATCTACGGCTTACA′－3 解析　书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′－TGATCTACGGCTTACA－3′。同理推测另外一条引物的序列。 [例4] 土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为(　　) A.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′ B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′ C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′ D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′ 答案　A 解析　图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′(上面链的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面链的引物)作为引物对，A符合题意。 (2)目的基因是正向连接还是反向连接的检测 ①利用电泳进行检测——检测长度 ②利用PCR进行检测——能否正常进行扩增 [例5] 研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)， 请回答： 经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、 GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。 为鉴定这3种连接方式，选择Hpa Ⅰ酶和Bam H Ⅰ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第　　　　泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。 答案　② 解析　由图可知，载体上有Hpa Ⅰ酶切位点，无BamH Ⅰ酶切位点，则载体自连情况下电泳得到的条带只有一条且分子量为6 000 bp，即①；基因与载体正向连接或反向连接的情况下，都有BamH Ⅰ和Hpa Ⅰ两个酶切位点，经酶切可产生两个片段，且正向连接时，Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点之间有700 bp，反向连接时Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点之间有200 bp，则载体正向连接后产生一个700 bp和一个6 000 bp的条带，即②。 [例6] (2019·江苏卷，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　　。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________________________________________________________。 答案　乙、丙　目的基因反向连接 解析　分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。 [例7] (2023·山东卷，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示： 构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图中的引物　　　　。 答案　F2和R1或F1与R2 解析　据图可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。 (3)引物与复性温度 ①复性温度：复性温度高，扩增特异性强，但扩增效率低；复性温度低，扩增效率高，但扩增特异性低。 ②引物：引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；引物GC含量越高，越容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。 [例8] 科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是 __________________________________________________________________。 若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是________________________________________________ __________________________________________________________________。 答案　引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)　引物过短导致引物的特异性下降 3.引物的数量计算 (1)如图：一个DNA分子n次扩增，则： ①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为　　　　个； ②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为　　　　个； ③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为　　　　个； ④子代DNA分子中含引物1(或2)的DNA分子数为　　　　个； ⑤复制过程中共需引物　　　　个； ⑥第n次复制需要引物　　　　个。 (2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第　　　　轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 答案　(1)①(2n－2n)　②2n　③2　④(2n－1) ⑤(2n＋1－2)　⑥2n　(2)3 热点2　PCR技术中限制酶和启动子的选择 1.单酶切和双酶切 (1)单酶切 (2)双酶切 ①过程：利用两个不同限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体均具有两个不同的黏性末端，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。优点 ②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。 [例1] (2024·重庆卷，19节选)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 ①表达载体 限制酶识别位点(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ) ②启动子D＋基因S 5′……TAGAATTCCA……3′ 3′……ATCTTAAGGT……5′ ③四种限制酶识别序列及切割位点 注：箭头表示酶的切割位置。 通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是　　　　；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________________ __________________________________________________________________。 答案　EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自身环化；不能保证目标片段与载体定向连接 解析　根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 [例2] (2022·湖北卷，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用　　　　酶切割S基因的cDNA和载体。 答案　Xba Ⅰ、Hind Ⅲ 解析　为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用Xba Ⅰ、Hind Ⅲ酶切割S基因的cDNA和载体。 2.启动子的选择 (1)启动子的类型 (2)乳腺生物反应器、膀胱生物反应器与植物反应器 [例3] (2024·河北卷，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： 实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 答案　在胚乳中特异性表达的基因　终止转录　Hind Ⅲ　EcoR Ⅰ 解析　若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一段有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限制酶KpnⅠ的识别序列，而SacⅠ的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ对r2HN和载体进行酶切。 [例4] (2024·黑吉辽卷，25节选)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是　　　　　　　　　　　　，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 __________________________________________________________________。 答案　RNA聚合酶识别并结合的部位　提高目的基因的转录效率 解析　穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因的转录效率。 强化练3　PCR引物的设计、修饰、选择与计算及限制酶、启动子的选择　 (时间：30分钟　分值：45分) 【对点强化】 热点1　PCR引物的设计、修饰、选择及相关计算 1.(2026·广东深圳高中调研)利用PCR获得目的基因后，用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如图所示。下列有关引物的分析正确的是(　　) A.通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3 B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1和引物4进行PCR C.若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR复性的温度 D.DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′端连接脱氧核苷酸 答案　A 解析　引物结合在模板链的3′端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确；引物结合在模板链的3′端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2和引物4进行PCR，B错误；若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3′端连接脱氧核苷酸，D错误。 2.(2026·四川成都开学考试)DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。下列说法正确的是(　　) A.若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅲ B.进行最初10个循环的目的是将限制性引物消耗完，以保证获得大量的单链DNA探针 C.设计较长的限制性引物与较短的非限制性引物，以便于后阶段通过提高温度来控制产物生成量 D.如果体系中原模板DNA的数量为a，共进行25次循环，则最终获得的单链探针数为15×210×a 答案　D 解析　由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，引物Ⅱ和引物Ⅲ不能作为扩增探针序列的引物，据题干信息“数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链”可知，若A链为所需的DNA分子探针，即目标DNA单链，则非限制性引物应选用引物Ⅳ，A错误；进行最初10个循环的目的是增加模板DNA的量，以便后期更快得到较多数量的目标DNA单链(单链DNA探针)，B错误；引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏，因此可设计较短的限制性引物与较长的非限制性引物，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合，从而提高产物生成量，C错误；如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链DNA分子，为210×a个，其中有B链210×a个，以这些链为模板，利用引物又进行了15次循环，每次循环生成的都是A链，不改变B链的数目，即每次循环开始模板都是210×a个，15次循环每次生成A也是210×a个，故最终获得的单链探针数共为15×210×a个，D正确。 热点2　PCR技术中限制酶和启动子的选择 3.(2026·吉林长春质检)干扰素(W)是一种具有特定功能的人体蛋白质，可用于治疗病毒的感染和癌症。图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。为使目的基因连接方向正确，对W基因和质粒都分别用两种不同的限制酶切割然后拼接，下列叙述正确的是(　　) A.选用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ切割质粒 B.选用BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割含W基因的DNA片段 C.利用PCR技术扩增目的基因时，选择引物A和引物D D.若受体细胞表现出X抗生素抗性和Y抗生素抗性，表明重组质粒成功导入受体细胞 答案　A 解析　目的基因需插入到质粒的启动子与终止子之间，据图甲可知，不可用Bcl Ⅰ切割质粒，结合图乙中目的基因的转录方向及限制酶识别序列，应选用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ切割质粒，选用Hind Ⅲ和Sau3A Ⅰ切割含W基因的DNA片段，A正确，B错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿5′→3′方向合成子链，故所用的引物组成为图乙中引物B和引物C，C错误；由于选用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ切割质粒，Y抗生素抗性基因被破坏，故重组质粒导入的受体细胞不会表现出Y抗生素抗性，D错误。 4.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案　D 解析　若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和空质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与空质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因(TetR)中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因(TetR)，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 【综合提升】 5.(2025·四川卷，19)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA－lrcF)导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′－3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA－赖氨酸；AUG－甲硫氨酸(起始)；UUC－苯丙氨酸；ACA－苏氨酸；UCG－丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA－lrcF目的基因时，应选用　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 __________________________________________________________________。 (2)采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 __________________________________________________________________。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带　　　　(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点，导致___________________________________________， 最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是__________________________________________________________________。 若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有__________________________________________________________________ (答出1点即可)。 答案　(1)F2、F4　保证目的基因能在链霉菌细胞中复制　(2)2　检测重组质粒是否构建成功　(3)苯丙氨酸　翻译过程无法正常进行，细菌无法合成蛋白质　(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等合理答案)　发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等合理答案) 解析　(1)引物需要结合到模板的3′端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5′端→3′端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA－lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证目的基因能在链霉菌细胞中复制，使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。(2)采用EcoR Ⅰ和Bam H Ⅰ完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。(3)观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：发酵的最佳条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 6.(2025·新课标卷，34)为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5′→3′方向)。回答下列问题： (1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是　　　　，而PCR过程中解开双链的方法是　　　　　　　　。 (2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有__________________________________________________________________。 (3)该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：__________________________________________________________________； ②无扩增产物，原因是_____________________________________________ __________________________________________________________________； ③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是 __________________________________________________________________。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果 __________________________________________________________________。 答案　(1)解旋酶　高温变性　(2)引物、脱氧核苷酸　(3)作为对照(或鉴定反应体系是否有模板污染)　P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列　目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段　(4)实验思路：提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系，催化相应底物(反应物)的反应，检测产物的生成情况。预期结果：含有酶X的反应体系中产物生成明显，而不含酶X的反应体系中产物无明显生成，则证明酶X有活性 解析　(1)在细胞中，DNA 复制时解开双链的酶是解旋酶。而在 PCR 过程中，是通过高温变性(温度超过90 ℃)的方法使 DNA 双链解开。(2)PCR过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和脱氧核苷酸。引物用于引导DNA聚合酶合成新的DNA链，脱氧核苷酸为合成新的DNA 链提供原料。(3)实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③以Px为模板，引物1和引物2扩增出的是含目的基因的 DNA 片段；⑤以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段 DNA 片段；⑥以Px为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的 DNA 片段。(4)实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系(作为对照)，在适宜条件下，加入酶X的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。 预期结果：含有酶X的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。 7.(2025·湖南卷，21)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A， 其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物　　　　对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为　　　　bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是__________________________________________________________________ (答出两点即可)。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有________________________________________________(答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 答案　(1)①终止子、复制原点　P1和P3　782　②蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失　(2)PEG融合法/电融合法/灭活病毒诱导法　抗体检测 解析　(1)①PCR时选用的两种引物应该方向相反， 分析题图，P3是唯一一个与P1和P2方向相反的引物，故必选P3；PCR的目的是确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，P3和P2分别与基因A两端互补配对，若选该对引物进行扩增，无论基因A插入质粒方向是否正确都可以扩增出片段(基因A)，不符合要求；P1与质粒一段序列互补配对，P3与基因A的一端互补配对，选P1和P3为引物，扩增时，若基因A未插入质粒，则不能扩增出相应片段；若基因A插入质粒的方向错误，也不能扩增出相应片段，故应选P1和P3对待测质粒进行PCR扩增。预期扩增的片段包括质粒的一段序列(200 bp)和基因A(582 bp)，故扩增片段大小为200＋582＝782(bp)。②上清液中检测到蛋白A的条件：重组菌将蛋白A正常表达；蛋白A不被重组菌降解；重组菌裂解或将蛋白A分泌到细胞外；蛋白A易溶于发酵液；离心时转速合适，既能将重组菌和大的颗粒沉淀，又不会将蛋白A沉降下来。(2)诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。对经选择培养所得的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 学科网（北京）股份有限公司 $