3.2.2 基因表达载体的构建课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程核心步骤“基因表达载体的构建”，通过“思考讨论”导入目的基因能否直接转入受体细胞的问题，衔接“获得目的基因”与后续操作，以组成元件分析和作用探讨为支架，帮助学生构建完整操作程序知识链。 其亮点在于结合科学思维与探究实践，通过对比表格明晰启动子与起始密码子等区别，设计模拟构建活动（如单/双酶切方案）分析限制酶选择原则，辅以针对训练深化理解。实例如双酶切法防止环化的探究，培养学生分析解决问题能力，为教师提供结构化教学资源，提升教学效率。

DNA是主要遗传物质 第三章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 第2步 基因表达载体的构建 选必三 REN JIAO BAN GAO ZHONG SHENG WU XUAN BI SAN 获得目的基因后能否直接转入受体细胞？ （1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解； （2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 思考讨论 阅读课本80页的内容，回答下面问题： 1．构建基因表达载体的目的是什么？ 2．基因表达载体的组成有哪几部分？ 3．标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？ 4．构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？ 5．为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？ 基因表达载体的构建 02. 1、目的： ---基因工程的核心 要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达和发挥作用，载体还需要哪些结构？ 2、基因表达载体的组成 思考：要各个元件有什么作用？ ①确保目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； ②使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的构建 02. 2. 组成： 包括 、 、 、 、 。 启动子 终止子 标记基因 目的基因 复制原点 位置：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游。 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。 位置：位于基因的下游，也是一段特殊的DNA片断。 功能：终止mRNA的转录 作用：便于重组DNA分子的筛选。 类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 作用：基因表达载体自我复制起始的一段序列。 目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，并且不能破坏启动子、终止子、 复制原点、标记基因。 ---基因工程的核心 基因表达载体的构建 02. 人工构建诱导型启动子,可激活或抑制目的基因的表达。 5 启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学 成分 位置 作用 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻碱基 mRNA上 三个相邻碱基 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号(编码氨基酸) 决定翻译的结束(不编码氨基酸) A A G U G U U A U mRNA 比较基因表达载体与基因克隆载体 基因克隆载体必须具备的条件 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体必须具备的条件 考虑到翻译，基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整 、 和 的序列。 核糖体结合位点 起始密码子 终止密码子 二者在组成上有什么区别？表达载体：在克隆载体基础上增加表达元件，使外源基因在宿主细胞中转录和翻译。克隆载体：专注于DNA复制和保存，不包含表达元件（如启动子、终止子）。。 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 7 (1)基因工程中的基因表达载体≠载体： 基因表达载体与载体相比增加了 。 目的基因 (2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： 基因表达载体的构建 02. 基因表达载体中启动子、终止子的来源： ①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。 ②如果目的基因是通过人工方法合成的，或是cDNA，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 注意事项 基因表达载体的构建 02. 3. 基因表达载体构建过程： 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同一种 基因表达载体的构建 02. 10 活动1. 模拟基因表达载体的构建： (1)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　 。  SmaⅠ会①破坏质粒的抗生素抗性基因 ②破坏外源DNA中的目的基因  Hind Ⅲ BamHⅠ  EcoRⅠ  EcoRⅠ SmaⅠ  Bt基因 方案一： 只用EcoRⅠ切割目的基因和质粒 方案二： 同时用BamHⅠ和HindⅢ (或EcoRⅠ和HindⅢ)切割目的基因和质粒 图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。 11 方案一：单酶切法 使用一种限制酶（EcoR Ⅰ）进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？ 载体与目的基因反向连接 载体与目的基 因正向连接 目的基因与目的基因之间的连接 目的基因自身环化 载体 自身环化 载体与载体之间的连接 转录方向错误影响：若目的基因包含启动子或依赖载体上的启动子，反向插入会导致转录方向与预期相反，无法生成功能性mRNA。 案例：假设目的基因编码绿色荧光蛋白（GFP），反向插入后，即使转录生成mRNA，其序列也会与正向插入的mRNA互补，无法翻译为GFP蛋白。若载体上的启动子为RNA聚合酶II依赖型，反向插入可能导致转录提前终止或生成无意义的转录本。 12 方案一：单酶切法 载体 自身环化 片段间 的连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 目的基因 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 ①质粒、目的基因自身环化； ②质粒与目的基因随意连接 单酶切法缺点： 总结：如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合) 13 方案二：双酶切法 a b a b 双酶切的优点: 防止质粒、目的基因自身环化 防止质粒与目的基因随意连接 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，使基因两端产生两个不同的粘性末端 a酶： b酶： 2、如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 14 15 1.图解限制酶的选择原则 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 不破坏目的基因原则： ① 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则： ② 核心归纳 1.图解限制酶的选择原则 通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ； 为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。 确保出现相同黏性末端原则： ③ 核心归纳 1.根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。 (1)应选择酶切位点位于 的限制酶，如图甲可选择 ；不能选择酶切位点位于 的限制酶，如图甲不能选择 。 目的基因两端 Pst Ⅰ 目的基因内部 SmaⅠ 针对训练 1.根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。 (2)为避免目的基因及质粒的 ，也可使用 的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的 )。 自身环化、反向连接 不同 PstⅠ和EcoRⅠ 切割位点 针对训练 (3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用 切割。（同理保留启动子、终止子、复制原点） （4）目的基因需要插入 之间。 Sma Ⅰ 启动子和终止子 针对训练 思考：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？ 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 引物1 引物2 引入限制酶识别序列 引入限制酶识别序列 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 使用引物设计引入酶切位点，通过PCR扩增实现突变。 思考讨论 21 1.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是(　　) 　　　　　　　　 A　　　　 B C　　　　　　 D A 针对训练 2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(　　) A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 A 针对训练 3.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因 等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因 的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 B 针对训练 4.图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是(　　) A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma Ⅰ切割 B.图甲所示的质粒分子在经Sma Ⅰ酶切割后含有4个游离的磷酸基团 C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶 D.用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和Bam HⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 A 针对训练 5.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是 A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反 向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 D 针对训练 $