3.2 基因工程的基本操作程序1课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件以转基因抗虫棉培育为情境，系统讲解基因工程基本操作程序，从目的基因筛选与获取（如Bt基因）、表达载体构建（核心）、导入受体细胞到检测鉴定，通过问题引导、资料补充和随堂演练搭建学习支架，衔接前后知识。 其亮点在于融合科学思维与探究实践，以PCR技术为核心，详细解析引物设计、反应过程及电泳鉴定实验，结合案例分析（如重叠延伸PCR）培养逻辑推理能力。通过分子与个体水平检测实例，强化生命观念，助力学生掌握实验技能，教师可直接用于教学提升效率。

一条小虫引发的科技大战 —中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实 转基因抗虫棉 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤? 普通棉花 培育转基因抗虫棉的简要过程 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 苏云金杆菌 Bt基因 重组DNA分子 人教版 选择性必修3 第3章 第2节 3 一. 目的基因的筛选与获取 (一)目的基因: 在基因工程的设计和操作中，用于改变______________或获得 _______________等的基因。主要是指___________的基因。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 (二)实例： 与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 【资料】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因——Bt 抗虫蛋白基因（Bt基因 ） 那么，如何筛选目的基因呢？ (三)目的基因的筛选: 1、较为有效的筛选方法 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 P27 1.3发酵工程及其应用 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) 掌握目的基因的功能 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (三)目的基因的筛选: 1、较为有效的筛选方法 3.目的基因的筛选: 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 利用测序技术、序列数据库、序列对比工具等，可了解基因的结构和功能，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 明确了目的基因后，该怎么获得它? 1、较为有效的筛选方法 4.目的基因的获取: 1、人工合成 在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段 方法： 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 2.从基因文库中获取 前提：基因比较小、核苷酸序列已知 (2).利用PCR获取和扩增目的基因 4.目的基因的获取: 模拟细胞内DNA的复制过程，在体外快速扩增特定的DNA片段。 3、利用PCR获取和扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 (聚合酶链式反应) DNA半保留复制。 体外（PCR扩增仪/PCR仪）。 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。 可以在短时间内大量扩增目的基因。 任务一：自主阅读教材77页正文第五段，明确PCR的概念、原理及目的 原理： 操作环境： 目的： 优点： 结合体内DNA复制过程，PCR的进行需要哪些条件？ 3、利用PCR获取和扩增目的基因 模板： 原料： 能量： 酶： 引物： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 ①条件 ATP DNA聚合酶（形成磷酸二酯键） 解旋酶(解螺旋，打开氢键) 边解旋边复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） ②复制原则： 半保留复制 ④子链的延伸方向： 5'端→3'端 因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。 使DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 要点回顾:体内DNA复制 ③复制特点： 拓展延伸 引物 DNA聚合酶无法从头合成DNA链 引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始拼接单个的核苷酸。 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列 的短单链核酸。 互补配对 细胞外(PCR)一般以DNA单链为引物，长度通常为20-30个核苷酸(不切除) 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除） (聚合酶链式反应) 3、利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的进行需要的条件： 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 2种引物（通常为与两条模板链结合的小的单链DNA） PCR反应还需要其他条件，如控温设备和缓冲液 （一般添加Mg2+，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）。 (聚合酶链式反应) 3、利用PCR获取和扩增目的基因 (2)PCR的过程： (2)PCR的过程： 3` 5` 5` 3` 92 55 75 ℃ 变性 3` 5` 5` 3` 复性 92 55 75 ℃ 延伸 5` 3` 3` 5` 3` 3` 3` 5` 5` 3` 5` 5` (2)PCR的过程： 第1步：变性 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 当温度超过90℃时， 双链DNA解旋为单链。 95℃ ①变性 (2)PCR的过程： 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 第2步：复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 50℃ 引物结合在: 模板链的3’端 ②复性 (2)PCR的过程： ②复性 思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链重新结合的情况，但概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 (2)PCR的过程： ③延伸 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 第3步：延伸 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (2)PCR的过程： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 【讨论1】PCR扩增过程中引物可以循环使用吗？ 引物会成为子链的一部分（不能循环利用） PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 【讨论2】PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 一般不是； 扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段； 设计引物时必须依据： 目的基因的核苷酸序列 【讨论3】由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？ PCR扩增的前提是： 根据一段已知目的基因两端的核苷酸序列合成引物 【讨论3】由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？ 例1：根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。 (1)写出互补链的碱基序列，并注明方向。 (2)从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。 ① ② ③ ④ 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ PCR扩增时至少需要____种引物，原因是________________________________________ 2 DNA的两条链是反向平行的（序列不同） 2.【2025湖南.T21】为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物___________对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 1.【2025四川.T19】用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF´目的基因时，应选用________引物。 注：F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。 F2、F4 782 P1、P3 随堂演练 只扩增目的基因用:______ 检测目的基因是否正向插入载体用: _________ ②③ 包含目的基因和左侧或右侧的序列 ③⑥或②⑤ 小结 【讨论3】由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？ 例2：下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由 每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，防止引物自身配对折叠 两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，防止引物不能与模板链结合 引物设计时还要注意：引物过短特异性差； 引物过长可能出现引物内部碱基互补配对及引物与非目的基因序列模糊配对。 【讨论4】若想在DNA两侧添加限制酶识别序列，可利用PCR技术对DNA进行扩增时，在引物A、B的 端分别添加限制酶识别序列，扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。 5’ 引物A 引物B 3’ 3’ 5’ 引物A 引物B 5’ 5’ 第1次 第2次 第3次 引物A 引物B 5’ 5’ 引物A 引物B 3’ 3’ 引物A 引物B 引物A 引物B 引物A 引物A 引物B 引物B 5’ 例1.（2025陕西.T21）为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的______（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-____________-3'。 5'端 AGATCT 上游 第一步： 引物的5＇添加限制酶 第二步： 确定目的基因转录方向 第三步： 插入载体位置 第四步： 考虑同尾酶替换 例2.多种霉菌能产生 T-2 毒素污染饲料，引起家猪中毒｡我国科学家将 C3A 酶基因导入家猪受精 卵内，获得的转基因家猪具有降解 T-2 毒素的能力｡C3A 酶含有 R 和 Q 两个功能区，质粒、 C3A 酶基因及两个功能区对应序列的相关结构如图 1、2 所示。 为使目的基因与载体正确连接，科研人员使用 PCR 技术在 C3A基因的两端加上限制酶识 别序列，扩增目的基因时选用的引物组合是______｡ 引物 1：5'-AAGCTTTCTGTT......-3' 引物 2：5'-AAGCTTCTTGAT......-3' 引物 3：5'-GAATTCCTTGGA.....-3' 引物 4：5'-GAATTCTCTGTT......-3' 1、3 小结：引物设计的原则 (1)引物长度要适宜 (2)引物G-C含量要适宜 一般在15-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。 一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于引发反应。 (3)引物自身及引物之间不应存在互补序列 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物 与模板的复性结合。 小结：引物设计的原则 (4)复性温度要适宜 复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。 引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 (5)引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰 【讨论4】利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 第3轮 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 引物1 引物2 2n 2n 2n-1 2n-2 2n+1-2 2 4 8 2 4 8 1 3 7 0 2 6 2 6 14 【讨论5】同桌合作以一个DNA为例，尝试画出3轮循环并讨论PCR中的相关数量关系，完成表格。 一个DNA，一对引物（1与2），通过PCR扩增n次后： ①DNA分子有：___个；DNA链有：_____条 ②子代等长链DNA分子（目的基因）数目：______个 ③ 子代DNA分子中含引物的DNA分子数为____个; ④含引物1（或2）的DNA分子数为：______个, ⑤同时含两种引物的DNA分子数________个; 不含引物的DNA数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ；仅含引物2的DNA数：______ ⑦复制过程中共需引物_________个； ⑧第n次复制需要引物______个 (2)PCR的过程： 2n 2n+1 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n 2n－2 2n 0 1 1 【讨论6】用PCR可以扩增mRNA吗？（P79旁栏思考） ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 RT-PCR RT-PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用，由RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。 拓展：常见PCR技术 1、实时荧光PCR RNA病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到。 拓展：常见PCR技术 1、实时荧光PCR 通过实时荧光PCR检测RNA病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙 例1：荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是：在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针，荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光监测系统接收不到荧光信号。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图所示)。下列相关叙述正确的是( ) A．扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上 B．在PCR体系中需加入解旋酶 C．荧光信号积累越多，说明PCR循环次数越多 D．若扩增n次，则其需要消耗2n-1个探针 C 拓展：常见PCR技术 2、重叠延伸PCR 采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来 2、重叠延伸PCR 引物2和引物3具有互补配对片段 2、重叠延伸PCR 例2：扩增融合基因时，引物R1和P2实现了两种基因片段的拼接，则R1和P2分别是___________(从下列引物中选填) 引物b、c 例3：实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题： 2、重叠延伸PCR (1)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列        互补； 引物P2与引物P3的碱基序列应 ，目的是     。 不能 部分互补 使LTB基因与 ST1基因的单链融合在一起 例3：实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题： 2、重叠延伸PCR (2)为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是        。 为杂交链延伸子链起始部位提供 3’端 例3：实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题： 2、重叠延伸PCR (3)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，         （填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3′端和5′端。 不需要 3’ 3’ 5’ 5’ 2、重叠延伸PCR 利用重叠延伸PCR技术进行定点突变： 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 最后，用引物a和引物d进行扩增得到的含有突变位点的DNA片段。 总结：PCR的应用 (3)PCR产物的鉴定： PCR过程可以在 中自动完成; 完成以后，常采用来________________鉴定PCR的产物。 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增仪 探究•实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究实践 1.实验原理 ①PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的 与 。 ②PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 解聚 结合 (1)DNA体外扩增的原理 探究•实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究实践 1.实验原理 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在____的作用下，这些带电分子会向着_________________的电极移动，这个过程就是_____。 可解离的基团 pH 电场 与它所带电荷相反 电泳 探究•实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究实践 一般使用的电泳缓冲液pH8.0～8.3，DNA分子带 ， 在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 1.实验原理 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、_______________和_____等有关。 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关。浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 小 小 凝胶的浓度越大，迁移速率越慢 DNA分子越大，迁移速率越慢 DNA分子构像有环状、链状等 1.实验原理 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、_______________和_____等有关。 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 1.实验原理 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 ③凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_______的_______下被检测出来。 染色 300nm 紫外灯 核酸染色剂：常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 标准参照物（Marker） DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 1.实验原理 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 2.实验用具 ①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头 （微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置 （包括电泳仪、电泳槽等） 3.实验材料 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液。 ②无菌水 电泳缓冲液（TAE或TBE） 凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）、 琼脂糖和核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）等。 4.实验步骤 (1)DNA片段的扩增 移液 离心 扩增 用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在 中依次加入各组分。 微量移液器 微量离心管 待所有组分都加入后， 离心管的盖子，将微量离心管放入 _ 里，离心约10s，使反应液集中在离心管的 （提高反应速率）。 盖严 离心机 4.实验步骤 (1)DNA片段的扩增 移液 离心 扩增 底部 4.实验步骤 (1)DNA片段的扩增 移液 离心 扩增 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。 将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 4.实验步骤 (1)DNA片段的扩增 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 【思考1】预变性的目的是什么？ 【思考2】为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 注：可根据目的片段长度适当调整延伸时间。 4.实验步骤 (2)琼脂糖凝胶电泳 4.实验步骤 (2)琼脂糖凝胶电泳 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 4.实验步骤 (2)琼脂糖凝胶电泳 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 4.实验步骤 (2)琼脂糖凝胶电泳 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 4.实验步骤 (2)琼脂糖凝胶电泳 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。 待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 4.实验步骤 (2)琼脂糖凝胶电泳 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 琼脂糖凝胶电泳图 探究•实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究实践 5.注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 (5)PCR扩增不能随意加大试剂用量。 6.结果分析与评价 (1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是_____条带，如图片段大小约为_____bp。 750 一条 (2)如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ①如果扩增不成功(没有条带)，可能的原因有： 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 6.结果分析与评价 引物出现质量问题； 变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 耐高温的DNA聚合酶失活； Mg2+浓度过 。 低 低 短 ②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： (2)如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 6.结果分析与评价 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成引物二聚体； 复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 耐高温的DNA聚合酶的质量不好； Mg2+浓度过高； 模板DNA出现污染。 注：Mg2+浓度过高(影响酶)和复性温度过低会过度稳定非特异性结合的引物-模板复合物。 1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 随堂演练 2.在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。下列说法错误的是(　　) A．两种限制酶在载体上识别的序列相同 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距约为200 bp D．该载体最可能为环状DNA分子 A 随堂演练 3.(2024黑吉辽高考)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验， 下列叙述正确的是(　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 随堂演练 4.人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度为8416bp，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答下列相关问题。 (1)上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，除了此方法外，还可以利用的方法是 从基因文库获取或人工合成 。 (2)利用PCR技术获取人胰岛素基因， 在缓冲液中除了要添加模板和引物外， 还需要添加的物质有 四种脱氧核苷酸 和耐高温的DNA聚合酶 。 (3)经过 3 轮循环可以得到所需的 目的基因，一个DNA分子经过5轮循 环，需要引物A 31 个，从 PCR的 过程和DNA分子的特点，试着写出设 计引物需要注意的问题： 引物自身不 能有互补序列；引物之间不能有互补序列 (答出2点即可)。 从基因文库获取或人工合成 四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶 3 31 引物自身不能有互补序列；引物之间不能有互补序列 随堂演练 4.人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度为8416bp，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答下列相关问题。 (4)利用 SDS-凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度与 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 等有关。 (5)利用图示方法获取的目的基因，直 接构建基因表达载体后导入大肠杆菌， 不能 (填“能”或“不能”)表达出人 胰岛素，理由是 此方法获得的目的基 因中含有内含子，大肠杆菌无法正常 识别内含子，而对内含子部分转录mR NA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误 。 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 不能 此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子，而对内含子部分转录mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误 随堂演练 获取足够量的目的基因后能不能直接将它导入受体细胞呢？ 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？ 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 1.构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； (2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 【思考】要想目的基因实现以上功能，载体需要哪些结构？ 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 2.表达载体的组成 启动子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA 终止子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 下游 转录 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 2.表达载体的组成 复制原点： DNA复制的起始位点 标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 位置：必须插到 和 之间 启动子 终止子 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 拓展延伸1 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 基因上游 基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 拓展延伸2 基因表达载体中启动子、终止子的来源 ①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的 ——已含有启动子、终止子 在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。 ②如果目的基因是通过人工方法合成的，或是cDNA。 ——目的基因不含启动子和终止子 在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 诱导型启动子： 有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当 存在时，可以 或 目的基因的表达。 诱导物 激活 抑制 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 3.基因表达载体的构建过程 (1)用限制酶在载体的基因插入位点处切割质粒； (2)用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的片段，获取目的基因； (3)用DNA连接酶把目的基因和载体连接，构建重组DNA分子 注意：切割时切点不能在目的基因上 【思考1】构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ限制酶切割质粒？为什么？ 不能； 因为 SmaⅠ 切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组 DNA 分子）。 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 【思考2】若只用 EcoR Ⅰ 限制酶切质粒和外源 DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？ 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 质粒自身环化 正向连接 反向连接 目的基因多拷贝与质粒连接 【思考3】为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源 DNA 进行切割？ 使用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA。 优点：①避免质粒、目的基因的自身环化； ②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接。 双酶切法 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 P80 总结：限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，提高筛选成功率。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。 1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 随堂演练 B 2.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　 ) A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 随堂演练 B 3.如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，欲将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是(　　) A．应选择的限制酶组合是酶E和酶G B．应选择含有ApR和TcR基因的受体菌 C．用含氨苄青霉素的培养基能筛选出含重组质粒的受体菌 D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带 D 随堂演练 三、将目的基因导入受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 我国科学家独创 常用 显微注射法 Ca2+处理法 受体细胞类型 农杆菌转化法 花粉管通道法 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 (1)花粉管通道法 (我国独创) 操作一：子房注射法 用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中 1.将目的基因导入植物细胞 操作二： 柱头处理法 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 ②适用生物： ①受体细胞： 受精卵 ③特点： 简便经济，但要求花朵较大 开花植物 (1)花粉管通道法 (我国独创) (2)农杆菌转化法 ①转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 ②农杆菌特点： a. 能在自然条件下侵染___________和________，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；当双子叶植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。 双子叶植物 裸子植物 b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________。 Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 该细胞的染色体DNA上 (2)农杆菌转化法 ③农杆菌转化过程： 【思考】为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将目的基因插入哪里？ 将目的基因插入_________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入_____________。 Ti质粒的T-DNA 植物细胞 ③农杆菌转化过程： 第一次拼接：将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。 第二次拼接：含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。 第二次导入：含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞（非人工操作）。 ④具体转化方法： 方法一：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 受体细胞为体细胞 方法二：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 受体细胞为受精卵 【思考】农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 三、将目的基因导入受体细胞 2.将目的基因导入动物细胞 (1)常用方法： 显微注射法 (2)受体细胞: 受精卵 (3)过程: ①个体大，易操作。 ②受精卵全能性高，易培养成完整个体。 3.将目的基因导入微生物细胞 三、将目的基因导入受体细胞 (1)常用方法： Ca2+处理(感受态细胞法) Ca2+处理目的 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 受体细胞 （1）原核细胞（常选择大肠杆菌） （2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 3.将目的基因导入微生物细胞 (1)常用方法： Ca2+处理(感受态细胞法) 吸收 Ca2+ 感受态细胞 三、将目的基因导入受体细胞 转录 翻译 【思考】如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ ①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA； ②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 一般不能产生原来的蛋白质 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达？ 【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常 生物活性，需要在体外 。 （因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工） 没有 进行再加工 1.研究人员将抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？ 有三种情况，如下图所示。 2.若甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？ 甲自交→全为抗虫 思考·讨论 乙自交→抗虫：不抗虫=3:1 丙自交→抗虫：不抗虫=15:1 106 花粉管通道法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 体细胞或受精卵 受精卵 通常选原核细胞 107 1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是 A.不必构建表达载体就可以直接导入 B.此方法可用于转基因动物 C.受体细胞只能是植物的卵细胞 D.有时可以取代农杆菌转化法 随堂演练 D 2.在基因工程技术中，将目的基因导入受体细胞的方法有许多种，下列叙述错误的是(　　) A．受体细胞为大肠杆菌时，常用Ca2＋溶液处理 B．农杆菌转化法主要用于双子叶植物和裸子植物 C．利用显微注射法可将目的基因直接注入动物的受精卵中 D．可采用花粉管通道法将含目的基因的DNA溶液直接注入子房 随堂演练 C 3.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是 A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞 B.②过程中需要进行胚胎移植操作 C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素 随堂演练 A 将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？ 可以利用标记基因（如抗生素抗性基因）筛选成功导入基因表达载体的受体细胞，如可用含青霉素的选择培养基鉴别。 标记基因（如抗生素抗性基因）筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。 此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 四、目的基因的检测与鉴定 结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面对目的基因进行检测与鉴定？ mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 Bt基因 PCR等技术检测 抗原-抗体杂交技术 抗虫接种实验 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 1.分子水平的检测 (1)检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 ①方法一：通过PCR等技术检测 1.分子水平的检测 (1)检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 ②方法二：核酸杂交技术(DNA分子杂交) 原理：碱基互补配对 首先取出转基因生物的基因组DNA。 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中。 1.分子水平的检测 (2)检测目的基因是否转录出了mRNA ①方法一：通过PCR等技术检测 如：检测 Bt 基因是否转录出 mRNA 提取棉花细胞 mRNA 逆转录得到 cDNA 用以Bt 基因序列设计的引物进行PCR扩增 电泳 检测 10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录 1.分子水平的检测 (2)检测目的基因是否转录出了mRNA ②方法二：通过核酸分子杂交技术 带标记的基因探针，与目的基因转录产物mRNA在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 1.分子水平的检测 (3)检测目的基因是否翻译成蛋白质 ①方法： ②原理： 抗原-抗体杂交技术 抗原能与抗体特异性结合 如：检测 Bt 基因是否翻译成 Bt 抗虫蛋白 过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 2.个体水平的检测 进行抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 饲喂害虫（抗虫接种实验） 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 盐水浇灌 喷洒除草剂 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 四、目的基因的检测与鉴定 1.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( ) A.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子杂交的方法 B. 检测目的基因是否转录用分子杂交的方法 C. 检测目的基因是否表达用抗原-抗体杂交的方法 D. 目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤 D 随堂演练 2.转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是(　　) A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法 B．检测抗虫基因是否转录——分子杂交技术 C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交 D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验 A 随堂演练 1.目的基因的筛选和获取-前提 DNA合成仪合成 基因文库获取 利用PCR获取和扩增 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.将目的基因导入受体细胞-关键 花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物) 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子水平：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 总结： 课堂小结 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.28 $