专题10 生物技术与工程（期末真题汇编，浙江专用）高二生物下学期

**基本信息** 浙江各地高二下期末试题汇编，聚焦发酵工程、细胞工程、基因工程三大核心考点，以沈荡黄酒酿造、CRISPR基因编辑等真实情境和实验流程为载体，覆盖生命观念与科学探究素养。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选题|约44题|发酵工程（传统发酵技术、微生物培养）、细胞工程（植物组培、单克隆抗体）、基因工程（载体构建、CRISPR技术）|结合非遗工艺（如酸笋制作）和科研案例（抗虫转基因水稻），考查操作原理与误差分析| |简答题|23题|基因表达载体构建、PCR技术、单克隆抗体制备流程|以实验设计为主（如启动子功能验证），层次分明，适配高考对实验探究能力的考查趋势|

专题10 生物技术与工程 3大高频考点概览 考点01 发酵工程 考点02 细胞工程 考点03 基因工程 地 城 考点01 发酵工程 1．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）海盐非物质文化遗产——沈荡黄酒采用传统工艺古法酿造，以大米和小麦为主要原料，沈荡黄酒含糖分、有机酸、氨基酸、脂类及多种维生素，风味独特。制作流程主要为：制曲→浸米→蒸米→拌曲→入缸发酵→压榨→装瓶。下列叙述错误的是（　　） A．蒸米有利于加速营养物质利用 B．蒸米后立即拌曲可加速发酵进程 C．通过检测酒精浓度等指标监控发酵过程 D．混菌发酵是沈荡黄酒具有独特风味的原因之一 【答案】B 【详解】A、蒸米使淀粉糊化，结构松散，更易被霉菌分泌的淀粉酶分解为葡萄糖，加速后续发酵中营养物质的利用，A正确； B、蒸米后温度过高，立即拌曲会杀死酒曲中的霉菌、酵母菌等微生物，需冷却至适宜温度（如30℃左右）再拌曲，B错误； C、酒精是酵母菌无氧呼吸的产物，其浓度随发酵时间增加而升高，检测酒精浓度可判断发酵进程，C正确； D、混菌发酵（如霉菌分解淀粉、酵母菌产酒精、其他微生物产有机酸或酯类）可形成多样的代谢产物，赋予黄酒独特风味，D正确。 故选B。 2．（24-25高二下·浙江宁波·期末）米曲霉（好氧菌）是我国传统发酵常用菌种之一，它能产生淀粉酶、蛋白酶等。豆酱以黄豆、蚕豆等为原料，通过米曲霉发酵制成。下列叙述错误的是（　　） A．米曲霉能将黄豆、蚕豆中的蛋白质分解成多肽和氨基酸 B．黄豆、蚕豆可提供微生物生长繁殖所需的碳源和氮源 C．传统豆瓣酱制作过程中需要严格灭菌和控制发酵条件 D．传统豆瓣酱制作过程中常需要将下层的酱翻至上层 【答案】C 【详解】A、米曲霉产生的蛋白酶可将蛋白质分解为多肽和氨基酸，符合其代谢特点，A正确； B、黄豆、蚕豆含大量蛋白质（含C、N元素），分解后可为微生物提供碳源和氮源，B正确； C、传统发酵依赖天然菌种，通过控制温度、pH、盐浓度等抑制杂菌，无需严格灭菌，C错误； D、翻动酱料可增加溶氧量，促进好氧的米曲霉繁殖及代谢，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·浙江宁波·期末）丙草胺（C17H26ClNO2）是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。为筛选修复污染土壤的微生物，某研究小组从某地土壤中分离出能有效降解丙草胺的细菌菌株，并对其计数，操作过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．涂布前要检测培养基是否被污染可接种自来水后培养 B．涂布培养的结果表明每克土壤中的菌株数约为1.7×109个 C．该方法的计数结果往往比显微镜直接计数法偏大 D．在选择培养基中添加少量有机碳源以加速丙草胺降解菌的分离 【答案】B 【详解】A、若接种自来水，自来水中本身含有微生物，会干扰检测结果，A错误； B、图中共稀释6次，稀释倍数为106。然后，取0.1mL 涂布，3 个平板菌落数分别为 168、175、167，平均菌落数=(168+175+167)÷3=170 。最后，计算每克土壤中菌株数：170÷0.1×106=1.7×109，B正确； C、稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起，会被统计为一个菌落，导致计数结果比显微镜直接计数的实际活菌数偏少，C错误； D、要筛选能降解丙草胺的细菌，应让丙草胺作为唯一碳源，这样只有能利用丙草胺的细菌才能生长，D错误。 故选B。 4．（24-25高二下·浙江丽水·期末）通常情况下，当培养基中同时含有葡萄糖和乳糖时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，之后再利用乳糖，其生长曲线如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．葡萄糖和乳糖都可作为大肠杆菌的碳源 B．大肠杆菌的种群密度可通过稀释涂布平板法获取 C．大肠杆菌t时生长停滞可能与细胞中缺乏利用乳糖的酶有关 D．大肠杆菌由利用葡萄糖转变为利用乳糖的原因是发生了基因突变 【答案】D 【详解】A、据图可知，大肠杆菌既能利用葡萄糖也能利用乳糖作为生长过程中的碳源，A正确； B、稀释涂布平板法通过将样品进行一系列稀释，然后将稀释后的样品涂布在固体培养基上，培养后每个活的微生物细胞会形成一个可见的菌落。通过计数菌落数，可以推算出原样品中的微生物数量，B正确； C、大肠杆菌在正常条件下无利用乳糖的酶时生长停滞与此相关，C正确； D、大肠杆菌在代谢中利用乳糖做碳源时，由于环境诱导，会产生分解乳糖的半乳糖苷酶，而非基因突变的作用，D错误。 故选D。 5．（24-25高二下·浙江台州·期末）卡拉胶是一种多糖，可被卡拉胶酶降解，在固体培养基中卡拉胶被降解可形成透明圈。科研人员利用腐烂的角叉菜筛选出了高产卡拉胶酶菌株，通过发酵工程生产卡拉胶酶。下列叙述错误的是（　　） A．筛选高产卡拉胶酶菌株应使用以卡拉胶为唯一碳源的选择培养基 B．从腐烂角叉菜中提取菌液后，可用稀释涂布平板法进行菌种分离和纯化 C．应选择透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，扩大培养后用于工业发酵 D．工业发酵产生的发酵液直接经过滤处理获取纯净的卡拉胶酶产物 【答案】D 【分析】刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 【详解】A、选择培养基需以目标菌可利用的物质为唯一碳源，卡拉胶作为唯一碳源可筛选出能分解卡拉胶的菌株，A正确； B、稀释涂布平板法可将菌液中的微生物分散成单个细胞，形成单一菌落，实现菌种分离和纯化，B正确； C、透明圈直径与菌落直径比值越大，说明单位菌落分解卡拉胶的能力越强，符合高产菌株筛选标准，C正确； D、工业发酵产生的发酵液中除了卡拉胶酶，还可能含有其他杂质，直接经过滤处理无法获取纯净的卡拉胶酶产物，还需要进一步的分离和纯化等操作，D错误。 故选D。 6．（24-25高二下·浙江杭州·期末）某家庭利用鲜牛奶和乳酸菌，运用传统发酵技术自制酸奶，其工艺流程为：鲜牛奶高温加热→接种→发酵→冷藏。下列叙述正确的是（    ） A．自制酸奶时需进行严格的无菌操作 B．鲜牛奶高温加热后立即加入乳酸菌 C．发酵前期需通气以利于乳酸菌增殖 D．发酵原料、菌种、温度影响酸奶风味 【答案】D 【详解】A、自制酸奶时无需严格无菌操作，因乳酸菌代谢产酸抑制杂菌，但需保持清洁以减少污染，A错误； B、高温灭菌后需冷却至适宜温度（约40℃）再接种，否则高温会杀死乳酸菌，B错误； C、乳酸菌为异养厌氧型，增殖无需氧气，发酵全程需密闭，C错误； D、原料成分差异、菌种代谢途径不同及温度变化均会影响产物种类，从而改变酸奶风味，D正确。 故选D。 7．（24-25高二下·浙江舟山·期末）螺蛳粉是广西传统小吃，其独特味道主要来源于酸笋。酸笋制作一般依赖传统发酵，某工厂尝试将竹笋高温灭菌后，接种植物乳酸菌发酵，但发酵产物酸味和风味都不如传统发酵。下列叙述正确的是（　　） A．酸笋风味由乳酸菌的种类决定 B．传统发酵时不需要对竹笋灭菌 C．工厂发酵酸味较弱是由于培养液中乳酸菌数量较少 D．高温灭菌破坏了竹笋中的纤维素导致乳酸菌无法利用 【答案】B 【详解】A、酸笋风味不仅由乳酸菌种类决定，还可能与其他微生物及其代谢产物有关，传统发酵中多种微生物共同作用形成独特风味，A错误； B、传统发酵利用的是自然环境中的乳酸菌（包括附着在竹笋表面的菌种），只需清洗处理，无需灭菌，避免杂菌污染主要依赖乳酸菌产生的酸性环境，B正确； C、工厂接种纯种乳酸菌，理论上菌种数量更多，酸味不足可能因灭菌破坏竹笋营养成分或单一菌种代谢效率低，而非数量少，C错误； D、乳酸菌不能直接分解纤维素，其利用的是葡萄糖等单糖，高温灭菌可能使纤维素分解为小分子糖类，反而可能促进乳酸菌利用，D错误。 故选B。 8．（24-25高二下·浙江温州·期末）青霉菌（异养需氧型）处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应，且已知青霉菌菌体生长所需的最适温度为30℃。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列操作与目的存在错误的是（    ） A．发酵液碳源不宜使用葡萄糖——防止青霉素分泌受抑制 B．发酵过程中通入无菌空气——满足青霉菌呼吸需求 C．发酵罐内冷却水全程维持30℃——保持菌体最适生长温度 D．接种前对高产菌株扩大培养——缩短发酵罐内发酵周期 【答案】C 【分析】培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等四类营养物质。配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、pH、O2的要求。 【详解】A、青霉菌在葡萄糖不足时分泌青霉素，若使用葡萄糖作为碳源，初期葡萄糖充足会抑制青霉素分泌，因此改用其他碳源（如乳糖）可避免此抑制，A正确； B、青霉菌为需氧型生物，通入无菌空气可满足其有氧呼吸需求，促进菌体生长和代谢，B正确； C、菌体最适生长温度为30℃，但青霉素的合成可能需在较低温度下进行。若全程维持30℃，虽利于菌体增殖，却可能抑制青霉素的合成效率，C错误； D、扩大培养可增加菌种数量，使发酵罐中菌体快速进入对数生长期，减少延迟期时间，从而缩短发酵周期，D正确。 故选C。 9．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）造纸厂排放的污水中含有大量木质素，易造成环境污染。研究人员欲从土壤中筛选得到能高效分解木质素的菌株，具体过程如下图所示。下列有关叙述错误的是（    ） A．可采集木材场附近的土壤进行筛选 B．操作过程共将土壤稀释了10000倍 C．培养基中除了木质素、水、琼脂外，还含其他物质 D．所用的接种方法是平板划线法 【答案】D 【分析】微生物常见的接种的方法。 ①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落； ②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过梯度稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】A、木材场附近的土壤富含木质素分解菌，可采集木材场附近的土壤进行筛选，A正确； B、10g土壤溶于90ml无菌水被稀释了10倍，三个试管内各自被稀释了10倍，因此图示操作过程共将土壤稀释了10000倍，B正确； C、培养基中除了木质素、水、琼脂外，还含其他物质，如氮源，C正确； D、图中菌落分布均匀，属于稀释涂布平板法接种的，D错误。 故选D。 10．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）二都杨梅味道鲜美，但保质期短不易储存，可利用杨梅发酵制作果酒来延长其食用期限。下列有关杨梅果酒制作的叙述错误的是（    ） A．挑选杨梅时应去除腐烂的杨梅 B．可加入白砂糖提高杨梅酒的酒精度 C．发酵过程中酵母菌数量会不断增加 D．密封性不好可能导致杨梅酒带有酸味 【答案】C 【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；反应中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。 【详解】A、腐烂的杨梅可能含有杂菌，影响发酵过程，去除腐烂杨梅可减少污染，A正确； B、白砂糖（蔗糖）可被分解为葡萄糖和果糖，作为酵母菌的碳源，提高酒精产量，B正确； C、酵母菌在发酵初期（有氧阶段）数量增加，但进入无氧阶段后，因酒精积累和环境恶化，数量会下降，C错误； D、密封不严会导致醋酸菌在有氧条件下将酒精转化为乙酸，使酒变酸，D正确。 故选C。 11．（24-25高二下·浙江温州·期末）下列关于生物技术实践的叙述，错误的是（　　） A．对酵母菌进行涂布分离的时候，用蘸有酒精的涂布器进行涂布 B．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵 C．泡菜的风味与乳酸菌的种类有关 D．酒精发酵旺盛期间，即使含有醋杆菌，也不能将果汁中的糖发酵为醋 【答案】A 【分析】参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。毛酶等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。 【详解】A、涂布分离时，涂布器需在酒精中浸泡，取出后需在火焰上灼烧灭菌，待酒精燃尽并冷却后再涂布。若直接蘸酒精涂布，残留酒精会灼烧菌种或未彻底灭菌，A错误； B、传统发酵（如果酒、泡菜）依赖天然微生物的混合菌群协同作用，B正确； C、不同乳酸菌代谢产物（如乳酸、风味物质）存在差异，直接影响泡菜风味，C正确； D、酒精发酵为无氧条件，而醋杆菌需有氧环境才能将乙醇转为醋酸，且其无法直接利用糖类产酸，D正确。 故选A。 12．（24-25高二下·浙江金华·期末）某同学尝试利用苹果发酵制作苹果醋，基本过程如下图。下列叙述正确的是（    ） A．参与①②过程的发酵菌种均有成型细胞核 B．①②过程中发酵液pH均有所下降 C．过程①②均需灭菌操作 D．过程①②均需要排气 【答案】B 【分析】图中①为酒精发酵，主要菌种为酵母菌；②为醋酸发酵，主要菌种是醋酸菌。 【详解】A、过程①的发酵菌种是酵母菌，真核生物，有细胞核，过程②的发酵菌种是醋酸菌，原核生物，无细胞核，A错误； B、①过程中产生CO2，②过程中产生醋酸，发酵液pH均有所下降，B正确； C、家庭果醋发酵过程中，①②均不需要灭菌操作，C错误； D、过程①需要排气（呼吸作用产生的二氧化碳），②需要提供氧气（无菌氧气），D错误。 故选B。 13．（24-25高二下·浙江衢州·期末）豆豉由黑豆或黄豆通过霉菌发酵制成，是中国传统特色发酵制品，其制作流程如下:选材→浸泡→蒸煮→加曲→前期发酵→调味→后期发酵(装坛)。下列叙述错误的是（    ） A．蒸煮可使组织软化、蛋白质变性，易于被霉菌利用 B．蒸煮具有一定的杀菌作用，蒸煮后需立即加曲搅拌 C．前期发酵过程中需要控制适宜温度，且要适时翻动 D．调味时添加的盐、白酒可发挥抑制杂菌生长的作用 【答案】B 【分析】参与腐乳制作的微生物主要是毛霉，其新陈代谢类型是异养需氧型。腐乳制作的原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。 【详解】A 、蒸煮可以破坏豆类的组织结构，使其软化，同时使蛋白质变性，这样的变化有利于霉菌对营养物质的吸收和利用，A 正确； B、蒸煮后需要冷却到适宜温度再加曲搅拌。如果立即加曲，高温会杀死曲中的菌种，影响发酵过程，B 错误； C、前期发酵过程中，适宜的温度有利于霉菌的生长和代谢，适时翻动可以保证氧气的供应，促进霉菌的有氧呼吸，C 正确； D、调味时添加的盐和白酒都具有抑制杂菌生长的作用，能够防止杂菌污染，保证豆豉发酵的正常进行，D 正确。 故选B。 地 城 考点02 细胞工程 1．（24-25高二下·浙江丽水·期末）某研究小组对三角梅的组培快速繁殖进行了研究，结果如表所示。 流程 最佳措施或最佳培养基 ①外植体的消毒 200mg/L的必洁仕 ②不定芽的诱导 MS+1.0 mg/L6-BA+0.1mg/LNAA ③不定芽的增殖 MS+2.0 mg/L6-BA+0.1mg/LNAA ④不定芽的生根 1/2MS+2.0mg/LIAA 注：不定芽是由茎段切口间接分化出的芽；1/2MS是将大量元素、微量元素和有机成分的浓度减半的MS培养基。 下列叙述错误的是（　　） A．流程①需考虑必洁仕的浓度和处理时间 B．与流程②相比，流程③高浓度的6-BA有利于不定芽的增殖培养 C．与流程③相比，流程④适当降低培养基浓度有利于不定芽的生根 D．整个实验的组培过程没有经历脱分化形成愈伤组织阶段 【答案】D 【详解】A、外植体消毒需选择合适的消毒剂浓度和处理时间，避免过度损伤细胞，200mg/L必洁仕的使用需考虑这两点，A正确； B、流程③中6-BA浓度由1.0mg/L增至2.0mg/L，细胞分裂素（6-BA）比例升高，更有利于芽的增殖，B正确； C、流程④使用1/2MS培养基（大量元素、微量元素和有机成分减半），适当降低浓度可减少无机盐对生根的抑制，促进不定芽生根，C正确； D、不定芽由茎段切口“间接分化”形成，说明需先脱分化形成愈伤组织，再分化出芽，因此实验中存在脱分化阶段，D错误。 故选D。 2．（24-25高二下·浙江宁波·期末）花椰菜（2n=18）是人们喜爱的蔬菜，种植时容易遭受病菌侵害，紫罗兰（2n=14）具有一定的抗病性。科研人员分别取紫罗兰叶肉细胞和花椰菜胚轴细胞，利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜-紫罗兰杂种植株，如图所示，其中①、②分别表示去除细胞壁、人工诱导融合过程。下列叙述正确的是（　　） A．①过程处理后获得原生质层 B．②过程仅获得一种融合细胞 C．取植物的胚轴细胞进行培育，有利于获得抗毒苗 D．培育花椰菜-紫罗兰杂种植株，体现了细胞膜的流动性和植物细胞的全能性 【答案】D 【详解】A、①过程为“去除细胞壁”，植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，需用纤维素酶和果胶酶处理。去除细胞壁后获得的是原生质体（细胞去除细胞壁后的结构），A错误； B、②过程为“人工诱导融合”。细胞融合时，融合的细胞类型包括：花椰菜细胞自身融合、紫罗兰细胞自身融合、花椰菜细胞与紫罗兰细胞相互融合，B错误； C、取植物的胚轴细胞进行培育，有利于获得无毒苗，但其不具有抗毒性，C错误； D、②过程“人工诱导融合”依赖细胞膜的流动性（细胞膜融合时，膜的结构特性——流动性是基础）；融合后的杂种细胞需通过植物组织培养培育成杂种植株，而植物组织培养的原理是“植物细胞的全能性”（已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能），D正确。 故选D。 3．（24-25高二下·浙江温州·期末）驱蚊草含有香茅醛，能散发出一种特殊的柠檬型香气，从而达到驱蚊且对人体无害的效果。驱蚊草是把天竺葵的原生质体和香茅草的原生质体进行诱导融合后培育而成的。下列关于驱蚊草培育的叙述，正确的是（    ） A．可使用PEG诱导融合的原理是PEG能使细胞膜发生一定程度的损伤实现相互粘连而融合 B．虽然该方法克服了远缘杂交不亲和的障碍，但利用该方法培育的驱蚊草是高度不育的 C．制备原生质体时，需在较高渗透压的溶液中使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶处理细胞 D．植物体细胞杂交完成的标志是杂种细胞细胞壁的再生 【答案】A 【分析】植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株。在进行植物体细胞杂交时需要使用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁，使用化学方法（聚乙二醇）或物理方法诱导原生质体融合，不能用灭活的病毒诱导。 【详解】A、在化学试剂PEG的诱导下，两种原生质体的细胞膜会发生一定程度的损伤，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞相互粘连而融合在一起，A正确； B、植物体细胞杂交技术克服了远缘杂交不亲和的障碍，驱蚊草是把天竺葵的原生质体和香茅草的原生质体进行诱导融合后培育而成的，假如天竺葵和香茅草均为二倍体，则驱蚊草为异源四倍体，理论上可减数分裂产生配子，因此利用上述方法培育的驱蚊草是可育的，B错误； C、制备原生质体需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，胰蛋白酶和胶原蛋白酶用于动物细胞处理，C错误； D、植物体细胞杂交时，杂种细胞融合完成的标志是再生出新的细胞壁，而植物体细胞杂交的最终目的是获得杂种植株，D错误。 故选A。 4．（24-25高二下·浙江宁波·期末）油菜（2n=20）与黑芥（2n=16）杂交，得到的子代再经染色体数加倍形成芥菜（4n=36），图为培育过程中检测到的亲代和子代部分细胞相关数据，a-f代表不同种类的细胞。下列叙述错误的是（　　） A．a一定为黑芥的生殖细胞 B．同源染色体的分离不可能发生在f中 C．e中可能存在交叉互换现象 D．若用体细胞杂交技术培育芥菜，需选择c和d 【答案】C 【分析】图示分析，a为黑芥产生的生殖细胞，b是油菜产生的生殖细胞，c是黑芥的体细胞，d是油菜的体细胞，e是芥菜体细胞，f是油菜细胞处于有丝后期。 【详解】A、由图可知，a细胞中有点个1染色体组、8条染色体，是黑芥（2n=16）细胞中染色体的一半，因此a一定是黑芥的生殖细胞，A正确； B、f染色体组数是4，核DNA数为40，应该是处于有丝分裂后期的油菜细胞，同源染色体的分离发生在减数分裂过程中，B正确； C、e染色体组数是4，核DNA数为36，应该是芥菜体细胞，交叉互换现象发生在减数分裂过程中，C错误； D、a是黑芥产生的生殖细胞，c是黑芥的体细胞，d是油菜的体细胞，若用体细胞杂交技术培育芥菜，需选择c和d，D正确。 故选C。 5．（24-25高二下·浙江台州·期末）为培育“高产耐盐碱”的水稻植株，某研究小组利用植物体细胞杂交技术设计了如下实验流程图。已知耐盐、高产性状分别受细胞质基因和细胞核基因控制，下列叙述正确的是（　　） A．去壁处理在较低浓度甘露醇溶液中进行 B．失活处理目的是促使A1的细胞质和B1的细胞核失活 C．过程①可以细胞颜色差异为标记判断细胞融合情况 D．过程②获取的再生植株一定能表现出耐盐、高产的优良性状 【答案】C 【分析】植物体细胞杂交技术： （1）植物体细胞杂交技术：是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。 （2）过程：①诱导融合的方法：物理法；化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂；②细胞融合完成的标志是新的细胞壁的生成；③植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束；④杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征，原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。 （3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 【详解】A、用纤维素酶和果胶酶混合液酶解细胞壁获取原生质体时应置于较高渗透压甘露醇溶液中（或等渗甘露醇溶液）进行，可防止原生质体吸水涨破，A错误； B、失活处理的目的是促使原生质体A1的细胞核失活和原生质体B1的细胞质失活，这样才能使杂种细胞含有耐盐植株的细胞质（含耐盐基因）和高产植株的细胞核（含高产基因），B错误； C、由于叶绿体有颜色且有特定结构，①过程的细胞融合中可通过观察原生质体的结构与颜色来判断其融合情况，C正确； D、由于基因的选择性表达以及基因间的相互作用等原因，通过植物体细胞杂交获得的杂种植株不一定都能表现出耐盐、高产的优良性状，D错误。 故选C。 6．（24-25高二下·浙江温州·期末）植物细胞工程作为一门新兴的生物技术，已经普遍应用于社会生产，下列叙述正确的是（　　） A．利用发酵罐大规模培养红豆杉细胞生产紫杉醇 B．利用花药离体培养得到二倍体或多倍体植株 C．利用杂交育种培育“番茄-马铃薯”杂种植株 D．利用茎尖进行植物组织培养可以获得抗病毒植株 【答案】A 【分析】植物组织培养的过程为：离体的植物组织，器官或细胞经过脱分化（避光）形成愈伤组织；愈伤组织经过再分化（需光）过程形成胚状体，进一步发育形成植株。 【详解】A、植物细胞工程中，利用植物细胞培养技术，可将红豆杉细胞放在发酵罐中大规模培养，这些细胞能产生紫杉醇，这是植物细胞工程在生产中的应用，A正确； B、花药离体培养得到的是单倍体植株（由配子发育而来），需要经过秋水仙素处理等才能得到二倍体或多倍体植株，B错误； C、“番茄-马铃薯” 杂种植株是利用植物体细胞杂交技术培育的，不是杂交育种（杂交育种是不同品种间杂交，原理是基因重组，难以克服远缘杂交不亲和障碍） ，C错误； D、茎尖细胞一般不带病毒（病毒在植物体内分布不均匀，茎尖分生区病毒少），利用茎尖进行植物组织培养可以获得脱毒植株，但不是抗病毒植株（脱毒是去除病毒，抗病毒是植株能抵抗病毒侵染，原理不同） ，D错误。 故选A。 7．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）市场对锦斑化等变异多肉植物的需求日益增长，对叶组织采取植物组织培养快速繁殖变异多肉植株应运而生。下列有关叙述错误的是（    ） A．利用植物组培有利于保持亲代的优良性状 B．外植体的消毒是植物组培成功的关键之一 C．愈伤组织的诱导形成过程中会逐渐失去叶绿素 D．炼苗阶段需选择营养丰富的基质 【答案】D 【分析】植物组织培养技术： 1、过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）→愈伤组织→胚状体→植株； 2、原理：植物细胞的全能性； 3、条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】A、植物组织培养属于无性生殖，后代遗传物质与亲代一致，可保持亲代优良性状，A正确； B、外植体消毒可减少微生物污染，是组培成功的重要环节，B正确； C、愈伤组织是脱分化形成的未分化细胞团，原有叶组织细胞的叶绿体退化，叶绿素逐渐消失，C正确； D、炼苗阶段需逐步适应自然环境，基质应透气、排水良好，而非营养丰富，否则易导致烂苗，D错误。 故选D。 8．（24-25高二下·浙江衢州·期末）半夏是中国常用中药材之一。获得大量半夏植株的传统方式是利用固体培养基进行快速繁殖(如图)，研究人员利用“间歇浸没反应器”(可预设浸没频率、持续时间，使培养基间歇性地浸没植物组织器官)快速繁殖半夏。下列叙述错误的是（    ） A．外植体接种前可依次用75%乙醇、10%次氯酸钠进行消毒 B．与传统快繁相比，间歇浸没培养可改善气体交换、促进物质运输 C．与步骤②相比，步骤③中细胞分裂素类与生长素类物质的比值更大 D．步骤④过程的措施包括炼苗、培养基质灭菌、清洗苗根部、栽种等 【答案】C 【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。 【详解】A、外植体消毒可先用75%乙醇消毒30s，无菌水清洗2～3次后，再用10%次氯酸钠溶液处理30min，A正确； B、与传统快繁相比，间歇浸没培养可改善气体交换，促进呼吸作用，促进物质运输，B正确； C、与步骤②诱导生芽相比，步骤③诱导生根中细胞分裂素类与生长素类物质的比值小，C错误； D、应将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。故③过程的措施有炼苗、清洗苗根部、栽培基质灭菌等，D正确。 故选C。 9．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）针对某病原体的单克隆抗体制备流程如图1。鼠源抗体的结构如图2，其中5区可与抗原特异性结合，6区可引起人体免疫反应。下列叙述错误的是（　　） A．对小鼠多次注射某病原体后，只有一种B淋巴细胞被激活 B．经选择培养1获得能增殖的杂交瘤细胞 C．经选择培养2获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 D．若图2的单克隆抗体6区为人源抗体片段，可降低免疫排斥 【答案】A 【详解】A、某病原体通常含有多种抗原决定簇，对小鼠多次注射后，会激活多种针对不同抗原决定簇的 B淋巴细胞，而非仅一种，A错误； B、选择培养1可淘汰未融合的亲本细胞、B-B融合细胞和瘤-瘤融合细胞，保留能增殖的杂交瘤细胞，B正确； C、选择培养2通过抗原 - 抗体杂交等方法，从杂交瘤细胞中筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，C正确； D、鼠源抗体的6区可引起人体免疫反应，若替换为人源片段，可降低这种排斥反应，D正确。 故选A。 10．（24-25高二下·浙江杭州·期末）花椰菜（2n=18）经济价值高，但易受病害影响。黑芥（2n=16）具有抗黑腐病基因。利用植物体细胞杂交技术，将花椰菜与黑芥的细胞融合，以培育抗黑腐病的花椰菜。下列叙述正确的是（    ） A．原生质体融合前需胰蛋白酶处理细胞壁 B．培育抗黑腐病的花椰菜不需要植物组织培养技术 C．培育抗黑腐病的花椰菜打破了生殖隔离的限制 D．获得抗黑腐病的花椰菜体细胞染色体数都为17 【答案】C 【详解】A、胰蛋白酶用于分解动物细胞间的蛋白质，而植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，需用纤维素酶和果胶酶处理，A错误； B、体细胞杂交后的杂种细胞需通过植物组织培养技术才能发育成完整植株，B错误； C、植物体细胞杂交技术可克服远缘杂交不亲和的障碍，使不同物种的遗传物质结合，打破生殖隔离的限制，C正确； D、花椰菜（2n=18）和黑芥（2n=16）的原生质体融合后，杂种细胞的染色体数为18+16=34条，D错误。 故选C。 11．（24-25高二下·浙江丽水·期末）肿瘤细胞膜上的PD-L1蛋白与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞活化，发生免疫逃逸现象。为阻断该信号传递，某科研小组利用小鼠制备了抗PD-L1单克隆抗体，其流程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．取注射过PD-1小鼠的脾脏分离B淋巴细胞 B．杂交瘤细胞在选择培养基中不能生长、存活 C．对杂交瘤细胞逐步稀释使每孔有少数几个细胞 D．检测呈阳性的a中细胞是符合要求的连续细胞株 【答案】D 【详解】A、制备抗PD-L1单克隆抗体所需要的B淋巴细胞应取自注射过PD-L1小鼠的脾脏，A错误； B、杂交瘤细胞的培养需要选择培养基，该培养基只允许融合的细胞生长，B错误； C、将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间(30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞)，C错误； D、抗体检测阳性表明这些细胞能够产生所需抗体，说明细胞是符合要求的连续细胞株，D正确。 故选D。 12．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）为增加产奶量高的奶牛数量，进行了“试管牛”培育，过程如图。下列叙述正确的是（　　） A．“试管牛”培育的原理是成体的体细胞具有全能性 B．需对良种母牛和良种公牛进行同期发情处理 C．精子采集后不能进行体外培养，应尽快用于体外受精 D．可取囊胚期的滋养层细胞进行性别鉴定 【答案】D 【详解】A、试管牛培育的核心技术是体外受精和胚胎移植，其原理是有性生殖过程中基因的重组，A错误； B、受体母牛需与供体母牛同期发情处理，以保证胚胎移植后正常发育，B错误； C、精子采集后，需在体外进行获能处理，才能在体外完成受精过程，C错误； D、胚胎移植前，可取囊胚的滋养层细胞进行性别鉴定，滋养层细胞未来形成胎膜和胎盘，这样既不影响内细胞团发育又不会损伤胚胎，D正确。 故选D。 13．（24-25高二下·浙江宁波·期末）人体心肌细胞中组成肌钙蛋白的亚基cTnI在血液中含量上升是心肌损伤的特异性指标。下图为制备抗cTnI的单克隆抗体的示意图。下列叙述正确的是（　　） A．动物细胞培养应在含5%CO2和95%O2的混合气体的恒温培养箱中进行 B．可在培养基中添加抗生素以防止有害代谢物的积累 C．用cTnI多次免疫小鼠可产生更多能产生特异性抗体的B淋巴细胞 D．甲、乙、丙中，只含杂交瘤细胞的是丙 【答案】C 【分析】单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞；第二次筛选：利用多孔板法和抗原—抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】A、动物细胞培养时，为了满足动物细胞对营养的需求，培养液中通常加入血清或血浆等天然成分，将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体环境中进行培养，CO2的主要作用是维持培养液的pH，A错误； B、为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素；为了防止有害代谢物的积累，可采用定期更换培养液的方法，以便清除代谢物，B错误； C、为了提高淋巴细胞的免疫能力，刺激小鼠机体产生更多的免疫细胞和抗体，一般通过多次注射相应抗原实现，C正确； D、由图可知：杂交瘤细胞需要对甲筛选，因此乙和丙应该都含杂交瘤细胞，D错误。 故选C。 14．（24-25高二下·浙江杭州·期末）某科研团队为去除某种单克隆抗体粗提液中的硫酸铵，将其加入密封透析袋中，置于主要成分为磷酸氢二钠等无机盐的PBS缓冲液中透析24h，期间多次更换PBS缓冲液。透析袋膜是一种允许离子自由通过的半透膜。下列叙述正确的是（    ） A．该单克隆抗体可自由通过透析袋膜 B．透析袋膜与质膜的透过性完全相同 C．多次更换PBS缓冲液可缩短实验时间 D．透析后的单克隆抗体溶液不含无机盐 【答案】C 【详解】A、单克隆抗体属于大分子蛋白质，无法通过半透膜（透析袋膜），仅小分子物质（如硫酸铵中的离子）可自由通过，A错误； B、透析袋膜仅允许小分子被动扩散，而质膜具有选择透过性且存在主动运输等机制，两者透过性不同，B错误； C、多次更换PBS缓冲液可维持袋内外硫酸铵的浓度梯度，加快离子扩散速率，从而缩短透析时间，C正确； D、PBS缓冲液本身含磷酸氢二钠等无机盐，透析后袋内外无机盐浓度会达到平衡，因此袋内仍含无机盐，D错误。 故选C。 15．（24-25高二下·浙江舟山·期末）人正常乳腺细胞和人乳腺癌细胞有部分相同的膜蛋白。科研人员通过以下过程获得能特异性识别乳腺癌细胞的靶向药物，下列说法错误的是（　　） A．两组小鼠注射的抗原种类不同 B．①中抗体类型不同，②中抗体类型相同 C．利用CO2培养箱对杂交瘤细胞进行扩大培养 D．该单克隆抗体可特异性杀死乳腺癌细胞 【答案】D 【分析】本题从人正常乳腺细胞和人乳腺癌细胞的实例入手，考查单克隆抗体的制备及应用，需分析各选项与流程及原理的匹配性。 【详解】A、一组小鼠注射人正常乳腺细胞膜蛋白，另一组注射人乳腺癌细胞膜蛋白，抗原种类不同，A 正确； B、①是不同 B 细胞产生的抗体，类型不同；②是杂交瘤细胞产生的抗体，类型相同，B 正确 ； C、杂交瘤细胞培养需CO2培养箱维持适宜环境，C 正确 ； D、单克隆抗体可特异性识别乳腺癌细胞，但不能直接杀死，需借助药物等发挥作用，D 错误 。 故选D。 16．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）科研人员以牛耳成纤维细胞成功克隆了高产奶牛，这为培育和繁殖优质种畜提供了新的思路，实验过程涉及核移植与胚胎移植两项核心技术。下列叙述错误的是（    ） A．该操作所需的卵母细胞可通过超数排卵获得 B．常利用电刺激激活重组细胞的分裂和发育 C．体外培养至原肠胚可提高胚胎着床的成功率 D．胚胎移植前需对代孕母牛进行同期发情处理 【答案】C 【详解】A、超数排卵技术通过注射促性腺激素促使母牛排出更多卵母细胞，A正确； B、核移植后需通过电刺激、化学诱导等方法激活重组细胞，使其恢复分裂和发育能力，B正确； C、胚胎移植通常在桑葚胚或囊胚阶段进行，原肠胚已开始分化且体积增大，无法用于移植，C错误； D、胚胎移植前需对代孕母牛进行同期发情处理，使其生理状态与供体一致，确保胚胎正常发育，D正确。 故选C。 17．（24-25高二下·浙江杭州·期末）研究者设计了利用植物细胞工程技术培育抗病柑橘的操作流程，如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．过程②中应将愈伤组织置于较低渗透压的溶液中 B．将过程③中X射线处理对象换成植株或器官，诱变频率降低 C．通过观察原生质体能否发生质壁分离可判断其是否具有活性 D．通过过程④获得的抗病柑橘均可通过有性生殖稳定遗传 【答案】B 【详解】A、原生质体无细胞壁，低渗溶液会使其吸水涨破，过程②应在等渗溶液中，A 错误； B、植株或器官细胞分裂不如原生质体旺盛，诱变频率降低，B 正确； C、原生质体无细胞壁，不能发生质壁分离，C 错误； D、过程④获得的抗病柑橘可能是杂合子，有性生殖不一定稳定遗传，D 错误。 故选B。 18．（24-25高二下·浙江温州·期末）通过培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时，下列进行的细胞培养相关操作，错误的是（　　） A．细胞培养液中添加的血清可采用过滤方式除菌 B．采用封闭式培养有利于培养液pH保持相对稳定 C．仙台病毒处理可使细胞膜发生一定程度的损伤，进而促进细胞融合 D．须筛选出抗原-抗体反应较灵敏的杂交瘤细胞株继续培养 【答案】B 【分析】制备单克隆抗体的流程为：①向小鼠体内注射特定的抗原，使其发生免疫，然后从小鼠脾内获得能产生特定抗体的B淋巴细胞。②将小鼠的骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞。③克隆化培养和抗体检测，从而筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。④将最终筛选出的杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠的腹水中提取单克隆抗体。 【详解】A、血清含有多种营养成分，高温灭菌会破坏其活性成分，通常采用过滤除菌（如0.22μm滤膜），A正确； B、封闭式培养会限制气体交换，细胞呼吸产生的CO₂积累导致培养液pH下降，而培养基中的缓冲系统（如碳酸氢盐）需在特定CO₂浓度（如5%）下调节pH，封闭环境无法维持此条件，B错误； C、仙台病毒可破坏细胞膜表面结构，促进细胞膜融合，是诱导动物细胞融合的常用方法，C正确； D、第二次筛选需通过抗原-抗体特异性结合检测，选择能分泌高灵敏度抗体的杂交瘤细胞株，D正确。 故选B。 19．（24-25高二下·浙江金华·期末）利用胚胎工程等技术可以提高奶牛的繁殖速度，如图表示繁育良种奶牛的流程。下列叙述错误的是（    ） A．体外受精获得的多个受精卵遗传物质一般不同 B．早期胚胎培养的培养液中需加入灭菌的血清 C．①过程涉及胚胎分割技术，提高了移植胚胎的成活率 D．②过程涉及胚胎移植技术，此技术是胚胎工程获得后代的唯一方法 【答案】C 【分析】胚胎工程指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术；经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内产生后代，以满足人类的各种需求。 【详解】A、由于在减数分裂过程中发生了基因重组，所以产生的精子和卵细胞均有多种基因型，导致体外受精获得的多个受精卵遗传物质一般不同，A正确； B、早期胚胎培养的培养液中需加入经过滤灭菌血清，B正确； C、①过程为胚胎分割，其提高了繁殖率，但不能提高胚胎的成活率，C错误； D、②过程涉及胚胎移植技术，此技术是胚胎工程获得后代的唯一方法，即必须将胚胎移植到同情发情处理的雌性动物子宫进行进一步发育，D正确。 故选C。 20．（24-25高二下·浙江台州·期末）研究人员利用体外受精和胚胎移植快速繁育优良种牛。下列叙述错误的是（　　） A．体外受精前，精子需处理以获得受精所需的能量 B．体外受精前，需对供体母牛进行超数排卵处理 C．胚胎移植前，可取滋养层细胞进行胚胎性别鉴定 D．胚胎移植前，需要对受体母牛进行同期发情处理 【答案】A 【分析】胚胎工程指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术，经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内产生后代，以满足人类的各种需求。 【详解】A、精子在体外受精前需进行获能处理，其目的是解除精子的去能因子，使其具备穿透卵子的能力，而非“获得受精所需的能量”，A错误； B、超数排卵处理通过注射促性腺激素促使供体母牛排出更多卵母细胞，这是体外受精的必要步骤，B正确； C、滋养层细胞是胚胎外层结构，未来形成胎膜和胎盘，取此部分细胞进行性别鉴定不会损伤胚胎，C正确； D、受体母牛需与供体生理状态同步（同期发情处理），以保证胚胎移植后正常发育，D正确。 故选A。 21．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）人心肌肌钙蛋白T（cTnT）是心肌受损的血清标志物。为提高心肌损伤的诊断速度，研究人员利用细胞融合技术建立了特异性分泌抗cTnT抗体的杂交瘤细胞株，具体过程如下图所示。下列叙述错误的是（    ） A．骨髓瘤细胞不能在HAT培养基上生存 B．过程①、②均需在CO2培养箱中进行 C．过程②利用抗原-抗体特异性结合的原理 D．需用cTnT刺激细胞株分泌单克隆抗体 【答案】D 【分析】整体流程利用细胞融合技术和选择性培养，把 B 淋巴细胞产生特异性抗体的能力与骨髓瘤细胞无限增殖能力结合，最终获得单克隆抗体，单克隆抗体因特异性强、纯度高、可大量制备等优点，在疾病诊断（如检测 cTnT 辅助诊断心肌损伤） 、治疗等领域应用广泛。 【详解】A、骨髓瘤细胞缺乏特定的酶，无法利用 HAT 培养基中的原料合成 DNA，不能在 HAT 培养基上生存，A正确； B、过程①（细胞融合及筛选 ）、②（杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体检测等 ）均需要适宜的气体环境，通常在CO2培养箱中进行，CO2可维持培养液的 pH ，B正确； C、过程②要筛选出能分泌抗 cTnT 抗体的杂交瘤细胞株，可利用抗原 - 抗体特异性结合的原理，如用 cTnT（抗原 ）检测杂交瘤细胞分泌的抗体是否为所需的抗 cTnT 抗体 ，C正确； D、杂交瘤细胞株能自主、持续分泌单克隆抗体，不需要再用 cTnT 刺激 ，D错误。 故选D。 22．（24-25高二下·浙江温州·期末）CD20是淋巴细胞的特异性膜蛋白之一，研究者设计如下图所示的技术流程制备抗CD20的单克隆抗体。下列叙述正确的是（　　） A．注射抗原后，甲细胞直接分化为浆细胞 B．经过步骤B后的细胞类型只有三种 C．细胞丁可在CO2培养箱中培养，也能冻存 【答案】C 【分析】单克隆抗体的制备：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞，将多种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合，利用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。 【详解】A、甲细胞需要在抗原刺激以及辅助性T细胞表面特定分子发生变化并与甲细胞结合这两个共同信号的刺激下才能增殖分化为浆细胞，A错误； B、经过步骤 B（细胞融合）后的细胞类型有未融合的 B 淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B 淋巴细胞 - B 淋巴细胞融合细胞、骨髓瘤细胞 - 骨髓瘤细胞融合细胞、B 淋巴细胞 - 骨髓瘤细胞融合细胞（杂交瘤细胞），不止三种，B错误； C、细胞丁（能产生特异性抗体的杂交瘤细胞）可在CO2培养箱中进行体外培养，也能冻存，C正确； D、筛选得到的细胞丙中可能存在一些产生其他抗体的细胞，只有经过进一步筛选得到的能稳定产生抗 CD20 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞才能用来生产抗 CD20 蛋白的单克隆抗体，D错误。 故选C。 地 城 考点03 基因工程 一、单选题 1．（24-25高二下·浙江金华·期末）某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．过程①加入的研磨液中含抑制DNA酶活性的物质 B．过程②④过滤后分别取滤渣和滤液进行后续操作 C．过程⑤加入酒精析出白色絮状物后进行后续操作 D．过程⑥中需加入NaCl溶液重新溶解DNA后进行后续操作 【答案】B 【分析】DNA粗提取：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，选择适当的盐浓度能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 【详解】A、过程①破碎细胞时加入的研磨液中含抑制 DNA 酶活性的物质，目的是防止 DNA 被 DNA 酶分解，A正确； B、过程②过滤后，DNA存在于滤液中，应取滤液进行后续操作，过程④过滤后，DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，也是取滤液进行后续操作，B错误； C、过程⑤加入酒精，由于DNA不溶于酒精，会析出白色絮状物，然后进行后续操作，C正确； D、过程⑥鉴定DNA 时，需加入NaCl溶液重新溶解DNA，然后加入鉴定试剂进行后续操作，D正确。 故选B。 2．（24-25高二下·浙江丽水·期末）囊性纤维病是一种常染色体隐性遗传病，利用带有荧光标记的DNA探针进行基因诊断。甲、乙、丙三个样本个体的诊断结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．探针诊断的原理是利用碱基互补对原则 B．根据检测结果可判定甲乙正常，丙患病 C．据结果推测囊性纤维病涉及多个复等位基因 D．若乙和丙婚配生出一男孩，正常概率为1/4 【答案】D 【详解】A、据题干信息可知，带有荧光标记的DNA探针能与待测样本中互补的DNA序列结合，通过检测荧光来确定是否存在相应的基因，故探针诊断的原理是利用碱基互补配对原则，A正确； B、由题干信息和图像 综合分析可知，囊性纤维化为常染色体隐性遗传病，若正常基因用A表示，则图中1~10对应 的致病基因可表示为a1~a10，甲的基因型为AA，表型正常，乙的基因型为Aa4，为杂合子， 表型正常，丙有两个突变基因a2a5，为患者，B正确； C、从图中可以看出，与丙个体杂交呈阳性的探针有多个，且这些探针含该基因的不同位点突变的基因，说明囊性纤维病涉及多个复等位基因，C正确； D、乙基因型为Aa4， 丙基因型为a2a5，两者婚配，Aa4×a2a5→1/4Aa2、1/4Aa5、1/4a4a2、1/4a4a5，生出男孩正常的 概率为（1/4+1/4）=1/2，D错误。 故选D。 （24-25高二下·浙江宁波·期末）2025年5月全球首例个性化CRISPR基因编辑疗法成功应用于一名患有罕见病的婴儿，通过静脉滴注，脂质纳米粒（LNP）包裹的CRISPR/Cas9药液进入婴儿体内并被肝脏细胞吸收，精准地修复一个关键基因的缺陷，从而改善病症。阅读材料完成下列小题： 3．下图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中sgRNA（向导RNA）可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的靶位点。下列有关说法正确的是（　　） A．Cas9蛋白可识别并切割特定的脱氧核苷酸序列 B．上图B基因的编辑属于基因突变，编辑后可以通过DNA分子杂交技术进行检测 C．sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 D．该技术可通过对人类胚胎基因的定向改造来预防某些疾病的发生 4．脂质纳米颗粒（LNP）是临床认可的非病毒核酸传输系统。研究人员使用Cas9mRNA替代Cas9DNA，并对其和sgRNA进行修饰，再用脂质封装Cas9mRNA和sgRNA。下列有关叙述错误的是（　　） A．脂质体与靶细胞的融合体现了膜的选择透过性 B．RNA包裹在LNP颗粒中可避免人体RNA酶的水解 C．选择Cas9mRNA而非Cas9DNA的优点之一是起效快 D．研究者在LNP表面包被特异性抗体，可实现肝细胞的靶向性递送 【答案】3．B 4．A 【分析】CRISPR/Cas9编辑系统中，sgRNA起导向作用，Cas9起切割作用。 3．A、Cas9蛋白不能识别特定脱氧核苷酸序列，A错误； B、上述对B基因的编辑过程减少了若干个碱基对，属于基因突变，可以通过DNA分子杂交对编辑后的DNA进行检测，B正确； C、一般sgRNA序列越短，脱靶率越高，C错误； D、对胚胎进行基因编辑涉及伦理问题，不能对胚胎直接进行基因编辑，D错误。 故选B。 4．A、脂质体与靶细胞的融合体现了膜具有一定的流动性，A错误； B、RNA包裹在LNP颗粒中可避免人体RNA酶的水解，有利于RNA发挥作用，B正确； C、选择Cas9mRNA而非Cas9DNA的优点之一是起效快，Cas9mRNA可以直接翻译产生Cas9蛋白，Cas9DNA需要经过转录翻译才能合成Cas9蛋白，C正确； D、研究者在LNP表面包被特异性抗体，通过抗原抗体的特异性结合，可实现肝细胞的靶向性递送，D正确。 故选A。 5．（24-25高二下·浙江杭州·期末）剔除转基因生物中的标记基因，可减少生物安全问题带来的疑虑。下图是利用双T-DNA表达载体系统培育无标记基因转基因大豆的基本流程。下列叙述错误的是（    ） 注：D6D为目的基因，bar为标记基因；两个T-DNA片段随机插入大豆细胞染色体中，每个片段只插入一次，且不考虑基因突变、染色体畸变和交叉互换等。 A．该双T-DNA表达载体中既包含复制起点，又包含适当的转录和翻译信号 B．若两个T-DNA插入同一条染色体中，通过自交无法筛选出符合要求的植株 C．若两个T-DNA插入同源染色体中，则F1中含D6D不含bar的植株占1/4 D．若两个T-DNA插入非同源染色体中，则F1中含D6D不含bar的植株占3/8 【答案】D 【详解】A、表达载体需复制起点（自主复制 ）、转录和翻译信号（表达目的基因 ），A 正确； B、若两 T - DNA 插入同一条染色体，则目的基因和标记基因连锁在一起，自交后代不可能出现含 D6D 不含 bar 的植株（基因分离 ），B 正确； C、两 T - DNA 插入同源染色体，设为 A、a 染色体，大豆基因型为 Aa（A 含 D6D 和 bar，a 不含 ），自交后含 D6D 不含 bar 的植株占 1/4，C 正确； D、两 T - DNA 插入非同源染色体，设为 A、B 染色体，大豆基因型为 AaBb（A、B 含 D6D 和 bar ），自交后含 D6D 不含 bar 的植株占 3/16，D 错误。 故选D。 6．（24-25高二下·浙江杭州·期末）PYL9基因是一种重要的脱落酸受体基因。科学家通过基因工程使番茄中原有的PYL9基因过量表达。实验发现，与普通番茄相比，这种转基因番茄抗旱性更强。下列分析合理的是（    ） A．PYL9基因存在于野生型和转基因番茄中 B．PYL9基因过量表达使番茄对脱落酸敏感度下降 C．PYL9基因过量表达促进了番茄气孔开放 D．PYL9基因过量表达增强抗旱性是偶然现象 【答案】A 【详解】A、PYL9基因是番茄本身存在的基因，转基因操作使其过量表达，因此野生型和转基因番茄中均含有该基因，A正确； B、PYL9基因编码脱落酸受体，过量表达会增加受体数量，增强对脱落酸的敏感度，B错误； C、脱落酸通过促进气孔关闭减少水分流失，PYL9过量表达会加强这一作用，导致气孔关闭，C错误； D、基因过量表达是人为设计的实验，抗旱性增强是预期结果，并非偶然现象，D错误。 故选A。 7．（24-25高二下·浙江温州·期末）基因工程会用到多种限制酶，下列为部分限制酶的识别序列和酶切位点及其在某质粒上的酶切位点。下列叙述正确的是（　　） A．Sau3AⅠ可切割BamHI和BclⅠ的识别序列，其不具有专一性 B．质粒分别被BamHI和BclI切割后，在DNA连接酶的作用下，可以避免发生环化 C．用Sau3AⅠ切割目的基因，用BamHI切割质粒，形成的重组质粒能被Sau3AⅠ切成5个片段 D．构建重组质粒时，切割该质粒的限制酶应选择BamHI和Sau3AⅠ 【答案】C 【分析】限制酶，又称限制性内切核酸酶，是一类能识别并切割双链 DNA 分子中特定核苷酸序列的酶。它们主要存在于原核生物中，是细菌抵御噬菌体等外来DNA入侵的防御机制，是基因工程中不可或缺的工具酶。 【详解】A、Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，但其仍是识别特定的序列进行切割，具有专一性，A错误； B、BamHⅠ和BclⅠ切割质粒后，会切出相同且互补的黏性末端，加入DNA连接酶其会发生环化，B错误； C、用Sau3AⅠ切割目的基因，用BamHⅠ切割质粒，则构建的重组质粒含有5个Sau3AⅠ识别位点，能被Sau3AⅠ酶切成5个片段，C正确； D、构建重组质粒时，目的基因要插入在启动子和终止子之间，则可选择BamHⅠ、Sau3A，但该质粒含有BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，可被Sau3AⅠ切割，因此用Sau3AⅠ则会在质粒上切出多个切口，所以只能用BamHⅠ，D错误。 故选C。 8．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）2021年4月15日，《中华人民共和国生物安全法》正式实施，下列做法和分析符合生物安全法的是（　　） A．不发展、不生产生物武器 B．可以开展人类的生殖性克隆 C．转基因食品由于制作时已被灭活，无需风险评估 D．将目的基因转入叶绿体的农作物不影响周围物种 【答案】A 【详解】A、《中华人民共和国生物安全法》明确规定禁止开发、制造或持有生物武器，因此“不发展、不生产生物武器”符合法律规定，A正确； B、生殖性克隆人违背伦理且被法律明文禁止，B错误； C、转基因食品需经过严格的安全评估和审批流程，即使灭活仍需风险评估，C错误； D、将目的基因转入叶绿体DNA中，由于叶绿体基因属于母系遗传（花粉中不含叶绿体），可减少基因通过花粉扩散到其他物种的风险，但并不代表对周围物种没有影响，如转基因抗虫棉会导致周围的物种更多地被害虫破坏，D错误。 故选A。 9．（24-25高二下·浙江丽水·期末）生物技术安全和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是（　　） A．转基因作物上市前无需通过食品和环境安全评价 B．生物武器利用致病微生物、毒素等形成杀伤力 C．治疗性克隆可解决器官移植时的免疫排斥问题 D．设计试管婴儿技术可减少遗传病的发生概率 【答案】A 【详解】A、转基因作物可能对生态环境和人类健康造成潜在风险，上市前必须经过严格的食品和环境安全评价，A错误； B、生物武器包括致病微生物、毒素等生物制剂，确实利用其致病性形成杀伤力，B正确； C、治疗性克隆通过患者自身细胞培育组织或器官，遗传物质相同，可避免免疫排斥，C正确； D、设计试管婴儿通过胚胎遗传学诊断筛选健康胚胎，可降低遗传病传递概率，D正确。 故选A。 二、简答题 10．（24-25高二下·浙江宁波·期末）粮食安全是“国之大者”，大豆是重要的农产品，改良大豆种子尤为重要。科研人员为研究大豆P34蛋白基因启动子（简称P启动子）的调控活性，将P启动子与GUS基因（一种报告基因，用于指示外源基因的表达情况；b链为转录模板链）融合，如图所示。通过农杆菌转化法导入烟草进行研究，旨在为大豆品质改良提供有力工具。 注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同 回答下列问题： (1)获得P启动子。据图分析，以大豆基因组DNA为模板，选取______（填数字）作引物进行PCR，可获得P启动子克隆。 (2)构建P-GUS基因表达载体。为了确保P启动子与GUS基因融合，且P-GUS基因能与Ti质粒高效连接，则需要在克隆P启动子的两种引物的______（5'或3'）端分别连接________两种限制酶识别序列，并用______两种限制酶对Ti质粒进行酶切。 (3)将P-GUS基因表达载体导入受体细胞和植物组织培养。先用______处理农杆菌，使细胞处于感受态，再将表达载体导入农杆菌，将其接种在含______的固体培养基中进行培养，筛选转化成功的农杆菌。再用农杆菌侵染经______的烟草叶片，置于MS培养基中，暗环境下培养3天，_______处理后，转移至分化培养基中，待根系发达后移栽至土中。 (4)P-GUS基因的检测和鉴定。可通过______技术确定P-GUS基因是否导入。为检验最终的实验目的是否达到，还应检测______（“P启动子”或“GUS基因”）在烟草各组织中的表达量。 【答案】(1)2和3 (2) 5’ BamHI、EcoRI BamHI、HindⅢ (3) Ca2+/CaCl2 卡那霉素 消毒 脱菌 (4) PCR/DNA分子杂交（答出1点即可） GUS基因 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）为获得P启动子，以大豆基因组DNA为模板，选取引物2、3进行PCR。 （2）由于耐高温的DNA聚合酶是从引物的3’端连接脱氧核苷酸，因此需要在引物的5’端加上限制酶的识别序列，为确保P启动子与GUS基因融合，引物的5’端需要连接BamHI、EcoRI。为P-GUS基因能与Ti质粒高效连接，利用BamHI、HindⅢ两种限制酶对Ti质粒进行酶切。 （3）将P-GUS基因表达载体导入受体细胞和植物组织培养。先用Ca2+/CaCl2处理农杆菌，使细胞处于感受态，再将表达载体导入农杆菌，将其接种在含卡那霉素的固体培养基中进行培养，筛选转化成功的农杆菌。再用农杆菌侵染经消毒的烟草叶片，置于MS培养基中，暗环境下培养3天，脱菌处理后，转移至分化培养基中，待根系发达后移栽至土中。 （4）通过PCR技术确定P-GUS基因是否导入，为检验最终的实验目的是否达到，还应检测GUS基因在烟草各组织中的表达量。 11．（24-25高二下·浙江丽水·期末）酿酒酵母是乙醇发酵领域的模式微生物，在生物燃料和酿酒工业中应用广泛。然而，该菌种由于缺乏葡萄糖淀粉酶，无法直接降解淀粉类原料。研究人员将糖化酵母中的葡萄糖淀粉酶基因S导入到酿酒酵母细胞中，构建的工程菌能够自主完成淀粉水解与乙醇发酵。下图为相关的重组质粒构建示意图。 注：↓为相应酶切位点，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制原点，LacZa基因编码的酶能够将底物X-gal分解为蓝色，URA3能够表达尿嘧啶。 回答下列问题： (1)目的基因的获取：糖化酵母具有很厚的细胞壁，先经________处理后，提取其总基因组较为容易。检索________中的目的基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。该PCR体系中的扩增缓冲液常含有Mg2+，其作用是________。扩增后的产物经________鉴定后，切胶回收目的条带。 (2)酿酒酵母的转化：使用________限制酶处理S基因和表达质粒，在________作用下作连接反应，构建出重组表达质粒。用________吸取适量尿嘧啶缺陷型酿酒酵母，与线性化的重组表达质粒混匀，转化后的酿酒酵母涂布在含________、不含________的平板上培养并筛选。 (3)葡萄糖淀粉酶产量和活性的测定：已知葡萄糖淀粉酶是胞外酶，将转化后的酿酒酵母扩大培养，培养液经离心后取________（填“上清液”或“沉淀物”），分离、纯化目标蛋白并测定其产量。还可将转化后的酿酒酵母接种于以淀粉为唯一碳源、添加有________指示剂的平板上，通过比较________判断酶活性。 (4)你认为同一实验批次的工程菌，其表达的葡萄糖淀粉酶产量________（填“是”或“否”）存在差异，并阐述理由。________。 【答案】(1) 破壁（或去壁）（或酶解法/机械法破壁） 基因数据库/NCBI/GeneBank 激活Taq酶（或提高DNA聚合酶活性） 电泳（或琼脂糖凝胶电泳） (2) Acc65Ⅰ和BspDⅠ DNA连接酶 移液枪 氨苄青霉素和X-gal 尿嘧啶 (3) 上清液 碘-碘化钾/碘 透明圈直径/菌落直径/透明圈大小 (4) 是 目的基因整合在受体细胞染色体的位置和数量不同 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）糖化酵母具有很厚的细胞壁，不利于提取其总基因组，因此需要进行破壁（或去壁）处理。检索基因数据库（或NCBI、GeneBank）中的目的基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。PCR反应需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液含有的Mg2+的作用是激活Taq酶（或提高DNA聚合酶活性）。常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 （2）S基因的两侧有限制酶Acc65Ⅰ和BspDⅠ的酶切位点，因此构建重组表达质粒时，可以使用Acc65Ⅰ和BspDⅠ处理S基因和表达质粒，再用DNA连接酶连接。吸取适量尿嘧啶缺陷型酿酒酵母，使用的操作工具为移液枪。质粒中含有的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）为标记基因，LacZa基因编码的酶能够将底物X-gal分解为蓝色，URA3能够表达尿嘧啶。在构建的重组质粒中，Ampr结构完整，S基因的插入导致LacZa基因的结构被破坏，据此可将转化后的酿酒酵母涂布在含氨苄青霉素和X-gal、不含尿嘧啶的平板上培养并筛选，长出的白色菌落即为成功转化的酿酒酵母。 （3）将转化后的酿酒酵母扩大培养，该酿酒酵母合成并分泌的葡萄糖淀粉酶是胞外酶，培养液经离心后，葡萄糖淀粉酶存在于上清液中，因此应取上清液分离、纯化葡萄糖淀粉酶并测定其产量。碘遇淀粉变蓝。将转化后的酿酒酵母接种于以淀粉为唯一碳源、添加有碘-碘化钾（或碘）指示剂的平板上，该酿酒酵母分泌的葡萄糖淀粉酶催化淀粉水解，在平板中菌落的周围会出现透明圈，且分泌的葡萄糖淀粉酶越多或活性越高，形成的透明圈就越大，因此可以通过比较透明圈直径（或透明圈大小）来判断酶活性。 （4）由于目的基因（S基因）整合在受体细胞染色体的位置和数量不同，所以同一实验批次的工程菌，其表达的葡萄糖淀粉酶产量存在差异。 12．（24-25高二下·浙江杭州·期末）围食膜是对虾消化道重要结构之一，是一种由几丁质和围食膜蛋白质结合而成的半透性膜，具有帮助食物消化、保护肠道上皮细胞等功能。回答下列问题： (1)电子显微镜的观察结果显示，围食膜仅允许直径在20nm以下的颗粒通过，该尺寸小于常见的病原体，从免疫类型的角度分析，围食膜的作用属于_________免疫。 (2)选取对虾_________组织（A．肌肉B．表皮C．胃和肠D．鳃），提取其mRNA并构建_________文库。测序发现，有一段序列在该文库中出现的频率很高，模拟翻译后与_________中的几丁质酶氨基酸序列比较分析，发现其蛋白产物也具有能和_________结合的位点，推测该序列来自于围食膜蛋白基因，并将相关基因命名为PT，编码链序列如下（其中1号位碱基位于5'端）。 注：起始密码子为AUG，终止密码子为UAA、UAG、UGA，数字表示碱基排序。 (3)根据已有研究，推测围食膜蛋白第1至19位氨基酸的肽段（信号肽）具有定位功能，能够把正在合成中的围食膜蛋白引导至内质网腔中，进而分泌到胞外。为了验证该肽段的功能，科学家通过_________技术分别扩增了PT基因和不含有信号肽对应区域（上图中深色区域）的PT序列（PTWSP），用于扩增PTWSP的一对引物是_________和5'-GAATTCTTAAGTACCTGGACAGAAGCCGTC-3'（引物序列中的下划线部分为构建表达载体时使用的酶切位点）。 A．5'-GGATCCATGAGGTCCAATACGTTCTTTGTT-3' B．5'-GGATCCATGAGAGACTTGCGAGCTAAACGC-3' C．5'-GGATCCAGAGACTTGCGAGCTAAACGCCGT-3' 将扩增得到的PT基因和PTWSP分别与_________载体相连构建重组DNA分子，为使目的基因蛋白产物与天然蛋白尽可能接近，优先选择导入_________（A．大肠杆菌B．酵母菌C．农杆菌D．昆虫卵巢细胞），记为PT组和PTWSP组，2组细胞分别在不含几丁质的液体培养基中培养一段时间后，用_________技术检测是否表达出围食膜蛋白。若推测成立，则实验结果为_________。 【答案】(1)非特异性 (2) C cDNA 数据库/蛋白质数据库 几丁质 (3) PCR B 表达 D 抗原-抗体杂交 PT组在培养基中可以检测到围食膜蛋白，而PTWSP组不能（只有PT组在培养基中可以检测到围食膜蛋白） 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）从免疫类型的角度来看，围食膜起到了物理屏障作用，属于非特异性免疫。 （2） 据题干信息“推测该序列来自于围食膜蛋白基因”可知，选取的组织应来自围食膜，而围食膜是对虾消化道重要结构，故选取对虾的胃和肠组织(C项)；提取其mRNA后进行逆转录获得cDNA，并构建cDNA文库；测序发现，有一段序列在该文库中出现的频率很高，模拟翻译后得到相应蛋白质，可与已知的蛋白质数据库中的几丁质酶氨基酸序列比较分析；几丁质酶能与几丁质结合，故比对结果是该未知蛋白也具有能和几丁质结合的位点。 （3）为了扩增PT基因和不含有信号肽对应区域的PT序列(PTWSP)，可采用PCR扩增技术；据图可知PTWSP编码链两端序列(不含图中深色区域)，又已知2个引物中的一个引物序列为5'- GAATTCTTAAGTACCTGGACAGAAGCCGTC-3'，其中5'-GAATTC-3'为限制酶序列，即该引物与DNA配对的序列为5'-TTAAGTACCTGGACAGAAGCCGTC-3'，可知与下游序列互补配对，故另一个引物序列应与上游序列(不含图中深色区域)互补配对，在5'端加上相应的限制酶序列和转录为起始密码子的序列ATG，故该引物为 5'-GGATCCATGAGAGACTTGCGAGCTAAACGC-3'(引物序列中的下划线部分为构建表达载体时使用的酶切位点)，故选B项；为获得相应的蛋白产物，需将扩增得到的PT基因和PTWSP分别与表达载体相连构建重组DNA分子；由于该目的基因是从对虾的基因组中获得的，而对虾属于动物，所以为使目的基因蛋白产物与天然蛋白尽可能接近，优先选择导入昆虫卵巢细胞中，故选D；检测蛋白质，可采用抗原-抗体杂交技术；若推测成立，则实验结果为PT组可检测到围食膜蛋白，而PTWSP组检测不到围食膜蛋白。 13．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）GFP蛋白最早在发光水母体内找到，它由GFP基因表达产生，在紫外线等激发下发出绿色荧光。下列是有关GFP的部分研究，回答下列问题： (1)提取水母DNA时，通常将组织冷冻处理并加入少量石英砂，目的是________。DNA提取液可选择2mol/L的________溶液。为防止所提取的核酸分子中存在RNA分子，可在提取液中加入________处理。 (2)分析水母基因组DNA时，在保证反应充分进行下，若想获得较小的片段，可以选择下列哪种限制酶？________。 (3)GFP基因的遗传改造可采用随机诱变PCR技术创造突变基因，再将扩增产物分别重组到表达载体（如图），然后分别转化大肠杆菌，最后筛选能发出其他颜色荧光的菌株。 ①为保障GFP突变基因能够与载体连接，随机诱变PCR时所设计的引物________端含有限制酶酶切序列。为提高PCR退火时的温度，引物碱基组成中需提高________碱基的比例。为了对GFP基因进行诱变改造，可以将PCR缓冲液中的________替换成锰离子，提高扩增时碱基错配的机会。 ②经转化的大肠杆菌，通过涂布法分离培养得到多个单菌落，在紫外线的照射下，淘汰________的单菌落，从剩余菌落中寻找所需基因。 (4)GFP基因可广泛应用到转基因植物中。如：将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游、乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。两组农杆菌分别侵染愈伤组织后，可在愈伤组织中检测到绿色荧光的是________（选填“甲组”“乙组”），原因是________。 【答案】(1) 有助于细胞结构的破坏 NaCl RNA酶 (2)酶3 (3) 5＇ GC 镁离子 绿色荧光和不发荧光 (4) 甲组 农杆菌质粒中，只有T-DNA侵入植物细胞内 【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成（2）基因表达载体的构建：是基 因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子、终止子和标记基因等（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）将组织冷冻处理并加入少量石英砂，目的是有助于细胞结构的破坏，释放DNA 。DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，所以DNA提取液可选择2mol/L的NaCl溶液。为防止所提取的核酸分子中存在RNA分子，可在提取液中加入RNA酶处理，RNA酶能催化RNA水解。 （2）酶1的识别序列和切割位点为GGATCC CCTAGG，酶2的识别序列和切割位点为CCCGGG GGGCCC，酶3的识别序列和切割位点为GATC CTAG，酶4的识别序列和切割位点为GCGGCCGC CGCCGGCG。酶3的识别序列最短，在DNA上的切割位点相对更密集，在保证反应充分进行下，若想获得较小的片段，可以选择酶3。 （3）①为保障GFP突变基因能够与载体连接，随机诱变PCR时所设计的引物5'端含有限制酶酶切序列（因为DNA合成是从5'到3'方向，在5'端设计酶切序列便于后续与载体连接）。G - C碱基对之间有3个氢键，A - T碱基对之间有2个氢键，为提高PCR退火时的温度，引物碱基组成中需提高GC碱基的比例。为了对GFP基因进行诱变改造，可以将PCR缓冲液中的镁离子替换成锰离子，提高扩增时碱基错配的机会。 ②经转化的大肠杆菌，通过涂布法分离培养得到多个单菌落，在紫外线的照射下，淘汰发出绿色荧光的单菌落（因为我们要筛选能发出其他颜色荧光的菌株，所以发出绿色荧光的是未突变的，应淘汰）和不发荧光，从剩余菌落中寻找所需基因。 （4）可在愈伤组织中检测到绿色荧光的是甲组。原因是农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。甲组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T - DNA内部基因启动子下游，T - DNA可将GFP基因转移并整合到愈伤组织细胞染色体DNA上并表达，从而检测到绿色荧光；而乙组GFP基因连接在T - DNA外部，T - DNA不能将其转移到愈伤组织细胞染色体DNA上，不能表达，所以检测不到绿色荧光。 14．（24-25高二下·浙江舟山·期末）水稻害虫主要通过啃咬、钻蛀水稻的绿色组织如叶片、茎秆危害水稻，从而影响水稻产量。为解决此问题，研究人员将两种抗虫基因Cry和Vip融合，培育双抗虫转基因水稻，其具体过程如图。表格是相关限制酶的识别序列及酶切位点信息。回答下列问题： 限制酶 NcoI XhoI EcoRI 识别序列和酶切位点 C↓CATGG C↓TCGAG G↓AATTC Cry基因部分序列:5'-GAGCTA……TAGTGC-3' Vip基因部分序列:5'-GTACAA……TATCAA -3' (1)将Cry基因和Vip基因拼接获得融合基因，引物P2和引物P3之间碱基序列的特点是必须有______（填“相同”或“互补”）片段。PCR1和PCR2至少经过______轮循环才能获得目标片段。③过程不需要引物，理由是______。 (2)为使过程④融合基因能按正确方向插入质粒，扩增融合基因时，需选择一对引物______，并在它们的5'端分别加上特定限制酶的识别序列。写出扩增融合基因模板链的引物5′_______3'（写出12个碱基） (3)通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定。若用NcoI酶切割质粒的电泳结果为5.5kb，再用Xhol酶切后，出现0.1kb和5.4kb两个片段。用NcoI酶切割重组质粒的电泳结果为7kb，则重组质粒中的目的基因片段分子量为_______kb。 (4)将重组质粒转入感受态农杆菌后，通过一定的方法处理使农杆菌______，再筛选出含重组质粒的农杆菌。⑥过程中选用水稻愈伤组织细胞，其意义是______，并用含______培养基筛选发生转化的水稻细胞。 (5)为缓解人们对转基因抗虫水稻的顾虑，研究人员通过_______使抗虫基因不在水稻胚乳（食用部分）中表达，同时又能发挥其抗虫效果；再以______为阴性对照，通过______技术进一步鉴定水稻的不同部位两种抗虫基因是否表达出抗虫蛋白质。 (6)除上述通过拼接融合基因的方式导入两种抗虫基因，还可以先分别获得两种单抗虫转基因植株，再通过______获得双抗虫的转基因水稻。 【答案】(1) 互补 2 两条部分互补杂交链已存在3’端，DNA聚合酶可以直接在3’端连接脱氧核苷酸。/在TaqDNA聚合酶催化下，可分别以这两条链为引物进行延伸 (2) P1和P4 CCATGGGAGCTA (3)1.6 (4) 恢复生理活性 愈伤组织全能性高，培养成水稻植株的成功率高 潮霉素 (5) 添加绿色组织特异性启动子 非转基因水稻 抗原-抗体分子杂交 (6)杂交 【分析】PCR1需要的引物是P1和P2，PCR2需要的引物是P3和P4。结合质粒上的酶切位点可知，选择EcoRI切割会破坏启动子，应该选择NcoI和XhoI进行切割。 【详解】（1）引物P2和P3上均含有两基因的部分序列，二者有部分序列互补，方便扩增产物的融合。 以PCR1为例，引物P2扩增出来的子链，再以引物P1扩增一次，可以形成目标片段，即PCR1和PCR2至少经过2次扩增，才能获得目标片段。 ③过程两条部分互补杂交链已存在3’端，DNA聚合酶可以直接在3’端连接脱氧核苷酸。/在TaqDNA聚合酶催化下，可分别以这两条链为引物进行延伸，不需要引物。 （2）扩增融合基因，应该选择两端的引物P1和P4。 结合上述分析可知，质粒应该选择NcoI和XhoI进行切割，目的基因的两端也应该加上NcoI和XhoI的识别序列，且融合基因上游应该加上NcoI的识别序列，由图可知，目的基因的左侧应该加上NcoI的识别序列，即引物1含有NcoI的识别序列和Cry基因的部分序列，引物1即扩增模板链的引物，其序列为5′CCATGGGAGCTA3'。 （3）若用NcoI酶切割质粒的电泳结果为5.5kb，再用Xhol酶切后，出现0.1kb和5.4kb两个片段，说明酶切后质粒的大片段的长度为5.4kb大片段与目的基因连接构成重组质粒，重组质粒上含有一个NcoI的识别序列，用NcoI酶切割重组质粒的电泳结果为7kb，说明重组质粒的长度为7kb，则重组质粒中的目的基因片段分子量为7-5.4=1.6kb。 （4）将目的基因导入重组质粒后，需要进行处理使农杆菌恢复生理活性。水稻愈伤组织全能性高，培养成水稻植株的成功率高，故⑥过程中选用水稻愈伤组织细胞。由于T-DNA区段含有潮霉素抗性基因，含目的基因的水稻细胞对潮霉素有抗性，故可以用潮霉素筛选发生转化的水稻细胞。 （5）可以在目的基因的上游添加绿色组织特异性启动子，使抗虫基因不在水稻胚乳（食用部分）中表达，同时又能发挥其抗虫效果。可以提取转基因水稻（实验组）和非转基因水稻（阴性对照组）不同部位细胞中的蛋白质，采用抗原抗体杂交的方法，鉴定水稻的不同部位两种抗虫基因是否表达出抗虫蛋白。 （6）也可以通过转基因技术分别获得两种抗虫转基因植株，再让二者杂交，经过筛选获得双抗虫的转基因水稻。 15．（24-25高二下·浙江台州·期末）番茄易受低温伤害，导致严重减产。我国科研人员从番茄低温诱导表达数据库中发现了低温下才能表达的Y基因。为了研究Y基因的具体作用，科研人员拟构建Y基因过度表达植株（Y-OE）及Y基因敲除植株（Y-KO）。 (1)图1为构建Y基因过度表达植株（Y-OE）的具体步骤： ①获取Y基因序列并扩增：将番茄细胞置于_______环境下处理后从细胞中提取总RNA，以此为模板进行逆转录，构建______，从中获取Y基因。为使Y基因与载体能够正确连接并顺利表达，应在引物______（填“3’端”或“5’端”）分别添加限制酶BamHI及______的识别序列。 ②构建重组质粒并转入农杆菌：用限制酶分别酶切质粒及Y基因片段，在______催化下连接成重组质粒。将重组质粒转入处于______（填生理状态）的农杆菌，筛选转化成功的农杆菌。 ③获得转化成功的植物细胞：将农杆菌与愈伤组织共培养，利用添加了_______的培养基筛选转化成功的愈伤组织，培养愈伤组织获取Y-OE植株。 (2)图2为利用向导RNA-Cas9蛋白复合物进行基因编辑，构建Y基因敲除植株（Y-KO）。由图可知，Cas9蛋白催化DNA的______（填化学键名称）水解，达到切割目标基因的目的。有时Cas9蛋白会对非目标基因进行切割，其原因可能是______。该基因编辑技术会导致细胞中发生______（填变异类型）从而干扰目的基因的表达，起到基因敲除的效果。 【答案】(1) 低温 cDNA文库/基因文库 5'端 SalI DNA连接酶 感受态 潮霉素 (2) 磷酸二酯键 其他基因也含有与向导RNA互补配对的序列 基因突变 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）①题意显示，我国科研人员从番茄低温诱导表达数据库中发现了低温下才能表达的Y基因，因此为了获取Y基因序列并扩增，需要将番茄细胞置于低温环境下处理后从细胞中提取总RNA，以此为模板进行逆转录，构建cDNA文库，从中获取Y基因。为使Y基因与载体能够正确连接并顺利表达，结合图示信息可知，应在引物“5’端”分别添加限制酶BamHI及SalI的识别序列，这里不选择NdeI的原因是由于质粒上有两个该限制酶的识别位点，且子链的延伸是脱氧核苷酸依次连接在引物的3‘端的，因此限制酶的识别序列需要添加到引物的5’端。 ②用限制酶BamHI及SalI分别酶切质粒及Y基因片段，在DNA连接酶催化下连接成重组质粒。将重组质粒转入处于感受态的农杆菌，感受态是指细胞处于容易吸收外源DNA的状态，因而能提高转化率，此后需要根据标记基因来筛选转化成功的农杆菌。 ③将成功转化的农杆菌与愈伤组织共培养，带有潮霉素抗性基因的目的基因可以转化到植物细胞中，因而需要利用添加了潮霉素的培养基筛选转化成功的愈伤组织，而后培养愈伤组织通过再分化过程获取Y-OE植株。 （2）由图可知，Cas9蛋白催化DNA的磷酸二酯键水解，进而达到切割目标基因的目的。有时Cas9蛋白会对非目标基因进行切割，其原因可能是其他基因也含有与向导RNA互补配对的序列，因而能实现对非目标基因的切割，可见，基因编辑技术可能会导致细胞中发生基因突变从而干扰目的基因的表达，达到基因敲除的效果。 16．（24-25高二下·浙江宁波·期末）人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但大剂量使用会诱发颅内出血。为此研究人员通过蛋白质工程将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸（密码子为UCU、UCC、UCC、UCG），获得了副作用显著降低的改良t-PA蛋白。图1为用重叠延伸的方法对t-PA基因进行定点突变及构建表达载体的过程。最后将表达载体导入大肠杆菌中诱导表达来生产t-PA改良蛋白。回答下列问题： (1)改良t-PA基因： ①根据_______提供的t-PA基因的序列分别设计引物。先利用引物______进行PCR1，至少需要_______次循环才能获得双链等长的产物1；再通过PCR2，获得产物2；PCR1和PCR2过程不能在同一反应系统中进行。原因是______。重叠延伸后利用引物______进行PCR3，获得大量改良t-PA基因。 ②研究表明，t-PA蛋白第84位氨基酸相应基因的模板链（图中t-PA基因的上链）的碱基序列是ACA，若诱变引物b的突变位点引入的碱基是G，则改造后第84位的丝氨酸的密码子是______。 (2)构建表达载体：将改良t-PA基因用限制酶切后得到如上图所示的片段，那么质粒pCLY11需用限制酶______切割，才能与改良t-PA基因高效连接。 (3)筛选工程菌：质粒pCLY11中的lacZ表达产物可以将X-gal分解为半乳糖和深蓝色物质，从而使所在的菌落呈现蓝色，反之则为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有_______的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的菌落是_______色。 (4)生产t-PA改良蛋白：可利用发酵罐大量培养工程菌来生产t-PA改良蛋白，发酵过程中需控制的参数是_______。 A．温度和pH     B．溶解氧 C．营养物质浓度  D．搅拌转速 利用大肠杆菌生产的t-PA改良蛋白还需解决加工和分泌问题，主要是因为大肠杆菌缺少______（填细胞器）。 (5)研究发现运用动物细胞工程可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图2所示。 过程②需先将t-PA改良基因与乳腺中特异表达基因的________等调控元件重组，过程④运用了胚胎移植技术，此过程前还需对胚胎进行______。 (6)在获取性能优良的t-PA突变蛋白的过程中，科学家是通过对基因的操作来实现的，而不是直接对天然的t-PA蛋白进行操作，主要原因是_______（答出1点即可）。 【答案】(1) 基因数据库（序列数据库） a和b 2 引物b和c存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系它们会结合而失去作用 a和d UCU (2)Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ (3) 新霉素和X-gal 白 (4) ABCD 内质网、高尔基体 (5) 启动子 性别鉴定 (6)t-PA蛋白具有十分复杂的空间结构，而t-PA基因的结构相对简单，更容易改造；t-PA改良基因可以遗传给下一代，t-PA突变蛋白不能遗传 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）①要扩增t-PA基因，需根据基因数据库（序列数据库 ） 中t-PA 基因的已知序列设计引物，保证引物与模板链互补配对，启动 PCR 扩增。图中信息显示，引物b和c存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系它们会结合而失去作用，因此，如果PCR1和PCR2同时进行，无法达到预期目的，因此先利用引物a、b进行进行PCR1，获得产物1，至少需2次循环才能获得双链等长产物，第一次循环得到两条不等长单链，第二次循环才能得到双链等长的目的片段，再通过PCR2，获得产物2；重叠延伸后利用引物a、d从两端进行扩增，进行PCR3，获得大量改良t-PA基因 ②原t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，对应DNA模板链（上链 ）碱基为ACA，转录出密码子UGU，要替换为丝氨酸（密码子UCU等 ），通过PCR定点突变，让模板链相应位置碱基改变，最终转录出丝氨酸密码子UCU。 （2）改构t-PA基因用限制酶切割后，需与质粒pCLY11连接，要高效连接，质粒和目的基因需用相同限制酶切割产生匹配黏性末端，根据图中质粒酶切位点以及t-PA改良基因两端的黏性末端，用Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割质粒pCLY11，可与改构t-PA基因的酶切末端互补，实现高效连接 。 （3）质粒pCLY11含 “lacZ基因产物可将X-gal分解为半乳糖和深蓝色物质”，且有 “neoⁿ 新霉素抗性基因”，转化后的大肠杆菌需在含新霉素和X-gal的培养基筛选，新霉素可淘汰未转化菌，X-gal可通过菌落颜色区分重组质粒，插入目的基因会破坏lacZ 基因，菌落呈白色。 （4）发酵工程生产t-PA改良蛋白，需控制温度、pH、溶解氧、营养物质浓度、搅拌转速，温度影响酶活性，pH影响细胞代谢，溶解氧影响呼吸，营养物质浓度影响生长，搅拌转速影响溶氧，ABCD正确。 故选ABCD。 大肠杆菌是原核生物，缺少内质网、高尔基体，内质网和高尔基体参与蛋白质加工（折叠、糖基化等 ），故大肠杆菌生产的t-PA蛋白需后续加工解决分泌问题 。 （5）过程②是将t-PA蛋白改良基因与乳腺中特异表达基因的启动子等调控元件重组，使目的基因在乳腺细胞中特异表达，过程④是胚胎移植，移植前需对胚胎进行性别鉴定 ，确保移植雌性胚胎（只有雌性奶牛能泌乳，表达t-PA蛋白）。 （6）选择基因操作而非直接改造蛋白，是因为t-PA蛋白空间结构复杂，直接改造难，而t-PA基因的结构相对简单，更容易改造；t-PA改良基因可以遗传给下一代，t-PA突变蛋白不能遗传。 17．（24-25高二下·浙江温州·期末）具有抑菌作用的β-苯乙醇易挥发，有玫瑰香味，被广泛应用于食品和化妆品中。自然界中存在能够合成β-苯乙醇的多种微生物，但这些微生物体内高浓度的β-苯乙醇不仅会抑制微生物的生长，也会抑制β-苯乙醇的合成，从而导致天然β-苯乙醇产量低、提取难。 (1)研究发现，部分酵母菌不受上述______调节机制影响，能高产β-苯乙醇。为筛选该类别的酵母菌，需要在选择培养基灭菌______（填“前”或“后”）加入一定浓度梯度的β-苯乙醇。接种时，需将土壤样品稀释后采用________法。 (2)核糖体DNA（rDNA）是DNA中用于转录rRNA的区段，因进化速率慢等优点常被用于物种鉴定。已知rDNA包含可变区和所有酵母菌间几乎无差别的保守区。上述筛选完成后，为鉴定酵母菌菌种，需提取酵母菌的rDNA。依据_______区设计引物，对可变区进行PCR扩增。PCR产物经电泳分离后，需与_______比对以确定种属。 (3)已知高产酵母菌中的ARO10基因表达的脱羧酶是合成β-苯乙醇的关键酶。研究人员把ARO10基因导入到普通酵母菌中进行过量表达，并检测β-苯乙醇的产量。 ①将ARO10基因与质粒连接构建重组载体（如图甲）。构建重组______（选填“表达”或“克隆”）载体时，用BamHI、SalI切割质粒后，用DNA连接酶连接质粒和ARO10基因。 ②重组载体导入酵母菌前，需用PEG/LiAc处理酵母菌细胞使其成为更易接受载体的______细胞。由图甲可知，转化后的酵母菌中的ARO10基因在转录时以其______链为模板链。 ③筛选成功转化目的基因的重组菌时，应将无抗生素平板上的酵母菌先接种到含______的培养基中，再将存活菌落影印到含_______的培养基中。 (4)①发酵过程中检测β-苯乙醇含量，结果如图乙。48小时后产量下降，可能的原因是______。 A．产物积累抑制菌体生长  B．营养物质消耗 C．发酵条件变得不适宜    D．营养物质过多 ②若要进一步提高产量，可通过________工程改造关键酶的结构。 【答案】(1) 负反馈 后 稀释涂布平板/涂布分离 (2) 保守 基因数据库 (3) 表达 感受态 β 氯霉素 四环素 (4) ABC 蛋白质 【分析】常用的微生物接种方法： 1、平板划线分离法：先倒制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝固后，在无菌条件下，用接种环沾取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。 2、稀释涂布平板法：该法是将已熔化并冷却至约50℃（减少冷凝水）的琼脂培养基，先倒入无菌培养皿中，制成无菌平板。待充分冷却凝固后，将一定量（约0.1 ml）的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用三角形无菌涂布器涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置温箱培养后挑取单个菌落。 【详解】（1）自然界中存在能够合成β-苯乙醇的多种微生物，但微生物体内高浓度的β-苯乙醇会抑制其合成，也会抑制微生物生长，即产物含量增加会抑制反应过程，这种调节方式为负反馈调节。由于β-苯乙醇易挥发，所以在灭菌之后才能加入到培养基中。土样进行梯度稀释后采用涂布分离法接种到酵母菌固体培养基上进行培养。 （2）为鉴定所筛选出的酵母菌具体的种属，依据酵母菌rDNA的保守区序列设计引物，对可变区序列进行PCR扩增。PCR产物回收纯化后进行测序并与基因数据库进行比对后鉴定酵母菌具体的种属。因为保守区序列种属间几乎无差别，不能用于鉴定。不同种属间可变区序列有差异，因此可以根据可变区序列的相似度来分类鉴定酵母菌的具体种属。 （3）①构建重组表达载体时，用BamHI、SalI切割质粒后，用DNA连接酶连接质粒和ARO10基因。 ②重组载体导入酵母菌前，需用PEG/LiAc处理酵母菌细胞使其成为更易接受载体的感受态细胞，基因转录时RNA聚合酶是沿着编码链从5’端向3’端移动，根据质粒图，启动子在ARO10基因的左边，而且ARO10基因的α链左边为5’端，所以转录是以α链为编码链，β链为模板链。 ③质粒上有氯霉素抗性基因，所以转化后的酵母菌在含氯霉素的培养基上进行筛选，再将存活菌落影印到含四环素的培养基中。 （4）①48小时后产量下降，可能的原因是产物积累抑制菌体生长 、营养物质消耗、发酵条件变得不适宜等。 故选ABC。 ②可采用蛋白质工程，将β-苯乙醇代谢过程中的关键酶进行改造以进一步提高β-苯乙醇产量。 18．（24-25高二下·浙江温州·期末）组织纤维溶酶原激活物（t-PA）能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。临床使用发现t-PA有诱发颅内出血的副作用，为此研究人员将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸（密码子UCU），获得了副作用显著降低的改良t-PA．下图为利用重叠延伸PCR技术改造t-PA基因和构建相应的表达载体的过程。（注：质粒pCLY11中的lacZ表达产物可以将X-gal分解为半乳糖和深蓝色物质） (1)PCR反应体系中通常含有模板、______、引物、TaqDNA聚合酶、扩增缓冲液等。研究人员先利用引物ab进行PCR1，获得产物1；再利用引物cd进行PCR2，至少需要经过______轮PCR2才能获得产物2.PCR时，引物可以______（多选）。（A．决定变性时间B．决定反应的特异性C．决定扩增产物大小D．为TaqDNA聚合酶提供结合位点） (2)获得大量产物1和产物2后，经过变性，复性（指两条互补链恢复双螺旋结构）处理后，会形成______种DNA分子，其中只有产物1上链和产物2下链互补配对的DNA分子（如图）才能进行重叠延伸PCR。重叠延伸后利用引物______进行PCR3，且需要在引物的5’端添加______限制酶的识别序列，经过PCR3后获得大量改良t-PA基因。 (3)构建形成重组质粒后，在低温条件下将重组质粒与感受态的大肠杆菌混合，进行短暂的______，使重组质粒导入大肠杆菌。将转化后的大肠杆菌接种在含有新霉素和X-gal的培养基上，培养一段时间后，形成白色菌落的是含重组质粒的大肠杆菌，其筛选的原理是______。除此以外，还可以采用______技术检测受体细胞中是否存在目的基因。 (4)将含重组质粒的大肠杆菌进行扩大培养，发酵结束后，收集大肠杆菌，采用一定方法使大肠杆菌______，释放出t-PA，经分离、纯化获得质检合格的t-PA．研究人员通过设计和改造t-PA基因获得特定的t-PA，该技术称为______。研究表明，改造前t-PA蛋白第84位氨基酸相应基因的模板链的碱基序列是ACA，则改造前后该位点氨基酸相应基因碱基序列的变化是______。 【答案】(1) dNTP 2 BCD (2) 4 ad XmaI、BglⅡ (3) 热刺激 含重组质粒的大肠杆菌含有新霉素抗性基因，能在该培养基上生存，重组质粒的laZ基因被破坏，不能将X-gal分解，故形成白色菌落 PCR（+电泳）/核酸分子杂交 (4) 破碎/裂解 蛋白质工程 ACA//TGT变成AGA//TCT（或ACA变成AGA） 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR（聚合酶链式反应）反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP（原料）、模板DNA、Mg2+。利用引物cd进行PCR2，扩增出来的DNA莲一长一短，因此需要再利用引物d以引物c扩增的短链DNA分子为模板再扩增一次才能获得产物2，所以至少需要经过2轮PCR2才能获得产物2。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，引物之间或引物内部不能互补配对，用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸，引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，提供了DNA聚合酶所需的3'端（末端），即为TaqDNA酶提供结合位点，引物的长度和位置决定了PCR扩增产物的大小，引物的设计基于已知的目标DNA序列，决定反应的特异性。 故选BCD。 （2）获得大量产物1和产物2后，经过变性，复性（指两条互补链恢复双螺旋结构）处理后，会形成4种DNA分子，即产物1与产物2，还有产物1上链和产物2下链互补配对的DNA分子和产物1下链和产物2上链互补配对的DNA分子。其中只有产物1上链和产物2下链互补配对的DNA分子（如图）才能进行重叠延伸PCR。重叠延伸后利用引物a和引物d进行PCR3。若要质粒pCLY11与t-PA突变基因高效连接，需质粒和突变基因切割后产生黏性末端能碱基互补配对，t-PA突变基因切割后的黏性末端分别为：-GGCC和-CTAG，则质粒pCLY11需要用XmaⅠ和BglⅡ切割，所以此时需要在引物的5’端添加XmaⅠ和BglⅡ限制酶的识别序列。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌的方法是首先用钙离子处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，再将重组质粒与感受态大肠杆菌混合，在短暂的热刺激完成转化，使重组质粒导入大肠杆菌。将转化后的大肠杆菌接种在含有新霉素和X-gal的培养基上，培养一段时间。含重组质粒的大肠杆菌含有新霉素抗性基因，能在该培养基上生存，重组质粒的laZ基因被破坏，不能将X-gal分解，故形成白色菌落。除此以外，要检测在受体细胞中是否存在目的基因，可采用DNA分子杂交技术。 （4）将含重组质粒的大肠杆菌进行扩大培养，发酵结束后，收集大肠杆菌，采用一定方法使大肠杆菌裂解，释放出t-PA，经分离、纯化获得质检合格的t-PA。研究人员通过设计和改造t-PA基因获得特定的t-PA，该技术称为蛋白质工程。已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA。 19．（24-25高二下·浙江温州·期末）人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由α链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题： 注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是_______。 (2)阶段Ⅱ将建好的融合基因表达载体与感受态大肠杆菌在_______上共同培养，该过程可通过调整物质浓度和转速来提升导入率，然后在含有_______的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (3)为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物对融合基因进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、TaqDNA聚合酶、_______、引物、Mg2+、缓冲液等。电泳时需要添加的缓冲液有_______（A．磷酸缓冲液B．Tri-硼酸缓冲液C．上样缓冲液D．扩增缓冲液），在制备PCR反应体系时，用_______反复吹吸使反应液混合均匀。以3000r/min的转速离心30s使反应液集中于_______的底部。采用PCR技术获取和扩增融合基因（两侧序列见图2）时，所需要的两种引物序列分别为_______（标出5’和3’端）。 (4)PCR反应中需要使用TaqDNA聚合酶，原因是_______，利用PCR技术对酵母菌进行hCGβ基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是_______。阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分_______（A．氨苄青霉素B．组氨酸C．无机盐D．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。 (5)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是_______。 【答案】(1)有利于hCGβ进入内质网加工 (2) 摇床 氨苄青霉素 (3) dNTP BC 微量移液器 微量离心管 5'-TCTGTGAAT-3'和5'-CTTGGATGAT-3' (4) ①在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而TaqDNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性 排除PCR体系中外源DNA的污染 AB (5)可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 【分析】图1中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。 【详解】（1）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。 （2）阶段Ⅱ将建好的融合基因表达载体与感受态大肠杆菌在摇床上共同培养，该过程可通过调整物质浓度和转速来提升导入率，由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 （3）PCR的反应体系包括模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP（作为合成DNA的原料）、缓冲液等，电泳时需要添加的缓冲液有Tri-硼酸缓冲液、上样缓冲液。在制备PCR反应体系时，用微量移液器反复吹吸使反应液混合均匀。以3000r/min的转速离心30s使反应液集中于微量离心管的底部。图2所示碱基序列磷酸端为5'端，羟基端为3'端，在进行PCR操作时，引物应分别基因两条链的3'端，根据碱基互补配对原则结合，所需要的两种引物序列分别为5'-TCTGTGAAT-3'和5'-CTTGGATGAT-3'。 （4）PCR反应中需要使用TaqDNA聚合酶，原因是在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而TaqDNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性。利用PCR技术对酵母菌进行hCGβ基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是排除PCR体系中外源DNA的污染。由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。 （5）AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。 20．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）研究发现，VvSUC27基因在葡萄的根等库器官（消耗或储存光合产物的组织）中大量表达，而在叶片中很少表达，猜测VvSUC27基因可能是编码特异性存在于库组织中的蔗糖转运蛋白。为验证VvSUC27基因的功能，研究人员通过酶切设计将VvSUC27基因反向插入pBI121质粒中构建了反义VvSUC27真核表达载体，再导入到烟草中进行生物学鉴定。VvSUC27基因和pBI121质粒的结构示意如下图甲、乙。 注：图甲呈现了VvSUC27基因原来的转录方向，KpnI、BamHI、SacI为限制酶识别位点，LB、RB分别为T-DNA的左边界、右边界 回答下列问题： (1)获得VvSUC27基因。以葡萄植株的________为材料提取总RNA，加入________处理以去除DNA污染，再经过_________形成cDNA。根据VvSUC27基因序列（图甲）设计引物1和引物2扩增基因片段，应在引物1和引物2的5’端分别添加限制酶_________的识别序列，以确保目的基因的反向插入。 (2)构建反义VvSUC27基因表达载体。对目的基因和质粒同时进行BamHI和SacI双酶切处理，然后利用________连接，得到重组表达载体。为验证VvSUC27基因是反向插入载体中，用不同的限制酶组合剪切重组质粒后，进行________分离酶切后的DNA片段，结果如下图所示。根据泳道________可判断VvSUC27基因是反向插入的。图中的________（选填上/下）端，对应电泳槽的正极。 (3)制备转反义VvSUC27基因烟草。先将经________溶液处理的农杆菌与重组表达载体混合，得到含有重组质粒的农杆菌液，再让其侵染经切割的叶片5min后，用无菌纸吸干多余的菌液后，将共培养的叶片接种到含有羧苄青霉素的培养基上培养一天，再转移到含有卡那霉素的培养基上培养生芽，这里羧苄青霉素和卡那霉素的作用分别是_________。待小芽长至3~5cm，转入只含________（填植物激素）培养基中继续培养生根，形成完整植株。 (4)鉴定转基因烟草的表型。对筛选得到的转基因烟草可进一步通过PCR和_________技术等，鉴定是否成功转入反义VvSUC27基因。继续研究发现转基因烟草根部蔗糖转运蛋白基因（NtSUT1）的mRNA含量与野生型烟草相近，但转基因烟草根部的蔗糖含量明显低于野生型烟草，可能的原因是________，使翻译受阻，无法在根部形成蔗糖转运蛋白，从而无法正常吸收蔗糖。 【答案】(1) 根 DNA酶 逆转录 SacI和BamHI (2) DNA 连接酶琼脂糖凝胶电泳 2 下 (3) CaCl2 去除农杆菌、筛选转化的植物细胞 生长素 (4) 核酸分子杂交 反义VvSUC27形成的mRNA与蔗糖转运蛋白基因的mRNA存在互补配对 【分析】题目聚焦葡萄 VvSUC27 基因的功能研究，通过基因工程技术展开实验：首先从葡萄储藏器官（如根、茎等储存光合产物的组织 ）提取 RNA，经 DNA 酶处理、逆转录获得 VvSUC27 基因的 cDNA，再利用限制酶（如 KpnⅠ、BamHⅠ 等 ）和 DNA 连接酶构建反义 VvSUC27 基因表达载体（反向插入 pBI121 质粒 ）；随后通过农杆菌转化法将载体导入烟草，借助抗生素（羧苄青霉素、卡那霉素 ）筛选与植物激素（生长素 ）诱导，获得转基因植株；最后利用 PCR、电泳等技术鉴定基因插入，结合表型分析（如蔗糖转运蛋白功能、蔗糖含量检测 ）验证基因功能，整体呈现基因工程从基因获取到功能验证的完整研究思路。 【详解】（1）因 VvSUC27 基因在根等库组织大量表达，故选根等组织提取总 RNA，保证获取目标基因转录的 RNA 。提取的 RNA 含 DNA 污染，需用 DNA 酶去除，以避免 DNA 干扰后续反转录 。RNA 经反转录合成 cDNA（PCR 扩增需 DNA 模板 ）。要实现基因反向插入载体，需在引物 5’端添加与载体多克隆位点匹配的酶切序列。载体用 BamHI 和 SacI 双酶切，故引物 5’端添加 BamHI 和 SacI 识别序列，以确保目的基因的反向插入。 （2） 酶切后的目的基因与质粒，需用 DNA 连接酶连接，形成重组载体。 酶切后的 DNA 片段大小不同，通过琼脂糖凝胶电泳分离。 反向插入时，酶切片段大小与正向插入不同。对比泳道 2（SacI + KpnI 酶切 ）和泳道 3（SacI + BamHI 酶切 ）的条带差异，可判断基因反向插入，反向插入后酶切产生的片段大小符合预期 。电泳时，DNA 分子因负电荷向 正极 移动，加样端为负极，故 下端对应正极。 （3） 农杆菌用 Ca²⁺ 处理，使其处于感受态，易吸收重组质粒 。 羧苄青霉素抑制非重组农杆菌，保留含重组质粒的农杆菌 ；载体含卡那霉素抗性基因 ，可用卡那霉素筛选成功转入重组载体的烟草细胞。 生芽后转入含生长素的培养基，诱导生根，完成植株再生 。 （4）除 PCR 外，用 分子杂交技术检测目的基因是否转入，如 DNA 探针杂交。反义 RNA 与 NtSUT1 的 mRNA 结合，阻碍核糖体翻译，使蔗糖转运蛋白无法合成，导致根部蔗糖含量降低。 21．（24-25高二下·浙江金华·期末）耳蜗毛细胞中的Prestin蛋白（由Prestin基因编码）是听觉信号转导的关键分子。为研究其功能，科研人员构建敲除Prestin基因小鼠，并进行了相关实验。回答下列问题。 (1)利用同源重组技术敲除基因，载体构建及敲除过程如图1所示： ①为构建打靶载体，需设计引物通过PCR扩增Prestin基因片段。在引物上添加PstI限制酶识别序列，应选择的引物组合为________与________（从图1标注的a、b、c、d中选填）。将得到的PCR产物酶切后插入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。 ②对Prestin基因和嘌呤霉素抗性基因（Purr）基因进行酶切，使Purr基因插入Prestin基因的外显子序列中，插入外显子序列中的目的是________。根据图1及下表限制酶信息，该过程中应选择________和________两种限制酶（填酶名称）分别对Prestin基因和Purr基因进行酶切，并用________酶连接完成打靶载体构建。 限制酶 KpnI MfeI HindⅢ EcoRI BamHI 识别序列及切割位点 ③将构建好的打靶载体通过________法导入小鼠的________细胞中。受体细胞基因组中的Prestin基因被替换为打靶载体上的________，该过程属于同源重组。打靶载体上未整合到基因组的部分会被降解。 (2)科研人员获得Prestin基因敲除纯合小鼠（KO）和野生型小鼠（WT），进行系列实验。 实验1：听觉行为学检测 装置：隔音箱内设发声器（可产生4~64kHz纯音）和通电网格地板 训练并选择：WT和KO小鼠在听到16kHz纯音时跳上安全平台逃避电击 测试：逐渐降低声强直至小鼠反应率<50%的阈值 结果： WT小鼠阈值：30dBSPL（声压级分贝） KO小鼠阈值：75dBSPL 实验2：毛细胞超微结构观察 扫描电镜观察耳蜗基底膜外毛细胞： WT：纤毛排列整齐，呈V形 KO：纤毛束紊乱，部分呈倒伏状 ①实验1中KO小鼠听觉阈值显著升高，说明________。训练前需进行播放声音但不电击的假刺激处理，其目的是选出________的小鼠。 ②纤毛的挺直排列需要消耗能量，实验2中KO小鼠纤毛异常，原因可能是Prestin蛋白缺失导致________（填细胞器名称）功能障碍。 ③通过基因治疗的方法向先天性缺乏Prestin基因的患者引入正常功能的基因，常用修饰过的________为载体，如________________________。 【答案】(1) a d 破坏Prestin基因 EcoRI MfeI DNA连接酶 显微注射 受精卵 插入Purr的Prestin基因 (2) Prestin蛋白缺失导致听觉敏感性下降 能听到声音，但不产生逃避行为 线粒体 病毒 腺病毒/逆转录病毒 【分析】1、引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）①DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此限制酶PstI识别序列应该添加在引物的5'端，同时引物只能与模板链的3'端结合，引物与模板链是反向平行的关系，引物d右侧是5'端，该端连有限制酶PstI识别序列，左侧是3'端，从3'端向左延伸DNA链可进行R基因上面一条链的PCR扩增，同理，引物a左侧是5'端，该端连有限制酶PstI识别序列，右侧是3'端，从3'端向右延伸可进行另一条链的扩增，所以应该选择引物a和d。 ②对Prestin基因和嘌呤霉素抗性基因（Purr）基因进行酶切，使Purr基因插入Prestin基因的外显子序列中，插入外显子序列中的目的是破坏Prestin基因。由图可知，Prestin基因内部有Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别位点，因此切割Prestin基因必须在这三种限制酶之间选择；Purr基因两侧具有Mfe I和Kpn I的识别序列，切割Purr基因只能在这两种限制酶之间选择，根据表中各种限制酶识别序列可知，只有Mfe I与EcoR I切割得到的黏性末端相同，都为AATT-3'，因此可用EcoR I切割Prestin基因，用Mfe I切割Purr基因，得到相同黏性末端之后再用DNA连接酶将其连接，即可将Purr基因插入到Prestin基因中，完成打靶载体构建。 ③将目的基因导入受体细胞时，若受体细胞是动物细胞，常采用显微注射法导入小鼠的受精卵。将打靶载体导入受体细胞后，打靶载体上的插入Purr的Prestin基因与受体细胞基因组中的Prestin基因发生交换（或同源重组），从而实现基因之间的替换。 （2）①实验1中KO小鼠听觉阈值显著升高，说明Prestin蛋白缺失导致听觉敏感性下降。训练前需进行播放声音但不电击的假刺激处理，其目的是选出能听到声音，但不产生逃避行为的小鼠。   ②纤毛的挺直排列需要消耗能量，实验2中KO小鼠纤毛异常，原因可能是Prestin蛋白缺失导致线粒体功能障碍，导致供能不足。 ③通过基因治疗的方法向先天性缺乏Prestin基因的患者引入正常功能的基因，常用修饰过的病毒为载体，如腺病毒（逆转录病毒）。 22．（24-25高二下·浙江衢州·期末）乳酸菌是一种非致病性微生物，可作为异源蛋白进入动物体内的载体，具有广阔的应用前景。研究人员尝试制备重组乳酸菌作为口服疫苗，为提升免疫效果，研究人员采用重叠延伸PCR技术将GFP基因与高表达启动子P11连接，构建重组质粒(如图)。已知GFP是来源于水母的绿色荧光蛋白，作为本研究的抗原蛋白，Cm为氯霉素抗性基因。回答下列问题: (1)乳酸菌获取与纯化:获取动物消化道内壁刮取物，加入无菌生理盐水振荡摇匀，采用______法接种于固体培养基上，培养一段时间后挑取单菌落接种于液体培养基中进行______培养基中加入磷酸氢二钾(K2HP04)与磷酸二氢钾(KH2P04)的作用是_______，为乳酸菌生长繁殖提供有利环境条件。 (2)构建重组乳酸菌: ①获取GFP基因:提取水母的基因组，通过PCR技术扩增GFP基因。PCR之初要进行预变性，以基因组作为模板进行PCR时需要更高的预变性温度和时间，这是为了______。 ②构建P11-GFP串联序列:PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，这是因为_______：为保证P11-GFP串联序列能定向接入质粒，由图分析设计引物时需_______。 ③构建重组质粒:利用BglⅡ限制酶、EcoRⅠ限制酶和_______酶，将P11-GFP串联序列与质粒载体连接，形成重组质粒。 ④转化乳酸菌:将重组质粒导入经_______处理的乳酸菌中，将处理过的乳酸菌涂布在含_______的LB平板中筛选重组乳酸菌。欲测定重组乳酸菌中GFP基因的转录水平，可用_______处理样品以避免乳酸菌中GFP基因的干扰，也可通过测定重组乳酸菌的_______来评估其GFP基因的表达水平。 (3)检测乳酸菌口服疫苗的免疫效果:给小鼠灌胃重组乳酸菌，可以通过检测小鼠体内_______的_______来评估乳酸菌口服疫苗的免疫效果。 【答案】(1) 稀释涂布法/划线法 扩大培养 维持pH稳定 (2) 确保DNA双链之间的氢键完全打开，以便引物与模板的结合 引物2和引物3存在互补序列 在引物1的5’端加入BglⅡ限制酶的识别序列，在引物4的5’端加入EcorⅠ限制酶的识别序列 DNA连接酶 CaCl2 氯霉素 DNA酶 绿色荧光强度/绿色荧光蛋白含量 (3) 抗绿色荧光蛋白 抗体的含量 【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。 【详解】（1）微生物的接种可采用稀释涂布平板法，也可采用平板划线法。接种培养一段时间后挑取单菌落接种于液体培养基中进行扩大培养，增大目的菌的浓度。微生物培养基调节pH值时可以用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，以维持微生物所需的正常酸碱度。 （2）①PCR每次循环都包括变性、复性和延伸过程。PCR过程中需要进行预变性处理，是为了是使增加模板DNA彻底变性的概率，确保DNA双链之间的氢键完全打开，以保证和引物顺利结合，使PCR过程顺利进行。 ②引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。根据质粒中的酶切位点，为保证P11-GFP串联序列能定向接入质粒，应在引物1的5’端加入BglⅡ限制酶的识别序列，在引物4的5’端加入EcorⅠ限制酶的识别序列。 ③构建重组质粒：利用BglⅡ限制酶、EcoRⅠ限制酶切割和DNA连接酶连接，将P11-GFP串联序列与质粒载体连接，形成重组质粒。 ④在将目的基因导入到受体细胞时要使用氯化钙处理受体细胞，使其处于感受态更易吸收重组质粒。因重组质粒上含有Cm氯霉素抗性基因，因此在进行筛选时应在培养基上添加氯霉素。避免乳酸菌中GFP基因的干扰，可以使用DNA酶将其水解除去。可通过测定重组乳酸菌的绿色荧光强度/绿色荧光蛋白含量来评估其GFP基因的表达水平。 （3）疫苗是抗原，因此进入机体后会引发机体产生抗体，所以抗体的含量可以作为评估效果的指标，其次GFP是来源于水母的绿色荧光蛋白，作为本研究的抗原蛋白，因此也可以测定抗绿色荧光蛋白来评估。 23．（24-25高二下·浙江温州·期末）番茄（2n=24）是重要的蔬菜作物，自花授粉。已知果实颜色有红色、粉色和白色，由等位基因A和a控制，其中白色是果实色素合成酶功能丧失所致。枯萎病是番茄的主要病害，抗病和感病由另一对等位基因B和b控制。现有红色感病的栽培种（AAbb）和白色抗病的农家种（aaBB），欲选育可稳定遗传的红色抗病品种。针对该育种过程及其衍生问题，回答下列问题： (1)授粉前，将栽培种番茄的花浸泡在44~45℃温水中5min，目的是______，再授以农家种花粉。为了______，授粉后需进行套袋处理。同时以栽培种为父本进行反交。 (2)正反交F1全为粉色抗病。F2表型及株数如下表（总株数825株）： 表型 红色抗病 粉色抗病 白色抗病 红色感病 粉色感病 白色感病 F2（株） 155 310 155 52 104 49 ①从F2中选不同基因型的红色抗病植株甲和乙、粉色抗病植株丙。甲自交子代全为红色抗病；丙自交子代为红色抗病、粉色抗病和白色抗病。若甲和丙杂交，子一代的基因型是______；乙连续自交的子二代红色抗病植株中，纯合子占______。 ②若以丙为原料进行单倍体育种，需进行______获得单倍体植株，该处理步骤的原理是_______。 (3)从安第斯山脉的“狼桃”到遍布世界的蔬果，番茄的诸多野生近缘种的抗逆性与营养潜力，可通过转基因技术等为可持续农业提供底层支撑。但转基因番茄也可能引发一些安全性问题，如转变为_______，从而引发过敏反应；再如引起基因________等环境安全性问题。 【答案】(1) 去雄/杀死雄蕊 防止外来花粉干扰 (2) AABB、AaBB 3/5 花药离体培养 植物细胞的全能性 (3) 致敏原/过敏原 漂移 【分析】基因的自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）授粉前将栽培种番茄的花浸泡在44~45℃温水中5min，目的是人工去雄，防止自花授粉，因为番茄是自花授粉作物，这样做可以保证后续能接受农家种的花粉进行杂交。再授以农家种的花粉后，为防止其他花粉的干扰，对授粉后的谷穗进行套袋处理，以确保杂交的准确性。 （2）①据题意可知，红色AA和白色aa正反交F1全为粉色，则粉色的基因型为Aa，感病bb和抗病BB杂交，后代全是抗病Bb，F2中抗病基因型为BB和Bb，从F2中选出的红色抗病甲，甲自交子代全为红色抗病，说明甲的基因型为AABB，粉色抗病植株丙自交子代为红色抗病、粉色抗病和白色抗病，说明丙的基因型为AaBB，甲和丙杂交，子一代的基因型是AABB、AaBB。甲和乙是不同基因型的红色抗病植株，因此乙基因型为AABb，乙自交的子一代为AABB：AABb：AAbb=1：2：1，再自交一代，子二代基因型及比例为AABB：AABb：AAbb=3：2：2，其中AABB和AABb是红色抗病植株，因此红色抗病植株中，纯合子占3/5。 ②单倍体育种时先花药离体培养获得单倍体植株，再人工诱导染色体数目加倍，因此若以丙为原料进行单倍体育种，需进行花药离体培养获得单倍体植株，花药离体培养的原理是植物细胞的全能性。 （3）过敏反应是指指已免疫的机体在再次接受相同物质的刺激时所发生的反应，引起过敏反应的物质叫做过敏原，转基因番茄也可能引发一些安全性问题，如转变为致敏原或者过敏原，从而引发过敏反应。在群体遗传学中，所谓基因漂移是指一个群体的遗传变异转移到另外一个群体的现象，转基因番茄可能会引起基因漂移等环境安全性问题。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题10 生物技术与工程 3大高频考点概览 考点01 发酵工程 考点02 细胞工程 考点03 基因工程 地 城 考点01 发酵工程 1．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）海盐非物质文化遗产——沈荡黄酒采用传统工艺古法酿造，以大米和小麦为主要原料，沈荡黄酒含糖分、有机酸、氨基酸、脂类及多种维生素，风味独特。制作流程主要为：制曲→浸米→蒸米→拌曲→入缸发酵→压榨→装瓶。下列叙述错误的是（　　） A．蒸米有利于加速营养物质利用 B．蒸米后立即拌曲可加速发酵进程 C．通过检测酒精浓度等指标监控发酵过程 D．混菌发酵是沈荡黄酒具有独特风味的原因之一 2．（24-25高二下·浙江宁波·期末）米曲霉（好氧菌）是我国传统发酵常用菌种之一，它能产生淀粉酶、蛋白酶等。豆酱以黄豆、蚕豆等为原料，通过米曲霉发酵制成。下列叙述错误的是（　　） A．米曲霉能将黄豆、蚕豆中的蛋白质分解成多肽和氨基酸 B．黄豆、蚕豆可提供微生物生长繁殖所需的碳源和氮源 C．传统豆瓣酱制作过程中需要严格灭菌和控制发酵条件 D．传统豆瓣酱制作过程中常需要将下层的酱翻至上层 3．（24-25高二下·浙江宁波·期末）丙草胺（C17H26ClNO2）是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。为筛选修复污染土壤的微生物，某研究小组从某地土壤中分离出能有效降解丙草胺的细菌菌株，并对其计数，操作过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．涂布前要检测培养基是否被污染可接种自来水后培养 B．涂布培养的结果表明每克土壤中的菌株数约为1.7×109个 C．该方法的计数结果往往比显微镜直接计数法偏大 D．在选择培养基中添加少量有机碳源以加速丙草胺降解菌的分离 4．（24-25高二下·浙江丽水·期末）通常情况下，当培养基中同时含有葡萄糖和乳糖时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，之后再利用乳糖，其生长曲线如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．葡萄糖和乳糖都可作为大肠杆菌的碳源 B．大肠杆菌的种群密度可通过稀释涂布平板法获取 C．大肠杆菌t时生长停滞可能与细胞中缺乏利用乳糖的酶有关 D．大肠杆菌由利用葡萄糖转变为利用乳糖的原因是发生了基因突变 5．（24-25高二下·浙江台州·期末）卡拉胶是一种多糖，可被卡拉胶酶降解，在固体培养基中卡拉胶被降解可形成透明圈。科研人员利用腐烂的角叉菜筛选出了高产卡拉胶酶菌株，通过发酵工程生产卡拉胶酶。下列叙述错误的是（　　） A．筛选高产卡拉胶酶菌株应使用以卡拉胶为唯一碳源的选择培养基 B．从腐烂角叉菜中提取菌液后，可用稀释涂布平板法进行菌种分离和纯化 C．应选择透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，扩大培养后用于工业发酵 D．工业发酵产生的发酵液直接经过滤处理获取纯净的卡拉胶酶产物 6．（24-25高二下·浙江杭州·期末）某家庭利用鲜牛奶和乳酸菌，运用传统发酵技术自制酸奶，其工艺流程为：鲜牛奶高温加热→接种→发酵→冷藏。下列叙述正确的是（    ） A．自制酸奶时需进行严格的无菌操作 B．鲜牛奶高温加热后立即加入乳酸菌 C．发酵前期需通气以利于乳酸菌增殖 D．发酵原料、菌种、温度影响酸奶风味 7．（24-25高二下·浙江舟山·期末）螺蛳粉是广西传统小吃，其独特味道主要来源于酸笋。酸笋制作一般依赖传统发酵，某工厂尝试将竹笋高温灭菌后，接种植物乳酸菌发酵，但发酵产物酸味和风味都不如传统发酵。下列叙述正确的是（　　） A．酸笋风味由乳酸菌的种类决定 B．传统发酵时不需要对竹笋灭菌 C．工厂发酵酸味较弱是由于培养液中乳酸菌数量较少 D．高温灭菌破坏了竹笋中的纤维素导致乳酸菌无法利用 8．（24-25高二下·浙江温州·期末）青霉菌（异养需氧型）处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应，且已知青霉菌菌体生长所需的最适温度为30℃。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列操作与目的存在错误的是（    ） A．发酵液碳源不宜使用葡萄糖——防止青霉素分泌受抑制 B．发酵过程中通入无菌空气——满足青霉菌呼吸需求 C．发酵罐内冷却水全程维持30℃——保持菌体最适生长温度 D．接种前对高产菌株扩大培养——缩短发酵罐内发酵周期 9．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）造纸厂排放的污水中含有大量木质素，易造成环境污染。研究人员欲从土壤中筛选得到能高效分解木质素的菌株，具体过程如下图所示。下列有关叙述错误的是（    ） A．可采集木材场附近的土壤进行筛选 B．操作过程共将土壤稀释了10000倍 C．培养基中除了木质素、水、琼脂外，还含其他物质 D．所用的接种方法是平板划线法 10．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）二都杨梅味道鲜美，但保质期短不易储存，可利用杨梅发酵制作果酒来延长其食用期限。下列有关杨梅果酒制作的叙述错误的是（    ） A．挑选杨梅时应去除腐烂的杨梅 B．可加入白砂糖提高杨梅酒的酒精度 C．发酵过程中酵母菌数量会不断增加 D．密封性不好可能导致杨梅酒带有酸味 11．（24-25高二下·浙江温州·期末）下列关于生物技术实践的叙述，错误的是（　　） A．对酵母菌进行涂布分离的时候，用蘸有酒精的涂布器进行涂布 B．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵 C．泡菜的风味与乳酸菌的种类有关 D．酒精发酵旺盛期间，即使含有醋杆菌，也不能将果汁中的糖发酵为醋 12．（24-25高二下·浙江金华·期末）某同学尝试利用苹果发酵制作苹果醋，基本过程如下图。下列叙述正确的是（    ） A．参与①②过程的发酵菌种均有成型细胞核 B．①②过程中发酵液pH均有所下降 C．过程①②均需灭菌操作 D．过程①②均需要排气 13．（24-25高二下·浙江衢州·期末）豆豉由黑豆或黄豆通过霉菌发酵制成，是中国传统特色发酵制品，其制作流程如下:选材→浸泡→蒸煮→加曲→前期发酵→调味→后期发酵(装坛)。下列叙述错误的是（    ） A．蒸煮可使组织软化、蛋白质变性，易于被霉菌利用 B．蒸煮具有一定的杀菌作用，蒸煮后需立即加曲搅拌 C．前期发酵过程中需要控制适宜温度，且要适时翻动 D．调味时添加的盐、白酒可发挥抑制杂菌生长的作用 地 城 考点02 细胞工程 1．（24-25高二下·浙江丽水·期末）某研究小组对三角梅的组培快速繁殖进行了研究，结果如表所示。 流程 最佳措施或最佳培养基 ①外植体的消毒 200mg/L的必洁仕 ②不定芽的诱导 MS+1.0 mg/L6-BA+0.1mg/LNAA ③不定芽的增殖 MS+2.0 mg/L6-BA+0.1mg/LNAA ④不定芽的生根 1/2MS+2.0mg/LIAA 注：不定芽是由茎段切口间接分化出的芽；1/2MS是将大量元素、微量元素和有机成分的浓度减半的MS培养基。 下列叙述错误的是（　　） A．流程①需考虑必洁仕的浓度和处理时间 B．与流程②相比，流程③高浓度的6-BA有利于不定芽的增殖培养 C．与流程③相比，流程④适当降低培养基浓度有利于不定芽的生根 D．整个实验的组培过程没有经历脱分化形成愈伤组织阶段 1．D 2．（24-25高二下·浙江宁波·期末）花椰菜（2n=18）是人们喜爱的蔬菜，种植时容易遭受病菌侵害，紫罗兰（2n=14）具有一定的抗病性。科研人员分别取紫罗兰叶肉细胞和花椰菜胚轴细胞，利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜-紫罗兰杂种植株，如图所示，其中①、②分别表示去除细胞壁、人工诱导融合过程。下列叙述正确的是（　　） A．①过程处理后获得原生质层 B．②过程仅获得一种融合细胞 C．取植物的胚轴细胞进行培育，有利于获得抗毒苗 D．培育花椰菜-紫罗兰杂种植株，体现了细胞膜的流动性和植物细胞的全能性 3．（24-25高二下·浙江温州·期末）驱蚊草含有香茅醛，能散发出一种特殊的柠檬型香气，从而达到驱蚊且对人体无害的效果。驱蚊草是把天竺葵的原生质体和香茅草的原生质体进行诱导融合后培育而成的。下列关于驱蚊草培育的叙述，正确的是（    ） A．可使用PEG诱导融合的原理是PEG能使细胞膜发生一定程度的损伤实现相互粘连而融合 B．虽然该方法克服了远缘杂交不亲和的障碍，但利用该方法培育的驱蚊草是高度不育的 C．制备原生质体时，需在较高渗透压的溶液中使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶处理细胞 D．植物体细胞杂交完成的标志是杂种细胞细胞壁的再生 4．（24-25高二下·浙江宁波·期末）油菜（2n=20）与黑芥（2n=16）杂交，得到的子代再经染色体数加倍形成芥菜（4n=36），图为培育过程中检测到的亲代和子代部分细胞相关数据，a-f代表不同种类的细胞。下列叙述错误的是（　　） A．a一定为黑芥的生殖细胞 B．同源染色体的分离不可能发生在f中 C．e中可能存在交叉互换现象 D．若用体细胞杂交技术培育芥菜，需选择c和d 5．（24-25高二下·浙江台州·期末）为培育“高产耐盐碱”的水稻植株，某研究小组利用植物体细胞杂交技术设计了如下实验流程图。已知耐盐、高产性状分别受细胞质基因和细胞核基因控制，下列叙述正确的是（　　） A．去壁处理在较低浓度甘露醇溶液中进行 B．失活处理目的是促使A1的细胞质和B1的细胞核失活 C．过程①可以细胞颜色差异为标记判断细胞融合情况 D．过程②获取的再生植株一定能表现出耐盐、高产的优良性状 6．（24-25高二下·浙江温州·期末）植物细胞工程作为一门新兴的生物技术，已经普遍应用于社会生产，下列叙述正确的是（　　） A．利用发酵罐大规模培养红豆杉细胞生产紫杉醇 B．利用花药离体培养得到二倍体或多倍体植株 C．利用杂交育种培育“番茄-马铃薯”杂种植株 D．利用茎尖进行植物组织培养可以获得抗病毒植株 7．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）市场对锦斑化等变异多肉植物的需求日益增长，对叶组织采取植物组织培养快速繁殖变异多肉植株应运而生。下列有关叙述错误的是（    ） A．利用植物组培有利于保持亲代的优良性状 B．外植体的消毒是植物组培成功的关键之一 C．愈伤组织的诱导形成过程中会逐渐失去叶绿素 D．炼苗阶段需选择营养丰富的基质 8．（24-25高二下·浙江衢州·期末）半夏是中国常用中药材之一。获得大量半夏植株的传统方式是利用固体培养基进行快速繁殖(如图)，研究人员利用“间歇浸没反应器”(可预设浸没频率、持续时间，使培养基间歇性地浸没植物组织器官)快速繁殖半夏。下列叙述错误的是（    ） A．外植体接种前可依次用75%乙醇、10%次氯酸钠进行消毒 B．与传统快繁相比，间歇浸没培养可改善气体交换、促进物质运输 C．与步骤②相比，步骤③中细胞分裂素类与生长素类物质的比值更大 D．步骤④过程的措施包括炼苗、培养基质灭菌、清洗苗根部、栽种等 9．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）针对某病原体的单克隆抗体制备流程如图1。鼠源抗体的结构如图2，其中5区可与抗原特异性结合，6区可引起人体免疫反应。下列叙述错误的是（　　） A．对小鼠多次注射某病原体后，只有一种B淋巴细胞被激活 B．经选择培养1获得能增殖的杂交瘤细胞 C．经选择培养2获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 D．若图2的单克隆抗体6区为人源抗体片段，可降低免疫排斥 10．（24-25高二下·浙江杭州·期末）花椰菜（2n=18）经济价值高，但易受病害影响。黑芥（2n=16）具有抗黑腐病基因。利用植物体细胞杂交技术，将花椰菜与黑芥的细胞融合，以培育抗黑腐病的花椰菜。下列叙述正确的是（    ） A．原生质体融合前需胰蛋白酶处理细胞壁 B．培育抗黑腐病的花椰菜不需要植物组织培养技术 C．培育抗黑腐病的花椰菜打破了生殖隔离的限制 D．获得抗黑腐病的花椰菜体细胞染色体数都为17 11．（24-25高二下·浙江丽水·期末）肿瘤细胞膜上的PD-L1蛋白与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞活化，发生免疫逃逸现象。为阻断该信号传递，某科研小组利用小鼠制备了抗PD-L1单克隆抗体，其流程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．取注射过PD-1小鼠的脾脏分离B淋巴细胞 B．杂交瘤细胞在选择培养基中不能生长、存活 C．对杂交瘤细胞逐步稀释使每孔有少数几个细胞 D．检测呈阳性的a中细胞是符合要求的连续细胞株 12．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）为增加产奶量高的奶牛数量，进行了“试管牛”培育，过程如图。下列叙述正确的是（　　） A．“试管牛”培育的原理是成体的体细胞具有全能性 B．需对良种母牛和良种公牛进行同期发情处理 C．精子采集后不能进行体外培养，应尽快用于体外受精 D．可取囊胚期的滋养层细胞进行性别鉴定 13．（24-25高二下·浙江宁波·期末）人体心肌细胞中组成肌钙蛋白的亚基cTnI在血液中含量上升是心肌损伤的特异性指标。下图为制备抗cTnI的单克隆抗体的示意图。下列叙述正确的是（　　） A．动物细胞培养应在含5%CO2和95%O2的混合气体的恒温培养箱中进行 B．可在培养基中添加抗生素以防止有害代谢物的积累 C．用cTnI多次免疫小鼠可产生更多能产生特异性抗体的B淋巴细胞 D．甲、乙、丙中，只含杂交瘤细胞的是丙 14．（24-25高二下·浙江杭州·期末）某科研团队为去除某种单克隆抗体粗提液中的硫酸铵，将其加入密封透析袋中，置于主要成分为磷酸氢二钠等无机盐的PBS缓冲液中透析24h，期间多次更换PBS缓冲液。透析袋膜是一种允许离子自由通过的半透膜。下列叙述正确的是（    ） A．该单克隆抗体可自由通过透析袋膜 B．透析袋膜与质膜的透过性完全相同 C．多次更换PBS缓冲液可缩短实验时间 D．透析后的单克隆抗体溶液不含无机盐 15．（24-25高二下·浙江舟山·期末）人正常乳腺细胞和人乳腺癌细胞有部分相同的膜蛋白。科研人员通过以下过程获得能特异性识别乳腺癌细胞的靶向药物，下列说法错误的是（　　） A．两组小鼠注射的抗原种类不同 B．①中抗体类型不同，②中抗体类型相同 C．利用CO2培养箱对杂交瘤细胞进行扩大培养 D．该单克隆抗体可特异性杀死乳腺癌细胞 16．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）科研人员以牛耳成纤维细胞成功克隆了高产奶牛，这为培育和繁殖优质种畜提供了新的思路，实验过程涉及核移植与胚胎移植两项核心技术。下列叙述错误的是（    ） A．该操作所需的卵母细胞可通过超数排卵获得 B．常利用电刺激激活重组细胞的分裂和发育 C．体外培养至原肠胚可提高胚胎着床的成功率 D．胚胎移植前需对代孕母牛进行同期发情处理 17．（24-25高二下·浙江杭州·期末）研究者设计了利用植物细胞工程技术培育抗病柑橘的操作流程，如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．过程②中应将愈伤组织置于较低渗透压的溶液中 B．将过程③中X射线处理对象换成植株或器官，诱变频率降低 C．通过观察原生质体能否发生质壁分离可判断其是否具有活性 D．通过过程④获得的抗病柑橘均可通过有性生殖稳定遗传 18．（24-25高二下·浙江温州·期末）通过培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时，下列进行的细胞培养相关操作，错误的是（　　） A．细胞培养液中添加的血清可采用过滤方式除菌 B．采用封闭式培养有利于培养液pH保持相对稳定 C．仙台病毒处理可使细胞膜发生一定程度的损伤，进而促进细胞融合 D．须筛选出抗原-抗体反应较灵敏的杂交瘤细胞株继续培养 19．（24-25高二下·浙江金华·期末）利用胚胎工程等技术可以提高奶牛的繁殖速度，如图表示繁育良种奶牛的流程。下列叙述错误的是（    ） A．体外受精获得的多个受精卵遗传物质一般不同 B．早期胚胎培养的培养液中需加入灭菌的血清 C．①过程涉及胚胎分割技术，提高了移植胚胎的成活率 D．②过程涉及胚胎移植技术，此技术是胚胎工程获得后代的唯一方法 20．（24-25高二下·浙江台州·期末）研究人员利用体外受精和胚胎移植快速繁育优良种牛。下列叙述错误的是（　　） A．体外受精前，精子需处理以获得受精所需的能量 B．体外受精前，需对供体母牛进行超数排卵处理 C．胚胎移植前，可取滋养层细胞进行胚胎性别鉴定 D．胚胎移植前，需要对受体母牛进行同期发情处理 21．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）人心肌肌钙蛋白T（cTnT）是心肌受损的血清标志物。为提高心肌损伤的诊断速度，研究人员利用细胞融合技术建立了特异性分泌抗cTnT抗体的杂交瘤细胞株，具体过程如下图所示。下列叙述错误的是（    ） A．骨髓瘤细胞不能在HAT培养基上生存 B．过程①、②均需在CO2培养箱中进行 C．过程②利用抗原-抗体特异性结合的原理 D．需用cTnT刺激细胞株分泌单克隆抗体 22．（24-25高二下·浙江温州·期末）CD20是淋巴细胞的特异性膜蛋白之一，研究者设计如下图所示的技术流程制备抗CD20的单克隆抗体。下列叙述正确的是（　　） A．注射抗原后，甲细胞直接分化为浆细胞 B．经过步骤B后的细胞类型只有三种 C．细胞丁可在CO2培养箱中培养，也能冻存 地 城 考点03 基因工程 一、单选题 1．（24-25高二下·浙江金华·期末）某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．过程①加入的研磨液中含抑制DNA酶活性的物质 B．过程②④过滤后分别取滤渣和滤液进行后续操作 C．过程⑤加入酒精析出白色絮状物后进行后续操作 D．过程⑥中需加入NaCl溶液重新溶解DNA后进行后续操作 2．（24-25高二下·浙江丽水·期末）囊性纤维病是一种常染色体隐性遗传病，利用带有荧光标记的DNA探针进行基因诊断。甲、乙、丙三个样本个体的诊断结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．探针诊断的原理是利用碱基互补对原则 B．根据检测结果可判定甲乙正常，丙患病 C．据结果推测囊性纤维病涉及多个复等位基因 D．若乙和丙婚配生出一男孩，正常概率为1/4 （24-25高二下·浙江宁波·期末）2025年5月全球首例个性化CRISPR基因编辑疗法成功应用于一名患有罕见病的婴儿，通过静脉滴注，脂质纳米粒（LNP）包裹的CRISPR/Cas9药液进入婴儿体内并被肝脏细胞吸收，精准地修复一个关键基因的缺陷，从而改善病症。阅读材料完成下列小题： 3．下图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中sgRNA（向导RNA）可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的靶位点。下列有关说法正确的是（　　） A．Cas9蛋白可识别并切割特定的脱氧核苷酸序列 B．上图B基因的编辑属于基因突变，编辑后可以通过DNA分子杂交技术进行检测 C．sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 D．该技术可通过对人类胚胎基因的定向改造来预防某些疾病的发生 4．脂质纳米颗粒（LNP）是临床认可的非病毒核酸传输系统。研究人员使用Cas9mRNA替代Cas9DNA，并对其和sgRNA进行修饰，再用脂质封装Cas9mRNA和sgRNA。下列有关叙述错误的是（　　） A．脂质体与靶细胞的融合体现了膜的选择透过性 B．RNA包裹在LNP颗粒中可避免人体RNA酶的水解 C．选择Cas9mRNA而非Cas9DNA的优点之一是起效快 D．研究者在LNP表面包被特异性抗体，可实现肝细胞的靶向性递送 5．（24-25高二下·浙江杭州·期末）剔除转基因生物中的标记基因，可减少生物安全问题带来的疑虑。下图是利用双T-DNA表达载体系统培育无标记基因转基因大豆的基本流程。下列叙述错误的是（    ） 注：D6D为目的基因，bar为标记基因；两个T-DNA片段随机插入大豆细胞染色体中，每个片段只插入一次，且不考虑基因突变、染色体畸变和交叉互换等。 A．该双T-DNA表达载体中既包含复制起点，又包含适当的转录和翻译信号 B．若两个T-DNA插入同一条染色体中，通过自交无法筛选出符合要求的植株 C．若两个T-DNA插入同源染色体中，则F1中含D6D不含bar的植株占1/4 D．若两个T-DNA插入非同源染色体中，则F1中含D6D不含bar的植株占3/8 6．（24-25高二下·浙江杭州·期末）PYL9基因是一种重要的脱落酸受体基因。科学家通过基因工程使番茄中原有的PYL9基因过量表达。实验发现，与普通番茄相比，这种转基因番茄抗旱性更强。下列分析合理的是（    ） A．PYL9基因存在于野生型和转基因番茄中 B．PYL9基因过量表达使番茄对脱落酸敏感度下降 C．PYL9基因过量表达促进了番茄气孔开放 D．PYL9基因过量表达增强抗旱性是偶然现象 7．（24-25高二下·浙江温州·期末）基因工程会用到多种限制酶，下列为部分限制酶的识别序列和酶切位点及其在某质粒上的酶切位点。下列叙述正确的是（　　） A．Sau3AⅠ可切割BamHI和BclⅠ的识别序列，其不具有专一性 B．质粒分别被BamHI和BclI切割后，在DNA连接酶的作用下，可以避免发生环化 C．用Sau3AⅠ切割目的基因，用BamHI切割质粒，形成的重组质粒能被Sau3AⅠ切成5个片段 D．构建重组质粒时，切割该质粒的限制酶应选择BamHI和Sau3AⅠ 8．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）2021年4月15日，《中华人民共和国生物安全法》正式实施，下列做法和分析符合生物安全法的是（　　） A．不发展、不生产生物武器 B．可以开展人类的生殖性克隆 C．转基因食品由于制作时已被灭活，无需风险评估 D．将目的基因转入叶绿体的农作物不影响周围物种 9．（24-25高二下·浙江丽水·期末）生物技术安全和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是（　　） A．转基因作物上市前无需通过食品和环境安全评价 B．生物武器利用致病微生物、毒素等形成杀伤力 C．治疗性克隆可解决器官移植时的免疫排斥问题 D．设计试管婴儿技术可减少遗传病的发生概率 二、简答题 10．（24-25高二下·浙江宁波·期末）粮食安全是“国之大者”，大豆是重要的农产品，改良大豆种子尤为重要。科研人员为研究大豆P34蛋白基因启动子（简称P启动子）的调控活性，将P启动子与GUS基因（一种报告基因，用于指示外源基因的表达情况；b链为转录模板链）融合，如图所示。通过农杆菌转化法导入烟草进行研究，旨在为大豆品质改良提供有力工具。 注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同 回答下列问题： (1)获得P启动子。据图分析，以大豆基因组DNA为模板，选取______（填数字）作引物进行PCR，可获得P启动子克隆。 (2)构建P-GUS基因表达载体。为了确保P启动子与GUS基因融合，且P-GUS基因能与Ti质粒高效连接，则需要在克隆P启动子的两种引物的______（5'或3'）端分别连接________两种限制酶识别序列，并用______两种限制酶对Ti质粒进行酶切。 (3)将P-GUS基因表达载体导入受体细胞和植物组织培养。先用______处理农杆菌，使细胞处于感受态，再将表达载体导入农杆菌，将其接种在含______的固体培养基中进行培养，筛选转化成功的农杆菌。再用农杆菌侵染经______的烟草叶片，置于MS培养基中，暗环境下培养3天，_______处理后，转移至分化培养基中，待根系发达后移栽至土中。 (4)P-GUS基因的检测和鉴定。可通过______技术确定P-GUS基因是否导入。为检验最终的实验目的是否达到，还应检测______（“P启动子”或“GUS基因”）在烟草各组织中的表达量。 11．（24-25高二下·浙江丽水·期末）酿酒酵母是乙醇发酵领域的模式微生物，在生物燃料和酿酒工业中应用广泛。然而，该菌种由于缺乏葡萄糖淀粉酶，无法直接降解淀粉类原料。研究人员将糖化酵母中的葡萄糖淀粉酶基因S导入到酿酒酵母细胞中，构建的工程菌能够自主完成淀粉水解与乙醇发酵。下图为相关的重组质粒构建示意图。 注：↓为相应酶切位点，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制原点，LacZa基因编码的酶能够将底物X-gal分解为蓝色，URA3能够表达尿嘧啶。 回答下列问题： (1)目的基因的获取：糖化酵母具有很厚的细胞壁，先经________处理后，提取其总基因组较为容易。检索________中的目的基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。该PCR体系中的扩增缓冲液常含有Mg2+，其作用是________。扩增后的产物经________鉴定后，切胶回收目的条带。 (2)酿酒酵母的转化：使用________限制酶处理S基因和表达质粒，在________作用下作连接反应，构建出重组表达质粒。用________吸取适量尿嘧啶缺陷型酿酒酵母，与线性化的重组表达质粒混匀，转化后的酿酒酵母涂布在含________、不含________的平板上培养并筛选。 (3)葡萄糖淀粉酶产量和活性的测定：已知葡萄糖淀粉酶是胞外酶，将转化后的酿酒酵母扩大培养，培养液经离心后取________（填“上清液”或“沉淀物”），分离、纯化目标蛋白并测定其产量。还可将转化后的酿酒酵母接种于以淀粉为唯一碳源、添加有________指示剂的平板上，通过比较________判断酶活性。 (4)你认为同一实验批次的工程菌，其表达的葡萄糖淀粉酶产量________（填“是”或“否”）存在差异，并阐述理由。________。 12．（24-25高二下·浙江杭州·期末）围食膜是对虾消化道重要结构之一，是一种由几丁质和围食膜蛋白质结合而成的半透性膜，具有帮助食物消化、保护肠道上皮细胞等功能。回答下列问题： (1)电子显微镜的观察结果显示，围食膜仅允许直径在20nm以下的颗粒通过，该尺寸小于常见的病原体，从免疫类型的角度分析，围食膜的作用属于_________免疫。 (2)选取对虾_________组织（A．肌肉B．表皮C．胃和肠D．鳃），提取其mRNA并构建_________文库。测序发现，有一段序列在该文库中出现的频率很高，模拟翻译后与_________中的几丁质酶氨基酸序列比较分析，发现其蛋白产物也具有能和_________结合的位点，推测该序列来自于围食膜蛋白基因，并将相关基因命名为PT，编码链序列如下（其中1号位碱基位于5'端）。 注：起始密码子为AUG，终止密码子为UAA、UAG、UGA，数字表示碱基排序。 (3)根据已有研究，推测围食膜蛋白第1至19位氨基酸的肽段（信号肽）具有定位功能，能够把正在合成中的围食膜蛋白引导至内质网腔中，进而分泌到胞外。为了验证该肽段的功能，科学家通过_________技术分别扩增了PT基因和不含有信号肽对应区域（上图中深色区域）的PT序列（PTWSP），用于扩增PTWSP的一对引物是_________和5'-GAATTCTTAAGTACCTGGACAGAAGCCGTC-3'（引物序列中的下划线部分为构建表达载体时使用的酶切位点）。 A．5'-GGATCCATGAGGTCCAATACGTTCTTTGTT-3' B．5'-GGATCCATGAGAGACTTGCGAGCTAAACGC-3' C．5'-GGATCCAGAGACTTGCGAGCTAAACGCCGT-3' 将扩增得到的PT基因和PTWSP分别与_________载体相连构建重组DNA分子，为使目的基因蛋白产物与天然蛋白尽可能接近，优先选择导入_________（A．大肠杆菌B．酵母菌C．农杆菌D．昆虫卵巢细胞），记为PT组和PTWSP组，2组细胞分别在不含几丁质的液体培养基中培养一段时间后，用_________技术检测是否表达出围食膜蛋白。若推测成立，则实验结果为_________。 13．（24-25高二下·浙江嘉兴·期末）GFP蛋白最早在发光水母体内找到，它由GFP基因表达产生，在紫外线等激发下发出绿色荧光。下列是有关GFP的部分研究，回答下列问题： (1)提取水母DNA时，通常将组织冷冻处理并加入少量石英砂，目的是________。DNA提取液可选择2mol/L的________溶液。为防止所提取的核酸分子中存在RNA分子，可在提取液中加入________处理。 (2)分析水母基因组DNA时，在保证反应充分进行下，若想获得较小的片段，可以选择下列哪种限制酶？________。 (3)GFP基因的遗传改造可采用随机诱变PCR技术创造突变基因，再将扩增产物分别重组到表达载体（如图），然后分别转化大肠杆菌，最后筛选能发出其他颜色荧光的菌株。 ①为保障GFP突变基因能够与载体连接，随机诱变PCR时所设计的引物________端含有限制酶酶切序列。为提高PCR退火时的温度，引物碱基组成中需提高________碱基的比例。为了对GFP基因进行诱变改造，可以将PCR缓冲液中的________替换成锰离子，提高扩增时碱基错配的机会。 ②经转化的大肠杆菌，通过涂布法分离培养得到多个单菌落，在紫外线的照射下，淘汰________的单菌落，从剩余菌落中寻找所需基因。 (4)GFP基因可广泛应用到转基因植物中。如：将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游、乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。两组农杆菌分别侵染愈伤组织后，可在愈伤组织中检测到绿色荧光的是________（选填“甲组”“乙组”），原因是________。 14．（24-25高二下·浙江舟山·期末）水稻害虫主要通过啃咬、钻蛀水稻的绿色组织如叶片、茎秆危害水稻，从而影响水稻产量。为解决此问题，研究人员将两种抗虫基因Cry和Vip融合，培育双抗虫转基因水稻，其具体过程如图。表格是相关限制酶的识别序列及酶切位点信息。回答下列问题： 限制酶 NcoI XhoI EcoRI 识别序列和酶切位点 C↓CATGG C↓TCGAG G↓AATTC Cry基因部分序列:5'-GAGCTA……TAGTGC-3' Vip基因部分序列:5'-GTACAA……TATCAA -3' (1)将Cry基因和Vip基因拼接获得融合基因，引物P2和引物P3之间碱基序列的特点是必须有______（填“相同”或“互补”）片段。PCR1和PCR2至少经过______轮循环才能获得目标片段。③过程不需要引物，理由是______。 (2)为使过程④融合基因能按正确方向插入质粒，扩增融合基因时，需选择一对引物______，并在它们的5'端分别加上特定限制酶的识别序列。写出扩增融合基因模板链的引物5′_______3'（写出12个碱基） (3)通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定。若用NcoI酶切割质粒的电泳结果为5.5kb，再用Xhol酶切后，出现0.1kb和5.4kb两个片段。用NcoI酶切割重组质粒的电泳结果为7kb，则重组质粒中的目的基因片段分子量为_______kb。 (4)将重组质粒转入感受态农杆菌后，通过一定的方法处理使农杆菌______，再筛选出含重组质粒的农杆菌。⑥过程中选用水稻愈伤组织细胞，其意义是______，并用含______培养基筛选发生转化的水稻细胞。 (5)为缓解人们对转基因抗虫水稻的顾虑，研究人员通过_______使抗虫基因不在水稻胚乳（食用部分）中表达，同时又能发挥其抗虫效果；再以______为阴性对照，通过______技术进一步鉴定水稻的不同部位两种抗虫基因是否表达出抗虫蛋白质。 (6)除上述通过拼接融合基因的方式导入两种抗虫基因，还可以先分别获得两种单抗虫转基因植株，再通过______获得双抗虫的转基因水稻。 15．（24-25高二下·浙江台州·期末）番茄易受低温伤害，导致严重减产。我国科研人员从番茄低温诱导表达数据库中发现了低温下才能表达的Y基因。为了研究Y基因的具体作用，科研人员拟构建Y基因过度表达植株（Y-OE）及Y基因敲除植株（Y-KO）。 (1)图1为构建Y基因过度表达植株（Y-OE）的具体步骤： ①获取Y基因序列并扩增：将番茄细胞置于_______环境下处理后从细胞中提取总RNA，以此为模板进行逆转录，构建______，从中获取Y基因。为使Y基因与载体能够正确连接并顺利表达，应在引物______（填“3’端”或“5’端”）分别添加限制酶BamHI及______的识别序列。 ②构建重组质粒并转入农杆菌：用限制酶分别酶切质粒及Y基因片段，在______催化下连接成重组质粒。将重组质粒转入处于______（填生理状态）的农杆菌，筛选转化成功的农杆菌。 ③获得转化成功的植物细胞：将农杆菌与愈伤组织共培养，利用添加了_______的培养基筛选转化成功的愈伤组织，培养愈伤组织获取Y-OE植株。 (2)图2为利用向导RNA-Cas9蛋白复合物进行基因编辑，构建Y基因敲除植株（Y-KO）。由图可知，Cas9蛋白催化DNA的______（填化学键名称）水解，达到切割目标基因的目的。有时Cas9蛋白会对非目标基因进行切割，其原因可能是______。该基因编辑技术会导致细胞中发生______（填变异类型）从而干扰目的基因的表达，起到基因敲除的效果。 16．（24-25高二下·浙江宁波·期末）人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但大剂量使用会诱发颅内出血。为此研究人员通过蛋白质工程将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸（密码子为UCU、UCC、UCC、UCG），获得了副作用显著降低的改良t-PA蛋白。图1为用重叠延伸的方法对t-PA基因进行定点突变及构建表达载体的过程。最后将表达载体导入大肠杆菌中诱导表达来生产t-PA改良蛋白。回答下列问题： (1)改良t-PA基因： ①根据_______提供的t-PA基因的序列分别设计引物。先利用引物______进行PCR1，至少需要_______次循环才能获得双链等长的产物1；再通过PCR2，获得产物2；PCR1和PCR2过程不能在同一反应系统中进行。原因是______。重叠延伸后利用引物______进行PCR3，获得大量改良t-PA基因。 ②研究表明，t-PA蛋白第84位氨基酸相应基因的模板链（图中t-PA基因的上链）的碱基序列是ACA，若诱变引物b的突变位点引入的碱基是G，则改造后第84位的丝氨酸的密码子是______。 (2)构建表达载体：将改良t-PA基因用限制酶切后得到如上图所示的片段，那么质粒pCLY11需用限制酶______切割，才能与改良t-PA基因高效连接。 (3)筛选工程菌：质粒pCLY11中的lacZ表达产物可以将X-gal分解为半乳糖和深蓝色物质，从而使所在的菌落呈现蓝色，反之则为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有_______的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的菌落是_______色。 (4)生产t-PA改良蛋白：可利用发酵罐大量培养工程菌来生产t-PA改良蛋白，发酵过程中需控制的参数是_______。 A．温度和pH     B．溶解氧 C．营养物质浓度  D．搅拌转速 利用大肠杆菌生产的t-PA改良蛋白还需解决加工和分泌问题，主要是因为大肠杆菌缺少______（填细胞器）。 (5)研究发现运用动物细胞工程可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图2所示。 过程②需先将t-PA改良基因与乳腺中特异表达基因的________等调控元件重组，过程④运用了胚胎移植技术，此过程前还需对胚胎进行______。 (6)在获取性能优良的t-PA突变蛋白的过程中，科学家是通过对基因的操作来实现的，而不是直接对天然的t-PA蛋白进行操作，主要原因是_______（答出1点即可）。 17．（24-25高二下·浙江温州·期末）具有抑菌作用的β-苯乙醇易挥发，有玫瑰香味，被广泛应用于食品和化妆品中。自然界中存在能够合成β-苯乙醇的多种微生物，但这些微生物体内高浓度的β-苯乙醇不仅会抑制微生物的生长，也会抑制β-苯乙醇的合成，从而导致天然β-苯乙醇产量低、提取难。 (1)研究发现，部分酵母菌不受上述______调节机制影响，能高产β-苯乙醇。为筛选该类别的酵母菌，需要在选择培养基灭菌______（填“前”或“后”）加入一定浓度梯度的β-苯乙醇。接种时，需将土壤样品稀释后采用________法。 (2)核糖体DNA（rDNA）是DNA中用于转录rRNA的区段，因进化速率慢等优点常被用于物种鉴定。已知rDNA包含可变区和所有酵母菌间几乎无差别的保守区。上述筛选完成后，为鉴定酵母菌菌种，需提取酵母菌的rDNA。依据_______区设计引物，对可变区进行PCR扩增。PCR产物经电泳分离后，需与_______比对以确定种属。 (3)已知高产酵母菌中的ARO10基因表达的脱羧酶是合成β-苯乙醇的关键酶。研究人员把ARO10基因导入到普通酵母菌中进行过量表达，并检测β-苯乙醇的产量。 ①将ARO10基因与质粒连接构建重组载体（如图甲）。构建重组______（选填“表达”或“克隆”）载体时，用BamHI、SalI切割质粒后，用DNA连接酶连接质粒和ARO10基因。 ②重组载体导入酵母菌前，需用PEG/LiAc处理酵母菌细胞使其成为更易接受载体的______细胞。由图甲可知，转化后的酵母菌中的ARO10基因在转录时以其______链为模板链。 ③筛选成功转化目的基因的重组菌时，应将无抗生素平板上的酵母菌先接种到含______的培养基中，再将存活菌落影印到含_______的培养基中。 (4)①发酵过程中检测β-苯乙醇含量，结果如图乙。48小时后产量下降，可能的原因是______。 A．产物积累抑制菌体生长  B．营养物质消耗 C．发酵条件变得不适宜    D．营养物质过多 ②若要进一步提高产量，可通过________工程改造关键酶的结构。 18．（24-25高二下·浙江温州·期末）组织纤维溶酶原激活物（t-PA）能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。临床使用发现t-PA有诱发颅内出血的副作用，为此研究人员将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸（密码子UCU），获得了副作用显著降低的改良t-PA．下图为利用重叠延伸PCR技术改造t-PA基因和构建相应的表达载体的过程。（注：质粒pCLY11中的lacZ表达产物可以将X-gal分解为半乳糖和深蓝色物质） (1)PCR反应体系中通常含有模板、______、引物、TaqDNA聚合酶、扩增缓冲液等。研究人员先利用引物ab进行PCR1，获得产物1；再利用引物cd进行PCR2，至少需要经过______轮PCR2才能获得产物2.PCR时，引物可以______（多选）。（A．决定变性时间B．决定反应的特异性C．决定扩增产物大小D．为TaqDNA聚合酶提供结合位点） (2)获得大量产物1和产物2后，经过变性，复性（指两条互补链恢复双螺旋结构）处理后，会形成______种DNA分子，其中只有产物1上链和产物2下链互补配对的DNA分子（如图）才能进行重叠延伸PCR。重叠延伸后利用引物______进行PCR3，且需要在引物的5’端添加______限制酶的识别序列，经过PCR3后获得大量改良t-PA基因。 (3)构建形成重组质粒后，在低温条件下将重组质粒与感受态的大肠杆菌混合，进行短暂的______，使重组质粒导入大肠杆菌。将转化后的大肠杆菌接种在含有新霉素和X-gal的培养基上，培养一段时间后，形成白色菌落的是含重组质粒的大肠杆菌，其筛选的原理是______。除此以外，还可以采用______技术检测受体细胞中是否存在目的基因。 (4)将含重组质粒的大肠杆菌进行扩大培养，发酵结束后，收集大肠杆菌，采用一定方法使大肠杆菌______，释放出t-PA，经分离、纯化获得质检合格的t-PA．研究人员通过设计和改造t-PA基因获得特定的t-PA，该技术称为______。研究表明，改造前t-PA蛋白第84位氨基酸相应基因的模板链的碱基序列是ACA，则改造前后该位点氨基酸相应基因碱基序列的变化是______。 19．（24-25高二下·浙江温州·期末）人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由α链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题： 注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是_______。 (2)阶段Ⅱ将建好的融合基因表达载体与感受态大肠杆菌在_______上共同培养，该过程可通过调整物质浓度和转速来提升导入率，然后在含有_______的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (3)为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物对融合基因进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、TaqDNA聚合酶、_______、引物、Mg2+、缓冲液等。电泳时需要添加的缓冲液有_______（A．磷酸缓冲液B．Tri-硼酸缓冲液C．上样缓冲液D．扩增缓冲液），在制备PCR反应体系时，用_______反复吹吸使反应液混合均匀。以3000r/min的转速离心30s使反应液集中于_______的底部。采用PCR技术获取和扩增融合基因（两侧序列见图2）时，所需要的两种引物序列分别为_______（标出5’和3’端）。 (4)PCR反应中需要使用TaqDNA聚合酶，原因是_______，利用PCR技术对酵母菌进行hCGβ基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是_______。阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分_______（A．氨苄青霉素B．组氨酸C．无机盐D．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。 (5)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是_______。 20．（24-25高二下·浙江绍兴·期末）研究发现，VvSUC27基因在葡萄的根等库器官（消耗或储存光合产物的组织）中大量表达，而在叶片中很少表达，猜测VvSUC27基因可能是编码特异性存在于库组织中的蔗糖转运蛋白。为验证VvSUC27基因的功能，研究人员通过酶切设计将VvSUC27基因反向插入pBI121质粒中构建了反义VvSUC27真核表达载体，再导入到烟草中进行生物学鉴定。VvSUC27基因和pBI121质粒的结构示意如下图甲、乙。 注：图甲呈现了VvSUC27基因原来的转录方向，KpnI、BamHI、SacI为限制酶识别位点，LB、RB分别为T-DNA的左边界、右边界 回答下列问题： (1)获得VvSUC27基因。以葡萄植株的________为材料提取总RNA，加入________处理以去除DNA污染，再经过_________形成cDNA。根据VvSUC27基因序列（图甲）设计引物1和引物2扩增基因片段，应在引物1和引物2的5’端分别添加限制酶_________的识别序列，以确保目的基因的反向插入。 (2)构建反义VvSUC27基因表达载体。对目的基因和质粒同时进行BamHI和SacI双酶切处理，然后利用________连接，得到重组表达载体。为验证VvSUC27基因是反向插入载体中，用不同的限制酶组合剪切重组质粒后，进行________分离酶切后的DNA片段，结果如下图所示。根据泳道________可判断VvSUC27基因是反向插入的。图中的________（选填上/下）端，对应电泳槽的正极。 (3)制备转反义VvSUC27基因烟草。先将经________溶液处理的农杆菌与重组表达载体混合，得到含有重组质粒的农杆菌液，再让其侵染经切割的叶片5min后，用无菌纸吸干多余的菌液后，将共培养的叶片接种到含有羧苄青霉素的培养基上培养一天，再转移到含有卡那霉素的培养基上培养生芽，这里羧苄青霉素和卡那霉素的作用分别是_________。待小芽长至3~5cm，转入只含________（填植物激素）培养基中继续培养生根，形成完整植株。 (4)鉴定转基因烟草的表型。对筛选得到的转基因烟草可进一步通过PCR和_________技术等，鉴定是否成功转入反义VvSUC27基因。继续研究发现转基因烟草根部蔗糖转运蛋白基因（NtSUT1）的mRNA含量与野生型烟草相近，但转基因烟草根部的蔗糖含量明显低于野生型烟草，可能的原因是________，使翻译受阻，无法在根部形成蔗糖转运蛋白，从而无法正常吸收蔗糖。 21．（24-25高二下·浙江金华·期末）耳蜗毛细胞中的Prestin蛋白（由Prestin基因编码）是听觉信号转导的关键分子。为研究其功能，科研人员构建敲除Prestin基因小鼠，并进行了相关实验。回答下列问题。 (1)利用同源重组技术敲除基因，载体构建及敲除过程如图1所示： ①为构建打靶载体，需设计引物通过PCR扩增Prestin基因片段。在引物上添加PstI限制酶识别序列，应选择的引物组合为________与________（从图1标注的a、b、c、d中选填）。将得到的PCR产物酶切后插入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。 ②对Prestin基因和嘌呤霉素抗性基因（Purr）基因进行酶切，使Purr基因插入Prestin基因的外显子序列中，插入外显子序列中的目的是________。根据图1及下表限制酶信息，该过程中应选择________和________两种限制酶（填酶名称）分别对Prestin基因和Purr基因进行酶切，并用________酶连接完成打靶载体构建。 限制酶 KpnI MfeI HindⅢ EcoRI BamHI 识别序列及切割位点 ③将构建好的打靶载体通过________法导入小鼠的________细胞中。受体细胞基因组中的Prestin基因被替换为打靶载体上的________，该过程属于同源重组。打靶载体上未整合到基因组的部分会被降解。 (2)科研人员获得Prestin基因敲除纯合小鼠（KO）和野生型小鼠（WT），进行系列实验。 实验1：听觉行为学检测 装置：隔音箱内设发声器（可产生4~64kHz纯音）和通电网格地板 训练并选择：WT和KO小鼠在听到16kHz纯音时跳上安全平台逃避电击 测试：逐渐降低声强直至小鼠反应率<50%的阈值 结果： WT小鼠阈值：30dBSPL（声压级分贝） KO小鼠阈值：75dBSPL 实验2：毛细胞超微结构观察 扫描电镜观察耳蜗基底膜外毛细胞： WT：纤毛排列整齐，呈V形 KO：纤毛束紊乱，部分呈倒伏状 ①实验1中KO小鼠听觉阈值显著升高，说明________。训练前需进行播放声音但不电击的假刺激处理，其目的是选出________的小鼠。 ②纤毛的挺直排列需要消耗能量，实验2中KO小鼠纤毛异常，原因可能是Prestin蛋白缺失导致________（填细胞器名称）功能障碍。 ③通过基因治疗的方法向先天性缺乏Prestin基因的患者引入正常功能的基因，常用修饰过的________为载体，如________________________。 22．（24-25高二下·浙江衢州·期末）乳酸菌是一种非致病性微生物，可作为异源蛋白进入动物体内的载体，具有广阔的应用前景。研究人员尝试制备重组乳酸菌作为口服疫苗，为提升免疫效果，研究人员采用重叠延伸PCR技术将GFP基因与高表达启动子P11连接，构建重组质粒(如图)。已知GFP是来源于水母的绿色荧光蛋白，作为本研究的抗原蛋白，Cm为氯霉素抗性基因。回答下列问题: (1)乳酸菌获取与纯化:获取动物消化道内壁刮取物，加入无菌生理盐水振荡摇匀，采用______法接种于固体培养基上，培养一段时间后挑取单菌落接种于液体培养基中进行______培养基中加入磷酸氢二钾(K2HP04)与磷酸二氢钾(KH2P04)的作用是_______，为乳酸菌生长繁殖提供有利环境条件。 (2)构建重组乳酸菌: ①获取GFP基因:提取水母的基因组，通过PCR技术扩增GFP基因。PCR之初要进行预变性，以基因组作为模板进行PCR时需要更高的预变性温度和时间，这是为了______。 ②构建P11-GFP串联序列:PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，这是因为_______：为保证P11-GFP串联序列能定向接入质粒，由图分析设计引物时需_______。 ③构建重组质粒:利用BglⅡ限制酶、EcoRⅠ限制酶和_______酶，将P11-GFP串联序列与质粒载体连接，形成重组质粒。 ④转化乳酸菌:将重组质粒导入经_______处理的乳酸菌中，将处理过的乳酸菌涂布在含_______的LB平板中筛选重组乳酸菌。欲测定重组乳酸菌中GFP基因的转录水平，可用_______处理样品以避免乳酸菌中GFP基因的干扰，也可通过测定重组乳酸菌的_______来评估其GFP基因的表达水平。 (3)检测乳酸菌口服疫苗的免疫效果:给小鼠灌胃重组乳酸菌，可以通过检测小鼠体内_______的_______来评估乳酸菌口服疫苗的免疫效果。 23．（24-25高二下·浙江温州·期末）番茄（2n=24）是重要的蔬菜作物，自花授粉。已知果实颜色有红色、粉色和白色，由等位基因A和a控制，其中白色是果实色素合成酶功能丧失所致。枯萎病是番茄的主要病害，抗病和感病由另一对等位基因B和b控制。现有红色感病的栽培种（AAbb）和白色抗病的农家种（aaBB），欲选育可稳定遗传的红色抗病品种。针对该育种过程及其衍生问题，回答下列问题： (1)授粉前，将栽培种番茄的花浸泡在44~45℃温水中5min，目的是______，再授以农家种花粉。为了______，授粉后需进行套袋处理。同时以栽培种为父本进行反交。 (2)正反交F1全为粉色抗病。F2表型及株数如下表（总株数825株）： 表型 红色抗病 粉色抗病 白色抗病 红色感病 粉色感病 白色感病 F2（株） 155 310 155 52 104 49 ①从F2中选不同基因型的红色抗病植株甲和乙、粉色抗病植株丙。甲自交子代全为红色抗病；丙自交子代为红色抗病、粉色抗病和白色抗病。若甲和丙杂交，子一代的基因型是______；乙连续自交的子二代红色抗病植株中，纯合子占______。 ②若以丙为原料进行单倍体育种，需进行______获得单倍体植株，该处理步骤的原理是_______。 (3)从安第斯山脉的“狼桃”到遍布世界的蔬果，番茄的诸多野生近缘种的抗逆性与营养潜力，可通过转基因技术等为可持续农业提供底层支撑。但转基因番茄也可能引发一些安全性问题，如转变为_______，从而引发过敏反应；再如引起基因________等环境安全性问题。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题10 生物技术与工程 3大高频考点概览 考点01 发酵工程 考点02 细胞工程 考点03 基因工程 地 城 考点01 发酵工程 1．B 2．C 3．B 4．D 5．D 6．D 7．B 8．C 9．D 10．C 11．A 12．B 13．B 地 城 考点02 细胞工程 1．D 2．D 3．A 4．C 5．C 6．A 7．D 8．C 9．A 10．C 11．D 12．D 13．C 14．C 15．D 16．C 17．B 18．B 19．C 20．A 21．D 22．C 地 城 考点03 基因工程 一、单选题 1．B 2．D 3．B 4．A 5．D 6．A 7．C 8．A 9．A 二、简答题 10．(1)2和3 (2) 5’ BamHI、EcoRI BamHI、HindⅢ (3) Ca2+/CaCl2 卡那霉素 消毒 脱菌 (4) PCR/DNA分子杂交（答出1点即可） GUS基因 11．(1) 破壁（或去壁）（或酶解法/机械法破壁） 基因数据库/NCBI/GeneBank 激活Taq酶（或提高DNA聚合酶活性） 电泳（或琼脂糖凝胶电泳） (2) Acc65Ⅰ和BspDⅠ DNA连接酶 移液枪 氨苄青霉素和X-gal 尿嘧啶 (3) 上清液 碘-碘化钾/碘 透明圈直径/菌落直径/透明圈大小 (4) 是 目的基因整合在受体细胞染色体的位置和数量不同 12．(1)非特异性 (2) C cDNA 数据库/蛋白质数据库 几丁质 (3) PCR B 表达 D 抗原-抗体杂交 PT组在培养基中可以检测到围食膜蛋白，而PTWSP组不能（只有PT组在培养基中可以检测到围食膜蛋白） 13．(1) 有助于细胞结构的破坏 NaCl RNA酶 (2)酶3 (3) 5＇ GC 镁离子 绿色荧光和不发荧光 (4) 甲组 农杆菌质粒中，只有T-DNA侵入植物细胞内 14．(1) 互补 2 两条部分互补杂交链已存在3’端，DNA聚合酶可以直接在3’端连接脱氧核苷酸。/在TaqDNA聚合酶催化下，可分别以这两条链为引物进行延伸 (2) P1和P4 CCATGGGAGCTA (3)1.6 (4) 恢复生理活性 愈伤组织全能性高，培养成水稻植株的成功率高 潮霉素 (5) 添加绿色组织特异性启动子 非转基因水稻 抗原-抗体分子杂交 (6)杂交 15．(1) 低温 cDNA文库/基因文库 5'端 SalI DNA连接酶 感受态 潮霉素 (2) 磷酸二酯键 其他基因也含有与向导RNA互补配对的序列 基因突变 16．(1) 基因数据库（序列数据库） a和b 2 引物b和c存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系它们会结合而失去作用 a和d UCU (2)Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ (3) 新霉素和X-gal 白 (4) ABCD 内质网、高尔基体 (5) 启动子 性别鉴定 (6)t-PA蛋白具有十分复杂的空间结构，而t-PA基因的结构相对简单，更容易改造；t-PA改良基因可以遗传给下一代，t-PA突变蛋白不能遗传 17．(1) 负反馈 后 稀释涂布平板/涂布分离 (2) 保守 基因数据库 (3) 表达 感受态 β 氯霉素 四环素 (4) ABC 蛋白质 18．(1) dNTP 2 BCD (2) 4 ad XmaI、BglⅡ (3) 热刺激 含重组质粒的大肠杆菌含有新霉素抗性基因，能在该培养基上生存，重组质粒的laZ基因被破坏，不能将X-gal分解，故形成白色菌落 PCR（+电泳）/核酸分子杂交 (4) 破碎/裂解 蛋白质工程 ACA//TGT变成AGA//TCT（或ACA变成AGA） 19．(1)有利于hCGβ进入内质网加工 (2) 摇床 氨苄青霉素 (3) dNTP BC 微量移液器 微量离心管 5'-TCTGTGAAT-3'和5'-CTTGGATGAT-3' (4) ①在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而TaqDNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性 排除PCR体系中外源DNA的污染 AB (5)可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 20．(1) 根 DNA酶 逆转录 SacI和BamHI (2) DNA 连接酶琼脂糖凝胶电泳 2 下 (3) CaCl2 去除农杆菌、筛选转化的植物细胞 生长素 (4) 核酸分子杂交 反义VvSUC27形成的mRNA与蔗糖转运蛋白基因的mRNA存在互补配对 21．(1) a d 破坏Prestin基因 EcoRI MfeI DNA连接酶 显微注射 受精卵 插入Purr的Prestin基因 (2) Prestin蛋白缺失导致听觉敏感性下降 能听到声音，但不产生逃避行为 线粒体 病毒 腺病毒/逆转录病毒 22．(1) 稀释涂布法/划线法 扩大培养 维持pH稳定 (2) 确保DNA双链之间的氢键完全打开，以便引物与模板的结合 引物2和引物3存在互补序列 在引物1的5’端加入BglⅡ限制酶的识别序列，在引物4的5’端加入EcorⅠ限制酶的识别序列 DNA连接酶 CaCl2 氯霉素 DNA酶 绿色荧光强度/绿色荧光蛋白含量 (3) 抗绿色荧光蛋白 抗体的含量 23．(1) 去雄/杀死雄蕊 防止外来花粉干扰 (2) AABB、AaBB 3/5 花药离体培养 植物细胞的全能性 (3) 致敏原/过敏原 漂移 / 学科网（北京）股份有限公司 $