专题13 基因工程（山东专用）2026年高考生物二模分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程专题，汇编2026年山东各地二模试题，以CRISPR/Cas9治疗镰状细胞贫血、重组质粒构建等科技前沿情境为载体，考查工具酶选择、PCR技术、基因编辑等核心知识。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |单选题|4|基因工程基本操作（如干细胞培养无菌条件）、DNA提取（NaOH裂解）|结合科研案例（如真菌DNA快速提取），考查操作细节| |多选题|2|重组菌株筛选（抗性基因应用）、DNA提取影响因素（材料与温度）|设置实验结果表格（如不同材料DNA提取量），考查变量分析| |解答题|14|载体构建（双酶切定向连接）、基因编辑（CRISPR-Cas9靶向敲入）、PCR技术（重叠延伸拼接）|综合图表分析（如酶切电泳图、质粒结构示意图），突出科技前沿（如phiC31整合酶重组）与实验设计（如菌落PCR鉴定）|

专题13 基因工程 一、单选题 1．（2026·山东济南·二模）科研人员提取患者自体CD34+造血干细胞，在体外通过CRISPR/Cas9编辑BCL11A基因启动子上游的序列，从而抑制BCL11A基因的表达，重新激活胎儿血红蛋白的表达，替代异常的成人血红蛋白以根治镰状细胞贫血。下列有关说法正确的是（    ） A．该治疗方案使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输是由于干细胞在体外更容易增殖 B．经过该疗法治疗的患者，其生殖细胞的基因也被同步修复，后代将不再患病 C．在体外培养和编辑CD34+造血干细胞的过程中，需要严格保持无菌条件 D．若基因编辑过程中存在非目标位点被编辑的现象，其原因是BCL11A基因发生了基因突变 【答案】C 【详解】A、使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输的主要原因是避免异体移植带来的免疫排斥反应，并非因为干细胞在体外更容易增殖，A错误； B、该疗法编辑的是造血干细胞，属于体细胞，患者生殖细胞的基因未被编辑，后代仍可能携带致病基因患病，B错误； C、体外培养动物细胞的过程中，杂菌污染会导致细胞死亡、培养失败，因此需要严格保持无菌条件，C正确； D、基因编辑过程中非目标位点被编辑是CRISPR/Cas9的脱靶效应，由向导RNA错误结合其他序列相似的位点导致，并非BCL11A基因发生基因突变，D错误。 2．（2026·山东聊城·二模）为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。下列叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可使真菌菌体更易破碎 B．利用NaOH溶液提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出DNA等步骤 C．NaOH溶液提取DNA的时间不宜过长且不能剧烈振荡，以免造成DNA损伤断裂 D．缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能 【答案】D 【详解】A、液氮冷冻可使真菌细胞内的水分形成冰晶，破坏细胞膜结构，研磨时能更充分地破碎细胞，释放细胞内的DNA，A正确； B、传统DNA提取中，低温冷藏静置和冷却酒精析出的目的是使DNA沉淀。NaOH溶液呈碱性，可能通过破坏细胞膜和细胞壁快速释放DNA，从而省去这些步骤，B正确； C、DNA分子结构不稳定，长时间接触NaOH溶液或剧烈震荡可能导致其磷酸二酯键断裂，造成DNA损伤。因此，提取时间不宜过长且需避免剧烈振荡，C正确； D、缓冲液的主要作用是中和NaOH的碱性，维持溶液pH稳定。DNA酶的作用是分解DNA，实验中需抑制其活性以防止DNA被降解；同时，提取的DNA需避免微生物污染，缓冲液不具有促进微生物生长的功能，D错误。 3．（2026·山东日照·二模）基因工程中，使用单个限制酶酶切构建的表达载体易出现连接方向错误和重复插入目的基因片段等现象，可通过酶切及筛选标记鉴定出符合预期的重组质粒。研究人员将目的基因CDS插入质粒P的SacⅡ位点后，对重组质粒进行扩增、筛选和检测。P和CDS结构如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：X-gal被LacZ基因表达产物分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则为白色。 A．重组质粒被PstⅠ完全酶切后电泳可能会获得长度为9.4kbDNA片段 B．用EcoRⅠ与SacⅡ完全酶切重组质粒，可得到2个长度的DNA片段 C．用EcoRⅠ与PstⅠ完全酶切重组质粒，可判断CDS基因的连接方向 D．将含重组质粒的细胞涂布在含X-gal的培养基上，菌落颜色为白色 【答案】B 【详解】A、构建重组载体时使用的是单酶酶切，可能出现目的基因重复插入的情况，若2个CDS与载体P连接，则重组载体被PstI酶切后电泳，可能会得到长度约4.2+2.6+2.6=9.4（kb）的DNA片段，A正确； B、若1个CDS和1个载体P连接，该重组载体上有2个SacⅡ酶切位点和一个EcoRI酶切位点，经EcoRI和SacⅡ充分酶切后可以得到长度约0.5kb、2.1kb、4.2kb的DNA片段；若有多个CDS重复插入载体P，也能得到相同结果，B错误； C、1个CDS插入载体P的方式有两种，正向连接和反向连接，两种连接方向下重组载体被EcoRI和PstI酶切后的片段长度不同，因此可以判断CDS片段的连接方向，C正确； D、基因工程构建重组载体时，用SacⅡ酶切割载体P， 破坏了载体P的LacZ基因，含该重组载体的宿主细胞不能合成β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal，在含X-gal的培养基上菌落呈白色，D正确。 4．（2026·山东滨州·二模）下图为甲、乙两种DNA样品及其酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，已知甲、乙都只含有1个限制酶R的酶切位点，加样孔1和2加入的DNA分子分别是甲和乙，加样孔3和4加入的是甲或乙的酶切产物。下列说法正确的是（　　） A．电泳时核酸分子所带电荷性质与缓冲液pH无关 B．加样孔4对应的条带是甲被酶R完全酶切后电泳的结果 C．甲与乙分子中所含碱基对数近似相等 D．增加琼脂糖凝胶的浓度，甲、乙条带距离将变大 【答案】C 【详解】A、电泳时核酸分子所带电荷性质与缓冲液pH有关，A错误； B、已知甲、乙都只含有1个限制酶R的酶切位点，甲或乙酶切后会形成两个DNA片段，因此加样孔4对应的条带是甲或乙被酶R完全酶切后电泳的结果，B错误； C、甲、乙电泳显示的条带位置基本相同，说明甲与乙分子中所含碱基对数近似相等，C正确； D、增加琼脂糖凝胶的浓度，DNA迁移速度变慢，因此甲、乙条带距离将变小，D错误。 二、多选题 5．（2026·山东泰安·二模）假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶是3-磷酸甘油脱氢酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌可将假丝酵母野生型菌株转化，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示（注：是腐草霉素抗性基因，是卡那霉素抗性基因）。下列说法错误的是（　　） A．从农杆菌中提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后电泳，若出现3条条带则表明转化成功 B．在含有卡那霉素的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株 C．与野生型菌株相比，该重组菌株可提高发酵液中甘油的含量、缩短发酵时间 D．转基因生物可能对环境造成新污染或破坏，需灭菌处理后再丢弃 【答案】AB 【详解】A、从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。若出现3条条带，提示可能为未完全切割、多拷贝连接或非特异性片段，不能作为转化成功的标志，A错误； B、重组质粒中的Kanᴿ（卡那霉素抗性）位于T-DNA 外，农杆菌转化时，只有T-DNA 区域（含Gpd和Zeoᴿ）会整合到假丝酵母基因组中，Kanᴿ不会被整合。假丝酵母本身不携带 Kanᴿ抗性，因此无法在含卡那霉素的培养基上筛选重组菌株，应使用腐草霉素（Zeoᴿ）进行筛选，B错误； C、从图2曲线可见，重组菌株的甘油含量始终高于野生型；重组菌株更早达到甘油含量峰值，说明发酵周期更短，C正确； D、转基因微生物可能通过基因扩散影响生态环境，因此实验室培养的重组菌株必须经过灭菌处理后再丢弃，防止污染，D正确。 6．（2026·山东德州·二模）称取等量新鲜的花菜、辣椒和蒜黄剪碎后分别均分成两组，一组置于20℃、另一组置于-20℃条件下，两组均保存24h后，将各组的DNA的粗提取物溶于2mol/L的NaCl溶液中，用相关试剂进行鉴定，结果如表所示。下列叙述错误的是（　　） 材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄 20℃ ++ + +++ -20℃ +++ ++ ++++ 注：“+”越多表示蓝色越深。 A．该实验可用于探究不同材料和不同温度对DNA粗提取量影响 B．若采用离心法对DNA进行粗提取，2次离心后DNA都分布在上清液中 C．等质量的不同实验材料，在相同保存温度下，辣椒中提取DNA量最少 D．低温下保存时DNA提取量更多，可能是低温抑制了蛋白酶的活性所致 【答案】BD 【详解】A、实验的自变量是材料种类（花菜 / 辣椒 / 蒜黄）和保存温度（20℃/-20℃），因变量是 DNA 粗提取量（用蓝色深浅表示），因此该实验可用于探究不同材料和不同温度对 DNA 粗提取量的影响，A正确； B、DNA 粗提取过程中，两次离心的 DNA 分布情况不同： 第一次离心（破碎细胞后）：DNA 溶解在 2mol/L 的 NaCl 溶液中，分布在上清液中； 第二次离心（加入酒精后）：DNA 不溶于酒精，会析出并沉淀在离心管底部，而非分布在上清液中。 因此 “2 次离心后 DNA 都分布在上清液中” 的说法错误，B错误； C、等质量的材料，在相同温度下，辣椒组的 “+” 最少（20℃时为 +，-20℃时为 ++），说明蓝色最浅，提取的 DNA量最少，C正确； D、低温（-20℃）下DNA提取量更多，可能是因为低温抑制了核酸酶的活性，减少了DNA的降解，从而提高了提取量，D错误。 三、解答题 7．（2026·山东临沂·二模）利用BsmB Ⅰ酶结合PCR技术可实现DNA片段无缝连接，从而构建目的基因。BsmB Ⅰ识别序列、切割位点及串联构建目的基因M的过程如图1。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9核酸酶对靶向双链DNA进行识别和切割，导致DNA双链断裂，断裂的DNA双链修复过程中可通过同源重组将载体上的目的基因靶向敲入。图2是结合该技术利用重组AAV病毒的DNA将目的基因M靶向敲入干细胞的过程。 (1)由图1可知，BsmB Ⅰ一次酶切产生的两个末端_____________（填“一定相同”“一定不同”“可能相同”）。gRNA依据________原则与靶序列特异性结合后，实现定点切割。设计gRNA时可适当________（填“延长”或“缩短”）gRNA的长度，提高敲除靶基因的准确性。 (2)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5'CGTCTCNcgacCAAAT…3'，则F2的序列为___________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列_________（接头序列用小写字母表示）。 (3)将图1中的目的基因M导入干细胞的靶向DNA后，分别提取DNA，同时加入图2所示的引物进行扩增，引物1、3扩增结果如图4。 引物1和2扩增后检测到条带说明________。根据图4结果推测，同源染色体中两条染色体均敲入了目的基因的组别可能是______。 【答案】(1) 可能相同 碱基互补配对 延长 (2) 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (3) 目的基因成功敲入 S2、S4、S5 【详解】（1）BsmBⅠ识别序列为5'-GCTCTCN-3'，切割后产生两个末端，由于N为任意碱基，因此两个末端可能相同（如N相同时）。gRNA通过碱基互补配对原则与靶DNA序列特异性结合，引导Cas9酶定点切割。 为提高敲除准确性，应适当延长gRNA长度，以增强其序列特异性，减少脱靶效应，提高敲除靶基因的准确性。 （2）据图可知，片段1与片段2经过PCR后连接在一起，R1切割后形成的黏性末端和F2被切割的黏性末端互补，图1可知，BsmB Ⅰ切割后的黏性末端为接头序列，已知R1序列为：5'-CGTCTCNcgacCAAAT...3'，其中“5'-cgac-3＇”属于片段1的一部分（下面一条链的后4个碱基），需与F2的接头互补， F2接头为“3＇-gctg-5＇”，与R1的“5'-cgac-3'”互补配对，F2的序列由识别序列和接头序列以及片段2部分序列构成（需要与片段2序列上游的3'碱基互补配对），故F2序列为 5’-CGTCTCNgtcgGTGCTGTA...3’ ； 方案二：R1序列为5'-CGTCTCNcgacCGACCAAAT...3'，方案一接头序列属于片段1的一部分，所以另一套方案F2的接头可以用片段2的一部分，与前4个碱基互补配对，故F2序列为：5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'。 （3）分析可知，引物1与左侧同源序列的上游片段结合，引物2与目的基因M内部片段结合，引物1和2扩增后检测到条带说明目的基因成功敲入。根据图4结果推测，电泳图谱中野生型所在的那条带是引物1、3扩增出来未敲入目的基因的片段大小，S1、S3都具有其中一条带，说明只有一条染色体上敲入了一个目的基因，还有一条染色体是未敲入目的基因，S2、S4、S5都只含有1条带，且扩增出来的条带片段更大比野生型扩增出来的条带更长（电泳的时候，DNA片段越大，跑的越慢，符合图2中所显示的敲入目的基因后，引物1和3扩增出来的片段更长），说明S2、S4、S5两条同源染色体均敲入了目的基因。 8．（2026·山东淄博·二模）某地中海贫血症是由于BCL11A 蛋白抑制血红蛋白基因的表达引起的。研究人员构建了含下调 BCL11A基因表达的改良型基因表达单元的重组载体，利用同源重组的方式将其导入患者的造血干细胞中并替换原BCL11A 基因，取得积极的研究进展。构建改良型BCL11A 基因表达单元 （图 1） 需要使用以下元件：BCL11A基因、BCL11A 基因特异启动子 （KLF） 、终止子 （无特异性） 、用于示踪的荧光蛋白基因 （GFP）、 荧光蛋白基因特异性启动子（CMV），在启动子上游抑制基因表达的沉默子（可远距离发挥作用）。 (1)图 1 中两个基因的转录方向都是从左到右，代表沉默子的数字是_____，代表终止子的数字是_____，终止子的作用是_____。将重组载体导人造血干细胞的常用方法是_____。 (2)为检测 BCL11A 基因的表达情况，研究人员提取了造血干细胞的总mRNA（可能混有基因组DNA）并逆转录为 cDNA，利用特定的 BCL11A 基因的引物进行 PCR 扩增 （不需要扩增 cDNA 的全部序列）。真核基因的编码区含有内含子和外显子，转录形成的 mRNA 不含有内含子对应序列。BCL11A 基因部分序列如图 2 所示。 为避免基因组 DNA 的扩增，需要选择的一对引物（只体现 5′端前 9 个碱基）是_____。_____（填序号）。 ①5′ATGTCTCGC 3′ ②5′ CTGCTATGT 3′ ③ 5′ CTGTGGTTG 3′ ④ 5′ CTCGCCCGA 3′ (3)研究发现造血干细胞中BCL11A 基因的表达量明显下降，但是荧光强度也很弱， 原因可能是_____。与传统输血治疗相比，该治疗方案的优势是_____（答出 1 点即可）。 【答案】(1) ① ④⑥ 终止转录（使转录在所需要的地方停下来） 显微注射法 (2) ② ④ (3) 沉默子远距离作用于GFP基因，抑制其表达 避免免疫排斥；效果持久；避免输血带来的感染 【详解】（1）两个基因的转录方向都是从左到右，而启动子在基因的上游，终止子在基因的下游，所以启动子在相应基因的左侧，终止子在右侧，基因在二者之间，根据⑤和⑥之间插入GFP，可以推知⑥一定是终止子，⑤是CMV，③是BCL11A 基因，②是KLF，④是终止子，所以④⑥是终止子，终止子的作用是终止转录（使转录在所需要的地方停下来）。沉默子在启动子上游抑制基因表达，可远距离发挥作用，所以可以推知①是沉默子。人造血干细胞是动物细胞，表达载体导入动物细胞常用的方法是显微注射法。 （2）引物①与左侧外显子5’端序列完全一致，这个序列在DNA和cDNA中都存在，作为引物能与基因组DNA和cDNA结合，无法区分二者；引物②和右侧外显子3’端的反向序列互补，可以作为下游引物；引物③和内含子右侧的CAACCACAG反向互补，由于cDNA不含有内含子，所以会扩增基因组DNA，而不能扩增cDNA；引物④对应左侧外显子的CTCGC加右侧外显子的CCGA，在切除内含子之后，可以与cDNA的5’端稳定结合，由于基因组DNA中间有内含子，无法有效结合扩增DNA，因此可以作为上游引物，所以为避免基因组 DNA 的扩增，需要选择的一对引物是②④。 （3）BCL11A基因表达量下降但荧光强度弱的原因可能是沉默子远距离作用于GFP基因，抑制其表达。该治疗方案相比传统输血的优势是避免免疫排斥；效果持久；避免输血带来的感染。 9．（2026·山东泰安·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞的形态结构等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。 (1)图中①过程需要使用______酶，该过程得到的DNA片段______（填“含有”或“不含有”）启动子序列；②过程需要用到的酶有______。 (2)为实现kit基因与运载体的定向连接，PCR扩增kit基因时，需要在引物的______（填“5’”或“3’”）端添加限制酶识别序列，引物的作用是______。可以用______限制酶双酶切kit基因与质粒pET-28a（+）。 (3)双酶切kit基因与质粒pET-28a（+）上长度为170bp片段进行置换，构建出重组质粒pET-28a（+）-kit，上述两种质粒经HindⅢ完全酶切后，片段长度如下表（每种片段仅出现一个）。 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindⅢ酶切片段 1000bp、2550bp 1050bp、2500bp、150bp 则kit基因长度为______，由此判定kit基因上有______个HindⅢ酶切位点。 (4)菌落PCR是直接以微生物菌体热解后的DNA为模板，以目的基因两端序列设计引物进行扩增的方法，根据凝胶电泳结果可初步鉴定菌落是否含有目的基因。对构建的基因工程菌进行菌落PCR验证，根据验证的结果提取大肠杆菌的质粒进行双酶切再验证，结果如图所示。初步分析可知，基因工程菌的构建______（选填“是”或“否”）成功，理由是______。 注：M为标准参照物，1为菌落PCR，2为质粒双酶切 【答案】(1) 逆转录酶 不含有 限制酶和DNA连接酶 (2) 5' 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ (3) 320bp 2/二 (4) 是 菌落PCR与质粒双酶切均可获得大小约320bp的基因片段 【详解】（1）图中①过程是以胶原蛋白mRNA为模板合成DNA（基因）的过程，此为逆转录过程，需要使用逆转录酶。因为该DNA片段是通过mRNA逆转录而来，不包含基因转录起始的启动序列，所以该过程得到的DNA片段不含有启动子序列。②过程是构建基因表达载体，需要的酶有限制酶和DNA连接酶。 （2）由于DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸延伸子链，因此需要在引物的5'端添加限制酶识别序列。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。由于ori复制原点中含有限制酶Hind Ⅲ的识别序列，因此不能用限制酶Hind Ⅲ来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对质粒pET-28a（+）进行双酶切。 （3）观察质粒pET-28a（+）图可知，在该质粒上有两个Hind Ⅲ的识别序列，一个在启动子和终止子之间，一个在复制原点ori中，因此用Hind Ⅲ切割质粒pET-28a（+）后，可得到两个片段，通过表格可知，这两个片段长度分别为1000bp和2550bp，说明质粒pET-28a（+）总长度是1000bp+2550bp=3550bp；利用双酶切法将kit基因与质粒pET-28a（+）长度为170bp片段进行置换后，形成的重组质粒pET-28a（+）-kit能被HindⅢ切割成三个片段，长度分别是1000bp、2000bp、700bp，说明置换后的kit基因上含有两个HindⅢ的识别序列，再加上复制原点ori中的一个HindⅢ的识别序列，共三个HindⅢ的识别序列，经HindⅢ酶切后才能将重组质粒pET-28a（+）-kit切成3段。利用这三段的长度可计算出重组质粒pET-28a（+）-kit的总长度为1000bp+2000bp+700bp=3700bp，由于kit基因与长度为170bp片段进行置换，设kit基因长度为n，可列出等式：3550+n-170=3700bp，故可计算出kit基因长度为n=320bp。 （4）由（3）分析可知，kit基因（即目的基因）的长度是320bp，根据电泳图可知，在约320bp处，菌落PCR组与质粒双酶切组均得到条带，说明基因工程菌的构建是成功的，且目的基因成功导入大肠杆菌中。 10．（2026·山东济南·二模）科研人员构建了整合酶（phiC31）基因表达载体和含有2个相向排列的attB位点和attP位点的红色荧光蛋白（DsRed）报告基因表达载体，分别如图1和图2所示。phiC31特异识别到Act4P启动子两侧attP位点（39bp）和attB位点（34bp）后，分别从两位点各自的中心位置碱基处切割双链DNA并使切下来的DNA片段反向旋转，再连接起来形成attL位点（36bp）和attR位点（37bp），继而完成位点特异性重组，如图2所示。phiC31不能识别attL位点和attR位点。已知相关基因和载体中只含图1所示的限制酶识别序列。回答下列问题。 (1)为了将引物F1和R1扩增得到phiC31和NLS融合基因克隆至图1载体目的基因插入位点，可在R1引物中引入图1中________酶切位点；将PCR产物进行双酶切后，可对限制酶Kpn Ⅰ切开的黏性末端中的单链进行________处理后才能在连接酶的作用下与Eco RV切开形成的________相连接。 (2)据图1分析，重组载体1中________酶（填“Bam H Ⅰ”或“Sau 3A Ⅰ”或“Eco RV”）的识别位点最多，其数量至少为________。 (3)已知家蚕细胞中不存在phiC31基因和attP、attB位点，将报告基因表达载体单独成功转染家蚕BmE细胞未观察到红色荧光信号，而phiC31基因表达载体和报告基因表达载体共同成功转染后则可观察到，说明在家蚕BmE细胞中，phiC31可催化图2中attB位点和attP位点之间DNA序列发生了________，该过程不可逆的原因是________。 (4)使用NLS与phiC31基因融合表达的目的是________。 【答案】(1) EcoR V 切除（切割/切掉/去除） 平末端 (2) Sau3A Ⅰ 3 (3) 位点特异性重组（倒位/翻转/断裂和翻转） attL位点和attR位点不会被phiC31识别 (4)核定位信号引导phiC31进入细胞核后起作用（将phiC31定位到细胞核） 【详解】（1）要将PCR产物克隆到载体目的基因插入位点，限制酶不能选择BamHI，因为融合基因中含有BamHI酶切位点，只能选择EcoR V，R₁引物需引入EcoR V酶切位点，F1中含有KpnI识别切割位点，将PCR产物进行双酶切后，Kpn I酶切后产生黏性末端，EcoR V切开产生平末端，需对Kpn I的黏性末端单链进行切除（切割/切掉/去除）处理，使其变为平末端。EcoR V切开形成的平末端，与处理后的平末端在连接酶作用下连接。 （2）图1中可以看出含有两个BamHⅠ酶切位点，则就含有两个Sau3AⅠ 的酶切位点，Eco RV切割后形成的平末端是5＇-GAT-3＇与Kpn Ⅰ切开的黏性末端切除后形成的平末端是5＇-C-3＇，用连接酶连接后形成一个Sau3AⅠ的识别位点5＇-GATC-3＇，重组载体1中Sau 3A Ⅰ的识别位点最多，其数量至少为3个。 （3）单独转染报告基因载体无荧光，共转染phiC31后有荧光，说明phiC31催化attB和attP位点间DNA序列反向旋转（倒位，使启动子正确驱动DsRed表达。phiC31不能识别重组产生的attL和attR位点，无法催化其再次重组。综上所述，phiC31可催化图2中attB位点和attP位点之间DNA序列发生了位点特异性重组（倒位/翻转/断裂和翻转），该过程不可逆的原因是attL位点和attR位点不会被phiC31识别。 （4）NLS是核定位信号序列，phiC31需进入细胞核发挥作用，因此融合NLS的目的是引导phiC31转运蛋白进入细胞核，使其在细胞核内发挥催化作用。 11．（2026·山东济宁·二模）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX启动子在DEX诱导下才可发挥作用；AUG为起始密码子，UAA、UGA、UAG为终止密码子。回答下列问题。 (1)图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切的优点是________（答出1点）。已知OsJRL40基因转录的非模板链的序列为：5'-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3'，为构建融合基因，引物2的前10个碱基序列为________。 A．5'-AGATCTCTAG-3' B．5'-AGATCTGTCA-3' C．5'-GATCCTAGTC-3' D．5'-GATCGTCAGC-3' (2)在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre酶可以将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，因此在设计引物3和引物4时需要在限制酶识别序列的________（填“5'端”或“3'端”）添加loxP序列。 (3)为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR技术进行鉴定。 实验组：首先提取在有DEX环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR扩增后用BglⅡ完全切割，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40基因和荧光素酶基因的条带。 对照组：用未经DEX环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。 若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。 【答案】(1) SacⅠ和XhoⅠ 避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接） B (2) 荧光素 有荧光出现 3′端 (3) 1和4 实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 【详解】（1）构建基因表达载体时，要将目的基因插入启动子和终止子之间，一般选用双酶切，避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接），切割载体用到的限制酶有SacⅠ和XhoⅠ，不能选用Bgl II，若用该酶切会破坏质粒上的四环素抗性基因，导致后续无法对重组DNA分子进行筛选。已知OsJRL40转录非模板链末端为5'-…GCTGACTAG-3'，构建融合基因需要去除原终止密码UAG，引物2为下游引物，其5'端需要添加BglⅡ的识别序列（5'-AGATCT-3'，共6个碱基），剩余4个碱基与OsJRL40末端互补，GTCA，因此前10个碱基为5'-AGATCTGTCA-3'，B正确。基因中间有SauAI的识别切割序列， 不能选该酶。 （2）融合基因的表达依赖DEX启动子，而该启动子仅在DEX诱导下才能启动转录，才能诱导融合基因表达出荧光素酶，因此培养液中须添加荧光素，荧光素酶催化荧光素产生荧光，因此检测到细胞有荧光出现即可证明转化成功。loxP等额外序列必须添加在引物的3'端，才能使Cre酶将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，完整保留目的片段两端。 （3）要扩增同时包含OsJRL40和荧光素酶基因的片段，需要选择OsJRL40上游的引物1和荧光素酶基因下游的引物4。Cre酶仅切除两个loxP序列之间的荧光素酶基因，OsJRL40基因不会被切除：实验组：DEX诱导Cre酶表达，荧光素酶基因被敲除，cDNA中仅保留OsIRL40基因，两种基因的条带都无；对照组：无DEX诱导，Cre酶不表达，荧光素酶基因完整保留。 12．（2026·山东德州·二模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题。 注：1．①、②、③和④是基因两端对应的引物 2．BsmBI的识别序列和切割位点信息（N代表任一碱基）： (1)利用大肠杆菌工程菌合成的hCGβ质量不理想，从细胞结构的角度分析原因是_____。对hCGβ基因进行PCR扩增时，所选引物是图中的_____，引物的作用是_____。 (2)限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端。载体信息如图所示，经BsmBI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-_____-3'和5'-_____-3'。 (3)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分_____（a．氨苄青霉素b．无机盐c．组氨酸d．葡萄糖），可在此培养基上生长的酵母菌即为转化成功的目的菌株，“转化”是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____的过程。 【答案】(1) 大肠杆菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对蛋白质进一步加工 ②、③ 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) CGTG CGAG (3) a、c 维持稳定和表达 【详解】（1）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是糖蛋白，大肠杆菌是原核生物，从细胞结构角度，原核细胞没有内质网、高尔基体，无法对核糖体合成的多肽链进行糖基化修饰，因此合成的hCGβ质量不理想。PCR扩增目的基因时，子链沿5′→3′方向延伸，引物需结合在目的基因两条链的两端，因此选择引物②和③；引物的作用是与模板链特异性结合，为DNA聚合酶提供延伸起点，使DNA聚合酶从引物3′端开始合成DNA。 （2）根据BsmB I的识别切割规律，该酶切割后会产生5′端突出的4个核苷酸的黏性末端；结合题中给出的载体酶切区序列，酶切后载体保留的两个黏性末端如下图，左边载体上保留的黏性末端序列应为5'-CGAG-3'和右边载体上保留的黏性末端序列应为5'-CGTG-3'。 （3）受体酵母菌是组氨酸缺陷型，只有成功导入携带组氨酸合成基因的重组质粒的酵母菌才能存活，因此筛选培养基不能添加组氨酸，才能筛选出成功转化的菌株；氨苄青霉素是筛选大肠杆菌（原核生物）时使用的选择试剂，酵母菌筛选不需要添加，因此不需要添加的成分是a（氨苄青霉素）和c（组氨酸）。基因工程中，转化的定义是：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 13．（2026·山东潍坊·二模）人体肠道中寄生的艰难梭菌接触到肠道分泌的溶菌酶后，会产生大量肽聚糖脱乙酰酶(PGD)改变细胞壁结构，以避免被溶菌酶伤害。已知艰难梭菌感应溶菌酶与蛋白甲和乙有关，为探究艰难梭菌感应溶菌酶的机制，科研人员预利用反义基因对蛋白甲和乙的表达进行抑制。前期设计的相关DNA结构如图1，其中→代表启动子，代表终止子。 (1)肠道分泌的溶菌酶属于免疫系统的第___________道防线。终止子在基因表达中的作用是___________。 (2)为将图1中的DNA片段拼合为质粒以导入艰难梭菌，可利用核酸酶特异性切除DNA5＇端单链，使各DNA片段两端的同源序列末端产生互补单链，混合后形成如图2的结构，然后用___________酶处理，将DNA双链补齐并实现多片段拼接与环化。上述过程中充当引物的单链是___________(填图2中编号)。若要将图1中的片段一次性拼合形成质粒，为避免错误连接共需要在图1的DNA片段的两端设计___________种DNA同源序列。 (3)添加不同诱导物对转基因艰难梭菌处理后，获得结果如图3。PGD相对值是指PGD与腺苷酸激酶的含量比值，利用该比值作为实验结果可有效排除艰难梭菌死亡等因素引起的实验误差。腺苷酸激酶作为参考蛋白需要具有在艰难梭菌中___________，受外界环境和实验处理的影响较小的特点。据实验结果分析，艰难梭菌感应溶菌酶调控PGD表达的机制是___________。 【答案】(1) 一 终止转录 (2) DNA聚合酶、DNA连接酶 ②、③ 3 (3) 含量稳定 甲蛋白促进PGD合成，乙蛋白抑制甲蛋白的功能，溶菌酶解除乙蛋白的抑制作用 【详解】（1）人体免疫系统的第一道防线由皮肤和黏膜组成，肠道不属于体液且分泌的溶菌酶有杀菌作用，溶菌酶属于黏膜分泌物，所以这属于免疫系统的第一道防线。终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，其在基因表达中的作用是终止转录过程。 （2）将DNA双链补平并实现多片段拼接与环化，需要DNA聚合酶补平末端，再用DNA连接酶连接片段、完成环化。引物需要与模板链3'端互补，结合图2的结构，②、③链可作为引物启动DNA合成。 若要将图1中的片段一次性拼合形成质粒，为避免错误连接共需要在图1的DNA片段的两端设计3种DNA同源序列（复制原点、木糖诱导型启动子＋反义基因甲、乳糖诱导型启动子＋反义基因乙，共3个不同的同源末端，保证定向拼接）。 （3）腺苷酸激酶作为参考蛋白需要具有在艰难梭菌中表达量稳定（含量稳定），受外界环境和实验处理的影响较小的特点。分析实验结果可知，无溶菌酶时，添加乳糖(诱导反义基因乙表达)会显著升高PGD相对值，说明蛋白乙会抑制PGD合成，添加木糖（抑制蛋白甲）PGD维持低水平，说明蛋白甲会促进PGD的合成，同时加乳糖＋木糖，PGD相对值较低，说明乙蛋白抑制甲蛋白的功能；有溶菌酶时，未添加诱导物（蛋白甲、乙正常表达）组PGD相对值较高，说明溶菌酶解除了乙蛋白的抑制作用，故艰难梭菌感应溶菌酶调控PGD表达的机制是:甲蛋白促进PGD合成，乙蛋白抑制甲蛋白的功能，溶菌酶解除乙蛋白的抑制作用。 14．（2026·山东东营·二模）植物受病原菌侵害时会产生大量水杨酸(SA)并利用SA合成水杨酸甲酯(MeSA)，释放给周围植物“报信”。科学家发现拟南芥S基因缺失株系①中MeSA合成受限，B基因缺失株系无法合成MeSA，为探究S蛋白和B蛋白在MeSA合成过程中的相互作用，科学家做了如下研究，相关信息如图所示。回答下列问题。 (1)为获得S-GST融合蛋白，需要构建S-GST基因过表达载体。通过PCR特异性扩增目的基因S(只含氨基酸编码序列，810个碱基对)需先设计引物，引物的作用是___________。为利用限制双酶切法将S基因连入载体，在引物___________(填“5′”或“3′”)端上添加相应的限制酶识别序列。实验室可使用的限制酶及载体信息如图1所示，已知目的基因中无图示限制酶识别序列，且引物上只添加限制酶识别序列，翻译过程从S基因的起始密码子开始，为正确表达S-GST融合蛋白，防止密码子读取错位，可选择的限制酶组合有___________种。 (2)将构建好的载体利用农杆菌导入株系①获得转基因株系①-1，提取转基因株系染色体DNA用构建载体的限制酶双酶切获得了与目的基因相同大小的片段，___________(填“能”或“不能”)证明目的基因成功导入受体细胞，原因是___________。后经测序发现只有一个T-DNA插入到①-1基因组中，利用测序结果设计了如图2所示特异性引物，让该株系自交，可选用图中三种引物___________(用字母表示)对自交后代基因组DNA进行PCR扩增并进行凝胶电泳检测，杂合子会出现一长一短两条电泳条带。 (3)为探究S蛋白与B蛋白之间的关系，又在株系①-1的基础上获得了可同时表达B-MBP蛋白的株系①-2，用可以和GST蛋白特异性结合的“磁珠”对不同株系总蛋白进行处理，处理过程中蛋白质保持活性，洗脱“磁珠”上的蛋白质，变性后进行凝胶电泳，抗体检测后结果如图3，推测蛋白S和蛋白B___________(填“能”或“不能”)结合。后续检测发现B蛋白是MeSA合成过程中的一种关键酶，且SA处理时①-2的MeSA合成能力较①-1显著增强，综合分析植物在受到病原菌侵袭时，完成“报信”的机制是___________。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 5′ 3 (2) 不能 限制酶切割植物基因组DNA时也可能出现与目的基因相同大小的DNA片段 acd或bcd (3) 能 病原菌侵染导致植物SA的大量合成，SA促进S蛋白和B酶结合，结合后B酶活性增强，大量合成MeSA，完成“报信” 【详解】（1）PCR技术中，引物的作用是与模板DNA特异性结合，为DNA聚合酶提供延伸起点，使DNA聚合酶从引物3'端开始连接脱氧核苷酸，合成子链。 限制酶识别序列需要添加在引物的5'端，若添加在3'端会影响引物与模板结合以及DNA子链延伸。 S基因共810个碱基对（为3的倍数），要保证融合蛋白读码框正确不错位，需要两个酶切位点之间被切除的碱基数为3的倍数，所给限制酶识别序列中包含四种限制酶识别序列，下游只能选择XbaI、上游可以选择SmaI、XmaI和BamHI，共三种组合。 （2）限制酶切割植物基因组DNA时可能会在多个位置出现同样的识别序列，这样在切割的时候可能出现与目的基因相同大小的DNA片段，有的片段有目的基因，有的片段没有，所以不能根据与目的基因相同大小的片段来确定基因是否成功导入受体细胞。 提取的染色体 DNA 用构建载体的限制酶双酶切，获得与目的基因相同大小的片段，只能说明该片段含有目的基因的酶切位点和大小，但无法区分该片段是来自插入到染色体上的重组载体，还是未整合到染色体上的游离载体 。杂合子出现一长一短两条电泳条带，是因为未插入的可以用cd扩增，题目说插入T-DNA以后，cd之间片段过长，但是未插入的时候可以扩增得到条带，另一条被插入的用ac扩增可以得到扩增条带，可选用图中三种引物acd或bcd进行扩增。 （3）据图分析，SA处理后①-2比①-1抗GST和抗MBP显著提高，说明①-2的MeSA合成能力显著增强，因此报信机制为：病原菌侵染导致植物SA的大量合成，SA促进S蛋白和B酶结合，结合后B酶活性增强，大量合成MeSA，完成“报信”。 15．（2026·山东日照·二模）M蛋白与“记忆”的形成密切相关，为研究相关机理科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，部分制作流程如图1。实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的外源蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。 (1)利用同源重组将外源基因插入染色体的特定位点，在PCR扩增片段①时，通常会在所用引物F1、R1的______（填“3′端”或“5′端”）添加同源序列。为了敲除小鼠的M基因，在构建载体1时，还应向M基因两端引入loxP位点，以图2中方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 (2)研究者利用______法将重组载体导入小鼠的______（填细胞）中，对代孕母鼠进行______处理，通过胚胎移植获得基因型floxM/floxM的小鼠。采用同样的方法，获得基因型Cre/+A/+的小鼠（基因型A/+指的是A基因被整合在细胞同源染色体中的一条，即可看成基因Aa）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM+/小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 (4)研究发现，四环素可竞争结合A蛋白，在饲喂实验模型小鼠时，在饲料中添加四环素的目的是______。 【答案】(1) 5' 端 ②（同向排列） (2) 显微注射 受精卵 同期发情（或同期发情处理） (3)Cre/+A/+ M-GFP/+floxM/floxM (4)竞争性结合 A 蛋白，抑制诱导型 T 启动子的激活，从而抑制 M-GFP（M 基因）的表达，实现 M 基因表达的可控调控 【详解】（1）在 PCR 扩增片段①时，需在引物5' 端添加同源序列。DNA 聚合酶只能从引物的 3' 端延伸 DNA 链，因此引物的 5' 端可以添加不影响延伸的同源序列，用于后续的同源重组。题目要求"敲除小鼠的M基因"，即需要切除M基因。因此需要loxP位点 同向排列，对应方式②（从图上看，方式②是同向排列的）。 （2）动物基因工程中，将外源重组载体导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法，受体细胞通常选择受精卵（因为受精卵的全能性高，能发育为完整个体）。胚胎移植时，需要对供体和受体母鼠进行同期发情处理，使它们的生理状态（子宫内膜环境）保持一致，这样移入的胚胎才能在受体子宫内正常着床和发育。 （3）获得同时含 4 个基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，即基因型为 Cre/+A/+ M-GFP/+/floxM/floxM。 （4）题干说明 “四环素可竞争结合 A 蛋白”，而 A 蛋白是诱导型 T 启动子的激活因子，只有 A 蛋白与 T 启动子结合，才能启动 M-GFP 的表达。 因此，在饲料中添加四环素的目的是： 竞争性结合 A 蛋白，阻止 A 蛋白与诱导型 T 启动子结合，从而抑制 M-GFP 基因的表达，实现 M 基因表达的可控调控（或 “关闭 M 基因的表达，构建条件性敲除模型”）。 16．（2026·山东菏泽·二模）研究人员发现，某蓝细菌能通过细胞表面的锶结合蛋白（由srp基因编码）高效富集核污染物90Sr，但该菌生长缓慢，难以直接应用。为解决这一问题，研究者计划将srp基因转入另一种易培养的模式蓝细菌中，用于核污水生物修复。技术路线如下图所示。 注：Ampr：氨苄青霉素抗性基因；gfp：绿色荧光蛋白基因。P1、P2、P3、P4表示引物限制酶及其识别序列：BamHⅠ5′G↓GATCC3′  EcoRⅠ5′G↓AATTC3′  MfeⅠ5′C↓AATTG3′ (1)为将锶结合蛋白展示在细胞表面，需将srp基因与表面锚定蛋白基因（omp）拼接成omp-srp融合基因。采用重叠延伸PCR技术拼接时需设计关键引物P2，其碱基序列5′-__________________-3′（写出8个碱基）。进行重叠延伸PCR时，应在引物P1的5′端添加限制酶____识别序列，并在引物____的5′端添加限制酶____的识别序列，以便于omp-srp融合基因正确插入已被限制酶____切割的质粒甲，提高构建重组质粒的效率。 (2)为筛选成功导入重组质粒的工程菌，应将蓝细菌涂布在特定的培养基上，选择____荧光的菌落。 (3)为防止工程菌过度繁殖造成生态风险，质粒中引入了“群体感应自毁”系统。该系统的工作机制为：菌群密度过大→分泌信号分子AHL→与LuxR蛋白结合形成复合物→激活启动子→致死基因表达→杀死菌体。据此推测LuxR蛋白在细胞中______（填“始终存在”或“密度高时才存在”），致死基因应插入图中A位点，则启动子甲为______型启动子。 (4)上述工程菌直接释放可能存在生态风险。研究人员希望获得目的基因已整合到基因组、但抗性基因已丢失的环保型菌株。可以用____基因的引物，通过PCR技术检测是否是环保菌。 【答案】(1) CGAATTCA BamHⅠ P3 MfeⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ (2)无（没有） (3) 始终存在 诱导 (4)srp基因和Ampr 【详解】（1）重叠延伸PCR中，P2是扩增omp基因的与非模板链互补的反向引物，其一部分与omp基因互补，其5'端需要添加与srp基因上游非模板链互补的序列才能将两个基因连接在一起形成融合基因；根据图中srp上游非模板链（3'→5'）序列为GCTT，按照碱基互补配对，P2的5'→3'序列为CGAATTCA。 根据质粒上限制酶切割位点的分布可知，切割质粒甲应用BamHⅠ和EcoRⅠ切割（如果选MfeⅠ和BamHⅠ会破坏两个标记基因，如果选EcoRⅠ和MfeⅠ产生黏性末端相同会反向连接），两个黏性末端不同，只能与融合基因正确连接，提高重组效率；由于P2中有EcoRⅠ的识别序列，所以不能用EcoRⅠ切割目的基因，为了实现定向克隆、防止质粒自连，利用同尾酶（EcoRⅠ和MfeⅠ切割后产生相同的黏性末端AATT）的特点：在融合基因上游引物P1的5'端添加BamHⅠ识别序列，下游引物P3的5'端添加MfeⅠ识别序列。 （2）gfp（绿色荧光蛋白基因）的编码区内存在BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，成功插入融合基因后，gfp被插入失活，因此成功导入重组质粒的菌落无绿色荧光，选择无荧光菌落。 （3）LuxR蛋白需要提前存在于细胞中，当菌群密度升高、AHL信号分子积累后，才能结合LuxR蛋白激活下游启动子，因此LuxR蛋白始终存在；致死基因只有在菌群密度过高时才被激活表达，因此控制致死基因转录的启动子甲是诱导型启动子（仅在诱导条件下激活转录）。 （4）环保型菌株的特点是：目的基因（srp）整合到基因组，质粒上的抗性基因（Ampr）随质粒丢失而消失，因此需要用srp基因和Ampr（氨苄抗性）基因的引物分别进行PCR，若能扩增出srp片段、无法扩增出Ampr片段，即为目标菌株。 17．（2026·山东滨州·二模）利用基因工程技术可定向编辑目标基因：将含有核酸酶基因和一段目标基因序列（该序列可转录，通常可将该序列设计到引物中）的载体导入受体细胞，该段目标基因序列的转录产物（一种起引导作用的RNA）可引导核酸酶基因表达的核酸酶特异性结合到目标基因序列并进行切割，使目标基因断裂，修复时可出现连接错误，形成突变体。向二倍体番茄细胞中导入终载体，对其紫胚轴基因G和雄性可育基因M进行同步编辑以培育绿胚轴雄性不育双突变体。终载体构建过程及引物、限制酶相关信息如图所示。 (1)PCR过程中引物的功能是_____，引物F、R会结合到模板链的_____（填“3′”或“5′”）端。 (2)中间载体是小型DNA，可携带相应功能片段整合到原载体上形成终载体。构建终载体时需将PCR扩增后的中间载体插入到原载体的两个限制酶BsaI切点之间，如图甲所示。 ①F、R引物序列如图乙所示，原载体经BsaI酶切后保留的黏性末端为5′-_____-3′和5′-_____-3′，用终载体转化农杆菌，经卡那霉素筛选并提取相关DNA后只能选用限制酶EcoRI或BamHI酶切鉴定导入成功的终载体，据此可知，图甲所示A处a链上的BsaI的识别序列为5′-_____-3′。 ②扩增中间载体时F引物序列中应含有BsaI的识别序列、_____和中间载体的一段序列。为实现对同一细胞中基因G和M的独立编辑，在扩增后的中间载体上还应含有的结构为_____（填“终止子”或“终止密码子的编码序列”）。 (3)终载体通过农杆菌导入番茄细胞，经PCR和电泳筛选得到突变体A和B，据图丙可知，突变体A和B的变异类型分别是染色体结构变异中的_____和_____。经检测突变体A确定为绿胚轴雄性不育系。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 3′ (2) CAAA GTTT（顺序可颠倒） GAGACC 基因G或基因M的一段序列 终止子 (3) 倒位 缺失 【详解】（1）PCR过程中引物的功能是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA复制时，从模板链的3'端开始，因此引物F、R会结合到模板链的3′端。 （2）①以引物R进行PCR扩增形成的双链DNA序列为（5'-GGTCTCGAAAC-3'/3'-CCAGAGCTTTG-5'），BsaI识别序列为（5'-GGTCTCG-3'/3'-CCAGAGCTTTG-5'），切割后形成的黏性末端是5'GTTT3'，同理，以引物F进行PCR扩增后，再经过酶切形成的黏性末端是5'CAAA3'。经卡那霉素筛选并提取相关DNA后只能选用限制酶EcoRI或BamHI酶切鉴定导入成功的终载体，因此BsaI的识别序列的两侧有限制酶EcoRI和BamHI酶的部分识别序列，再结合BsaI识别序列可知图甲所示A处a链上的BsaI的识别序列为5′-GAGACC-3′。 ②我们的目的是对番茄紫胚轴基因G和雄性可育基因M进行同步编辑以培育绿胚轴雄性不育双突变体，因此扩增中间载体时F引物序列中应含有基因G或基因M的一段序列。在扩增后的中间载体上还应含有的结构为终止子，这样可以实现基因G和M的独立编辑，互不干扰，而终止密码子的编码序列并不能终止基因的转录。 （3）结合2染色体片段及引物分析，突变体A利用引物P1+P3、P2+P4可以扩增出产物，原因可能是M基因所在的染色体片段或G基因所在的染色体片段发生了倒位；突变体B利用P1+P4能扩增出产物，而利用P1+P2和P3+P4不能扩增出产物，可能是M基因和G基因之间的染色体片段发生了缺失。 18．（2026·山东枣庄·模拟预测）农杆菌转化法用到的Ti质粒是基因工程常用的载体，Ti质粒及相应酶切位点如图1。采用农杆菌转化法将改造的抗虫基因导入杂合高茎（Dd）玉米的愈伤组织中，通过组织培养获得抗虫转基因玉米。大引物PCR可用于抗虫基因的定点突变（突变后的基因可能会带来限制酶切割位点的变化），图2为示意图。图3为采用大引物PCR的方法定点突变抗虫基因（编码137位的缬氨酸转变为谷氨酸），使抗虫效果大大提升。 注：5´-GUA-3´为缬氨酸密码子，5´-GAA-3´为谷氨酸密码子 (1)Ti质粒因具备________（答出2点）条件，而成为基因工程常用的运载体之一。据图分析切割Ti质粒所需的限制酶为________。同种限制酶切割产生的2个末端相同且互补，若3´端凸出长度为4个碱基，理论上最多有________种相同且互补的黏性末端。 (2)图2中PCR1和PCR2共需要设计________种引物。一个目的基因在PCR2的第n轮，理论上用到________个设计的常规引物。 (3)PCR1过程所需的上游引物（靠近基因启动子）序列为5´________3´（写出10个碱基），下游引物序列为5´________3´（写出10个碱基）据此，切割突变后的抗虫基因所需的限制酶为________。 (4)愈伤组织培养得到的转基因抗虫玉米经检测发现导入了2个抗虫基因，该抗虫高茎玉米自交得到的子代中抗虫高茎∶抗虫矮茎∶不抗虫高茎=11∶4∶1，据此推断2个抗虫基因插入的位置为________。 【答案】(1) 能在受体细胞中复制并稳定保存；具有标记基因（或具有一个或多个限制酶切割位点，任答两点） NheI和 EcoR I 16 (2) 3 2n − 1 (3) 5′−GCTAGCGATC−3′ 5′−GAATTCGGTA−3′ MfeⅠ (4)两个抗虫基因插入到了非同源染色体上，且有一个抗虫基因与d基因所在同一条染色体，另一个抗虫基因不在D/d基因的染色体上 【详解】（1）基因工程中运载体需要满足的条件：能在受体细胞中复制稳定保存、具有一个或多个限制酶切割位点便于插入目的基因、具有标记基因便于筛选（任答两点即可）。为了将目的基因插入T-DNA区域，同时不破坏启动子、终止子和标记基因，应选择 NheI和 EcoR I（SalI在质粒的非T-DNA区域也有识别位点 ）。黏性末端凸出4个碱基，一般为回文序列，确定前两个碱基，后两个碱基序列也可以确定，每个碱基有4种可能，因此理论总种类为42=16种。 （2）大引物PCR中，设计的引物包括2个常规引物+1个突变引物，共3种，大引物是PCR1的产物不需要提前设计。PCR2中初始模板只含1个大引物，每一轮扩增新合成的DNA都需要1个设计的常规引物，因此第n轮需要2n − 1 个常规引物。 （3）根据图示信息可知，抗虫基因中上面的链为编码链，下面的链为模板链，基因启动子靠近模板链的3'端，所以PCR1过程所需的上游引物（靠近基因启动子）序列应为常规引物，下游引物则为带突变序列的突变引物，由图可知，上游引物与下面的链（模板链）互补，则与给出的序列相同，且需包含NheI的酶切序列，因此上游引物序列为5′−GCTAGCGATC−3′，下游引物带有突变序列，与PCR1产物上面的链（编码链）互补，则下游引物序列为5′−GAATTCGGTA−3′ 。由于突变后产生了EcoRⅠ的识别序列，因此切割突变后抗虫基因不能使用EcoRⅠ酶切，需要产生与载体相同的黏性末端，根据图1可知，EcoRⅠ和MfeⅠ可产生相同的黏性末端，则可用MfeⅠ切割突变后的抗虫基因。 （4）亲本基因型为 Dd（高茎），自交后代高茎：矮茎 = 3：1； 抗虫：不抗虫 = 15：1（11+4：1），符合双杂合子自交的 9：3：3：1 变式（抗虫为显性），遵循自由组合定律， 说明两个抗虫基因插入在非同源染色体上，而且矮茎均为抗虫，说明只有一个抗虫基因与矮茎基因d连锁，另一个抗虫基因不在D/d基因所在的染色体上。 19．（2026·山东青岛·二模）人工胰岛素是降血糖的常见药物，由A链和B链构成。科研人员利用重叠延伸PCR技术获得编码胰岛素A链与B链的融合基因，过程如图1所示。将融合基因插入图2质粒后再导入大肠杆菌，获取了能同时高效表达人工胰岛素A链和B链的工程菌，以大量制备有活性的胰岛素。已知在本实验温度条件下，不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。 (1)与体内DNA的复制相比，PCR不需要________酶的参与。PCR之初要进行预变性的目的是________。图1中的延伸过程不需要引物的原因________。 (2)已知m链为编码链，则临近启动子的序列为胰岛素________（填“A”或“B”）链基因。短肽基因序列可确保等比例表达A、B肽链，为保证获得胰岛素B链，短肽基因序列的尾端不能含有________序列。 (3)胰岛素A链和B链基因（编码链）、引物及限制酶的识别序列见下表，结合图1、图2和表可知，短肽基因序列含有________个碱基对，构建基因表达载体时，需选用限制酶________切割大肠杆菌质粒。 基因 序列 限制酶 序列及切割位点 A链基因 5′AATTCATGGGCATCG……CTACTGTAACTAATAG3′ EcoRI B链基因 5′AATTCATGTTCGTCA……TCCTAAGACTTAATAG3′ BamHI 引物1 5′GTACAATTCATGGGCATCG3′ BmtI 引物2 5′CTACTCGATTACCGTCGTCTATTAGTTACAGTAG3′ HindIII 引物3 5′GTAATCGAGTAGCAGCAGAATTCATGTTCGTCA3′ NdeI 引物4 5′GGATCCCTATTAAGTCTTAGGA3′ CviQI (4)工程菌产生的胰岛素A、B链需在体外组合才具备胰岛素活性，科研人员欲从个体水平检测体外组合的胰岛素是否具有降低血糖的作用，以正常小鼠、体外组合的胰岛素溶液、葡萄糖溶液为实验材料，以小鼠活动状况为观察指标进行实验。请写出实验设计思路：________。 【答案】(1) 解旋 确保DNA双链之间的氢键完全打开 两条链可以互为模板、互为引物 (2) A 终止密码子的编码序列和终止子 (3) 24 NdeI和BamHI (4)给正常小鼠先注射适量的体外组合的胰岛素，观察小鼠的活动状况，再注射葡萄糖溶液观察小鼠活动状况 【详解】（1）体内DNA的复制需要解旋酶的参与，PCR技术通过高温进行解旋，因此与体内DNA的复制相比，PCR不需要解旋酶的参与。PCR之初要进行预变性的目的是确保DNA双链之间的氢键完全打开。图1中的延伸过程不需要引物的原因是两条链可以互为模板、互为引物。 （2）已知m链为编码链，翻译的方向是从mRNA的5'开始，图1的左侧是胰岛素链基因序列，因此临近启动子的序列为胰岛素A链基因。短肽基因序列可确保等比例表达A、B肽链，为保证获得胰岛素B链，短肽基因序列的尾端不能含有终止密码子的编码序列和终止子，这样可以保证翻译形成一条A肽链后可以继续翻译形成一条B肽链。 （3）通过引物2扩增胰岛素A链基因序列的右侧，引物3扩增胰岛素B链基因序列的左侧，引物2和引物3的重叠序列有24个碱基对，重叠序列为短肽基因序列。胰岛素链基因序列的左侧是通过引物1扩增的，胰岛素B链基因序列的右侧是通过引物4扩增的，根据引物1和引物4的碱基序列，再结合图表所示的限制酶识别序列可知，构建基因表达载体时，由于引物1上有CviQI限制酶识别序列，使用限制酶NdeI可以获得与之相同的黏性末端，故应该选择限制酶NdeI和BamHI切割大肠杆菌质粒。 （4）本实验是为了探究体外组合的胰岛素是否具有降低血糖的作用，以小鼠活动状况为观察指标进行实验，因此实验设计思路是给正常小鼠先注射适量的体外组合的胰岛素，观察小鼠的活动状况，再注射葡萄糖溶液观察小鼠活动状况。若注射适量的体外组合胰岛素后小鼠会出现低血糖症状，再注射葡萄糖溶液，低血糖症状消失，说明体外组合的胰岛素具有降低血糖的作用。 20．（2026·山东聊城·二模）图1为Ti质粒的部分结构示意图，LB与RB为T-DNA左边界序列和右边界序列，tms与tmr为激素基因，Ori为复制原点，Tetr为四环素抗性基因，Vir基因编码产物能激活T-DNA片段转移，Pro为启动子。图2中①～⑥为部分限制酶及其识别序列和切割位点。研究人员分别利用结构如图1的Ti质粒A、去除了图1中tms与tmr的Ti质粒B、去除了图1中LB或RB的Ti质粒C进行了相关实验。回答下列问题： (1)在农杆菌侵染植物的过程中，农杆菌会产生酶甲，其可将T-DNA的一条核苷酸链切割下来，该单链进入植物细胞后形成双链，则酶甲识别与切割的序列应为T-DNA中的________。该片段上的基因在被转化植物体内________（填“能”或“不能”）实现稳定遗传，理由是________。 (2)在利用质粒B构建基因表达载体时，需在目的基因的首尾两端添加两种限制酶的识别序列，目的是________，在目的基因尾端最宜添加的序列是________。 (3)将质粒A、质粒B、质粒C导入不含质粒的农杆菌中，导入质粒的农杆菌与植物外植体分别共培养后，若实验结果为________，则说明LB与RB是T-DNA进入植物细胞不可缺少的结构，而tms与tmr则不是。为获得胚状体或试管苗，研究人员用携带了质粒B的农杆菌侵染植物，而不用携带质粒A的农杆菌，原因最可能是________。 【答案】(1) LB与RB 能 Ti质粒的T-DNA片段被转移并整合到受体细胞的染色体DNA上 (2) 防止质粒与目的基因的自身环化或反向连接 5'-CCCGGG-3'（或Xma Ⅰ或Sma Ⅰ所识别的序列） (3) 含质粒A、质粒B的农杆菌侵染植物时均出现转化、含质粒C的农杆菌侵染植物时不出现转化 T-DNA中的tms与tmr在植物细胞中表达，产生的激素会影响愈伤组织的形成及分化 【详解】（1）LB、RB是T-DNA的左右边界序列，要切割下完整的T-DNA单链，酶甲需要识别切割LB和RB。农杆菌转化法中，T-DNA最终会整合到植物细胞的染色体DNA上，随染色体DNA复制同步传递给子代，因此片段上的基因可以稳定遗传。 （2）使用两种不同限制酶切割，可使目的基因和质粒两端产生不同的黏性末端，从而避免目的基因或质粒自身环化，同时保证目的基因按照正确方向插入。结合图1，酶切位点需要选在LB和RB之间，LB和RB之间存在③④⑤三种酶切位点，但③存在两处，选③会导致tms和tmr被切除，故选④⑤切割质粒，而这两种酶识别序列相同但酶切位点不同，故在目的基因尾端最宜添加的序列是5'-CCCGGG-3'（或Xma Ⅰ或Sma Ⅰ所识别的序列）。 （3）若LB、RB是T-DNA转移必需，tms、tmr不是，则结果为：保留LB、RB的质粒A和质粒B都可以完成转化，缺失LB/RB的质粒C不能完成转化。tms、tmr是激素基因，质粒A保留这两个基因，导入植物后会导致植物细胞激素含量异常，细胞分化紊乱，无法正常发育为胚状体或试管苗，因此选择去除了tms和tmr的质粒B。 学科网（北京）股份有限公司第 1 页 共 15 页 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题01 细胞的组成、结构及物质运输 题号 1 2 3 4 5 6 答案 C D B C AB BD 7.【答案】(1) 可能相同 碱基互补配对 延长 (2) 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (3) 目的基因成功敲入 S2、S4、S5 8.【答案】(1) ① ④⑥ 终止转录（使转录在所需要的地方停下来） 显微注射法 (2) ② ④ (3) 沉默子远距离作用于GFP基因，抑制其表达 避免免疫排斥；效果持久；避免输血带来的感染 9.【答案】(1) 逆转录酶 不含有 限制酶和DNA连接酶 (2) 5' 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ (3) 320bp 2/二 (4) 是 菌落PCR与质粒双酶切均可获得大小约320bp的基因片段 10.【答案】(1) EcoR V 切除（切割/切掉/去除） 平末端 (2) Sau3A Ⅰ 3 (3) 位点特异性重组（倒位/翻转/断裂和翻转） attL位点和attR位点不会被phiC31识别 (4)核定位信号引导phiC31进入细胞核后起作用（将phiC31定位到细胞核） 11.【答案】(1) SacⅠ和XhoⅠ 避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接） B (2) 荧光素 有荧光出现 3′端 (3) 1和4 实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 12.【答案】(1) 大肠杆菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对蛋白质进一步加工 ②、③ 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) CGTG CGAG (3) a、c 维持稳定和表达 13.【答案】(1) 一 终止转录 (2) DNA聚合酶、DNA连接酶 ②、③ 3 (3) 含量稳定 甲蛋白促进PGD合成，乙蛋白抑制甲蛋白的功能，溶菌酶解除乙蛋白的抑制作用 14.【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 5′ 3 (2) 不能 限制酶切割植物基因组DNA时也可能出现与目的基因相同大小的DNA片段 acd或bcd (3) 能 病原菌侵染导致植物SA的大量合成，SA促进S蛋白和B酶结合，结合后B酶活性增强，大量合成MeSA，完成“报信” 15.【答案】(1) 5' 端 ②（同向排列） (2) 显微注射 受精卵 同期发情（或同期发情处理） (3)Cre/+A/+ M-GFP/+floxM/floxM (4)竞争性结合 A 蛋白，抑制诱导型 T 启动子的激活，从而抑制 M-GFP（M 基因）的表达，实现 M 基因表达的可控调控 16.【答案】(1) CGAATTCA BamHⅠ P3 MfeⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ (2)无（没有） (3) 始终存在 诱导 (4)srp基因和Ampr 17.【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 3′ (2) CAAA GTTT（顺序可颠倒） GAGACC 基因G或基因M的一段序列 终止子 (3) 倒位 缺失 18.【答案】(1) 能在受体细胞中复制并稳定保存；具有标记基因（或具有一个或多个限制酶切割位点，任答两点） NheI和 EcoR I 16 (2) 3 2n − 1 (3) 5′−GCTAGCGATC−3′ 5′−GAATTCGGTA−3′ MfeⅠ (4)两个抗虫基因插入到了非同源染色体上，且有一个抗虫基因与d基因所在同一条染色体，另一个抗虫基因不在D/d基因的染色体上 19.【答案】(1) 解旋 确保DNA双链之间的氢键完全打开 两条链可以互为模板、互为引物 (2) A 终止密码子的编码序列和终止子 (3) 24 NdeI和BamHI (4)给正常小鼠先注射适量的体外组合的胰岛素，观察小鼠的活动状况，再注射葡萄糖溶液观察小鼠活动状况 【答案】(1) LB与RB 能 Ti质粒的T-DNA片段被转移并整合到受体细胞的染色体DNA上 (2) 防止质粒与目的基因的自身环化或反向连接 5'-CCCGGG-3'（或Xma Ⅰ或Sma Ⅰ所识别的序列） (3) 含质粒A、质粒B的农杆菌侵染植物时均出现转化、含质粒C的农杆菌侵染植物时不出现转化 T-DNA中的tms与tmr在植物细胞中表达，产生的激素会影响愈伤组织的形成及分化 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题13 基因工程 一、单选题 1．（2026·山东济南·二模）科研人员提取患者自体CD34+造血干细胞，在体外通过CRISPR/Cas9编辑BCL11A基因启动子上游的序列，从而抑制BCL11A基因的表达，重新激活胎儿血红蛋白的表达，替代异常的成人血红蛋白以根治镰状细胞贫血。下列有关说法正确的是（    ） A．该治疗方案使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输是由于干细胞在体外更容易增殖 B．经过该疗法治疗的患者，其生殖细胞的基因也被同步修复，后代将不再患病 C．在体外培养和编辑CD34+造血干细胞的过程中，需要严格保持无菌条件 D．若基因编辑过程中存在非目标位点被编辑的现象，其原因是BCL11A基因发生了基因突变 2．（2026·山东聊城·二模）为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。下列叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可使真菌菌体更易破碎 B．利用NaOH溶液提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出DNA等步骤 C．NaOH溶液提取DNA的时间不宜过长且不能剧烈振荡，以免造成DNA损伤断裂 D．缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能 3．（2026·山东日照·二模）基因工程中，使用单个限制酶酶切构建的表达载体易出现连接方向错误和重复插入目的基因片段等现象，可通过酶切及筛选标记鉴定出符合预期的重组质粒。研究人员将目的基因CDS插入质粒P的SacⅡ位点后，对重组质粒进行扩增、筛选和检测。P和CDS结构如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：X-gal被LacZ基因表达产物分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则为白色。 A．重组质粒被PstⅠ完全酶切后电泳可能会获得长度为9.4kbDNA片段 B．用EcoRⅠ与SacⅡ完全酶切重组质粒，可得到2个长度的DNA片段 C．用EcoRⅠ与PstⅠ完全酶切重组质粒，可判断CDS基因的连接方向 D．将含重组质粒的细胞涂布在含X-gal的培养基上，菌落颜色为白色 4．（2026·山东滨州·二模）下图为甲、乙两种DNA样品及其酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，已知甲、乙都只含有1个限制酶R的酶切位点，加样孔1和2加入的DNA分子分别是甲和乙，加样孔3和4加入的是甲或乙的酶切产物。下列说法正确的是（　　） A．电泳时核酸分子所带电荷性质与缓冲液pH无关 B．加样孔4对应的条带是甲被酶R完全酶切后电泳的结果 C．甲与乙分子中所含碱基对数近似相等 D．增加琼脂糖凝胶的浓度，甲、乙条带距离将变大 二、多选题 5．（2026·山东泰安·二模）假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶是3-磷酸甘油脱氢酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌可将假丝酵母野生型菌株转化，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示（注：是腐草霉素抗性基因，是卡那霉素抗性基因）。下列说法错误的是（　　） A．从农杆菌中提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后电泳，若出现3条条带则表明转化成功 B．在含有卡那霉素的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株 C．与野生型菌株相比，该重组菌株可提高发酵液中甘油的含量、缩短发酵时间 D．转基因生物可能对环境造成新污染或破坏，需灭菌处理后再丢弃 6．（2026·山东德州·二模）称取等量新鲜的花菜、辣椒和蒜黄剪碎后分别均分成两组，一组置于20℃、另一组置于-20℃条件下，两组均保存24h后，将各组的DNA的粗提取物溶于2mol/L的NaCl溶液中，用相关试剂进行鉴定，结果如表所示。下列叙述错误的是（　　） 材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄 20℃ ++ + +++ -20℃ +++ ++ ++++ 注：“+”越多表示蓝色越深。 A．该实验可用于探究不同材料和不同温度对DNA粗提取量影响 B．若采用离心法对DNA进行粗提取，2次离心后DNA都分布在上清液中 C．等质量的不同实验材料，在相同保存温度下，辣椒中提取DNA量最少 D．低温下保存时DNA提取量更多，可能是低温抑制了蛋白酶的活性所致 三、解答题 7．（2026·山东临沂·二模）利用BsmB Ⅰ酶结合PCR技术可实现DNA片段无缝连接，从而构建目的基因。BsmB Ⅰ识别序列、切割位点及串联构建目的基因M的过程如图1。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9核酸酶对靶向双链DNA进行识别和切割，导致DNA双链断裂，断裂的DNA双链修复过程中可通过同源重组将载体上的目的基因靶向敲入。图2是结合该技术利用重组AAV病毒的DNA将目的基因M靶向敲入干细胞的过程。 (1)由图1可知，BsmB Ⅰ一次酶切产生的两个末端_____________（填“一定相同”“一定不同”“可能相同”）。gRNA依据________原则与靶序列特异性结合后，实现定点切割。设计gRNA时可适当________（填“延长”或“缩短”）gRNA的长度，提高敲除靶基因的准确性。 (2)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5'CGTCTCNcgacCAAAT…3'，则F2的序列为___________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列_________（接头序列用小写字母表示）。 (3)将图1中的目的基因M导入干细胞的靶向DNA后，分别提取DNA，同时加入图2所示的引物进行扩增，引物1、3扩增结果如图4。 引物1和2扩增后检测到条带说明________。根据图4结果推测，同源染色体中两条染色体均敲入了目的基因的组别可能是______。 8．（2026·山东淄博·二模）某地中海贫血症是由于BCL11A 蛋白抑制血红蛋白基因的表达引起的。研究人员构建了含下调 BCL11A基因表达的改良型基因表达单元的重组载体，利用同源重组的方式将其导入患者的造血干细胞中并替换原BCL11A 基因，取得积极的研究进展。构建改良型BCL11A 基因表达单元 （图 1） 需要使用以下元件：BCL11A基因、BCL11A 基因特异启动子 （KLF） 、终止子 （无特异性） 、用于示踪的荧光蛋白基因 （GFP）、 荧光蛋白基因特异性启动子（CMV），在启动子上游抑制基因表达的沉默子（可远距离发挥作用）。 (1)图 1 中两个基因的转录方向都是从左到右，代表沉默子的数字是_____，代表终止子的数字是_____，终止子的作用是_____。将重组载体导人造血干细胞的常用方法是_____。 (2)为检测 BCL11A 基因的表达情况，研究人员提取了造血干细胞的总mRNA（可能混有基因组DNA）并逆转录为 cDNA，利用特定的 BCL11A 基因的引物进行 PCR 扩增 （不需要扩增 cDNA 的全部序列）。真核基因的编码区含有内含子和外显子，转录形成的 mRNA 不含有内含子对应序列。BCL11A 基因部分序列如图 2 所示。 为避免基因组 DNA 的扩增，需要选择的一对引物（只体现 5′端前 9 个碱基）是_____。_____（填序号）。 ①5′ATGTCTCGC 3′ ②5′ CTGCTATGT 3′ ③ 5′ CTGTGGTTG 3′ ④ 5′ CTCGCCCGA 3′ (3)研究发现造血干细胞中BCL11A 基因的表达量明显下降，但是荧光强度也很弱， 原因可能是_____。与传统输血治疗相比，该治疗方案的优势是_____（答出 1 点即可）。 9．（2026·山东泰安·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞的形态结构等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。 (1)图中①过程需要使用______酶，该过程得到的DNA片段______（填“含有”或“不含有”）启动子序列；②过程需要用到的酶有______。 (2)为实现kit基因与运载体的定向连接，PCR扩增kit基因时，需要在引物的______（填“5’”或“3’”）端添加限制酶识别序列，引物的作用是______。可以用______限制酶双酶切kit基因与质粒pET-28a（+）。 (3)双酶切kit基因与质粒pET-28a（+）上长度为170bp片段进行置换，构建出重组质粒pET-28a（+）-kit，上述两种质粒经HindⅢ完全酶切后，片段长度如下表（每种片段仅出现一个）。 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindⅢ酶切片段 1000bp、2550bp 1050bp、2500bp、150bp 则kit基因长度为______，由此判定kit基因上有______个HindⅢ酶切位点。 (4)菌落PCR是直接以微生物菌体热解后的DNA为模板，以目的基因两端序列设计引物进行扩增的方法，根据凝胶电泳结果可初步鉴定菌落是否含有目的基因。对构建的基因工程菌进行菌落PCR验证，根据验证的结果提取大肠杆菌的质粒进行双酶切再验证，结果如图所示。初步分析可知，基因工程菌的构建______（选填“是”或“否”）成功，理由是______。 注：M为标准参照物，1为菌落PCR，2为质粒双酶切 10．（2026·山东济南·二模）科研人员构建了整合酶（phiC31）基因表达载体和含有2个相向排列的attB位点和attP位点的红色荧光蛋白（DsRed）报告基因表达载体，分别如图1和图2所示。phiC31特异识别到Act4P启动子两侧attP位点（39bp）和attB位点（34bp）后，分别从两位点各自的中心位置碱基处切割双链DNA并使切下来的DNA片段反向旋转，再连接起来形成attL位点（36bp）和attR位点（37bp），继而完成位点特异性重组，如图2所示。phiC31不能识别attL位点和attR位点。已知相关基因和载体中只含图1所示的限制酶识别序列。回答下列问题。 (1)为了将引物F1和R1扩增得到phiC31和NLS融合基因克隆至图1载体目的基因插入位点，可在R1引物中引入图1中________酶切位点；将PCR产物进行双酶切后，可对限制酶Kpn Ⅰ切开的黏性末端中的单链进行________处理后才能在连接酶的作用下与Eco RV切开形成的________相连接。 (2)据图1分析，重组载体1中________酶（填“Bam H Ⅰ”或“Sau 3A Ⅰ”或“Eco RV”）的识别位点最多，其数量至少为________。 (3)已知家蚕细胞中不存在phiC31基因和attP、attB位点，将报告基因表达载体单独成功转染家蚕BmE细胞未观察到红色荧光信号，而phiC31基因表达载体和报告基因表达载体共同成功转染后则可观察到，说明在家蚕BmE细胞中，phiC31可催化图2中attB位点和attP位点之间DNA序列发生了________，该过程不可逆的原因是________。 (4)使用NLS与phiC31基因融合表达的目的是________。 11．（2026·山东济宁·二模）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX启动子在DEX诱导下才可发挥作用；AUG为起始密码子，UAA、UGA、UAG为终止密码子。回答下列问题。 (1)图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切的优点是________（答出1点）。已知OsJRL40基因转录的非模板链的序列为：5'-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3'，为构建融合基因，引物2的前10个碱基序列为________。 A．5'-AGATCTCTAG-3' B．5'-AGATCTGTCA-3' C．5'-GATCCTAGTC-3' D．5'-GATCGTCAGC-3' (2)在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre酶可以将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，因此在设计引物3和引物4时需要在限制酶识别序列的________（填“5'端”或“3'端”）添加loxP序列。 (3)为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR技术进行鉴定。 实验组：首先提取在有DEX环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR扩增后用BglⅡ完全切割，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40基因和荧光素酶基因的条带。 对照组：用未经DEX环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。 若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。 12．（2026·山东德州·二模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题。 注：1．①、②、③和④是基因两端对应的引物 2．BsmBI的识别序列和切割位点信息（N代表任一碱基）： (1)利用大肠杆菌工程菌合成的hCGβ质量不理想，从细胞结构的角度分析原因是_____。对hCGβ基因进行PCR扩增时，所选引物是图中的_____，引物的作用是_____。 (2)限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端。载体信息如图所示，经BsmBI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-_____-3'和5'-_____-3'。 (3)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分_____（a．氨苄青霉素b．无机盐c．组氨酸d．葡萄糖），可在此培养基上生长的酵母菌即为转化成功的目的菌株，“转化”是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____的过程。 13．（2026·山东潍坊·二模）人体肠道中寄生的艰难梭菌接触到肠道分泌的溶菌酶后，会产生大量肽聚糖脱乙酰酶(PGD)改变细胞壁结构，以避免被溶菌酶伤害。已知艰难梭菌感应溶菌酶与蛋白甲和乙有关，为探究艰难梭菌感应溶菌酶的机制，科研人员预利用反义基因对蛋白甲和乙的表达进行抑制。前期设计的相关DNA结构如图1，其中→代表启动子，代表终止子。 (1)肠道分泌的溶菌酶属于免疫系统的第___________道防线。终止子在基因表达中的作用是___________。 (2)为将图1中的DNA片段拼合为质粒以导入艰难梭菌，可利用核酸酶特异性切除DNA5＇端单链，使各DNA片段两端的同源序列末端产生互补单链，混合后形成如图2的结构，然后用___________酶处理，将DNA双链补齐并实现多片段拼接与环化。上述过程中充当引物的单链是___________(填图2中编号)。若要将图1中的片段一次性拼合形成质粒，为避免错误连接共需要在图1的DNA片段的两端设计___________种DNA同源序列。 (3)添加不同诱导物对转基因艰难梭菌处理后，获得结果如图3。PGD相对值是指PGD与腺苷酸激酶的含量比值，利用该比值作为实验结果可有效排除艰难梭菌死亡等因素引起的实验误差。腺苷酸激酶作为参考蛋白需要具有在艰难梭菌中___________，受外界环境和实验处理的影响较小的特点。据实验结果分析，艰难梭菌感应溶菌酶调控PGD表达的机制是___________。 14．（2026·山东东营·二模）植物受病原菌侵害时会产生大量水杨酸(SA)并利用SA合成水杨酸甲酯(MeSA)，释放给周围植物“报信”。科学家发现拟南芥S基因缺失株系①中MeSA合成受限，B基因缺失株系无法合成MeSA，为探究S蛋白和B蛋白在MeSA合成过程中的相互作用，科学家做了如下研究，相关信息如图所示。回答下列问题。 (1)为获得S-GST融合蛋白，需要构建S-GST基因过表达载体。通过PCR特异性扩增目的基因S(只含氨基酸编码序列，810个碱基对)需先设计引物，引物的作用是___________。为利用限制双酶切法将S基因连入载体，在引物___________(填“5′”或“3′”)端上添加相应的限制酶识别序列。实验室可使用的限制酶及载体信息如图1所示，已知目的基因中无图示限制酶识别序列，且引物上只添加限制酶识别序列，翻译过程从S基因的起始密码子开始，为正确表达S-GST融合蛋白，防止密码子读取错位，可选择的限制酶组合有___________种。 (2)将构建好的载体利用农杆菌导入株系①获得转基因株系①-1，提取转基因株系染色体DNA用构建载体的限制酶双酶切获得了与目的基因相同大小的片段，___________(填“能”或“不能”)证明目的基因成功导入受体细胞，原因是___________。后经测序发现只有一个T-DNA插入到①-1基因组中，利用测序结果设计了如图2所示特异性引物，让该株系自交，可选用图中三种引物___________(用字母表示)对自交后代基因组DNA进行PCR扩增并进行凝胶电泳检测，杂合子会出现一长一短两条电泳条带。 (3)为探究S蛋白与B蛋白之间的关系，又在株系①-1的基础上获得了可同时表达B-MBP蛋白的株系①-2，用可以和GST蛋白特异性结合的“磁珠”对不同株系总蛋白进行处理，处理过程中蛋白质保持活性，洗脱“磁珠”上的蛋白质，变性后进行凝胶电泳，抗体检测后结果如图3，推测蛋白S和蛋白B___________(填“能”或“不能”)结合。后续检测发现B蛋白是MeSA合成过程中的一种关键酶，且SA处理时①-2的MeSA合成能力较①-1显著增强，综合分析植物在受到病原菌侵袭时，完成“报信”的机制是___________。 15．（2026·山东日照·二模）M蛋白与“记忆”的形成密切相关，为研究相关机理科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，部分制作流程如图1。实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的外源蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。 (1)利用同源重组将外源基因插入染色体的特定位点，在PCR扩增片段①时，通常会在所用引物F1、R1的______（填“3′端”或“5′端”）添加同源序列。为了敲除小鼠的M基因，在构建载体1时，还应向M基因两端引入loxP位点，以图2中方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 (2)研究者利用______法将重组载体导入小鼠的______（填细胞）中，对代孕母鼠进行______处理，通过胚胎移植获得基因型floxM/floxM的小鼠。采用同样的方法，获得基因型Cre/+A/+的小鼠（基因型A/+指的是A基因被整合在细胞同源染色体中的一条，即可看成基因Aa）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM+/小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 (4)研究发现，四环素可竞争结合A蛋白，在饲喂实验模型小鼠时，在饲料中添加四环素的目的是______。 16．（2026·山东菏泽·二模）研究人员发现，某蓝细菌能通过细胞表面的锶结合蛋白（由srp基因编码）高效富集核污染物90Sr，但该菌生长缓慢，难以直接应用。为解决这一问题，研究者计划将srp基因转入另一种易培养的模式蓝细菌中，用于核污水生物修复。技术路线如下图所示。 注：Ampr：氨苄青霉素抗性基因；gfp：绿色荧光蛋白基因。P1、P2、P3、P4表示引物限制酶及其识别序列：BamHⅠ5′G↓GATCC3′  EcoRⅠ5′G↓AATTC3′  MfeⅠ5′C↓AATTG3′ (1)为将锶结合蛋白展示在细胞表面，需将srp基因与表面锚定蛋白基因（omp）拼接成omp-srp融合基因。采用重叠延伸PCR技术拼接时需设计关键引物P2，其碱基序列5′-__________________-3′（写出8个碱基）。进行重叠延伸PCR时，应在引物P1的5′端添加限制酶____识别序列，并在引物____的5′端添加限制酶____的识别序列，以便于omp-srp融合基因正确插入已被限制酶____切割的质粒甲，提高构建重组质粒的效率。 (2)为筛选成功导入重组质粒的工程菌，应将蓝细菌涂布在特定的培养基上，选择____荧光的菌落。 (3)为防止工程菌过度繁殖造成生态风险，质粒中引入了“群体感应自毁”系统。该系统的工作机制为：菌群密度过大→分泌信号分子AHL→与LuxR蛋白结合形成复合物→激活启动子→致死基因表达→杀死菌体。据此推测LuxR蛋白在细胞中______（填“始终存在”或“密度高时才存在”），致死基因应插入图中A位点，则启动子甲为______型启动子。 (4)上述工程菌直接释放可能存在生态风险。研究人员希望获得目的基因已整合到基因组、但抗性基因已丢失的环保型菌株。可以用____基因的引物，通过PCR技术检测是否是环保菌。 17．（2026·山东滨州·二模）利用基因工程技术可定向编辑目标基因：将含有核酸酶基因和一段目标基因序列（该序列可转录，通常可将该序列设计到引物中）的载体导入受体细胞，该段目标基因序列的转录产物（一种起引导作用的RNA）可引导核酸酶基因表达的核酸酶特异性结合到目标基因序列并进行切割，使目标基因断裂，修复时可出现连接错误，形成突变体。向二倍体番茄细胞中导入终载体，对其紫胚轴基因G和雄性可育基因M进行同步编辑以培育绿胚轴雄性不育双突变体。终载体构建过程及引物、限制酶相关信息如图所示。 (1)PCR过程中引物的功能是_____，引物F、R会结合到模板链的_____（填“3′”或“5′”）端。 (2)中间载体是小型DNA，可携带相应功能片段整合到原载体上形成终载体。构建终载体时需将PCR扩增后的中间载体插入到原载体的两个限制酶BsaI切点之间，如图甲所示。 ①F、R引物序列如图乙所示，原载体经BsaI酶切后保留的黏性末端为5′-_____-3′和5′-_____-3′，用终载体转化农杆菌，经卡那霉素筛选并提取相关DNA后只能选用限制酶EcoRI或BamHI酶切鉴定导入成功的终载体，据此可知，图甲所示A处a链上的BsaI的识别序列为5′-_____-3′。 ②扩增中间载体时F引物序列中应含有BsaI的识别序列、_____和中间载体的一段序列。为实现对同一细胞中基因G和M的独立编辑，在扩增后的中间载体上还应含有的结构为_____（填“终止子”或“终止密码子的编码序列”）。 (3)终载体通过农杆菌导入番茄细胞，经PCR和电泳筛选得到突变体A和B，据图丙可知，突变体A和B的变异类型分别是染色体结构变异中的_____和_____。经检测突变体A确定为绿胚轴雄性不育系。 18．（2026·山东枣庄·模拟预测）农杆菌转化法用到的Ti质粒是基因工程常用的载体，Ti质粒及相应酶切位点如图1。采用农杆菌转化法将改造的抗虫基因导入杂合高茎（Dd）玉米的愈伤组织中，通过组织培养获得抗虫转基因玉米。大引物PCR可用于抗虫基因的定点突变（突变后的基因可能会带来限制酶切割位点的变化），图2为示意图。图3为采用大引物PCR的方法定点突变抗虫基因（编码137位的缬氨酸转变为谷氨酸），使抗虫效果大大提升。 注：5´-GUA-3´为缬氨酸密码子，5´-GAA-3´为谷氨酸密码子 (1)Ti质粒因具备________（答出2点）条件，而成为基因工程常用的运载体之一。据图分析切割Ti质粒所需的限制酶为________。同种限制酶切割产生的2个末端相同且互补，若3´端凸出长度为4个碱基，理论上最多有________种相同且互补的黏性末端。 (2)图2中PCR1和PCR2共需要设计________种引物。一个目的基因在PCR2的第n轮，理论上用到________个设计的常规引物。 (3)PCR1过程所需的上游引物（靠近基因启动子）序列为5´________3´（写出10个碱基），下游引物序列为5´________3´（写出10个碱基）据此，切割突变后的抗虫基因所需的限制酶为________。 (4)愈伤组织培养得到的转基因抗虫玉米经检测发现导入了2个抗虫基因，该抗虫高茎玉米自交得到的子代中抗虫高茎∶抗虫矮茎∶不抗虫高茎=11∶4∶1，据此推断2个抗虫基因插入的位置为________。 19．（2026·山东青岛·二模）人工胰岛素是降血糖的常见药物，由A链和B链构成。科研人员利用重叠延伸PCR技术获得编码胰岛素A链与B链的融合基因，过程如图1所示。将融合基因插入图2质粒后再导入大肠杆菌，获取了能同时高效表达人工胰岛素A链和B链的工程菌，以大量制备有活性的胰岛素。已知在本实验温度条件下，不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。 (1)与体内DNA的复制相比，PCR不需要________酶的参与。PCR之初要进行预变性的目的是________。图1中的延伸过程不需要引物的原因________。 (2)已知m链为编码链，则临近启动子的序列为胰岛素________（填“A”或“B”）链基因。短肽基因序列可确保等比例表达A、B肽链，为保证获得胰岛素B链，短肽基因序列的尾端不能含有________序列。 (3)胰岛素A链和B链基因（编码链）、引物及限制酶的识别序列见下表，结合图1、图2和表可知，短肽基因序列含有________个碱基对，构建基因表达载体时，需选用限制酶________切割大肠杆菌质粒。 基因 序列 限制酶 序列及切割位点 A链基因 5′AATTCATGGGCATCG……CTACTGTAACTAATAG3′ EcoRI B链基因 5′AATTCATGTTCGTCA……TCCTAAGACTTAATAG3′ BamHI 引物1 5′GTACAATTCATGGGCATCG3′ BmtI 引物2 5′CTACTCGATTACCGTCGTCTATTAGTTACAGTAG3′ HindIII 引物3 5′GTAATCGAGTAGCAGCAGAATTCATGTTCGTCA3′ NdeI 引物4 5′GGATCCCTATTAAGTCTTAGGA3′ CviQI (4)工程菌产生的胰岛素A、B链需在体外组合才具备胰岛素活性，科研人员欲从个体水平检测体外组合的胰岛素是否具有降低血糖的作用，以正常小鼠、体外组合的胰岛素溶液、葡萄糖溶液为实验材料，以小鼠活动状况为观察指标进行实验。请写出实验设计思路：________。 20．（2026·山东聊城·二模）图1为Ti质粒的部分结构示意图，LB与RB为T-DNA左边界序列和右边界序列，tms与tmr为激素基因，Ori为复制原点，Tetr为四环素抗性基因，Vir基因编码产物能激活T-DNA片段转移，Pro为启动子。图2中①～⑥为部分限制酶及其识别序列和切割位点。研究人员分别利用结构如图1的Ti质粒A、去除了图1中tms与tmr的Ti质粒B、去除了图1中LB或RB的Ti质粒C进行了相关实验。回答下列问题： (1)在农杆菌侵染植物的过程中，农杆菌会产生酶甲，其可将T-DNA的一条核苷酸链切割下来，该单链进入植物细胞后形成双链，则酶甲识别与切割的序列应为T-DNA中的________。该片段上的基因在被转化植物体内________（填“能”或“不能”）实现稳定遗传，理由是________。 (2)在利用质粒B构建基因表达载体时，需在目的基因的首尾两端添加两种限制酶的识别序列，目的是________，在目的基因尾端最宜添加的序列是________。 (3)将质粒A、质粒B、质粒C导入不含质粒的农杆菌中，导入质粒的农杆菌与植物外植体分别共培养后，若实验结果为________，则说明LB与RB是T-DNA进入植物细胞不可缺少的结构，而tms与tmr则不是。为获得胚状体或试管苗，研究人员用携带了质粒B的农杆菌侵染植物，而不用携带质粒A的农杆菌，原因最可能是________。 学科网（北京）股份有限公司第 1 页 共 15 页 学科网（北京）股份有限公司 $