专题16 基因工程（期末真题汇编，广东专用）高二生物下学期人教版

**基本信息** 广东高二下期末基因工程专题汇编，覆盖基本工具、操作程序、应用及安全性三大考点，精选各地期末真题，融合CRISPR/Cas9、无缝克隆等前沿情境，注重实验操作与科学思维考查。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |单选题|24|限制酶作用、PCR原理、电泳技术等|结合DNA粗提取等实验情境，考查基础操作| |实验题|3|载体构建、酶切鉴定、目的基因检测|如东莞期末题涉及限制酶选择与电泳分析，强调实验设计| |解答题|9|CRISPR编辑、蛋白质工程、转基因应用|如清远期末CRISPR敲除Krt71基因题，融合前沿技术与伦理分析|

专题16 基因工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点02 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具 一、单选题 1．(24-25高二下·广东湛江·期末)下列关于DNA粗提取与鉴定、PCR技术及电泳的叙述，正确的是（    ） A．DNA粗提取时，可用95%的冷酒精析出DNA B．PCR反应中，需要加入解旋酶和四种脱氧核苷酸作为原料 C．琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率与分子量大小呈正相关 D．鉴定DNA时，加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，故DNA粗提取时，可用95%的冷酒精析出DNA，A正确； B、PCR通过高温（90℃以上）使DNA变性解链，无需解旋酶，B错误； C、琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子量越小，迁移速率越快，迁移速率与分子量大小呈负相关，C错误； D、二苯胺试剂鉴定DNA需在沸水浴条件下加热才会显蓝色，D错误。 故选A。 2．(24-25高二下·广东清远·期末)某同学将洋葱研磨液离心后取出上清液，为了从上清液析出DNA，应加入的是（　　） A．二苯胺试剂 B．2mol/L的NaCl溶液 C．冷却的酒精溶液 D．酸性重铬酸钾溶液 【答案】C 【分析】DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 【详解】A、二苯胺试剂用于在沸水浴条件下鉴定DNA，不会导致DNA析出，A错误； B、2mol/L的NaCl溶液会使DNA的溶解度升高，促进溶解而非析出，B错误； C、冷却的酒精溶液能降低DNA的溶解度，使其从溶液中析出，同时去除部分杂质，C正确； D、酸性重铬酸钾用于检测酒精，与DNA析出无关，D错误。 故选C。 3．(24-25高二下·广东肇庆·期末)下列对有关实验的叙述，正确的是（    ） A．鉴定糖类、脂肪、蛋白质三种有机物时，都可以不用显微镜 B．紫色洋葱鳞片叶的外表皮细胞可观察到质壁分离及复原现象，内表皮细胞不能 C．分离不同类型的细胞器，常用梯度离心法 D．做DNA粗提取与鉴定实验时，用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 【答案】A 【详解】A、斐林试剂可用于鉴定还原糖，在水浴加热的条件下，溶液的颜色变化为砖红色，蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，脂肪可用苏丹Ⅲ染液鉴定，呈橘黄色，都可以不用显微镜观察，A正确； B、紫色洋葱鳞片叶的内外表皮细胞都可观察到质壁分离及复原现象，因为两者都含有成熟的大液泡，B错误； C、分离不同类型的细胞器，常用差速离心法，C错误； D、兔属于哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核及各种细胞器，不含DNA；而鸡属于鸟类，其成熟的红细胞内含有细胞核等，含有DNA，D错误。 故选A。 4．(24-25高二下·广东梅州·期末)甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点 B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定等 C．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 D．PCR扩增R基因时，微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前均须进行灭菌处理 【答案】C 【分析】1、图甲中①是逆转录过程，②是经过复制形成双链cDNA，③是将R蛋白基因和质粒结合形成基因表达载体，图乙是用限制酶切割后形成的电泳图。 2、PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 3、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、用HindIII将质粒2000bp切割后形成了200bp、400bp和1400bp共3个片段，说明HindIII在重组质粒上有3个酶切位点，而用HindIII和BamHl将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2000=420×2+560+200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有6个酶切位点，因此BamHI在重组质粒上有6-3=3个酶切位点，A正确； B、不同生物的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，B正确； C、图甲获得重组质粒过程，需要逆转录、形成双链cDNA分子以及R蛋白基因与质粒的重组，所以至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，C错误； D、PCR扩增R基因时，微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前均须进行灭菌处理，D正确。 故选C。 5．(24-25高二下·广东佛山·期末)关于DNA的粗提取和鉴定的实验，下列叙述错误的是（　　） A．将研磨液倒入垫有滤纸的漏斗中过滤以去除杂质 B．研磨液需在4℃的冰箱中放置几分钟后再取上清液 C．加入酒精出现丝状物后，用玻璃棒沿一个方向搅拌 D．溶解的DNA粗提物在沸水浴中与二苯胺反应呈蓝色 【答案】A 【详解】A、实验中过滤研磨液应使用纱布或尼龙布，而非滤纸。滤纸孔径较小，易堵塞且无法有效分离细胞碎片等大分子杂质，A错误； B、4℃静置可降低DNA溶解度，促使DNA沉淀析出，此时取上清液可减少杂质干扰，B正确； C、加入酒精后DNA析出为丝状物，沿同一方向搅拌可避免DNA断裂，便于缠绕收集，C正确； D、二苯胺试剂在沸水浴条件下与DNA反应生成蓝色复合物，此现象用于鉴定DNA，D正确。 故选A。 6．(24-25高二下·广东韶关·期末)基因编辑的困难在于精准地将DNA片段插入基因组的特定位置。近期，我国科学家发现R2逆转座子可将DNA片段特异性插入目的DNA区域，但插入效率较低。科学家利用蛋白质工程等技术将R2逆转座子改造后，实现了在哺乳动物细胞中高效插入。R2逆转座子和DNA片段插入过程如图所示。下列叙述错误的是（　　）    A．R2逆转座子也有DNA连接酶的活性 B．合成第二条DNA链的模板是R2 RNA C．插入的目的序列应设计在R2 RNA中 D．可通过改造R2蛋白结构提高插入效率 【答案】B 【分析】以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。 【详解】A、结合图示可以看出，R2逆转座子不仅具有逆转录酶活性，也有DNA连接酶的活性，A正确； B、结合图示可以看出，合成第二条DNA链的模板是合成的第一条DNA链，B错误； C、插入的目的序列应设计在R2 RNA中，因为目标序列需要通过逆转录过程获得，而R2 RNA是逆转录的模板，C正确； D、题意显示，科学家利用蛋白质工程等技术将R2逆转座子改造后，实现了在哺乳动物细胞中高效插入，该过程可通过改造R2蛋白的基因实现，进而实现对R2蛋白结构的改变，D正确。 故选B。 二、实验题 7．(24-25高二下·广东东莞·期末)人类γ-干扰素是由γ基因编码的分泌蛋白，可用于治疗病毒感染和癌症。为了实现干扰素的工厂化生产，科研人员拟利用A基因上游的调控序列来驱动γ基因的表达。科研人员扩增了A基因上游的这段调控序列（如图甲所示），将其插入质粒pCLY11中（如图乙所示，质粒中已含γ基因），并导入酵母菌中实现工厂化生产。表a列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点，已知质粒pCLY11经EcoR I、BamH I、Bgl Ⅱ酶切后产生1.5kb、3kb和4.5kb的片段。请回答下列问题： 限制酶 识别序列及切割位点 BamH I 5'-G↓GATCC-3' Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' EcoR I 5'-G↓AATTC-3' Xho I 5'-C↓TCGAG-3' (1)PCR扩增调控序列的反应需要提供DNA模板、引物、脱氧核苷酸和__________。 (2)为将A基因上游的调控序列定向插入质粒驱动γ基因表达，处理质粒pCLY11时需要选用的限制酶是__________，处理A基因上游的调控序列时需要选用的限制酶是__________。 (3)在含新霉素的培养基中形成的菌落不一定都是目的菌株，理由是__________。 (4)为鉴定筛选出的菌落中含有重组质粒，科研人员用EcoR I、BamH I、Bgl Ⅱ酶切质粒后，进行电泳检测。若酶切后电泳中出现__________kb左右大小的条带，则说明A基因上游的调控序列已成功插入基因表达载体。对于电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序来确认质粒中插入了目的片段，原因是__________。 【答案】(1)耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） (2) EcoR I、BamH I EcoR I、Bgl II (3)导入空质粒的酵母菌也具有新霉素抗性 (4) 3kb、8kb 电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列 【分析】PCR 即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术。其基本原理是模拟体内 DNA 复制的过程，通过人为控制温度变化，使目的 DNA 片段在耐高温的 DNA 聚合酶、引物、脱氧核苷酸等物质参与下，经过变性、退火、延伸三个步骤的循环，实现指数级扩增，从而在短时间内获得大量相同的 DNA 片段。基因工程的基本操作步骤是：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）PCR 扩增反应需要提供 DNA 模板、引物、脱氧核苷酸和耐高温的 DNA 聚合酶（Taq DNA聚合酶）。Taq 酶能够在高温条件下催化脱氧核苷酸聚合形成 DNA 链。 （2）为了将 A 基因上游的调控序列定向插入质粒驱动γ基因表达，需要选择合适的限制酶，使目的基因和质粒产生的黏性末端能准确连接。观察可知，质粒 pCLY11 上有 EcoRⅠ和 BamHⅠ的酶切位点，且用这两种酶切割不会破坏关键元件；A 基因上游的调控序列两端也可以用 EcoRⅠ和 BglⅡ切割，BamHⅠ和 BglⅡ切割产生的黏性末端相同，所以处理质粒 pCLY11 时需要选用的限制酶是 EcoRⅠ、BamHⅠ，处理 A 基因上游的调控序列时需要选用的限制酶是 EcoRⅠ、BglⅡ。 （3）在含新霉素的培养基中形成的菌落不一定都是目的菌株，因为导入空质粒的酵母菌也具有新霉素抗性即存在未插入目的基因的空质粒导入酵母菌的情况 ，这些酵母菌也能在含新霉素的培养基中生长形成菌落。 （4）已知质粒pCLY11经EcoR I、BamH I、Bgl Ⅱ酶切后产生1.5kb、3kb和4.5kb的片段。目的基因长度3.5kb，若A基因上游的调控序列已成功插入基因表达载体，则用EcoR I、BamH I、Bgl Ⅱ酶切质粒后，会出现3kb和3.5+4.5=8kb左右的条带。由于电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列，通常需进一步通过基因测序来确认质粒中插入了目的片段。 三、解答题 8．(24-25高二下·广东梅州·期末)无缝克隆技术是依赖于同源序列的基因克隆技术，利用同源的DNA序列能够将任意DNA片段进行无缝连接在一起，过程如图1所示。我国某科研团队利用无缝克隆技术构建了多基因表达载体，从而培育出了抗虫抗除草剂的玉米，抗虫抗除草剂玉米表达载体构建过程如图2所示。 (1)图1中修复缺口用到的DNA聚合酶和DNA连接酶在发挥作用时的区别是______。（答出1点即可） (2)T5核酸外切酶沿“5′→3′”的方向水解DNA，其目的是形成______末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而图1中T5核酸外切酶作用的温度通常选择为50℃，目的是：______，防止过度水解DNA，从而更好地控制反应过程。 (3)图2中为了使CryIAc基因和GR79基因与线性化质粒进行无缝连接，需要对CrylAc基因和GR79基因进行PCR改造，改造所用的引物要加入额外的片段，根据图1无缝连接的原理，图2中引物2和引物3所加的片段碱基序列应______（填“相同”或“互补”）。引物1和引物4所加片段应分别与线性化质粒中的______（从“a、b、c、d”中选填）片段序列相同。 (4)结合图1和图2信息可以看出无缝克隆技术不依赖于任何限制酶，利用T5核酸外切酶可以将有同源序列的片段进行无缝连接。和传统方法比，无缝克隆技术构建基因表达载体的优点是______。 【答案】(1)DNA聚合酶催化单个核苷酸添加到已有的 DNA链上，形成磷酸二酯键，而 DNA连接酶是催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶不需要板 (2) 黏性 降低酶活性 (3) 互补 b、d (4)插入位点不受限制酶识别序列限制，实现了目的基因在载体任意位点上的插入 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1中修复缺口用到的DNA聚合酶和DNA连接酶在发挥作用时的区别有以下两点：DNA聚合酶催化单个核苷酸添加到已有的 DNA链上，形成磷酸二酯键，而DNA连接酶是催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶不需要板。 （2）分析题图可知：T5核酸外切酶沿“5′→3′”的方向水解DNA，其目的是形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而图1中T5核酸外切酶作用的温度通常选择为50℃，以降低酶活性，防止过度水解DNA，从而更好地控制反应过程。 （3）无缝克隆技术是依赖于同源序列的基因克隆技术，利用同源的DNA序列能够将任意DNA片段进行无缝连接在一起，图2中为了使CryIAc基因和GR79基因与线性化质粒进行无缝连接，需要对CrylAc基因和GR79基因进行PCR改造，改造所用的引物要加入额外的片段，根据图1无缝连接的原理，图2中引物2和引物3所加的片段碱基序列应互补。引物1扩增的产物插到靠近LB的一侧，根据引物方向5′→3′与ab的方向可知，引物1所加片段应与线性化质粒中的b片段序列相同。同理引物4所加片段应分别与线性化质粒中的d片段序列相同。 （4）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶酶切位点的限制，实现了目的基因在载体任意位点上的插入。 9．(24-25高二下·广东清远·期末)CRISPR/Cas9系统可表达sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到特定基因上并对基因进行切割，可应用于基因的敲除。单纯性少毛症的发生与角蛋白基因（Krt71）的突变有关。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对小鼠的Krt71基因进行编辑。Krt71基因的部分序列和基因编辑技术流程见图。回答下列问题： (1)Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。Cas9蛋白的功能与基因工程常用的______酶功能类似。对Krt71基因进行编辑时，质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因______（填“序列1”“序列2”或“序列3”）的部分碱基序列相同。 (2)质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为______。过程③通常将受精卵培养至______阶段。 (3)与直接导入质粒pUC57相比，将Krt71－sgRNA和Cas9－mRNA直接注入小鼠受精卵，可减少转录的时间从而快速启动基因编辑过程；同时可降低外源基因整合到______的风险。 (4)敲除Krt71基因后对小鼠的毛发生长情况和毛发量等方面进行表型分析。该实验构建了单纯性少毛症小鼠模型，其研究价值是______（答出一点即可）。 【答案】(1) 限制（或限制性内切核酸） 序列3 (2) 启动子 桑葚胚（或囊胚） (3)基因组/细胞核/DNA/染色体 (4)用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。故Cas9蛋白的功能与基因工程常用的限制酶功能类似。由于Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因，而Krt71基因在序列3中含有TGG序列（序列1和2不含NGG），因此需要sgRNA能识别序列3的部分碱基序列，进而通过Cas9蛋白切割序列3的相应位点，故质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因序列3的部分碱基序列相同，保证转录形成的Krt71-sgRNA能通过碱基互补配对识别序列3。 （2）过程①为转录，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因转录形成RNA，即质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为启动子，胚胎移植时应选发育良好的桑葚胚或囊胚阶段的胚胎进行移植。 （3）由于质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上，因此将目的基因与质粒构建形成表达载体后，可能会将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，而将Krt71－sgRNA和Cas9－mRNA直接注入小鼠受精卵，则可降低外源基因整合到受体细胞的染色体DNA上的风险。 （4）敲除Krt71基因的生物体不在有Krt71基因的表达产物，会表现出相应的性状，相当于利用减法原理去除相应基因，来观察该基因的功能，因此该实验构建的单纯性少毛症小鼠模型，可用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗。 10．(23-24高二下·广东珠海·期末)转基因技术是发展农业现代化的重要新质生产力，二化螟的幼虫主要危害水稻的叶和茎，严重影响产量，转Bt基因水稻能够抵抗二化螟幼虫的侵害，cryIC基因能促进Bt基因的表达。科研人员采用GAL4/UAS基因调控系统构建了cryIC-Bt转基因抗虫水稻，实验部分流程如图1所示。GAL4/UAS系统调控基因表达的机理如图2所示：UAS序列抑制靶基因表达使靶基因沉默，GAL4蛋白是一种转录活性因子，可特异性地识别并结合UAS序列，激活UAS下游靶基因的表达。      请回答： (1)图1中①②操作过程涉及到的工具酶有______。③④过程经目的基因的检测和鉴定后，还需要通过_____将细胞培养成转基因个体。 (2)拟采用农杆菌转化法导入目的基因，图3为Ti质粒的T-DNA片段示意图。现已获得cryIC基因、Bt基因和GFP（绿色荧光蛋白）基因，GFP基因有助于筛选受体细胞，起到基因表达载体中_______（填结构）的作用。构建UAS-靶基因表达载体时，应将cryIC、Bt、GFP三个基因插入到图3所示T-DNA中的位置分别是_________。（用序号①②③作答） (3)将GAL4转基因个体与UAS-Bt转基因个体杂交得到的子代个体表现出抗虫性状，原因是_________。 (4)转基因作物的安全性备受关注，采用GAL4/UAS系统培育转基因水稻，通过特异性启动子-GAL4调控UAS-靶基因的表达，可以使Bt基因只在特定器官中高效的表达，则构建GAL4基因表达载体时选用的启动子应来自于_______（填水稻器官名称），其意义是______。 【答案】(1) 限制酶、DNA连接酶 植物组织培养技术 (2) 标记基因 ②③① (3)同时含有GAL4基因和UAS-Bt基因，GAL4基因表达产生的GAL4蛋白与UAS结合激活Bt基因的表达 (4) 叶和茎 使目的基因只在叶和茎中表达，而在食用的水稻种子中不表达，对人没有危害。 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1中①②操作过程为将目的基因导入受体细胞，该过程涉及的酶有限制酶和DNA连接酶（用于切割和连接目的基因与载体，构建基因表达载体）。 、③④过程除了要进行目的基因的检测和鉴定外还需要进行植物组织培养（原理为植物细胞的全能性）才能将细胞培养成转基因个体。 （2）拟采用农杆菌转化法导入目的基因，图3为Ti质粒的T-DNA片段示意图。现已获得cryIC基因、Bt基因和GFP（绿色荧光蛋白）基因，GFP基因有助于筛选受体细胞，属于基因表达载体中的标记基因。 若要以GFP基因为标记基因筛选受体细胞，又知Bt基因能够抵抗二化螟幼虫的侵害，cryIC基因能促进Bt基因的表达，因此构建的基因表达载体中①处应该插入标记基因（GFP基因），②③处插入cry1C、Bt基因，即应将cry1C、Bt、GFP三个基因插入到图3所示T-DNA中的位置分别是②③①。 （3）将GAL4转基因个体与UAS-B1转基因个体杂交得到的子代个体表现出抗虫性状，这是因为子代细胞中含有GAL4基因和UAS-Bt基因，GAL4基因表达产生的GAL4蛋白与UAS结合激活Bt基因的表达，进而表现出抗虫性状。 （4） 根据题意可知，启动子具有特异性，构建GAL4基因表达载体时采用叶片和茎鞘中特异性表达基因的启动子，可使目的基因只在叶和茎中表达，而在食用的水稻种子中不表达，对人没有危害，故该技术在提高食品安全方面可能存在一定的意义。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．(24-25高二下·广东湛江·期末)将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin - Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和T1质粒构建基因表达载体的过程，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述错误的是（    ） A．利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物5'端添加相应酶切位点 B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnI和HindⅢ比选用KpnI和SmaI效果更好 C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2+处理受体细胞 D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性 【答案】D 【分析】基因工程包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3在引物5'端添加相应酶切位点，A正确； B、为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好，因为SmaI切割DNA后形成平末端，T4DNA连接酶连接平末端的效率相对较低，B正确； C、为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2+处理受体细胞，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，然后再将重组质粒导入其中，C正确； D、只有T-DNA区段会导入植物受体细胞，因此氨苄青霉素抗性基因不会导入植物受体细胞中，即成功导入目的基因的杨树细胞只能表现出新霉素抗性，D错误。 故选D。 2．(24-25高二下·广东梅州·期末)下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述错误的是（    ） A．获取该基因，要破坏4个磷酸二酯键 B．蛛丝蛋白基因上游和下游分别含有启动子和终止子 C．一个蛛丝蛋白基因扩增4次共消耗引物30个 D．用PCR技术获取该基因，设计的引物应分别结合在1、4部位 【答案】D 【分析】PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 DNA复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因DNA 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链 DNA为模板，在 DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 【详解】A、获取该基因，目的基因的两端均需要用限制酶进行切割，每条链各破坏一个磷酸二酯键，故要破坏4个磷酸二酯键，A正确； B、启动子是转录的起点，终止子是转录的终点，故蛛丝蛋白基因上游和下游分别含有启动子和终止子，调控转录过程，B正确； C、一个蛛丝蛋白扩增4次，共形成24=16个DNA分子，共含有16×2=32条链，除去原来的母链，其他子链的形成各需要消耗一个引物，故共需要消耗的引物的数目为：32-2=30个，C正确； D、子链的延伸方向为5’到3’，故应该选择引物2和3扩增蛛丝蛋白基因，D错误。 故选D。 3．(24-25高二下·广东汕尾·期末)qPCB（定量PCB）通过荧光染料与扩增的双链DNA结合，产生荧光信号，分析荧光信号的强度，可以定量分析样品中的目标基因。以下属于进行qPCR的必备条件的是（　　） A．已知目标基因的全部序列 B．32P标记的脱氧核苷酸原料 C．碱基不发生互补配对的两种引物 D．逆转录酶和耐高温DNA聚合酶 【答案】C 【分析】本题考查qPCR（定量聚合酶链式反应）的必备条件，需结合PCR的基本原理和qPCR的特点分析各选项。 【详解】A、已知目标基因的全部序列并非必需，只需已知两端部分序列以设计引物即可，A不符合题意； B、qPCR通过荧光染料检测双链DNA，无需放射性标记（如³²P）的脱氧核苷酸，B错误； C、PCR需要两种引物分别结合DNA双链，且引物间碱基不互补配对，否则会形成引物二聚体，C正确； D、逆转录酶仅用于RNA逆转录为cDNA（如RT-qPCR），而题目未提及RNA模板，故无需逆转录酶；耐高温DNA聚合酶是PCR必需，但D包含无关成分，D不符合题意； 故选C。 4．(24-25高二下·广东广州八区·期末)蛛丝有超强韧性，将蛛丝蛋白基因转入羊的乳腺中可以生产蛛丝蛋白。图a是蛛丝蛋白基因的DNA片段；利用PCR技术对蛛丝蛋白基因进行检测，电泳结果如图b。其中1号来自普通羊，2号来自含蛛丝蛋白基因的质粒，其余来自转基因羊。下列叙述错误的是（　　） A．用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④ B．PCR过程在第3次循环结束后可以得到两端都含引物的目的基因 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关 D．使用抗原-抗体结合法可能在3、5、8号羊的乳汁中检测到蛛丝蛋白 【答案】A 【详解】A、据题图分析可知，磷酸基团为DNA的5'端，羟基为DNA的3'端，由于DNA聚合酶只能从5'→3'延伸子链，所以在PCR扩增中引物与DNA模板链的3'端结合进行延伸，故选择图中引物②和引物③，A错误； B、PCR过程中，以引物为起点进行DNA链的延伸。在第1次循环后，得到的两个DNA分子只有一端含引物；第2次循环后，得到的4个DNA分子中有2个DNA分子两端都含引物；第3次循环结束后可以得到两端都含引物的目的基因，B正确； C、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，C正确； D、由题干信息和图b可知，2号来自含蛛丝蛋白基因的质粒，3、5、8号羊的电泳结果与2号相似，说明3、5、8号羊含有蛛丝蛋白基因，使用抗原 - 抗体结合法可能在3、5、8号羊的乳汁中检测到蛛丝蛋白，D正确。 故选A。 5．(24-25高二下·广东韶关·期末)实时荧光定量PCR（qPCR）是在传统PCR基础上引入荧光信号检测系统，通过实时监测荧光信号累积量来定量分析扩增产物数量的技术。qPCR使用的DNA探针的5'端和3'端分别带有一个荧光报告基团（FAM）和一个淬灭基团（TAMRA），探针完整时FAM的荧光被TAMRA吸收，检测不出荧光信号；探针被切割时FAM和TAMRA分离，释放荧光信号，检测过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．反应体系中需加入Mg2+以激活Taq酶，帮助其催化复性过程 B．引物能使Taq酶从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸以形成新链 C．Taq酶能水解探针的5'端脱氧核苷酸，使FAM和TAMRA分离 D．随着循环次数的增加，PCR产物量快速增长，荧光信号逐渐减弱 【答案】C 【分析】PCR是体外模拟DNA复制的过程，其原理是DNA双链复制。体内DNA复制过程中需要模板、原料、能量、引物和酶等，PCR过程中原料和能量由dNTP提供，酶是热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 【详解】A、在 PCR 反应体系中，加入Mg2+可以激活 Taq 酶，但 Taq 酶催化的是延伸过程，而不是复性过程，A错误； B、引物能使 Taq 酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸以形成新链，而不是5′端，B错误； C、由题可知，Taq 酶能水解探针的5′端脱氧核苷酸，使得荧光报告基团（FAM）和淬灭基团（TAMRA）分离，从而释放荧光信号，C正确； D、随着循环次数的增加，PCR 产物量快速增长，被切割的探针增多，荧光信号应该逐渐增强，而不是减弱，D错误。 故选C。 6．(24-25高二下·广东佛山·期末)图a示基因L及其启动子pL和终止子的结构，图b示某种Ti质粒的结构，其中基因gue编码GUS酶，可通过检测GUS酶活性来反映启动子活性。研究人员欲检测基因L的启动子pL的活性，应选下列哪种组合的限制酶对DNA片段和Ti质粒进行处理?（　　） A．XbaI、BamHI B．HindⅢ、BamHI C．SmaI、HindⅢ D．SacI、XbaI 【答案】B 【详解】A、用XbaI、BamHI切割含基因L的DNA片段，会同时切下启动子pL和基因L，不能单独获取启动子pL，不符合要求，A错误； B、HindⅢ在基因L的左侧，BamHI在基因L内。用HindⅢ、BamHI切割含基因L的DNA片段，一方面可获取启动子pL（HindⅢ与BamHI之间部分），另一方面用这两种酶切割Ti质粒后，可将启动子pL连接到Ti质粒上gus基因的上游，通过检测GUS酶活性来反映启动子活性，B正确； C、SmaⅠ的酶切位点在基因L内，用SmaⅠ、HindⅢ切割含基因L的DNA片段会破坏基因L和启动子pL的结构，无法达到实验目的，C错误； D、SacI的酶切位点在基因L的终止子之后，XbaI在启动子pL左侧。用SacI、XbaI切割含基因L的DNA片段，会将启动子pL、基因L以及终止子一起切下，不能单独获取启动子pL，D错误。 故选B。 7．(24-25高二下·广东韶关·期末)下列对某目标DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定实验的叙述，错误的是（　　） A．PCR实验中使用的离心管、枪头等需经高压灭菌处理 B．应在凝胶完全凝固前小心拔出梳子，形成加样孔 C．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 D．若电泳鉴定结果出现不止一条带，可能是复性温度低导致的 【答案】B 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、PCR实验使用到的器具和试剂如微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，避免杂菌对实验结果产生影响，A正确； B、待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，形成加样孔，B错误； C、待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，C正确； D、PCR扩增时复性温度过低，可能会导致引物与非互补配对的序列发生部分结合，从而产生不同长度的DNA分子，出现多条条带，D正确。 故选B。 8．(23-24高二下·广东茂名·期末)PCR 也称为聚合酶链式反应，是一项 DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。下列叙述错误的是（    ） A．PCR 技术的原理是 DNA 的半保留复制 B．1 个 DNA 扩增n次需消耗引物对数为2n-1 C．复性是让引物通过碱基互补配对与 DNA 母链的3’端配对 D．延伸过程需要 DNA 聚合酶、ATP 和4 种核糖核苷酸 【答案】D 【分析】PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR包括三个步骤，分别为：变性、复性、延伸。 【详解】A、PCR 是一项 DNA 体外合成技术，原理是 DNA 的半保留复制，A 正确； B、每新合成1个DNA 需要1对引物，n次循环相当于新合成2n-1个DNA，共需要2n-1对引物，B正确； C、复性过程中引物与DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，引物与母链的3'端结合，C正确； D、延伸过程需要耐高温的 DNA 聚合酶、四种dNTP，NTP提供脱氧核苷酸和能量，D错误。 故选D。 9．(23-24高二下·广东佛山·期末)我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得了有香味的水稻，机理如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．sgRNA的识别序列过短可能会导致编辑对象出错 B．Cas9蛋白功能类似于限制酶，可以识别并剪切特定DNA片段 C．在培养基中加入潮霉素，可用于筛选导入基因敲除载体的植物细胞 D．构建好的基因敲除载体可用农杆菌转化法导入水稻细胞 【答案】B 【分析】1、基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术； 2、基因工程的基本工具：（1）“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶），（2）“分子缝合针”--DNA连接酶，（3）“分子运输车”--载体； 3、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，sgRNA能识别靶基因的特定序列，引导Cas9蛋白去切割特定序列，sgRNA的识别序列过短可能会导致编辑对象出错，A正确； B、由图可知，Cas9蛋白在功能上属于限制（性内切核酸）酶，可以剪切特定DNA片段，sgRNA能识别靶基因的特定序列，B错误； C、由图可知，基因敲除载体中有sgRNA基因、Cas9基因和潮霉素抗性基因，使转基因水稻也带有潮霉素抗性基因，所以在培养基中加入潮霉素进行选择，C正确； D、农杆菌转化法一般适用于双子叶植物，单子叶植物经处理后也可用农杆菌转化，D正确。 故选B。 二、解答题 10．(24-25高二下·广东深圳龙华区·期末)腺病毒载体广泛用于基因治疗和疫苗研究，其实质是将目的基因整合至腺病毒基因组，进而表达蛋白抗原，诱导较强的免疫反应。现为了探索猴1型腺病毒（SAdV-1）作为疫苗载体的可能性，科研人员利用基因工程的方法将绿色荧光蛋白（GFP）基因和萤火虫荧光素酶（Fluc）基因导入腺病毒质粒pKSAV1中，成功构建了携带双报告基因的新型SAdV-1载体，部分流程如图所示。回答下列问题：    (1)利用PCR扩增GFP和Fluc基因时，需要设计引物，引物的作用是__________。同时依赖引物的重叠序列将两者串联，形成融合基因GFluc。为了保证GFluc和PKSAV1质粒相连，可在设计引物的__________端加上限制酶的识别序列。 (2)步骤③使用Ca²⁺处理大肠杆菌的目的是__________，使重组质粒进入大肠杆菌，完成转化实验。检测转化是否成功的技术是__________。 (3)为了提高转基因效率，同时避免标记基因进入受体细胞，据图应选用__________限制酶将重组质粒线性化。若要检测受体细胞系是否产生了目的蛋白，可以采用__________技术。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 5′ (2) 使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 荧光显微镜观察绿色荧光（或检测荧光素酶活性） (3) SwaI 抗原-抗体杂交 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：(1)目的基因的获取;(2)基因表达载体的构建(核心);(3)将目的基因导入受体细胞;(4)目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由于DNA聚合酶无法将单个脱氧核苷酸直接聚合成链，因此在PCR扩增过程中，需要加入一小段DNA片段，即引物，故引物的作用是与模板链在特定位置发生碱基互补配对，而后使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸;由于 DNA子链是从引物的3'端延伸，而且引物的3'端序列必须与模板链配对，因此在设计引物时，只能在两条引物的5'端加上限制性酶切位点，从而确保GFluc和PKSAV1质粒后续能够相连形成重组质粒。 （2）步骤③将目的基因导入大肠杆菌时，一般先用Ca2+溶液处理大肠杆菌，其目的是使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围DNA分子的生理状态，即感受态，进而使重组质粒进入大肠杆菌，完成转化实验;质粒上带有卡那霉素抗性基因，因此可以在培养基中加入卡那霉素对成功转化的大肠杆菌进行初步筛选。 （3）据图可知，限制酶Swal可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因及启动子的片段，因此为了提高转基因效率，同时避免标记基因进入受体细胞，据图应选用限制酶Swal将重组质粒线性化，若要检测受体细胞系是否产生了目的蛋白，可用相应蛋白质的单克隆抗体，采用抗原-抗体杂交技术来鉴定。 11．(24-25高二下·广东广州八区·期末)炎症性肠病（IBD）属于肠道慢性炎症性疾病的范畴。研究揭示，患者肠道中会生成硫代硫酸盐（物质S），其产生量与疾病的严重程度呈正比关系。研究人员将抗炎蛋白基因与物质S特异性诱导激活的启动子P、终止子等元件连接，构建了重组基因（如图a所示）。随后，该重组基因与图b所示的载体结合，形成了表达载体。通过将此载体导入大肠杆菌并进行筛选，成功获得了菌株E。当患病模型小鼠被饲喂摄入菌株E后，其IBD症状得到了显著的缓解。 回答下列问题： (1)图a中能被RNA聚合酶识别和结合的部位是______。从抗炎蛋白表达调控的角度分析，选用启动子P的优点是______。 (2)将图a的抗炎蛋白重组基因插入如图b所示Kanr基因内的sacⅡ位点。为确认抗炎蛋白重组基因的大小和插入方向，科研人员用限制酶pstⅠ切割重组质粒并进行电泳，结果出现了4.8kb和0.8kb两个片段。据图分析，抗炎蛋白重组基因长度约为______kb；抗炎蛋白重组基因插入后转录方向与Kanr基因______（填“相同”或“相反”）。 (3)使用氨苄青霉素和卡那霉素筛选出菌株E，可进行的操作是______，菌株E对两种抗生素的抗性特征表现为______。 【答案】(1) 启动子P 通过物质S特异性诱导激活启动子P，促使抗炎蛋白基因表达，实现精准治疗 (2) 2.6kb 相反 (3) 将导入表达载体的大肠杆菌接种到分别含有氨苄青霉素和卡那霉素的不同培养基中 抗氨苄青霉素，不抗卡那霉素 【分析】由图可知，目的基因插入位点在抗卡那霉素标记基因内部，目的基因插入会把该抗性基因破坏，但抗氨苄青霉素基因完整。 【详解】（1）图a中启动子P能被RNA聚合酶识别和结合，是转录开始的地方。患者肠道中会生成硫代硫酸盐（物质S），其产生量与疾病的严重程度呈正比关系。通过物质S特异性诱导激活启动子P，促使抗炎蛋白基因表达，实现精准治疗。 （2）由题意可知，加入目的基因后大小为4.8kb+0.8kb=5.6kb，载体大小为3kb，所以抗炎蛋白重组基因长度约为5.6-3=2.6kb。如果插入目的基因与Kanr基因转录方向相同，则两个pstⅠ位点之间大小大于2.6kb，加上载体3kb，与题意不符，所以插入目的基因与Kanr基因转录方向相反。 （3）由图可知，卡那霉素基因已经被破坏，所以重组菌株不能在含卡那霉素的培养基生长，但可在含氨苄青霉素的培养基培养。将导入表达载体的大肠杆菌接种到分别含有氨苄青霉素和卡那霉素的不同培养基中，菌株E抗氨苄青霉素、不抗卡那霉素。 12．(24-25高二下·广东汕尾·期末)HPV疫苗由HPV病毒的主要衣壳蛋白L1组成，该蛋白主要通过基因工程技术制备。下图1是研究人员通过不同方法构建表达载体，图2表示酶切位点。回答下列问题： (1)图a是用单酶切构建基因表达载体，目的基因和质粒分别选择的限制酶是_______。 (2)图b是双酶切构建基因表达载体，为使转基因成功率更高，通常会选择_______限制酶对_______进行酶切；双酶切的原因一方面是可以防止质粒和目的基因_______，提升目的基因与质粒连接效率；另一方面可以避免_______，防止连接到质粒的目的基因无法表达。 (3)含有lacZ基因的菌体可在加入IPTG的情况下，呈现蓝色菌落，否则菌落为白色。为筛选转化成功的受体菌，在培养基中加入青霉素和IPTG的具体作用分别是_______。 【答案】(1)BamHI、BamHI或BglⅡ (2) BamHI、EcoRI 质粒和目的基因 自身环化 目的基因与质粒反向连接 (3)青霉素主要是淘汰未转化的受体菌，IPTG可以使转化重组质粒的菌落呈现白色，转化空载体的菌落呈现蓝色 【分析】基因工程中，用限制酶切割DNA分子时，会产生两种末端，一种是平末端，一种是黏性末端。平未端是指DNA分子在对称轴两端对称切开，从其他位置切开的是黏性未端。E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平未端，但连接平末端时的效率比较低。 【详解】（1）图a是单酶切，根据酶切位点的位置及酶切要求，需要切下目的基因并且切开质粒，所以选择BamHI对目的基因进行切割。由于BamHI和BglⅡ两种酶产生的末端是相同的，所以可以用这两种酶切割质粒。 （2）双酶切是选择不同的酶进行切割，根据目的基因虽然可以选择BamHI、EcoRI或BamHI、BglⅡ，但是BamHI、BglⅡ酶切会形成相同的黏性末端，不能定向连接，只能选择BamHI、EcoRI。通常会选择与处理目的基因相同的酶，质粒只能选择BamHI、EcoRI两种酶进行切割，即选择BamHI、EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行酶切；双酶切后由于形成的末端不同可以防止质粒和目的基因自身环化，，提升目的基因与质粒连接效率；同时也会防止目的基因与质粒切口反向连接后导致无法表达。 （3）质粒带有青霉素抗性基因，加入青霉素的作用是淘汰未转化的受体菌；含有lacZ基因的菌体可在加入IPTG的情况下，呈现蓝色菌落，否则菌落为白色，重组质粒已经破坏了lacZ基因，故IPTG的具体作用是可以使转化重组质粒的菌落呈现白色，转化空载体的菌落呈现蓝色。 13．(24-25高二下·广东潮州·期末)水蛭唾液腺分泌的水蛭素(Hiruan)是一种优良的凝血酶抑制剂，在血栓治疗上有着重要的医学价值，但天然的水蛭素的临床活性较低，如果将水蛭素分子中第47位的天冬酰胺替换成赖氨酸，其分子活性会提高20倍。如图表示改造 Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。回答下列问题： (1)获取目的基因：从水蛭唾液腺细胞中获取_______反转录得到cDNA后，利用PCR引物在 Hirudin基因内部碱基进行替换，需要在__________(填引物)中设计特定的碱基，从而对 Hirudin 基因进行改造以获得改良的 Hirudin 蛋白。 (2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11与 Hirudin改良基因高效连接，应选用___________对pCLY11进行酶切。与单酶切相比，采用双酶切的优点有___________(答两点)。 (3)将经蛋白质工程改造后得到的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如下图所示。推测两种蛋白酶水解处理后，酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的_______(填“种类”或“含量”)有关。 (4)得到控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因后，利用基因工程可以制备乳腺生物反应器，让哺乳动物批量生产高抗凝血活性的水蛭蛋白，此时需要将______与______等调控原件重组在一起。某生物兴趣小组同学大胆推测，用类似方法制备膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的__________(写出两点)的限制。 【答案】(1) mRNA/信使RNA 引物2和引物3 (2) XmaⅠ和BglⅡ 可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接 (3)种类 (4) 控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因（药用蛋白基因） 乳腺中特异表达的基因的启动子 性别和生理状态 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）可以从水蛭唾液腺细胞中获取mRNA反转录得到cDNA。因为引物与模板链互补配对进行扩增，要在基因内部引入特定碱基对实现替换，需要在引物2和引物3中设计特定的碱基。 （2）Hirudin改良基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶Xmal和BglⅡ切割产生的黏性末端能与Hirudin改良基因的黏性末端碱基互补，要想把Hirudin改良基因与质粒pCLY11(运载体)拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶XmaI和BglⅡ切。与单酶切相比，采用双酶切的优点有可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。 （3）据图可知，水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，水解产物中的肽含量随着时间的延长均上升，且差别不大，而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终明显高于经酶乙处理的酶解产物的抗凝血活性；据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因可能是对水蛭蛋白进行酶解时所用酶的种类不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。 （4）得到控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因后，利用基因工程可以制备乳腺生物反应器，让哺乳动物批量生产高抗凝血活性的水蛭蛋白，此时需要将控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因（药用蛋白基因）与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控原件重组在一起。与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器的优势在于不受转基因动物性别和生理状态的限制，因为尿液是无论雌雄、无论不同年龄都是要产生的。 14．(24-25高二下·广东湛江·期末)某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因（IL-10基因），研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有Ampr、LacZ基因及一些酶切位点。其结构如下图所示。注：LacZ基因编码产物在X - gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请根据以上信息回答下列问题。 (1)扩增IL - 10基因时，可以利用PCR在体外扩增该目的基因的DNA片段，其原理为______________。PCR反应缓冲溶液中一般需要加入Mg2+，Mg2+的作用是______________。 (2)利用大肠杆菌感受态细胞的转化效率通常低于100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含有____________________的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若使用同种限制酶切割，理论上应选择的限制酶是__________，构建重组质粒后，成功导入重组质粒的菌落呈现______色，这些菌落不一定能产生IL - 10蛋白，理由是____________。 ②若要实现目的基因与质粒的定向连接，理论上应选择的两种限制酶是____________（需结合质粒结构分析）。 【答案】(1) DNA半保留复制 激活耐高温的DNA聚合酶 (2) 氨苄青霉素、X-gal和IPTG NdeI 白 NdeI切割可能导致质粒和目的基因反向连接，目的基因无法正确表达，无法获得IL-10蛋白 XhoI和NdeI 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR的原理是DNA半保留复制。PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+，其作用是激活耐高温的DNA聚合酶。 （2）加入氨苄青霉素Ampr可以杀死未导入质粒的普通大肠杆菌；LacZ基因编码产物在X - gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色，导入目的基因后的重组质粒，其上的LacZ基因被切断，故加入X-gal和IPTG，根据蓝白菌落筛选区分重组质粒（白色）和空载体（蓝色），故将转化后的宿主菌接种在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 若使用同种限制酶切割，理论上应选择的限制酶是NdeI，因为目的基因的两侧和质粒上均含有NdeI的酶切位点，构建重组质粒后，LacZ基因被切断，成功导入重组质粒的菌落呈现白色；NdeI切割可能导致质粒和目的基因反向连接，目的基因无法正确表达，无法获得IL-10蛋白，故这些菌落不一定能产生IL - 10蛋白。使用PstⅠ会破坏目的基因，质粒的启动子和终止子之间有PstⅠ、XhoI和NdeI的酶切位点，故若要实现目的基因与质粒的定向连接，理论上应选择的两种限制酶是XhoI和NdeI。 三、实验题 15．(24-25高二下·广东肇庆·期末)胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是从鼠胶质细胞株B49的条件培养基中分离、纯化获得的。研究发现GDNF具有促进神经细胞生长和保护受损神经细胞的功能，因此GDNF有可能应用于人类帕金森病的治疗。下图1表示研究人员构建的含GDNF基因的表达载体，并将其导入大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。回答下列问题： (1)获取GDNF基因的方法是________。 (2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择上图中的_______限制酶处理载体和目的基因。 (3)将酶切后的载体和GDNF基因用DNA连接酶连接，得到的重组载体有______种，分别是_______，用HpaI酶和BamHI酶对获得的重组载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第_________泳道显示所鉴定的重组载体是我们所需要的基因表达载体。 (4)如果你是研究人员，请利用健康小鼠、患帕金森病小鼠模型（运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等症状）及所需的材料用具，设计实验来探究GDNF对人类帕金森病是否有疗效，请写出该实验的实验思路：__________。 【答案】(1)PCR扩增（或人工合成、从基因文库中获取） (2)XhoI (3) 2 GDNF基因与载体正向连接重组载体、GDNF基因与载体反向连接重组载体 ② (4)将健康小鼠设置为组1，同时将患帕金森病小鼠模型均分成2、3组，在正常饲养3组小鼠过程中，定期给3组注射一定量的GDNF，同时给1、2组注射等量的生理盐水，一段时间后观察3组小鼠是否出现运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等症状 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）GDNF基因属于目的基因，获取目的基因的方法一般有3种，可以通过PCR扩增、人工合成及从基因文库中获取。 （2）BamHI会破坏目的基因，目的基因上没有HpaI限制酶识别位点，故不能选用BamHI、HpaI限制酶处理载体和目的基因，目的基因和质粒上都有XhoI的识别位点，而且质粒上的XhoI的识别位点位于启动子之后，所以可选用XhoI限制酶进行酶切。 （3）目的基因和质粒选用的是同一种限制酶进行酶切，所以目的基因和质粒的两端都是相同的黏性末端，连接时目的基因既可以正向连接，也可以反向连接，因而得到的重组载体有2种，分别是GDNF基因与载体正向连接重组载体、GDNF基因与载体反向连接重组载体。泳道①仅有1种条带，属于载体自连；泳道②有2种条带，长度为6000pb和700pb，分别与质粒和GDNF基因长度相同，为正向连接；泳道③有2种条带，长度为6500pb和200pb，为反向连接。 （4）该实验的目的是探究GDNF对人类帕金森病是否有疗效，根据所给的材料用具，自变量为是否含有GDNF，因变量为帕金森病是否有疗效，可以通过观察运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等症状来判断，实验思路为：将健康小鼠设置为组1（阳性对照），同时将患帕金森病小鼠模型均分成2、3组，在正常饲养3组小鼠过程中，定期给3组注射一定量的GDNF，同时给1（阳性对照）、2组（空白对照组）注射等量的生理盐水，一段时间后观察3组小鼠是否出现运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等症状。 地 城 考点03 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 一、单选题 1．(24-25高二下·广东韶关·期末)生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也会引起人们对它安全性的关注。下列生物技术需要严格禁止的是（　　） A．农作物转基因技术 B．生殖性克隆人技术 C．设计试管婴儿技术 D．蛋白质工程技术 【答案】B 【分析】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体，它面临很多伦理问题。我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 【详解】A、转基因农作物可通过花粉将转入的基因扩散到与之亲缘关系较近的物种，而不是所有农作物，因此，农作物转基因技术不是需要严格禁止的，不符合题意，A错误； B、生殖性克隆人技术是需要完全禁止的，一方面会由于技术问题生产出有缺陷的孩子，更重要的是会带来伦理和道德等问题，符合题意，B正确； C、为了防止有人滥用设计试管婴儿技术选择性设计婴儿性别和完美婴儿，我国反对设计试管婴儿，需要严格监管，但没有完全禁止，不符合题意，C错误； D、蛋白质工程技术可以通过对相关基因的改造和修饰生产出更加符合人们要求的蛋白质，不需要被禁止，不符合题意，D错误。 故选B。 2．(24-25高二下·广东佛山·期末)2024年大卫·贝克等三位科学家因利用AI精准预测蛋白质的结构，推动蛋白质结构研究取得革命性进展，共同获得了诺贝尔化学奖。AI蛋白质的合成是蛋白质工程在人工智能时代的技术延伸。下列叙述错误的是（　　） A．AI蛋白在设计前需要先明确其功能需求 B．利用AI能设计出自然界不存在的蛋白质 C．AI蛋白的最终获得不需要经过基因工程 D．AI蛋白的功能需进行实验验证才能确定 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程的基本流程是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），所以 AI 蛋白在设计前需要先明确其功能需求，A正确； B、利用 AI 进行蛋白质设计属于蛋白质工程范畴，蛋白质工程可以设计出自然界不存在的蛋白质，B正确； C、AI 蛋白的合成需要以基因工程为基础，因为最终要通过基因的表达（转录和翻译 ）来合成蛋白质，需要构建基因表达载体，导入受体细胞等基因工程操作，C错误； D、AI 设计出的蛋白功能需要进行实验验证（如体外活性检测、体内功能验证等 ）才能确定是否符合预期，不能仅依赖理论模型，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·广东汕尾·期末)T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先研究的是（　　） A．对溶菌酶的相关基因进行改造 B．影响T4溶菌酶耐热性的重要结构 C．推测T4溶菌酶应有的氨基酸序列 D．研究促进溶菌酶相关基因表达的因素 【答案】B 【分析】本题考查蛋白质工程的步骤。蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改造相应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、对溶菌酶的相关基因进行改造属于后续步骤，需先明确目标结构后才能进行，A不符合题意； B、影响T₄溶菌酶耐热性的重要结构是研究起点，需先确定关键结构才能针对性改进，B正确； C、推测氨基酸序列需在明确目标结构后进行，属于后续步骤，C不符合题意； D、促进基因表达是提高酶产量，与耐热性改造无关，D不符合题意； 故选B。 4．(24-25高二下·广东佛山·期末)生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也引起了人们对它安全性的关注，带来新的伦理挑战。下列各项不符合生物技术伦理规范的是（　　） A．种植转基因抗虫棉 B．改造猪器官进行人体移植 C．进行iPS细胞研究实验 D．设计完美试管婴儿 【答案】D 【详解】A、种植转基因抗虫棉属于农业生物技术应用，通过减少农药使用提高产量，在安全性评估通过后符合伦理规范，A错误； B、改造猪器官进行人体移植（异种移植）旨在解决器官短缺问题，虽需关注跨物种感染风险，但属于治疗性研究，在严格监管下符合伦理，B错误； C、iPS细胞（诱导多能干细胞）研究属于治疗性克隆，用于疾病机制探索或再生医学，不涉及胚胎破坏，伦理争议较小，C错误； D、设计“完美试管婴儿”涉及非医学需要的基因筛选（如外貌、智力等），超出疾病预防范畴，违背伦理原则，D正确。 故选D。 5．(23-24高二下·广东珠海·期末)我国政府对克隆技术在伦理、法律等方面可能造成的影响非常重视，一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。下列属于从伦理角度反对生殖性克隆人的观点的是（　　） A．克隆技术尚不成熟，生殖性克隆人很可能孕育出有严重生理缺陷的孩子 B．可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法弥补技术的不足 C．生殖性克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的道德观念 D．随着社会发展和技术进步，人们关于克隆人的道德观念是可以逐渐改变的 【答案】C 【分析】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。 【详解】A、克隆技术尚不成熟，属于技术角度，不属于伦理角度，A错误； B、可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法弥补充隆技术的不足，是生物学家支持克隆人的观点，B错误； C、伦理学家认为克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念，进而反对克隆人，属于从伦理角度反对生殖性克隆人的观点，C正确； D、随着社会发展和技术进步，人们关于克隆人的道德观念是可以逐渐改变的，是伦理学家支持克隆人的观点，D错误。 故选C。 6．(24-25高二下·广东揭阳·期末)以基因工程为代表的生物技术革命给人类带来了巨大收益和无限愿景，同时也带来了安全和伦理问题。下列说法错误的是（    ） A．转基因作物可能因花粉传播等造成“基因污染” B．转入目的基因后形成新物种，缺乏对环境的适应能力 C．生物武器具有致病能力强、作用范围广等特点，应严格禁止 D．生殖性克隆可能会破坏人类的基因多样性，不利于人类的生存和进化 【答案】B 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)，对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是趋利避害，不能因噎废食。 【详解】A、转基因作物的花粉可能通过自然媒介传播至野生近缘种，导致外源基因扩散到自然种群，引发基因污染问题，A正确； B、转入目的基因的个体是否形成新物种需满足生殖隔离的标准，仅转入基因未必形成新物种；且目的基因（如抗虫、抗病基因）可能增强其适应性，B错误； C、生物武器具有高致病性、易传播性及难以防控等特点，《禁止生物武器公约》明确禁止其研发和使用，C正确； D、生殖性克隆通过无性繁殖产生基因完全相同的个体，会降低基因多样性，削弱种群应对环境变化的进化潜力，D正确。 故选B。 7．(23-24高二下·广东中山·期末)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述正确的是（    ） A．我国禁止克隆人的实验，对治疗性克隆实验也进行严格审查 B．鉴于转基因食品安全的不确定性，应该禁止转基因食品上市 C．设计试管婴儿能使后代更优秀，应该大力提倡使用该技术 D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 【答案】A 【分析】生物技术安全性问题包括食物安全、生物安全、环境安全三个方面。伦理问题主要在克隆人的问题上出现争议。 【详解】A、当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，特别是生殖性克隆，但不反对治疗性克隆，应对治疗性克隆实验也进行严格审查，A正确； B、严格选择转基因植物的目的基因，可避免产生对人类有害的物质，减少人们对转基因食物安全的担忧，同时严格把关转基因食品上市的每一道程序，适量上市，B错误； C、试管婴儿可以设计婴儿的性别，反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿，因此应该禁止该技术，否则会导致社会秩序的紊乱，C错误； D、生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的一类武器，干扰素为淋巴因子，并非生物武器，D错误。 故选A。 8．(23-24高二下·广东佛山·期末)生物技术的安全性和伦理问题已经成为广受关注的社会热点。下列技术或要求不符合安全与伦理规范的是（    ） A．利用核移植技术获得造血干细胞，用于白血病治疗 B．利用基因组编辑技术设计试管婴儿，解决不孕不育问题 C．禁止生殖性克隆人，以防破坏人类基因多样性的天然属性 D．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播 【答案】B 【分析】1、生殖性克隆指将克隆技术用于生育目的，即用于产生人类个体。治疗性克隆指利用克隆技术产生特定细胞和组织(皮肤、神经或肌肉等)用于治疗性移植； 2、中国政府:禁止生殖性克隆人，坚持四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，不反对治疗性克隆人； 3、转基因生物的安全性问题：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)。 【详解】A、利用核移植技术获得造血干细胞，用于白血病治疗，符合生物技术的安全与伦理规范，A错误； B、基因编辑技术存在安全风险，我们不反对试管婴儿技术，但有人滥用设计试管婴儿技术设计婴儿性别，不符合生物技术的安全与伦理规范，B正确； C、禁止生殖性克隆人，以防破坏人类基因多样性的天然属性，不利于人类的生存与进化，符合生物技术的安全与伦理规范，C错误； D、研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染，符合生物技术的安全与伦理规范，D错误。 故选B。 9．(23-24高二下·广东湛江·期末)生物技术的安全性与伦理问题是社会关注的热点问题之一。下列有关叙述错误的是（    ） A．转基因技术作为一种技术是中性的，我们要理性地看待 B．基因编辑技术既可用于疾病预防领域研究，也可用于编辑婴儿 C．我国反对生物武器及其技术的扩散 D．我国禁止生殖性克隆人，因为这技术既不成熟也存在很多法律、伦理方面的问题 【答案】B 【分析】中国政府对克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，坚持四不原则（不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验），但不反对治疗性克隆。 【详解】A、转基因作为一种技术本身是中性的，我们需要理性地看待转基因技术，使其在生产生活中发挥最大的作用，A正确； B、基因编辑技术允许用于疾病预防领域研究，但不能用于编辑设计婴儿，因为违反伦理和法律，B错误； C、生物武器的种类包括病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等，具有致病能力强、攻击范围广的特点，我国反对生物武器及其技术的扩散，C正确； D、生殖性克隆人的技术尚未完全成熟，我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验，故我国禁止生殖性克隆人，因为这技术既不成熟也存在很多法律、伦理方面的问题，D正确。 故选B。 二、解答题 10．(23-24高二下·广东东莞·期末)柑橘是南方重要的水果，由柑橘韧皮部杆菌引起的柑橘黄龙病对柑橘产业带来了巨大的经济损失。研究人员利用基因工程技术，导入外源抗病基因以防治柑橘黄龙病。请回答问题： (1)研究人员从NCBI数据库中获得了包含噬菌体裂解酶基因（CaLasLYS）的一段DNA序列，利用PCR技术扩增CaLasLYS需要设计引物，请写出各包含8个碱基的一对引物______。PCR扩增完成后可用______（填方法名称）鉴定产物。    (2)基因工程中为使获得的CaLasLYS在柑橘细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，需要进行的操作是______，CaLasLYS______（选填“能”或“不能”）含有该操作所选用的限制酶的识别序列，原因是______。 (3)将CaLasLYS导入柑橘细胞，经植物组织培养获得组培苗，通过______来确定CaLasLYS是否赋予了组培苗抗柑橘黄龙病的特性。 (4)从基因工程安全性角度考虑，转基因柑橘可能存在的风险有______（答出1点即可）。 【答案】(1) 5'-CCTAGGTA-3'；5'-GTCGACTT-3' 琼脂糖凝胶电泳 (2) 构建基因（CaLasLYS）表达载体 不能 会破坏CaLasLYS的完整性 (3)向组培苗接种柑橘韧皮部杆菌 (4)造成基因污染；引起食用者过敏反应 【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物引导子链合成的方向是5′→3′，根据碱基互补配对原则可知，利用 PCR 技术扩增CaLasLYS 需要设计引物，各包含8个碱基的一对引物为：5'-CCTAGGTA-3'： 5'-GTCGACTT-3'。PCR扩增完成后可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物，其原理是根据DNA的分子量大小实现对不同DNA片段的分离。 （2） 为使获得的目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，需要进行的操作是构建基因表达载体。CaLasLYS是目的基因，不能含有该操作所选用的限制酶的识别序列，否则会破坏 CaLasLYS的完整性。 （3） 经植物组织培养获得组培苗为个体，故通过向组培苗接种柑橘韧皮部杆菌来确定 CaLasLYS是否赋予了组培苗抗柑橘黄龙病的特性。 （4） 转基因柑橘存在外源基因，可能造成基因污染，引起食用者过敏反应等风险。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题16 基因工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点02 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具 一、单选题 1．A 2．C 3．A 4．C 5．A 6．B 二、实验题 7．(1)耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） (2) EcoR I、BamH I EcoR I、Bgl II (3)导入空质粒的酵母菌也具有新霉素抗性 (4) 3kb、8kb 电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列 三、解答题 8．(1)DNA聚合酶催化单个核苷酸添加到已有的 DNA链上，形成磷酸二酯键，而 DNA连接酶是催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶不需要板 (2) 黏性 降低酶活性 (3) 互补 b、d (4)插入位点不受限制酶识别序列限制，实现了目的基因在载体任意位点上的插入 9．(1) 限制（或限制性内切核酸） 序列3 (2) 启动子 桑葚胚（或囊胚） (3)基因组/细胞核/DNA/染色体 (4)用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗 10．(1) 限制酶、DNA连接酶 植物组织培养技术 (2) 标记基因 ②③① (3)同时含有GAL4基因和UAS-Bt基因，GAL4基因表达产生的GAL4蛋白与UAS结合激活Bt基因的表达 (4) 叶和茎 使目的基因只在叶和茎中表达，而在食用的水稻种子中不表达，对人没有危害。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．D 2．D 3．C 4．A 5．C 6．B 7．B 8．D 9．B 二、解答题 10．(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 5′ (2) 使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 荧光显微镜观察绿色荧光（或检测荧光素酶活性） (3) SwaI 抗原-抗体杂交 11．(1) 启动子P 通过物质S特异性诱导激活启动子P，促使抗炎蛋白基因表达，实现精准治疗 (2) 2.6kb 相反 (3) 将导入表达载体的大肠杆菌接种到分别含有氨苄青霉素和卡那霉素的不同培养基中 抗氨苄青霉素，不抗卡那霉素 12．(1)BamHI、BamHI或BglⅡ (2) BamHI、EcoRI 质粒和目的基因 自身环化 目的基因与质粒反向连接 (3)青霉素主要是淘汰未转化的受体菌，IPTG可以使转化重组质粒的菌落呈现白色，转化空载体的菌落呈现蓝色 13．(1) mRNA/信使RNA 引物2和引物3 (2) XmaⅠ和BglⅡ 可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接 (3)种类 (4) 控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因（药用蛋白基因） 乳腺中特异表达的基因的启动子 性别和生理状态 14．(1) DNA半保留复制 激活耐高温的DNA聚合酶 (2) 氨苄青霉素、X-gal和IPTG NdeI 白 NdeI切割可能导致质粒和目的基因反向连接，目的基因无法正确表达，无法获得IL-10蛋白 XhoI和NdeI 三、实验题 15．(1)PCR扩增（或人工合成、从基因文库中获取） (2)XhoI (3) 2 GDNF基因与载体正向连接重组载体、GDNF基因与载体反向连接重组载体 ② (4)将健康小鼠设置为组1，同时将患帕金森病小鼠模型均分成2、3组，在正常饲养3组小鼠过程中，定期给3组注射一定量的GDNF，同时给1、2组注射等量的生理盐水，一段时间后观察3组小鼠是否出现运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等症状 地 城 考点03 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 一、单选题 1．B 2．C 3．B 4．D 5．C 6．B 7．A 8．B 9．B 二、解答题 10．(1) 5'-CCTAGGTA-3'；5'-GTCGACTT-3' 琼脂糖凝胶电泳 (2) 构建基因（CaLasLYS）表达载体 不能 会破坏CaLasLYS的完整性 (3)向组培苗接种柑橘韧皮部杆菌 (4)造成基因污染；引起食用者过敏反应 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题16 基因工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点02 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具 一、单选题 1．(24-25高二下·广东湛江·期末)下列关于DNA粗提取与鉴定、PCR技术及电泳的叙述，正确的是（    ） A．DNA粗提取时，可用95%的冷酒精析出DNA B．PCR反应中，需要加入解旋酶和四种脱氧核苷酸作为原料 C．琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率与分子量大小呈正相关 D．鉴定DNA时，加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 2．(24-25高二下·广东清远·期末)某同学将洋葱研磨液离心后取出上清液，为了从上清液析出DNA，应加入的是（　　） A．二苯胺试剂 B．2mol/L的NaCl溶液 C．冷却的酒精溶液 D．酸性重铬酸钾溶液 3．(24-25高二下·广东肇庆·期末)下列对有关实验的叙述，正确的是（    ） A．鉴定糖类、脂肪、蛋白质三种有机物时，都可以不用显微镜 B．紫色洋葱鳞片叶的外表皮细胞可观察到质壁分离及复原现象，内表皮细胞不能 C．分离不同类型的细胞器，常用梯度离心法 D．做DNA粗提取与鉴定实验时，用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 4．(24-25高二下·广东梅州·期末)甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点 B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定等 C．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 D．PCR扩增R基因时，微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前均须进行灭菌处理 5．(24-25高二下·广东佛山·期末)关于DNA的粗提取和鉴定的实验，下列叙述错误的是（　　） A．将研磨液倒入垫有滤纸的漏斗中过滤以去除杂质 B．研磨液需在4℃的冰箱中放置几分钟后再取上清液 C．加入酒精出现丝状物后，用玻璃棒沿一个方向搅拌 D．溶解的DNA粗提物在沸水浴中与二苯胺反应呈蓝色 6．(24-25高二下·广东韶关·期末)基因编辑的困难在于精准地将DNA片段插入基因组的特定位置。近期，我国科学家发现R2逆转座子可将DNA片段特异性插入目的DNA区域，但插入效率较低。科学家利用蛋白质工程等技术将R2逆转座子改造后，实现了在哺乳动物细胞中高效插入。R2逆转座子和DNA片段插入过程如图所示。下列叙述错误的是（　　）    A．R2逆转座子也有DNA连接酶的活性 B．合成第二条DNA链的模板是R2 RNA C．插入的目的序列应设计在R2 RNA中 D．可通过改造R2蛋白结构提高插入效率 二、实验题 7．(24-25高二下·广东东莞·期末)人类γ-干扰素是由γ基因编码的分泌蛋白，可用于治疗病毒感染和癌症。为了实现干扰素的工厂化生产，科研人员拟利用A基因上游的调控序列来驱动γ基因的表达。科研人员扩增了A基因上游的这段调控序列（如图甲所示），将其插入质粒pCLY11中（如图乙所示，质粒中已含γ基因），并导入酵母菌中实现工厂化生产。表a列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点，已知质粒pCLY11经EcoR I、BamH I、Bgl Ⅱ酶切后产生1.5kb、3kb和4.5kb的片段。请回答下列问题： 限制酶 识别序列及切割位点 BamH I 5'-G↓GATCC-3' Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' EcoR I 5'-G↓AATTC-3' Xho I 5'-C↓TCGAG-3' (1)PCR扩增调控序列的反应需要提供DNA模板、引物、脱氧核苷酸和__________。 (2)为将A基因上游的调控序列定向插入质粒驱动γ基因表达，处理质粒pCLY11时需要选用的限制酶是__________，处理A基因上游的调控序列时需要选用的限制酶是__________。 (3)在含新霉素的培养基中形成的菌落不一定都是目的菌株，理由是__________。 (4)为鉴定筛选出的菌落中含有重组质粒，科研人员用EcoR I、BamH I、Bgl Ⅱ酶切质粒后，进行电泳检测。若酶切后电泳中出现__________kb左右大小的条带，则说明A基因上游的调控序列已成功插入基因表达载体。对于电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序来确认质粒中插入了目的片段，原因是__________。 三、解答题 8．(24-25高二下·广东梅州·期末)无缝克隆技术是依赖于同源序列的基因克隆技术，利用同源的DNA序列能够将任意DNA片段进行无缝连接在一起，过程如图1所示。我国某科研团队利用无缝克隆技术构建了多基因表达载体，从而培育出了抗虫抗除草剂的玉米，抗虫抗除草剂玉米表达载体构建过程如图2所示。 (1)图1中修复缺口用到的DNA聚合酶和DNA连接酶在发挥作用时的区别是______。（答出1点即可） (2)T5核酸外切酶沿“5′→3′”的方向水解DNA，其目的是形成______末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而图1中T5核酸外切酶作用的温度通常选择为50℃，目的是：______，防止过度水解DNA，从而更好地控制反应过程。 (3)图2中为了使CryIAc基因和GR79基因与线性化质粒进行无缝连接，需要对CrylAc基因和GR79基因进行PCR改造，改造所用的引物要加入额外的片段，根据图1无缝连接的原理，图2中引物2和引物3所加的片段碱基序列应______（填“相同”或“互补”）。引物1和引物4所加片段应分别与线性化质粒中的______（从“a、b、c、d”中选填）片段序列相同。 (4)结合图1和图2信息可以看出无缝克隆技术不依赖于任何限制酶，利用T5核酸外切酶可以将有同源序列的片段进行无缝连接。和传统方法比，无缝克隆技术构建基因表达载体的优点是______。 9．(24-25高二下·广东清远·期末)CRISPR/Cas9系统可表达sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到特定基因上并对基因进行切割，可应用于基因的敲除。单纯性少毛症的发生与角蛋白基因（Krt71）的突变有关。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对小鼠的Krt71基因进行编辑。Krt71基因的部分序列和基因编辑技术流程见图。回答下列问题： (1)Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。Cas9蛋白的功能与基因工程常用的______酶功能类似。对Krt71基因进行编辑时，质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因______（填“序列1”“序列2”或“序列3”）的部分碱基序列相同。 (2)质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为______。过程③通常将受精卵培养至______阶段。 (3)与直接导入质粒pUC57相比，将Krt71－sgRNA和Cas9－mRNA直接注入小鼠受精卵，可减少转录的时间从而快速启动基因编辑过程；同时可降低外源基因整合到______的风险。 (4)敲除Krt71基因后对小鼠的毛发生长情况和毛发量等方面进行表型分析。该实验构建了单纯性少毛症小鼠模型，其研究价值是______（答出一点即可）。 10．(23-24高二下·广东珠海·期末)转基因技术是发展农业现代化的重要新质生产力，二化螟的幼虫主要危害水稻的叶和茎，严重影响产量，转Bt基因水稻能够抵抗二化螟幼虫的侵害，cryIC基因能促进Bt基因的表达。科研人员采用GAL4/UAS基因调控系统构建了cryIC-Bt转基因抗虫水稻，实验部分流程如图1所示。GAL4/UAS系统调控基因表达的机理如图2所示：UAS序列抑制靶基因表达使靶基因沉默，GAL4蛋白是一种转录活性因子，可特异性地识别并结合UAS序列，激活UAS下游靶基因的表达。      请回答： (1)图1中①②操作过程涉及到的工具酶有______。③④过程经目的基因的检测和鉴定后，还需要通过_____将细胞培养成转基因个体。 (2)拟采用农杆菌转化法导入目的基因，图3为Ti质粒的T-DNA片段示意图。现已获得cryIC基因、Bt基因和GFP（绿色荧光蛋白）基因，GFP基因有助于筛选受体细胞，起到基因表达载体中_______（填结构）的作用。构建UAS-靶基因表达载体时，应将cryIC、Bt、GFP三个基因插入到图3所示T-DNA中的位置分别是_________。（用序号①②③作答） (3)将GAL4转基因个体与UAS-Bt转基因个体杂交得到的子代个体表现出抗虫性状，原因是_________。 (4)转基因作物的安全性备受关注，采用GAL4/UAS系统培育转基因水稻，通过特异性启动子-GAL4调控UAS-靶基因的表达，可以使Bt基因只在特定器官中高效的表达，则构建GAL4基因表达载体时选用的启动子应来自于_______（填水稻器官名称），其意义是______。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．(24-25高二下·广东湛江·期末)将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin - Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和T1质粒构建基因表达载体的过程，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述错误的是（    ） A．利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物5'端添加相应酶切位点 B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnI和HindⅢ比选用KpnI和SmaI效果更好 C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2+处理受体细胞 D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性 2．(24-25高二下·广东梅州·期末)下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述错误的是（    ） A．获取该基因，要破坏4个磷酸二酯键 B．蛛丝蛋白基因上游和下游分别含有启动子和终止子 C．一个蛛丝蛋白基因扩增4次共消耗引物30个 D．用PCR技术获取该基因，设计的引物应分别结合在1、4部位 3．(24-25高二下·广东汕尾·期末)qPCB（定量PCB）通过荧光染料与扩增的双链DNA结合，产生荧光信号，分析荧光信号的强度，可以定量分析样品中的目标基因。以下属于进行qPCR的必备条件的是（　　） A．已知目标基因的全部序列 B．32P标记的脱氧核苷酸原料 C．碱基不发生互补配对的两种引物 D．逆转录酶和耐高温DNA聚合酶 4．(24-25高二下·广东广州八区·期末)蛛丝有超强韧性，将蛛丝蛋白基因转入羊的乳腺中可以生产蛛丝蛋白。图a是蛛丝蛋白基因的DNA片段；利用PCR技术对蛛丝蛋白基因进行检测，电泳结果如图b。其中1号来自普通羊，2号来自含蛛丝蛋白基因的质粒，其余来自转基因羊。下列叙述错误的是（　　） A．用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④ B．PCR过程在第3次循环结束后可以得到两端都含引物的目的基因 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关 D．使用抗原-抗体结合法可能在3、5、8号羊的乳汁中检测到蛛丝蛋白 5．(24-25高二下·广东韶关·期末)实时荧光定量PCR（qPCR）是在传统PCR基础上引入荧光信号检测系统，通过实时监测荧光信号累积量来定量分析扩增产物数量的技术。qPCR使用的DNA探针的5'端和3'端分别带有一个荧光报告基团（FAM）和一个淬灭基团（TAMRA），探针完整时FAM的荧光被TAMRA吸收，检测不出荧光信号；探针被切割时FAM和TAMRA分离，释放荧光信号，检测过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．反应体系中需加入Mg2+以激活Taq酶，帮助其催化复性过程 B．引物能使Taq酶从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸以形成新链 C．Taq酶能水解探针的5'端脱氧核苷酸，使FAM和TAMRA分离 D．随着循环次数的增加，PCR产物量快速增长，荧光信号逐渐减弱 6．(24-25高二下·广东佛山·期末)图a示基因L及其启动子pL和终止子的结构，图b示某种Ti质粒的结构，其中基因gue编码GUS酶，可通过检测GUS酶活性来反映启动子活性。研究人员欲检测基因L的启动子pL的活性，应选下列哪种组合的限制酶对DNA片段和Ti质粒进行处理?（　　） A．XbaI、BamHI B．HindⅢ、BamHI C．SmaI、HindⅢ D．SacI、XbaI 7．(24-25高二下·广东韶关·期末)下列对某目标DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定实验的叙述，错误的是（　　） A．PCR实验中使用的离心管、枪头等需经高压灭菌处理 B．应在凝胶完全凝固前小心拔出梳子，形成加样孔 C．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 D．若电泳鉴定结果出现不止一条带，可能是复性温度低导致的 8．(23-24高二下·广东茂名·期末)PCR 也称为聚合酶链式反应，是一项 DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。下列叙述错误的是（    ） A．PCR 技术的原理是 DNA 的半保留复制 B．1 个 DNA 扩增n次需消耗引物对数为2n-1 C．复性是让引物通过碱基互补配对与 DNA 母链的3’端配对 D．延伸过程需要 DNA 聚合酶、ATP 和4 种核糖核苷酸 9．(23-24高二下·广东佛山·期末)我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得了有香味的水稻，机理如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．sgRNA的识别序列过短可能会导致编辑对象出错 B．Cas9蛋白功能类似于限制酶，可以识别并剪切特定DNA片段 C．在培养基中加入潮霉素，可用于筛选导入基因敲除载体的植物细胞 D．构建好的基因敲除载体可用农杆菌转化法导入水稻细胞 二、解答题 10．(24-25高二下·广东深圳龙华区·期末)腺病毒载体广泛用于基因治疗和疫苗研究，其实质是将目的基因整合至腺病毒基因组，进而表达蛋白抗原，诱导较强的免疫反应。现为了探索猴1型腺病毒（SAdV-1）作为疫苗载体的可能性，科研人员利用基因工程的方法将绿色荧光蛋白（GFP）基因和萤火虫荧光素酶（Fluc）基因导入腺病毒质粒pKSAV1中，成功构建了携带双报告基因的新型SAdV-1载体，部分流程如图所示。回答下列问题：    (1)利用PCR扩增GFP和Fluc基因时，需要设计引物，引物的作用是__________。同时依赖引物的重叠序列将两者串联，形成融合基因GFluc。为了保证GFluc和PKSAV1质粒相连，可在设计引物的__________端加上限制酶的识别序列。 (2)步骤③使用Ca²⁺处理大肠杆菌的目的是__________，使重组质粒进入大肠杆菌，完成转化实验。检测转化是否成功的技术是__________。 (3)为了提高转基因效率，同时避免标记基因进入受体细胞，据图应选用__________限制酶将重组质粒线性化。若要检测受体细胞系是否产生了目的蛋白，可以采用__________技术。 11．(24-25高二下·广东广州八区·期末)炎症性肠病（IBD）属于肠道慢性炎症性疾病的范畴。研究揭示，患者肠道中会生成硫代硫酸盐（物质S），其产生量与疾病的严重程度呈正比关系。研究人员将抗炎蛋白基因与物质S特异性诱导激活的启动子P、终止子等元件连接，构建了重组基因（如图a所示）。随后，该重组基因与图b所示的载体结合，形成了表达载体。通过将此载体导入大肠杆菌并进行筛选，成功获得了菌株E。当患病模型小鼠被饲喂摄入菌株E后，其IBD症状得到了显著的缓解。 回答下列问题： (1)图a中能被RNA聚合酶识别和结合的部位是______。从抗炎蛋白表达调控的角度分析，选用启动子P的优点是______。 (2)将图a的抗炎蛋白重组基因插入如图b所示Kanr基因内的sacⅡ位点。为确认抗炎蛋白重组基因的大小和插入方向，科研人员用限制酶pstⅠ切割重组质粒并进行电泳，结果出现了4.8kb和0.8kb两个片段。据图分析，抗炎蛋白重组基因长度约为______kb；抗炎蛋白重组基因插入后转录方向与Kanr基因______（填“相同”或“相反”）。 (3)使用氨苄青霉素和卡那霉素筛选出菌株E，可进行的操作是______，菌株E对两种抗生素的抗性特征表现为______。 12．(24-25高二下·广东汕尾·期末)HPV疫苗由HPV病毒的主要衣壳蛋白L1组成，该蛋白主要通过基因工程技术制备。下图1是研究人员通过不同方法构建表达载体，图2表示酶切位点。回答下列问题： (1)图a是用单酶切构建基因表达载体，目的基因和质粒分别选择的限制酶是_______。 (2)图b是双酶切构建基因表达载体，为使转基因成功率更高，通常会选择_______限制酶对_______进行酶切；双酶切的原因一方面是可以防止质粒和目的基因_______，提升目的基因与质粒连接效率；另一方面可以避免_______，防止连接到质粒的目的基因无法表达。 (3)含有lacZ基因的菌体可在加入IPTG的情况下，呈现蓝色菌落，否则菌落为白色。为筛选转化成功的受体菌，在培养基中加入青霉素和IPTG的具体作用分别是_______。 13．(24-25高二下·广东潮州·期末)水蛭唾液腺分泌的水蛭素(Hiruan)是一种优良的凝血酶抑制剂，在血栓治疗上有着重要的医学价值，但天然的水蛭素的临床活性较低，如果将水蛭素分子中第47位的天冬酰胺替换成赖氨酸，其分子活性会提高20倍。如图表示改造 Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。回答下列问题： (1)获取目的基因：从水蛭唾液腺细胞中获取_______反转录得到cDNA后，利用PCR引物在 Hirudin基因内部碱基进行替换，需要在__________(填引物)中设计特定的碱基，从而对 Hirudin 基因进行改造以获得改良的 Hirudin 蛋白。 (2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11与 Hirudin改良基因高效连接，应选用___________对pCLY11进行酶切。与单酶切相比，采用双酶切的优点有___________(答两点)。 (3)将经蛋白质工程改造后得到的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如下图所示。推测两种蛋白酶水解处理后，酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的_______(填“种类”或“含量”)有关。 (4)得到控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因后，利用基因工程可以制备乳腺生物反应器，让哺乳动物批量生产高抗凝血活性的水蛭蛋白，此时需要将______与______等调控原件重组在一起。某生物兴趣小组同学大胆推测，用类似方法制备膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的__________(写出两点)的限制。 14．(24-25高二下·广东湛江·期末)某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因（IL-10基因），研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有Ampr、LacZ基因及一些酶切位点。其结构如下图所示。注：LacZ基因编码产物在X - gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请根据以上信息回答下列问题。 (1)扩增IL - 10基因时，可以利用PCR在体外扩增该目的基因的DNA片段，其原理为______________。PCR反应缓冲溶液中一般需要加入Mg2+，Mg2+的作用是______________。 (2)利用大肠杆菌感受态细胞的转化效率通常低于100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含有____________________的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若使用同种限制酶切割，理论上应选择的限制酶是__________，构建重组质粒后，成功导入重组质粒的菌落呈现______色，这些菌落不一定能产生IL - 10蛋白，理由是____________。 ②若要实现目的基因与质粒的定向连接，理论上应选择的两种限制酶是____________（需结合质粒结构分析）。 三、实验题 15．(24-25高二下·广东肇庆·期末)胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是从鼠胶质细胞株B49的条件培养基中分离、纯化获得的。研究发现GDNF具有促进神经细胞生长和保护受损神经细胞的功能，因此GDNF有可能应用于人类帕金森病的治疗。下图1表示研究人员构建的含GDNF基因的表达载体，并将其导入大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。回答下列问题： (1)获取GDNF基因的方法是________。 (2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择上图中的_______限制酶处理载体和目的基因。 (3)将酶切后的载体和GDNF基因用DNA连接酶连接，得到的重组载体有______种，分别是_______，用HpaI酶和BamHI酶对获得的重组载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第_________泳道显示所鉴定的重组载体是我们所需要的基因表达载体。 (4)如果你是研究人员，请利用健康小鼠、患帕金森病小鼠模型（运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等症状）及所需的材料用具，设计实验来探究GDNF对人类帕金森病是否有疗效，请写出该实验的实验思路：__________。 地 城 考点03 基因工程的应用、蛋白质工程、生物技术的安全性和伦理问题 一、单选题 1．(24-25高二下·广东韶关·期末)生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也会引起人们对它安全性的关注。下列生物技术需要严格禁止的是（　　） A．农作物转基因技术 B．生殖性克隆人技术 C．设计试管婴儿技术 D．蛋白质工程技术 2．(24-25高二下·广东佛山·期末)2024年大卫·贝克等三位科学家因利用AI精准预测蛋白质的结构，推动蛋白质结构研究取得革命性进展，共同获得了诺贝尔化学奖。AI蛋白质的合成是蛋白质工程在人工智能时代的技术延伸。下列叙述错误的是（　　） A．AI蛋白在设计前需要先明确其功能需求 B．利用AI能设计出自然界不存在的蛋白质 C．AI蛋白的最终获得不需要经过基因工程 D．AI蛋白的功能需进行实验验证才能确定 3．(24-25高二下·广东汕尾·期末)T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先研究的是（　　） A．对溶菌酶的相关基因进行改造 B．影响T4溶菌酶耐热性的重要结构 C．推测T4溶菌酶应有的氨基酸序列 D．研究促进溶菌酶相关基因表达的因素 4．(24-25高二下·广东佛山·期末)生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也引起了人们对它安全性的关注，带来新的伦理挑战。下列各项不符合生物技术伦理规范的是（　　） A．种植转基因抗虫棉 B．改造猪器官进行人体移植 C．进行iPS细胞研究实验 D．设计完美试管婴儿 5．(23-24高二下·广东珠海·期末)我国政府对克隆技术在伦理、法律等方面可能造成的影响非常重视，一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。下列属于从伦理角度反对生殖性克隆人的观点的是（　　） A．克隆技术尚不成熟，生殖性克隆人很可能孕育出有严重生理缺陷的孩子 B．可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法弥补技术的不足 C．生殖性克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的道德观念 D．随着社会发展和技术进步，人们关于克隆人的道德观念是可以逐渐改变的 6．(24-25高二下·广东揭阳·期末)以基因工程为代表的生物技术革命给人类带来了巨大收益和无限愿景，同时也带来了安全和伦理问题。下列说法错误的是（    ） A．转基因作物可能因花粉传播等造成“基因污染” B．转入目的基因后形成新物种，缺乏对环境的适应能力 C．生物武器具有致病能力强、作用范围广等特点，应严格禁止 D．生殖性克隆可能会破坏人类的基因多样性，不利于人类的生存和进化 7．(23-24高二下·广东中山·期末)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述正确的是（    ） A．我国禁止克隆人的实验，对治疗性克隆实验也进行严格审查 B．鉴于转基因食品安全的不确定性，应该禁止转基因食品上市 C．设计试管婴儿能使后代更优秀，应该大力提倡使用该技术 D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 8．(23-24高二下·广东佛山·期末)生物技术的安全性和伦理问题已经成为广受关注的社会热点。下列技术或要求不符合安全与伦理规范的是（    ） A．利用核移植技术获得造血干细胞，用于白血病治疗 B．利用基因组编辑技术设计试管婴儿，解决不孕不育问题 C．禁止生殖性克隆人，以防破坏人类基因多样性的天然属性 D．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播 9．(23-24高二下·广东湛江·期末)生物技术的安全性与伦理问题是社会关注的热点问题之一。下列有关叙述错误的是（    ） A．转基因技术作为一种技术是中性的，我们要理性地看待 B．基因编辑技术既可用于疾病预防领域研究，也可用于编辑婴儿 C．我国反对生物武器及其技术的扩散 D．我国禁止生殖性克隆人，因为这技术既不成熟也存在很多法律、伦理方面的问题 二、解答题 10．(23-24高二下·广东东莞·期末)柑橘是南方重要的水果，由柑橘韧皮部杆菌引起的柑橘黄龙病对柑橘产业带来了巨大的经济损失。研究人员利用基因工程技术，导入外源抗病基因以防治柑橘黄龙病。请回答问题： (1)研究人员从NCBI数据库中获得了包含噬菌体裂解酶基因（CaLasLYS）的一段DNA序列，利用PCR技术扩增CaLasLYS需要设计引物，请写出各包含8个碱基的一对引物______。PCR扩增完成后可用______（填方法名称）鉴定产物。    (2)基因工程中为使获得的CaLasLYS在柑橘细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，需要进行的操作是______，CaLasLYS______（选填“能”或“不能”）含有该操作所选用的限制酶的识别序列，原因是______。 (3)将CaLasLYS导入柑橘细胞，经植物组织培养获得组培苗，通过______来确定CaLasLYS是否赋予了组培苗抗柑橘黄龙病的特性。 (4)从基因工程安全性角度考虑，转基因柑橘可能存在的风险有______（答出1点即可）。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $