2026届四川省成都市石室中学高三二轮复习学案：课时2 赋予生物新的遗传特性的基因工程

该高中生物学高考复习学案系统梳理了基因工程与蛋白质工程、PCR技术及应用等核心考点，按操作步骤、工具选择（限制酶、引物）、技术原理（电泳检测、扩增过程）构建知识网络，通过知识盘查问题链和任务驱动设计，引导学生自主归纳限制酶双酶切优点、PCR引物设计原则等规律，形成完整知识框架。 亮点在于真题导向与分层诊断设计，如“曾经这样考”整合2024-2025年多省高考真题解析，“精准强化”设置选择与填空题进行自主检测，培养科学思维和探究实践素养。每个模块配方法指导（如酶切位点分析）和反思总结（真题再判断），助力学生个性化提升，教师可通过学情数据实现精准教学。

课时2　赋予生物新的遗传特性的基因工程 热点 考情速览 限制酶的选择 2025·山东卷，25；2025·陕晋宁青卷，21；2025·河南卷，21；2025·河北卷，22； 2025·黑吉辽蒙卷，25；2025·江苏卷，19；2024·全国甲卷，38；2024·重庆卷，19； 2024·江西卷，12；2024·河北卷，22；2024·福建卷，17；2024·湖南卷，21； 2024·浙江1月选考，22；2024·江苏卷，23；2024·山东卷，25 引物和启动子的选择 2025·新课标卷，34；2025·山东卷，22；2025·湖南卷，21；2025·河南卷，20；2025·四川卷，19；2024·河北卷，22；2024·广西卷，21；2024·湖南卷，21；2024·重庆卷，19；2024·广东卷，21 单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 2025·山东卷，25；2025·北京卷，21；2025·广东卷，21；2024·黑吉辽蒙卷，17、25；2024·全国甲卷，38；2024·河北卷，24；2024·湖南卷，15；2024·江西卷，12；2024·浙江6月选考，19、20；2023·山东卷，25 重点1　基因工程和蛋白质工程 【知识盘查】 1.熟记基因工程的四个操作步骤 2.限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶 ①不破坏目的基因和标记基因，如不能选择限制酶Sma Ⅰ。 ②单酶切：易出现目的基因与质粒的反向连接和自身环化，如图中Pst Ⅰ。 ③双酶切优点：利于目的基因与质粒正确连接，避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，可选择图中Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) (3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。 (4)同尾酶的使用 不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。如BamH Ⅰ、 Bcl Ⅰ、Bgl Ⅱ、Sau3A Ⅰ、Xho Ⅱ为一组同尾酶，它们的识别序列和切割位点依次分别是，它们切割DNA后都形成由GATC组成的黏性末端。由同尾酶酶切产生的DNA片段，能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。一般情况下，同尾酶产生的黏性末端连接后不能再被原来的限制酶切割，这是因为同尾酶产生的黏性末端连接后原来的识别序列可能已不复存在。 3.图示法解读蛋白质工程 4.DNA的粗提取与鉴定 5.DNA片段的电泳鉴定 【曾经这样考】 1.(2025·河南卷，21节选)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是_____________________________________________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要选用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是___________________________________________________________________ _____________________________________________________________________， 随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 答案　(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够降解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释 (2)BamH Ⅰ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列　(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 解析　(1)生物在长期的进化过程中，会逐渐形成适应特定环境条件的特性。在富含卡拉胶的环境中存在能够降解卡拉胶的微生物的可能性较大，这些微生物体内含有可以降解卡拉胶的酶，使其能够利用卡拉胶作为碳源，从而在这样的环境中生存和繁衍。(2)转录过程沿模板链的3′端到5′端进行，所以转录模板链的5′端为靠近终止子的一端，由于E.coli DNA连接酶连接黏性末端的效率较高，连接平末端效率低，因此不选用EcoRⅤ和Sma Ⅰ酶切，Xba Ⅰ与Spe Ⅰ切割产生的黏性末端相同，容易反向连接，所以cg基因转录模板链的5′端应包含BamH Ⅰ的酶切位点。 T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端。选择不同的双酶切组合后，若重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列，会导致重组质粒无法使用构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3)用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为筛选出成功导入表达载体的大肠杆菌，应在培养基中添加卡拉胶和四环素，培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈来判断。 2.(2025·新课标卷，34)为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5′→3′方向)。回答下列问题： (1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是________，而PCR过程中解开双链的方法是 ________________。 (2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有_____________________________________________________________________。 (3)该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：_____________________________________________________________________； ②无扩增产物，原因是__________________________________________________ _____________________________________________________________________； ③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是_____________________________________________________________________。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 答案　(1)解旋酶　高温变性　(2)引物、脱氧核苷三磷酸(dNTP)　(3)作为对照(或答：鉴定反应体系是否有模板污染)　P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列　目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段　(4)实验思路：提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系，催化相应底物(反应物)的反应，检测产物的生成情况。预期结果：含有酶X的反应体系中产物生成明显，而不含酶X的反应体系中产物无明显生成，则证明酶X有活性 解析　(1)在细胞中，DNA 复制时解开双链的酶是解旋酶。而在 PCR 过程中，是通过高温变性(温度超过90 ℃)的方法使 DNA 双链解开。(2)PCR过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和dNTP(脱氧核苷三磷酸)。引物用于引导DNA聚合酶合成新的DNA链，dNTP脱去两分子磷酸，产生dNMP，进而为合成新的DNA 链提供原料。(3)实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③以Px为模板，引物1和引物2扩增出的是含目的基因的 DNA 片段；⑤以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段 DNA 片段；⑥以Px为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的 DNA 片段。(4)实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系(作为对照)，在适宜条件下，加入酶X的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。 预期结果：含有酶X的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。 3.经典真题再判断 (1)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变。(2024·山东卷，13C)(×) 提示　鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变。 (2)在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。(2024·黑吉辽蒙卷，7C)(×) 提示　在琼脂糖凝胶电泳中，在同一电场作用下，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢。 (3)琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来。(2024·黑吉辽蒙卷，7D)(×) 提示　琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 (4)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(2024·河北卷，13A)(×) 提示　4种脱氧核糖酸作为PCR扩增原料。 (5)DNA鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。(2023·广东卷，11D)(×) 提示　需沸水浴加热。 (6)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(2022·山东卷，13A)(√) (7)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(2022·湖北卷，5)(×) 提示　动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。 【还会这样考】 4.(2025·广东珠海一中质检)人溶菌酶(HLZ)是一种人体内天然存在的具有抗菌、抗病毒、抗炎、增强免疫力等特性的蛋白质，它能水解细菌的细胞壁而将其杀死，细菌对其完全不存在耐受性，也无免疫原性。科学家培育出转基因HLZ 山羊，从其乳汁中提取HLZ。请回答下列问题： (1)要获得大量的HLZ需要采用PCR技术对HLZ基因进行扩增，在该技术中复性的目的是_____________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (2)切割质粒时最好选用两种不同的限制酶切割。若HLZ基因两端不存在这两种限制酶的识别序列，则在扩增前需要在基因模板链的________端加入两种限制酶的识别序列。选择两种不同的限制酶切割目的基因和质粒________(填“一定”或“不一定”)能防止目的基因自身环化。 (3)若用细菌的质粒构建HLZ基因的表达载体，需将其启动子替换后，目的基因才能在真核细胞中表达， 主要原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)将构建的基因表达载体常采用________的方法导入山羊的受精卵中，发育成早期胚胎后移植到受体羊的子宫内，胚胎在受体中存活的基础是 _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 答案　(1)使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(使引物与单链相应互补序列结合)　(2)3′　不一定　(3)真核生物和原核生物的RNA聚合酶识别和结合的启动子有所不同(启动子具有物种特异性)　(4)显微注射　受体对外来胚胎不发生免疫排斥反应 解析　(1)PCR扩增时复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 (2)扩增目的基因前需在目的基因模板链的3′端添加限制酶的识别序列；用两种不同的限制酶切割质粒及目的基因可能产生平末端或相同的黏性末端，不一定能防止质粒和目的基因自身环化。 (3)由于真核生物和原核生物的RNA聚合酶识别和结合的启动子有所不同，因此从原核细胞中获取的质粒不适用于直接构建真核细胞中的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达。 (4)将基因表达载体导入动物细胞常采用显微注射法；早期胚胎在受体中成活的原因是受体对外来胚胎不发生免疫排斥反应。 5.(2025·福建龙岩模拟)科学家采用了下图所示流程，将除草剂抗性基因G导入到玉米细胞中，以期获得抗除草剂性状的转基因玉米，回答下列问题： (1)基因表达载体除了含目的基因、特定限制酶切割位点、复制原点外，还必须有_____________________________________________________________________ ________________________，以确保导入的基因正常表达及后续的筛选。 (2)图中采用________________________法将目的基因转移到玉米细胞中，除草剂抗性基因G必须插入Ti质粒的T－DNA中，原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中，目的是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ ________________________。 (4)构建重组表达载体后，为了确定除草剂抗性基因G是否连接到改造后的载体中且插入方向正确(下图示为除草剂抗性基因G以正确的方向插入到载体中的情况)，需进行PCR和凝胶电泳来检测和判断，若仅用一对引物，应选择图中的引物①③或________(填序号)。该PCR反应体系中需加入________以提高DNA聚合酶活性。 答案　(1)启动子、终止子、标记基因　(2)农杆菌转化　只有T－DNA可转移并整合到玉米细胞的染色体DNA上　(3)防止转基因作物的目的基因通过花粉转移到自然界中的其他植物中，造成环境污染(答案合理即可) 　(4)②④　Mg2＋ 重点2　PCR技术及应用 【知识盘查】 1.PCR技术的要点归纳 2.PCR引物的设计和修饰 (1)PCR引物的设计原则 ①引物长度要适宜。一般引物过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。 ②引物内部应避免自身互补。 ③引物之间应避免互补。尤其应避免3′端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。 (2)引物的特异性和修饰 (3)目的基因是正向连接还是反向连接的检测 ①利用电泳进行检测——检测长度 ②利用PCR进行检测——能否正常进行扩增 [例1] 研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示), 请回答： 经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、 GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。 为鉴定这3种连接方式，选择Hpa Ⅰ酶和Bam H Ⅰ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。 答案　② 解析　由图可知，载体上有Hpa Ⅰ酶切位点，无BamH Ⅰ酶切位点，则载体自连情况下电泳得到的条带只有一条且分子量为6 000 bp，即①；基因与载体正向连接或反向连接的情况下，都有BamH Ⅰ和Hpa Ⅰ两个酶切位点，经酶切可产生两个片段，且正向连接时，Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ之间有700 bp，反向连接时Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ之间有200 bp，则载体正向 连接后产生一个700 bp和一个6 000 bp的条带，即②。 [例2] (2023·山东卷，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示： 图甲 构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。 答案　F2和R1或F1与R2 解析　据图可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。 (4)引物与复性温度 ①复性温度：复性温度高，扩增特异性强，但扩增效率低；复性温度低，扩增效率高，但扩增特异性低。 ②引物：引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；引物GC含量越高，越容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。 [例3] 科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是 _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是___________________________________________________ _____________________________________________________________________。 答案　引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)　引物过短导致引物的特异性下降 3.引物的结合方向 如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是___________________； _______________________________________。 答案　5′－ATGCCGTAAGTCCTAC－3′ 5′－TGATCTACGGCTTACA′－3 解析　书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′－TGATCTACGGCTTACA－3′。同理推测另外一条引物的序列。 4.引物的数量计算 (1)如图：一个DNA分子n次扩增，则： ①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为________个； ②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为________个； ③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为________个； ④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个； ⑤复制过程中共需引物________个； ⑥第n次复制需要引物________个。 (2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第________轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 答案　(1)①2n－2n　②2n　③2　④2n－1 ⑤2n＋1－2　⑥2n　(2)2 【曾经这样考】 1.(2025·陕晋宁青卷，21)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、______、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′－________－3′，切割载体时应选用的两种限制酶是________。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________上，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 答案　(1)(4种)脱氧核苷酸　延伸　(2)5′端　AGATCT　BamH Ⅰ与EcoR Ⅰ　(3)染色体DNA　2　再分化 解析　(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、(4种)脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR过程一般可以分为变性、复性、延伸，DNA聚合酶在延伸步骤中起作用，即DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的3′端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列。为保证目的基因的正确插入，应使用双酶切；载体中含有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ的酶切位点，S基因上含有Xba Ⅰ、Nde Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点，为保证S基因结构的完整性，不能在S基因两端添加Xba Ⅰ、Nde Ⅰ、BamH Ⅰ的识别序列；分析表格数据，Bgl Ⅱ切割产生的黏性末端和BamH Ⅰ切割产生的黏性末端相同，结合S基因的转录方向和载体上启动子的转录方向可知， 应在上游引物添加 Bgl Ⅱ的识别序列，即5′－AGATCT－3′， 下游引物添加EcoR Ⅰ的识别序列。因此，切割载体应选用的两种限制酶为BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，农杆菌能将基因表达载体中的T－DNA转移到愈伤组织细胞的染色体DNA上。分析载体，T－DNA中含有抗性基因2, 若T－DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上，则该细胞具有抗性基因2对应的抗性，因此，抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、 根，继续培育可获得抗寒能力显著增加的马铃薯植株。 2.(2025·河北卷，22节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。 回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是________和________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____________________________________________________________________。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成________键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为________________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量________，则表明融合蛋白能结合镉离子。 答案　(1)引物　脱氧核苷酸　复性　PCR过程变性，延伸需要的温度较高，一般的DNA聚合酶在高温下会变性失活　(2)Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ　磷酸二酯　(3)发出黄色荧光　高 解析　(1)PCR过程中，每进行一轮的扩增，都需要消耗引物和作为原料的脱氧核苷酸，所以随着PCR反应进行，引物和脱氧核苷酸的数量逐渐减少，可作为模板的DNA 会越来越多，DNA聚合酶的数量基本保持不变。PCR反应中，变性、延伸过程温度较高，DNA聚合酶的化学本质为蛋白质，为防止高温导致蛋白质变性失活，所以PCR过程中需要用耐高温的DNA聚合酶。(2)分析图示中几种限制酶可知，Nhe Ⅰ与Xba Ⅰ酶切后产生的黏性末端相同，为了防止载体和目的基因出现自身环化和二者之间反向连接，不能同时在目的基因两端添加这两种酶的识别序列。根据题图中几种基因和限制酶的顺序可得出目的基因与对应酶切位点的位置关系，如图所示，即GP1基因两端应分别添加Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列。 DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，完成DNA片段的连接。(3)由题干信息可知，该转基因体系构建了SP7、CADR、GP1、YFP融合蛋白表达载体，其中黄色荧光蛋白基因(YFP)可看作标记基因。若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻发出黄色荧光，说明YFP表达成功，即融合蛋白表达成功。 将两种衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量高于野生型衣藻，则说明融合蛋白可结合镉离子。 【还会这样考】 3.(2025·华师一附中模拟)目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、 丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300 bp的片段。下列有关说法错误的是(　　) A.PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B.电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关 C.选取引物甲、丙，扩增出450 bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D.选取引物甲、乙，扩增出400 bp长度片段时，可以说明目的基因反接 答案　C 解析　复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管目的基因正接还是反接，扩增出的片段均为450 bp，C错误；选取引物甲和乙，扩增出400 bp长度片段时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出400 bp的片段，D正确。 4.(2025·江西金太阳大联考)培育稳定且抗病能力强的番茄新品种是稳产高产的重要途径。番茄代谢产生的H2O2是一种重要的抗病信号分子，可被体内的过氧化氢酶清除。现采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除番茄过氧化氢酶基因，过程如图1所示。获取的突变体可作为分析番茄的抗病性和产量的遗传材料。回答下列问题： (1)常用PCR快速扩增目的基因，PCR反应体系需含_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ (至少答2种)等成分。常采用________________来鉴定PCR的产物。 (2)CRISPR/Cas9由gRNA和Cas9蛋白两大部分组成，gRNA由crRNA和tracrRNA组成，其中crRNA约有20个碱基，含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9切开靶基因所在双链DNA，随后细胞中的酶将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑。番茄过氧化氢酶基因CRISPR/Cas9敲除突变体载体构建过程如图2所示，其中“某序列”是指_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 为了确保“某序列”能正确连接到Ti质粒上，相应的限制酶识别序列和切割位点如表所示，需在“某序列”的引物1的5′端加上碱基序列________________________，引物2的5′端加上碱基序列________________________。 限制酶 识别序列和切割位点 Bgl Ⅱ 5′A↓GATCT3′ Nhe Ⅰ 5′G↓CTAGC3′ (3)制备过程中利用了农杆菌Ti质粒的T－DNA，原因是T－DNA具有_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________的特点。 (4)植物组织培养常用MS培养基，该培养基中加入适量的蔗糖的作用是_____________________________________________________________________ ________________。可在MS培养基中添加________________________(填激素及比例)用于诱导愈伤组织。 答案　(1)PCR缓冲液、模板DNA、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶(至少答2种)　琼脂糖凝胶电泳　(2)根据番茄过氧化氢酶基因的部分序列人工合成的指导crRNA合成的DNA序列　5′AGATCT3′　5′GCTAGC3′　(3)可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上　(4)为离体细胞提供碳源和能源；能维持细胞的渗透压(答出1点即可)　生长素与细胞分裂素，且二者值等于1 解析　(2)crRNA约有20个碱基，含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9切开靶基因所在双链DNA，故“某序列”是根据番茄过氧化氢酶基因的部分序列人工合成的指导crRNA合成的DNA序列。根据转录模板链、转录方向及启动子的方向可判断引物2上应该加上限制酶Nhe Ⅰ的识别序列，引物1上应该加上限制酶Bgl Ⅱ的识别序列。 5.(2025·江西八所重点高中联考)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。 限制酶名称 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Xho Ⅰ Mun Ⅰ 识别序列 5′G↓AATTC3′ 5′G↓GATCC3′ 5′C↓TCGAG3 5′C↓AATTG3′ (1)据图分析，为获得Y－GFP融合基因，在设计引物时， 引物F2和F3序列应该分别选择(　　) A.5′TCACTGCTAGCG3′ B.5′TTACGACTAGCG3′ C.5′CGCTAGTCGTAA3′ D.5′CGCTAGCAGTGA3′ (2)构建基因表达载体时，因融合基因两端不含酶切位点，根据题中所提供的限制酶，应当在引物F1和F4中分别添加________________________限制酶识别序列，若用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割(完全酶切)构建成功的表达载体，能够得到________个片段。 (3)常用________法将基因表达载体导入大肠杆菌，在检测融合基因表达情况时发现，能够检测到融合基因的mRNA，但表达的蛋白质只有蛋白激酶Y，原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)A蛋白磷酸化水平一定程度上代表了细菌对外界刺激的反应程度，在导入基因表达载体的大肠杆菌中，可通过直接观察________________________来反应这一情况。 答案　(1)BC　(2)Mun Ⅰ和Xho Ⅰ　两 (3)Ca2＋处理　Y基因中编码终止密码子的序列未去除，翻译到终止密码子处停止翻译　(4)绿色荧光强度 解析　(1)据题图分析可知，为获得Y－GFP融合基因，需要设计特定的引物进行PCR扩增。由于PCR扩增是依赖模板进行的，且需要保证扩增出的片段是Y基因与GFP基因的融合，因此引物的设计至关重要。结合Y－GFP融合基因的转录方向和Y基因与GFP基因的模板链特点，引物F2应该与Y基因模板链的5′端一部分序列相同，而引物F3则应该与GFP基因的模板链的3′端一部分序列互补，并且引物之间应该有一定的互补区域，以便在PCR扩增时能够形成融合基因。故引物F2序列为5′TTACGACTAGCG3′，引物F3序列为5′CGCTAGTCGTAA3′，A、D错误，B、C正确。 故选BC。 (2)在构建基因表达载体时，由于融合基因两端不含酶切位点，我们需要在引物F1和F4中分别添加限制酶识别序列，以便将融合基因插入到载体中。根据题中所提供的限制酶及识别序列可知，若在融合基因两端添加EcoR Ⅰ限制酶的识别序列，因Y基因中含有EcoR Ⅰ限制酶识别序列，在构建基因表达载体时，用EcoR Ⅰ限制酶切割时会破坏融合基因，若在融合基因两端添加BamH Ⅰ限制酶的识别序列，在构建基因表达载体时， 使用的质粒中的标记基因含有BamH Ⅰ限制酶识别序列，用BamH Ⅰ限制酶切割时会破坏标记基因，根据Y－GFP融合基因的转录方向可知，在构建基因表达载体时，融合基因中Y基因3′端连接质粒启动子端，而GFP基因5′端连接终止子端，再因为用EcoR Ⅰ限制酶酶切形成的黏性末端与用Mun Ⅰ限制酶酶切形成的黏性末端相同，故在PCR扩增时，引物F1应添加Mun Ⅰ限制酶的识别序列，引物F4应添加Xho Ⅰ限制酶的识别序列。由于构建成功的表达载体含有Y－GFP融合基因，且插入在EcoR Ⅰ限制酶和Xho Ⅰ限制酶识别点之间， 所以构建成功的表达载体中只含有一个EcoR Ⅰ限制酶和一个BamH Ⅰ限制酶的识别位点，故用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割(完全酶切)构建成功的表达载体，能得到2个DNA片段。 (3)将目的基因导入大肠杆菌时，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。在检测融合基因表达情况时发现，能够检测到融合基因的mRNA，但表达的蛋白质只有蛋白激酶Y，这可能是Y基因中编码终止密码子的序列未去除，翻译到终止密码子处停止翻译，导致无法合成绿色荧光蛋白，仅表达Y蛋白。(4)A蛋白磷酸化水平一定程度上代表了细菌对外界刺激的反应程度。在导入基因表达载体的大肠杆菌中我们可以通过直接观察绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度来反映这一情况。 【精准强化】 重点1　基因工程和蛋白质工程 1.(2025·广东茂名调研)FSHD是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白而导致的神经肌肉疾病，研究者尝试将如下表达载体导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。下列说法正确的是(　　) A.利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶 B.利用图中质粒和DUX4基因构建表达载体时，应选择的限制酶为BamH Ⅰ和Hind Ⅲ C.可采用农杆菌转化法将基因表达载体导入患病组织 D.获取受体细胞的mRNA经逆转录获得DNA后，利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测表达载体是否构建成功 2. (2025·山西师大附中模拟)烟草作为一种重要的经济作物，其品质改良一直是研究的热点，超甜基因的发现为烟草甜度的提升带来了机遇。现从具有高甜度特性的植物甜叶菊中得到的甜蛋白基因如图1，选用的植物表达载体pBI121如图2，其含有CaMV 35S强启动子、多克隆位点(含有多个限制酶识别序列)和筛选标记基因(如卡那霉素抗性基因)等，构建基因表达载体后再转化至农杆菌菌株中，用于后续的烟草转化。回答下列问题： (1)通常可先从甜叶菊叶片组织中提取________，再利用________酶得到cDNA，进而通过PCR技术扩增获得目的基因，在扩增目的基因时还需要在设计的引物________(填“5′”或“3′”)端添加限制酶的识别序列。 (2)构建基因表达载体时，首先选用图中的限制酶________________________同时切割pBI121质粒和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶拼接。DNA连接酶与DNA聚合酶在作用上的区别是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)将构建的基因表达载体导入农杆菌前，需先用________处理农杆菌，接着用含有________的培养基培养农杆菌来筛选目的菌。 (4)用农杆菌转化法获得转甜蛋白基因的烟草细胞后，先经________形成愈伤组织，即失去其特有的________，再诱导其形成新植株。 (5)现科研人员发现转基因烟草细胞中没有表达出甜蛋白，请分析可能的原因： _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________(答出2点)。 重点2　PCR技术及应用 3.(2025·湖北黄石模拟)如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBⅠ 121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的的是(　　) A.用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 B.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 C.用限制酶BsaB Ⅰ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因 D.与只用Kpn Ⅰ相比，Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 4.(2025·八省联考陕西卷，21)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径，其基因表达载体如图(a)，基因1、2和3为该途径的必需基因，基因大小分别为2 650 bp、1 240 bp和3 476 bp。回答下列问题。 (1)图(a)中，构建基因表达载体时用到的酶是________________________，片段X是________。 (2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种________________________________的生理状态，导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落，分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图(b)。据图可知，PCR时选用的引物对是图(a)中的________，选择该引物对进行鉴定的原因是____________________________________________________；菌落B中未检测到目标条带，其原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响，请针对其中任一因素，探究其对产物Z产量的影响，写出简要的实验思路_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 【综合提升】 5.(2025·湖南卷，21)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A, 其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和________等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物________对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为________bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是_____________________________________________________________________ (答出两点即可)。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有_____________________________________________________ (答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和________，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 6.(2025·四川卷，19)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA－lrcF)导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′－3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA－赖氨酸；AUG－甲硫氨酸(起始)；UUC－苯丙氨酸；ACA－苏氨酸；UCG－丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA－lrcF目的基因时，应选用________引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (2)采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生________条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带________(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点，导致______________________________________________， 最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是_____________________________________________________________________。 若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有___________________________________________________________________ (答出1点即可)。 参考答案 1.答案　B 解析　利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶，不需要DNA连接酶，A错误；DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，因此DUX4的反义基因的模板链为DUX4基因的编码链，子链延伸的方向是5′→3′，因此DUX4基因右侧连接启动子，左侧连接终止子，构建DUX4反义基因表达载体，选用的限制酶为Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，B正确；当受体细胞为动物时应选用显微注射法，C错误；由于DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，两者转录的模板不同，但形成的mRNA序列互补，经逆转录获得的双链DNA相同，因此不能检测表达载体是否构建成功，D错误。 2.答案　(1)mRNA　逆转录　5′　(2)Xba Ⅰ和Hind Ⅲ　DNA连接酶将DNA片段连接起来，DNA聚合酶将脱氧核苷酸连接在脱氧核苷酸链的3′端 (3)Ca2＋　卡那霉素　(4)脱分化　结构和功能　(5)甜蛋白基因导入烟草细胞中，但是没有转录出相应的mRNA；甜蛋白基因导入烟草细胞中，但是没有翻译出甜蛋白等 3.答案　B 解析　根据GNA－ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，A不符合题意；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B符合题意；雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)均有BsaB Ⅰ酶切位点，所以用限制酶BsaB Ⅰ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，C不符合题意；图中质粒与GNA－ACA上都含有Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，与只用Kpn Ⅰ相比， Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D不符合题意。 4.答案　(1)限制酶、DNA连接酶　复制原点　(2)能吸收周围环境中DNA分子　引物2、引物5　该引物对可同时检测到三个目的基因，且扩增出来的条带介于2 000～3 000 bp之间　转入受体细胞的载体未插入外源基因　(3)以温度为例：设定温度梯度，检测并分析不同温度时的产物Z产量 解析　(1)构建基因表达载体时用到的酶是限制酶、DNA连接酶，利用限制酶切割质粒和目的基因所在的DNA片段获得相同的黏性末端，然后利用DNA连接酶连接质粒和目的基因获得重组DNA分子。质粒上一般包含启动子、终止子、复制原点、标记基因(抗性基因)，结合图(a)分析，片段X是复制原点。 (2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这样有利于重组DNA分子的导入。导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落，分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图(b)。电泳检测的目的为判断3个抗性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3)，电泳结果显示，菌落A和C电泳条带显示基因大小介于2 000～3 000 bp之间，结合目的基因上的引物分析，应该选择引物2和引物5，因为这两种引物扩增了基因2(1 240 bp)以及基因1和基因3的部分片段，片段大小应该在2 000～3 000之间，且两种引物扩增的区段包含了完整的基因2、基因1和基因3的部分片段，这样可以很好的判断大肠杆菌中是否成功导入了目的基因。菌落B中未检测到目标条带，即不含目的基因但含抗性基因，其原因是转入受体细胞的载体未插入外源基因。 5.答案　(1)①终止子、复制原点　P1和P3　782　②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外或转速过高使蛋白A发生沉淀或蛋白A亲水性较差发生沉淀或蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解　(2)PEG融合法/电融合法/灭活病毒诱导法　抗体检测 解析　(1)①PCR时选用的两种引物应该方向相反， 分析题图，P3是唯一一个与P1和P2方向相反的引物，故必选P3；PCR的目的是确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，P3和P2分别与基因A两端互补配对，若选该对引物进行扩增，无论基因A插入质粒方向是否正确都可以扩增出片段(基因A)，不符合要求；P1与质粒一段序列互补配对，P3与基因A的一端互补配对，选P1和P3为引物，扩增时，若基因A未插入质粒，则不能扩增出相应片段；若基因A插入质粒的方向错误，也不能扩增出相应片段，故应选P1和P3对待测质粒进行PCR扩增。预期扩增的片段包括质粒的一段序列(200 bp)和基因A(582 bp)，故扩增片段大小为200＋582＝782(bp)。②上清液中检测到蛋白A的条件：重组菌将蛋白A正常表达；蛋白A不被重组菌降解；重组菌裂解或将蛋白A分泌到细胞外；蛋白A易溶于发酵液；离心时转速合适，既能将重组菌和大的颗粒沉淀，又不会将蛋白A沉降下来。(2)诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。对经选择培养所得的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 6.答案　(1)F2、F4　保证目的基因能在链霉菌细胞中复制　(2)2　检测重组质粒是否构建成功　(3)苯丙氨酸　翻译过程无法正常进行，细菌无法合成蛋白质　(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等合理答案)　发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等合理答案) 解析　(1)引物需要结合到模板的3′端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5′端→3′端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA－lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证目的基因能在链霉菌细胞中复制，使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。(2)采用EcoR Ⅰ和Bam H Ⅰ完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。(3)观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：发酵的最佳条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 学科网（北京）股份有限公司 $