专题03 基因工程（5大考点）（期末真题汇编）高二生物下学期人教版

**基本信息** 聚焦基因工程核心考点，整合多地区期末真题，突出科技前沿与实验探究，适配高中生物学期末复习需求。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|50题|涵盖5大高频考点，重点考查限制酶作用、PCR技术、基因表达载体构建等|结合CRISPR/Cas9技术（第23题）、转基因抗虫棉（第11题）等前沿情境，设置酶切位点分析（第5题）、实验操作辨析（第2题）等层次化问题| |非选择题|35题|涉及基因工程操作程序、应用及伦理问题，如乳腺生物反应器构建（第24题）、蛋白质工程改造（第22题）|以真实科研案例为背景，如“利用农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄”（第8题），强调实验设计与结果分析，匹配高考命题趋势|

专题03 基因工程 5大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程 考点05 生物技术的安全与伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具 1．(24-25高二下·宁夏固原·期末)基因工程技术的实施必须具备的四个必要条件是（　　） A．目的基因、DNA聚合酶、载体、受体细胞 B．工具酶、目的基因、载体、受体细胞 C．模板DNA、信使RNA、质粒、标记基因 D．重组DNA、RNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶 【答案】B 【详解】基因工程的核心要素是：工具酶（如限制性内切酶、DNA 连接酶）、目的基因（待导入的外源基因）、载体（运载目的基因的 “交通工具”，如质粒）、受体细胞（接收并表达目的基因的宿主细胞），B正确，ACD错误。 故选B。 2．(24-25高二下·甘肃临夏州·期末)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，下列关于操作流程的叙述错误的是（　　） A．DNA溶于酒精，某些蛋白质不溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质 B．通常不选用哺乳动物血液作为实验材料，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核 C．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液静置于4℃冰箱中几分钟后，DNA存在于上清液中 D．可利用二苯胺试剂鉴定丝状物的主要成分——DNA，沸水浴后观察是否出现蓝色 【答案】A 【详解】A、DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精，而某些蛋白质可溶于酒精，因此加入酒精后DNA析出，而部分蛋白质溶解，从而实现初步分离，A错误； B、哺乳动物成熟红细胞无细胞核和各种细胞器，没有DNA，难以提取足够量，因此通常不选用，B正确； C、在DNA粗提取实验中，通常首先通过研磨和加入适量的洗涤剂与食盐溶液来释放细胞中的DNA，并破坏细胞膜和其他细胞结构，然后在此混合液中DNA会溶解在溶液中，并随同蛋白质、多糖等其他物质一起存在，DNA在一定浓度的NaCl溶液中溶解度较高，所以初步处理后的滤液经过离心或静置后，DNA不会形成沉淀，而是在上清液中，C正确； D、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，所以将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后，滴加二苯胺试剂，沸水浴观察是否出现蓝色，可鉴定其是否为DNA，D正确。 故选A。 3．(24-25高二下·新疆乌鲁木齐101中学·期末)限制酶的作用特点是（　　） A．识别特定RNA序列 B．切割双链DNA中特定磷酸二酯键 C．催化DNA双链随机断裂 D．连接DNA片段 【答案】B 【详解】A、限制酶识别的是特定的双链DNA序列，而非RNA序列，A错误； B、限制酶能切割双链DNA中的特定磷酸二酯键，且切割位点具有特异性，B正确； C、限制酶的切割位点是特定的，并非随机断裂，C错误； D、连接DNA片段是DNA连接酶的功能，而非限制酶的作用，D错误。 故选B。 4．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．可选择新鲜洋葱、香蕉、菜花或猪肝等作为实验材料 B．在4℃冰箱中进行过滤液沉淀是为了防止DNA被降解 C．加入预冷酒精后需用玻璃棒沿一个方向搅拌滤液 D．鉴定时将丝状物直接加入二苯胺试剂中并沸水加热 【答案】D 【详解】A、洋葱、香蕉、菜花等植物细胞及猪肝（动物细胞）均含有较多DNA，可作为提取材料，A正确； B、低温能抑制DNA酶活性，避免DNA被水解，故需在4℃下进行沉淀，B正确； C、预冷酒精可降低DNA溶解度，单向搅拌能减少DNA断裂，符合实验规范，C正确； D、鉴定时需将DNA丝状物溶于2mol/L NaCl溶液，再与二苯胺混合沸水浴显色，直接加入试剂会导致反应不充分，D错误。 故选D。 5．(24-25高二下·甘肃武威·期末)用A和B两种限制酶同时和分别处理某DNA分子，酶切位点及酶切产物的电泳鉴定结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．图中X代表的碱基对数为4500bp B．图中Y是限制酶A的酶切位点 C．图乙中①代表限制酶A，②代表限制酶B D．用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到4个末端 【答案】D 【详解】ABC、只被限制酶②切割时，得到8000bp和2000bp长度的条带，限制酶②代表限制酶B，X代表的碱基对数为8000−3500=4500；根据图中①电泳鉴定结果存在3500bp长度的条带可知，①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳鉴定结果，再根据①电泳鉴定结果存在500bp长度和6000bp长度的条带，可知Y是限制酶A的酶切位点，ABC正确； D、由题图可知，图乙中用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段，共有3个酶切位点，每个酶切位点得到2个末端，所以共得到6个末端，D错误。 故选D。 6．(24-25高二下·陕西渭南临渭区·期末)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”及“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验的叙述正确的是（    ） A．DNA溶于酒精，某些蛋白质不溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质 B．向含DNA的试管中加入二苯胺试剂，混合后即可比较观察颜色变化 C．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小和构象有关，与凝胶浓度无关 D．电泳凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来 【答案】D 【分析】DNA的粗提取和鉴定：利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，以及DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可以将DNA与蛋白质分离开；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、DNA不溶于高浓度酒精，而某些蛋白质在酒精中溶解度降低，因此可通过冷酒精沉淀DNA来初步分离，而非“DNA溶于酒精”，A错误； B、二苯胺试剂需在沸水浴条件下与DNA反应显蓝色，直接混合无法立即观察颜色变化，B错误； C、DNA在凝胶中的迁移速率与分子大小、构象及凝胶浓度均有关，凝胶浓度越高，孔隙越小，大分子迁移越慢，C错误； D、电泳后的DNA需用荧光染料（如溴化乙锭）染色，在300nm紫外灯下可观察到荧光条带，D正确。 故选D。 7．(24-25高二下·甘肃武威·期末)在利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关操作正确的是（　　） A．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度 B．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNA C．该实验利用了DNA可溶于酒精而某些蛋白质不溶于酒精的原理 D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应 【答案】B 【详解】A、定性滤纸的孔径较小，过滤时可能导致DNA被截留，无法有效提高DNA的含量和纯度。实验中通常使用纱布或多层纱布过滤细胞碎片，A错误； B、研磨洋葱时加入的研磨液（含洗涤剂和食盐），可瓦解细胞膜，溶解细胞质中的物质，从而释放核DNA，B正确； C、实验中利用的是DNA不溶于高浓度酒精（体积分数95%的冷酒精），而某些蛋白质可溶的原理，通过离心或沉淀分离DNA，C错误； D、DNA的鉴定需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液，再与二苯胺试剂混合后沸水浴显蓝色。若直接将丝状物加入二苯胺试剂，DNA未充分溶解，无法有效显色，D错误。 故选B。 8．(24-25高二下·青海西宁城北区青海三江源民族中学·期末)下列关于基因工程的叙述，正确的是（　　） A．“分子缝合针”是限制性内切核酸酶 B．DNA连接酶和载体是构建重组质粒必需的工具酶 C．限制酶和DNA连接酶的作用都与磷酸二酯键有关 D．转基因烟草操作过程中常用烟草花叶病毒作载体 【答案】C 【详解】A、“分子缝合针”是DNA连接酶，限制酶是“剪刀”，A错误； B、DNA连接酶是工具酶，但载体属于工具而非酶，构建重组质粒必需的工具酶是限制酶和DNA连接酶，B错误； C、限制酶切割磷酸二酯键，DNA连接酶连接磷酸二酯键，两者均作用于该化学键，C正确； D、转基因植物常用农杆菌的Ti质粒作载体，烟草花叶病毒是RNA病毒，一般不作为载体，D错误。 故选C。 9．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法错误的是（　　） A．DNA连接酶和DNA聚合酶均能形成磷酸二酯键 B．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上 C．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割RNA片段 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不会剪切自身的DNA 【答案】B 【详解】A、DNA连接酶催化两个DNA片段间磷酸二酯键的形成，DNA聚合酶在DNA复制时将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，两者均能形成磷酸二酯键，A正确； B、DNA连接酶的作用是连接两个DNA片段的末端，而非添加单个核苷酸，B错误； C、限制酶特异性识别双链DNA的特定序列并进行切割，无法识别或切割RNA片段，C正确； D、限制酶主要来源于原核生物，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D正确。 故选B。 10．(24-25高二下·江苏镇江六校等校联考·期末)某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。相关叙述不正确的是（    ）    A．为了方便对材料进行处理，也可以用新鲜猪血来代替猪肝用于DNA的粗提取 B．过程⑤加入酒精后，也可将溶液倒入离心管离心后取沉淀物 C．过滤液放入4℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性 D．提取到的丝状物先溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热后变蓝 【答案】A 【详解】A、哺乳动物成熟红细胞没有细胞核，因此新鲜猪血不能代替猪肝用于DNA的粗提取，A错误 B、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，过程⑤加入酒精后，蛋白质溶解，DNA析出，因此离心后弃上清取沉淀，B正确； C、酶活性的发挥需要适宜的温度等条件，将过滤液放入4℃冰箱或加入预冷的酒精的目的是抑制DNA酶的活性，避免DNA被水解，C正确； D、将析出的丝状物先溶于2mol/L的NaCl溶液中，然后加入二苯胺试剂，混匀后沸水浴中加热可出现蓝色，D正确。 故选A。 11．(24-25高二下·贵州遵义区县一中·期末)培育转基因抗虫棉时，需要将Bt抗虫基因进行“切割”、改造和“拼接”；将重组DNA导入棉花细胞内并表达。下列有关基因工程叙述正确的是（　　） A．限制酶、RNA聚合酶可作用于DNA上的磷酸二酯键 B．T4DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的DNA片段 C．1种限制酶切割只有1个酶切位点的质粒时产生1个5′端 D．构建的基因表达载体上应具备启动子、终止子等调控元件 【答案】D 【详解】A、限制酶切割DNA的磷酸二酯键，RNA聚合酶催化RNA链中核糖核苷酸间的磷酸二酯键形成，而非作用于DNA的磷酸二酯键，A错误； B、T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，B错误； C、环状质粒被1种限制酶切割1次后，产生线状DNA，每个切口断裂2个磷酸二酯键，形成2个5′端，C错误； D、基因表达载体需包含启动子（RNA聚合酶识别结合位点）、终止子（终止转录）等调控元件，D正确。 故选D。 12．(24-25高二下·四川绵阳·期末)图是家庭版DNA的粗提取的过程。若该实验得到的DNA鉴定效果不明显，则可能的原因不包括（　　） A．实验所选用的材料中DNA含量较低 B．实验过程中酒精未预冷时，DNA被降解 C．粗提取的DNA中含有较多的杂质 D．鉴定时所用甲紫溶液失效，且未沸水浴加热 【答案】D 【分析】DNA 在不同浓度的NaCI溶液中溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，而在0.015mol/L的NaCI溶液中溶解度较高，DNA不溶于酒精，而细胞中 的许多其他物质可溶于酒精溶液，利用这些特性，可以提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A \实验材料中DNA含量低，提取的DNA少，会使鉴定效果不明显，可能是DNA鉴定效果不明显的原因，A不符合题意； B、酒精未预冷，相应酶的活性相对较高，可能会导致DNA被降解，可能是DNA鉴定效果不明显的原因，B不符合题意； C、粗提取的 DNA 含较多杂质，会干扰鉴定，使鉴定效果不明显，可能是DNA鉴定效果不明显的原因，B不符合题意； D、甲紫溶液不是 DNA 鉴定的试剂，可能不是DNA鉴定效果不明显的原因，D符合题意。 故选D。 13．(24-25高二下·重庆第一中学校·期末)蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1-4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（    ） A．若用限制酶从该DNA片段中直接切取蛛丝蛋白基因，则会破坏2个磷酸二酯键 B．若用PCR技术获取蛛丝蛋白基因，则设计的引物应分别结合在1、4部位 C．若以蜘蛛核DNA为模板，至少需经过6次循环才可以获得32个等长的蛛丝蛋白基因 D．利用凝胶电泳检测PCR产物时，需将产物与核酸染料混合以便实时观察电泳进程 【答案】C 【详解】A、若用限制酶从该DNA片段中直接切取蛛丝蛋白基因，则会破坏4个磷酸二酯键，A错误； B、PCR 的原理是DNA半保留复制，DNA复制时引物延伸子链的方向为5′→3′，而子链和模板链反向平行，所以引物需要与模板链的3′端结合，据此可知图中与引物结合的部位是2、3，B错误； C、若以蜘蛛核DNA为模板，要获取等长的蛛丝蛋白基因，经过n=5次获得的等长DNA片段为2n-2n=22个，经过n=6次循环可以获得2n-2n=52＞32个，C正确； D、利用凝胶电泳检测PCR产物时，不需将产物与核酸染料混合，而是将核酸染料与琼脂糖凝胶混合，以便实时观察电泳进程，D错误。 故选C。 14．(24-25高二下·四川南充·期末)几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示）如下表所示。据表推测，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 A．限制酶使特定核苷酸序列特定部位的磷酸二酯键断开 B．BamHⅠ和Bel Ⅰ识别的核苷酸序列都能被Sau3A Ⅰ识别 C．SmaⅠ切割DNA 片段后形成的黏性末端，可用E.coli DNA连接酶连接 D．BamHⅠ切割产生的DNA片段能与BelⅠ切割产生的DNA片段相连接 【答案】C 【分析】限制性核酸内切酶主要作用于DNA分子的磷酸二酯键，用同种核酸内切酶处理不同的DNA分子后产生相同的黏性末端，黏性末端之间的碱基可以进行互补配对，在DNA连接酶的作用下能够连接。 【详解】A、限制酶通过识别特定核苷酸序列，断开磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端，A正确； B、BamHⅠ的识别序列为GGATCC，BclⅠ为TGATCA，均包含Sau3AⅠ的识别序列GATC，因此两者均可被Sau3AⅠ识别，B正确； C、SmaⅠ切割后产生平末端，平末端需T4 DNA连接酶，C错误； D、BamHⅠ切割后黏性末端为GATC，BclⅠ为GATC，两者互补，可通过连接酶连接，D正确。 故选C。 15．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)用Xho I和Sal I两种限制酶分别处理同一DNA片段（限制酶在对应切点均能切开）。酶切位点及酶切产物电泳结果分别如图1和图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 B．解旋酶与图1中的两种限制酶均能催化氢键断裂 C．图2泳道②中可能是用Xho Ⅰ处理得到的酶切产物 D．用两种限制酶同时处理该DNA电泳后可得到6种条带 【答案】B 【详解】A、大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数为4个、5个或8个核苷酸，A正确； B、限制酶的作用是切割DNA双链中的磷酸二酯键，不涉及氢键断裂；解旋酶的作用是断裂DNA双链间的氢键，使DNA解旋，B错误； C、分析图1，限制酶Xho I有两处切割位点，切割后产生3个DNA片段，图2泳道②有3个DNA片段，C正确； D、分析图1，限制酶Xho I有两处切割位点，限制酶Sal I有三处切割位点，且两种酶的切割位点无重叠，根据酶切位点分布推断，两种酶同时处理可产生6种不同大小的片段，电泳后呈现6种条带，D正确。 故选B。 16．(24-25高二下·黑龙江大庆萨尔图区大庆实验中学·期末)下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是（　　） 限制酶 AluI BamHI SmaI Sau3AI 识别序列 切割位点 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑ A．BamHI和Sau3AI切割产生的片段能够相连，连接后的片段两者都能再切割 B．SmaI和AluI切割一次需切断2个氢键，增加2个游离的磷酸基团 C．①③连接时可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶，但后者连接效率低 D．②④⑤对应的识别序列均能被限制酶Sau3AI识别并切割 【答案】D 【详解】A、BamH I和Sau3A I切割后产生的黏性末端相同，能够相连，连接后的两条链为-GGATC-和-CCTAG-，其中不再存在BamH I的识别序列G↓GATCC，所以BamH I不能再切割，但存在Sau3A I的识别序列↓GATC，Sau3A I能再切割，A错误；   B、Sma I和Alu I切割的是磷酸二酯键，不是氢键，B错误；    C、①③是平末端，可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶，但前者连接效率低，C错误；    D、 Sau3A I的识别序列是↓GATC，②④⑤对应的识别序列中都含有GATC，均能被限制酶Sau3A I识别并切割，D正确。    故选D。 17．(24-25高二下·广东佛山·期末)关于DNA的粗提取和鉴定的实验，下列叙述错误的是（　　） A．将研磨液倒入垫有滤纸的漏斗中过滤以去除杂质 B．研磨液需在4℃的冰箱中放置几分钟后再取上清液 C．加入酒精出现丝状物后，用玻璃棒沿一个方向搅拌 D．溶解的DNA粗提物在沸水浴中与二苯胺反应呈蓝色 【答案】A 【详解】A、实验中过滤研磨液应使用纱布或尼龙布，而非滤纸。滤纸孔径较小，易堵塞且无法有效分离细胞碎片等大分子杂质，A错误； B、4℃静置可降低DNA溶解度，促使DNA沉淀析出，此时取上清液可减少杂质干扰，B正确； C、加入酒精后DNA析出为丝状物，沿同一方向搅拌可避免DNA断裂，便于缠绕收集，C正确； D、二苯胺试剂在沸水浴条件下与DNA反应生成蓝色复合物，此现象用于鉴定DNA，D正确。 故选A。 18．(24-25高二下·辽宁葫芦岛·期末)下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（　　） A．解旋酶、限制酶、DNA连接酶 B．DNA连接酶、限制酶、解旋酶 C．限制酶、解旋酶、DNA连接酶 D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶 【答案】A 【详解】①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位，催化磷酸二酯键的形成。 综上所述，BCD不符合题意，A符合题意。 故选A。 19．(24-25高二下·青海西宁大通县·期末)“工欲善其事，必先利其器”，基因工程的实施也需要借助“工具”才能完成。下列相关叙述错误的是（　　） A．限制酶可以将DNA水解为脱氧核糖核苷酸 B．T4DNA连接酶可以连接DNA片段的平末端 C．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的作用对象相同 D．动植物病毒和噬菌体也可以作为基因工程中的载体 【答案】A 【详解】A、限制酶的作用是识别特定核苷酸序列，并在特定位点切割DNA双链，形成黏性末端或平末端，而非将DNA完全水解为脱氧核糖核苷酸，A错误； B、T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，B正确； C、限制酶和DNA连接酶的作用对象均为DNA的磷酸二酯键（前者切割，后者连接），因此作用对象相同，C正确； D、除质粒外，动植物病毒（如腺病毒）、噬菌体（如λ噬菌体衍生物）也可作为基因工程的载体，D正确。 故选A。 20．(24-25高二下·广西河池·期末)如图依次表示了BamHI和Sau3AI两种限制的识别序列与切割位点，据图分析，下列有关叙述正确的是（　　） A．二者的识别序列都由4个核苷酸组成 B．二者切割DNA分子可产生相同的黏性末端 C．二者切割DNA分子产生的片段不能相连接 D．能被Sau3AI切割的DNA也一定能被BamHI切割 【答案】B 【分析】由图可知，两种限制酶的识别序列不同，但切割后形成的黏性末端相同，属于同尾酶。 【详解】A、据图可知，BamHI的识别序列“GGATCC”由6个核苷酸组成，Sau3AI的识别序列“GATC”由4个核苷酸组成，A错误； BC、二者切割DNA分子产生的黏性末端都是“GATC”，相同的黏性末端可以互补配对相互连接，B正确，C错误； D、能被Sau3AI切割的DNA并不一定也能被BamHI切割，例如“AGATCT”只能被Sau3AI识别并切割，BamHI对该片段无作用，D错误。 故选B。 21．(24-25高二下·河北邯郸复兴中学·期末)关于DNA是粗提取与鉴定的实验，依据的原理是（    ） A．DNA在NaCl溶液中的溶解度，随NaCl浓度的不同而不同 B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA C．DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于有机溶剂 D．在沸水中，DNA遇二甲苯会出现蓝色反应 【答案】AB 【详解】A、DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液．利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA，B正确； C、DNA是大分子有机物，不能溶于有机溶剂酒精，C错误； D、DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂，D错误。 22．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)现有一长度为3 000个碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制酶切割后进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1；用酶B单独酶切，结果如图2；用酶H和酶B同时酶切，结果如图3.下列相关叙述错误的是（　　） A．酶B和酶H有相同的识别并切割位点 B．酶H在该DNA分子上有2个识别并切割的位点 C．酶B和酶H同时切割时，有3个识别并切割的位点 D．酶B和酶H同时切割后，能够产生完全相同的DNA片段 【答案】ABD 【详解】A、线性DNA分子总长度为3000bp，用限制酶H单独酶切，可产生2000bp和1000bp的两个片段，说明酶H在这个DNA分子上只有1个识别并切割的位点，用酶B单独酶切，可产生2000bp、600bp和400bp的三个片段，说明酶B在这个DNA分子上有2个识别并切割的位点，酶B和酶H的识别并切割位点都是不同的，A错误； B、酶H在该DNA分子上有1个识别并切割的位点，B错误； C、酶B和酶H同时切割时，有3个识别并切割的位点，C正确； D、酶B和酶H同时切割后，产生三种长度，四种类型的DNA片段，D错误。 故选ABD。 23．(24-25高二下·河北衡水桃城区衡水第二中学·期末)下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，其中PAM序列是一个短DNA序列，单链向导RNA可引导Cas9内切酶到特定的基因位点进行切割。下列叙述错误的是（　　） A．Cas9内切酶能将脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开 B．细菌细胞中的限制酶也能起到类似Cas9内切酶的作用 C．Cas9内切酶定点切割与向导RNA和目标DNA结合无关 D．双链DNA的断裂修复过程需要DNA聚合酶的催化 【答案】CD 【详解】A、核酸内切酶Cas9的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，故Cas9内切酶断裂的是脱氧核苷酸链特定部位的磷酸二酯键，A正确； B、核酸内切酶Cas9的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，与细菌细胞内的限制酶的作用相似，B正确； C、向导RNA通过碱基互补配对与目标DNA的单链结合，从而使Cas9内切酶可以定点切割，因此Cas9内切酶定点切割与向导RNA和目标DNA结合有关，C错误； D、双链DNA的断裂修复过程需要DNA连接酶的催化形成磷酸二酯键，D错误。 故选CD。 24．(24-25高二下·江苏宿迁泗阳县·期末)关于“花菜DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．研磨前先用液氮冷冻处理花菜，有利于DNA的释放 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精这一原理来粗提DNA D．鉴定DNA时将丝状物或沉淀物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热出现蓝色 【答案】BD 【详解】A、加入适量液氮冷冻处理花菜，然后研磨，可以抑制酶的活性，避免DNA降解，使DNA提取更充分，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步粗提取DNA，C正确； D、DNA鉴定时，将提取到的丝状物溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，在水浴加热下呈现蓝色，D错误。 故选BD。 25．(24-25高二下·辽宁葫芦岛·期末)下列关于DNA的粗提取与鉴定实验，说法错误的是（　　） A．鸡血、猪肝等动物细胞可作为实验材料提取DNA，但方法可能有所不同 B．将洋葱研磨液过滤到烧杯中，需要在4℃冰箱放置几分钟，再弃上清液 C．利用DNA溶于酒精但某些蛋白质不溶于酒精的原理可以分离DNA和蛋白质 D．将粗提取的DNA（白色丝状物）溶解在2mol/L的NaCl溶液中用来进行鉴定 【答案】BC 【详解】A、鸡血细胞含有细胞核，适合提取DNA；猪肝细胞需更充分破碎，方法有所不同，A正确； B、洋葱研磨液过滤后应保留含DNA的上清液，B错误； C、DNA不溶于冷酒精，而某些蛋白质可溶，C错误； D、DNA在2mol/L NaCl中溶解度较高，溶解后可用二苯胺试剂鉴定，D正确。 故选BC。 26．(24-25高二下·黑龙江绥化肇东第四中学校·期末)用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的是（　　）    A．图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同 B．图1中X代表的碱基对数为5500 C．推测图1中Y是限制酶B的酶切位点 D．推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 【答案】AD 【分析】限制性核酸内切酶酶切，是一项基于DNA限制性核酸内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性核酸内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、限制酶具有特异性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，所以图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同，A正确；   B、从图2的A+B酶一组结果可知，限制酶A和B切完后总共有4个片段，长度分别为 500、1500、3500、4500。而X代表的碱基对数为4500， B错误；   C、图1表示酶A和B切割时只会得到3个片段，长度应该是3500、 X、2000，从图2的A+B酶一组结果可知，限制酶A和B切完后总共有4个片段，长度分别为 500、1500、3500、4500。所以可推测Y是限制酶A的酶切位点，C错误；   D、 根据以上结论，图1中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个长度的片段：3500、 （4500+1500）、500：正好与图2的①结果相符，故推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物，D正确。 故选AD。 27．(24-25高二下·内蒙古巴彦淖尔·期末)某目的基因的两端含有限制酶EcoRI识别和切割的位点，使用单酶切割容易产生目的基因与质粒反向连接现象。用于扩增、检测目的基因是否正确连接的相关引物1～引物5如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．EcoRI酶切可使目的基因两端产生不同的黏性末端 B．目的基因与质粒反向连接会改变mRNA合成的方向 C．扩增目的基因时，选用的引物是1、5或引物2、3 D．检测目的基因与质粒是否正确连接时，可选用引物2、4 【答案】ABC 【详解】A、经过相同的酶切割后，会产生相同的黏性末端，A错误； B、mRNA的合成方向是从5'3'端，所以无论时正向连接，还是反向连接，不会改变mRNA的合成方向，B错误； C、扩增目的基因时，是从子链的5'3'端，所以扩增目的基因时，选用的引物是2、3，C错误； D、依据DNA的复制方向及经过切割后所产生的末端进行连接时，可知，引物可选择2、4，D正确。 故选ABC。 28．(24-25高二下·河北石家庄·期末)某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含目的基因的DNA片段，用限制酶进行酶切后，再用所得片段进行基因工程后续操作。下列叙述正确的是（　　） A．若将Spe I和Nhe I切出的末端连接形成片段，则该片段不能再被二者识别并切割 B．PCR中一个引物的序列为 5’ - TGCGCAGT -  3’，第3轮循环需消耗4个该引物 C．步骤①所用的酶是Nhe I和Cfo I，酶切后共产生2个游离的磷酸基团 D．酶切片段和载体连接时，仅可使用E.coli DNA连接酶催化磷酸二酯键合成 【答案】AB 【分析】每种限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。限制酶切割的结果形成黏性末端或平末端。DNA连接酶分为E.coli DNA连接酶、T4DNA连接酶，二者都是将双连DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的 DNA片段。而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对比较低。 【详解】A、Spel和Nhel切割产生的黏性末端相同，因此能够被DNA连接酶相连，但连接后的片段两者都不能被Spel和Nhel识别，因此都不能被Soel和Nhel再切割，A正确； B、PCR 技术大量扩增目的基因时，第n次复制形成2n个DNA，相当于新合成2n-1个DNA分子，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n-1×2=2n，故PCR中一个引物的序列为5’ - TGCGCAGT - 3’，第3轮循环需消耗4个该引物，B正确； C、经一种限制酶酶切DNA后，会产生2个游离的磷酸基团，而步骤①所用的酶是Nhe I和Cfo I，每种限制酶识别不同的特定核苷酸序列，故经这两种酶酶切后共产生4个游离的磷酸基团，C错误； D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D错误。 故选AB。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 1．(24-25高二下·河南天一大联考·期末)乙肝疫苗是通过基因工程将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的基因导入酵母菌中表达，再利用发酵工程大规模生产获得的。已知HBsAg不能被酵母菌分泌到细胞外。下列相关叙述错误的是（　　） A．为了提高转基因的成功率，可以通过PCR技术扩增基因 B．可以利用抗HBsAg抗体在分子水平上检测基因的表达产物 C．可利用酵母菌大量生产乙肝疫苗，在发酵之前需要对菌种进行扩大培养 D．发酵结束后从培养液中提取HBsAg，并对提取的HBsAg进行纯化、灭活 【答案】D 【详解】A、PCR技术可在体外大量扩增目的基因（HBsAg基因），从而增加导入的成功率，A正确； B、HBsAg基因的表达产物是蛋白质，利用抗原-抗体特异性结合的原理，可用抗HBsAg抗体进行检测，B正确； C、发酵工程中需先对菌种进行扩大培养以增加菌体数量，再转入发酵罐进行大规模生产，C正确； D、题干明确HBsAg不能被酵母菌分泌到细胞外，说明其存在于细胞内，需通过破碎细胞提取，而非直接从培养液中获取，D错误。 故选D。 2．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析错误的是（　　）    A．泳道2与泳道1相比较，条带2变窄 B．出现条带1是因为O2蛋白与指示探针结合 C．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同 D．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合 【答案】C 【详解】A、泳道1应为 “仅指示探针”（未加 O₂蛋白和待测物），条带2代表游离的指示探针；泳道2可能为 “指示探针+O₂蛋白”（未加待测物），O₂蛋白会与指示探针结合，导致游离探针减少，条带2变窄，A正确； B、指示探针是带荧光的片段P，若O₂蛋白与其结合，会形成 “O₂蛋白-探针复合物”，电泳时迁移速率与游离探针不同，可能表现为条带1（复合物条带），B正确； C、若M2和M3与O₂蛋白结合强度相同，两组中游离指示探针的量应一致（条带2宽度相同）。但根据实验设计，突变体的结合位点不同，结合能力可能存在差异，条带2的变化不同，因此无法推断二者结合强度相同，C错误； D、若M1与O₂蛋白的结合能力接近野生型片段P，则加入M1后，O₂蛋白主要与M1结合，对指示探针的结合影响小，条带2宽度与“仅加O₂蛋白” 组接近，说明M1的突变位点不影响结合，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)将一段编码序列（CDS）插入到一个载体上，将该载体命名为pVN2024。如图A所示，将CDS插入到载体的SacⅡ位点，该位点位于lacZ基因的MCS区（含多个酶切位点），CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstI的酶切位点。为确认CDS的大小和插入方向，科研人员用不同的限制酶切割重组质粒并进行电泳，结果如图B。下列叙述正确的是（    ） （A图为载体示意图，方框内表示载体中限制酶识别位点）；（B图为不同限制酶切割产物的电泳示意图，M为标准电泳条带） A．SpeI酶切可用于判断CDS插入的方向 B．CDS插入时方向与lacZ基因的方向相同 C．CDS长度为2.6kb，在距一端0.5kb处有一个EcoRI识别位点 D．若重组质粒同时用EcoRI和SpeI酶切，电泳能检测到5个不同条带 【答案】C 【分析】基因工程的应用：①植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。②动物基因工程：提高动物生长速度；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物，如乳腺生物反应器和膀胱生物反应器。③基因治疗是把正常基因导入病人的体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗的目的，这是治疗遗传病最有效的手段。 【详解】A、由题意可知，CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstⅠ的酶切位点，而SpeⅠ酶切后产生的两个片段为4.3kb和1.3kb，由此只能推出CDS上有1个SpeⅠ酶切位点，且位于CDS的中间位置，但不能判断CDS插入的方向，A错误； B、CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstⅠ的酶切位点，分析图B可知，SpeI酶切割后产生了0.8kb的片段，分析图A可知，PstI的酶切位点位于CDS终止子的位置，则与lacZ基因的方向相比，CDS插入时方向相反，B错误； C、线性空载体为3.0kb，MCS上有两个EcoRI位点，EcoRI酶切后产生3.0kb、2.1kb、0.5kb共3个片段，说明CDS长度为2.6kb，在距一端0.5kb处有一个EcoRI识别位点，C正确； D、由图B可知，重组质粒上有3个EcoRI位点，1个SpeⅠ位点，该重组质粒为一个环状质粒，若重组质粒同时用EcoRⅠ和SpeⅠ酶切，电泳能检测到4个不同条带，D错误。 故选C。 4．(24-25高二下·陕西渭南临渭区·期末)聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，通过模拟生物体内DNA的自然复制过程，在体外特异性地去复制特定的DNA片段，它的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。下列说法正确的是（    ） A．利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶 B．PCR的每次循环包括复性、变性、延伸3个阶段 C．PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度控制PCR进程 D．复性时引物之间通过碱基互补配对结合 【答案】C 【详解】A、PCR技术中需要耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶），但不需要DNA连接酶，A错误； B、PCR每次循环的正确顺序为变性（高温使DNA双链分离）→复性（低温使引物与模板结合）→延伸（中温合成新链），B错误； C、PCR通过调节温度控制反应进程：高温变性（约95℃）、低温复性（约55℃）、适温延伸（约72℃），其核心是DNA的热变性原理，C正确； D、复性时引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合，而非引物之间配对。若引物之间结合会导致扩增失败，D错误。 故选C。 5．(24-25高二下·山东东营·期末)研究发现，果聚蔗糖酶（LSase）第404位氨基酸与其热稳定性密切相关。为提升LSase的热稳定性，科研人员以野生型LSase基因为模板，设计引物改变LSase第404位氨基酸对应的碱基序列，实现对氨基酸的定点替换，相关流程如图所示。已知大肠杆菌含有20种合成蛋白质的氨基酸，F和R代表突变引物，DpnI能特异性的水解甲基化的DNA。下列说法错误的是（　　） A．若要选出热稳定性最强的LSase，至少需要设计19对突变引物 B．推测混合处理是让质粒发生变性与复性，新合成的子链未甲基化 C．对突变质粒进行进一步扩增时，可继续使用突变引物F和R D．采用琼脂糖凝胶电泳技术不能区分出原始质粒与突变质粒 【答案】C 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的筛选和获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、已知大肠杆菌含有20种合成蛋白质的氨基酸，若要对LSase的第404位氨基酸进行替换，由于密码子的简并性，一种氨基酸可能由多种密码子编码，但为了确保能替换成所有可能的氨基酸，至少需要设计19种图示突变引物（因为要替换掉原来的氨基酸，所以是20 -1=19种），A正确； B、由图可知，混合处理后，新合成的子链与模板链分离，新合成的子链与子链组合成突变质粒，原来的模板链组合成原始质粒，故推测该过程是为了让质粒变性和复性，DpnI能特异性的水解甲基化的DNA，去除原始质粒，故推测新合成的子链未甲基化，B正确； C、F和R突变引物存在互补序列，不能用F和R对突变质粒进行进一步扩增，C错误； D、原始质粒经过碱基的替换后形成突变质粒，二者的碱基数目相同，不能用琼脂糖凝胶电泳技术进行区分，D正确。 故选C。 6．(24-25高二下·山东德州·期末)利用生物技术培育新品种、制备生物产品时都需要进行筛选或检测。下列说法错误的是（　　） A．用发酵工程生产柠檬酸钠时，应采用过滤、沉淀等方法获得产品 B．用 96 孔板筛选杂交瘤细胞时，每个孔中尽量只接种一个细胞 C．培育乳腺生物反应器时，可用 PCR 检测目的基因是否转录出 mRNA D．用植物体细胞杂交培育作物新品种时，需对杂种细胞和杂种植株进行筛选 【答案】C 【详解】A、柠檬酸是微生物的次级代谢产物，发酵结束后需通过过滤、沉淀等方法分离菌体并获取产物，A正确； B、用96孔板进行克隆化培养时，需将菌液稀释到每个孔中只接种一个细胞，以确保获得单克隆抗体，B正确； C、PCR用于检测DNA，而检测mRNA需通过分子杂交等，直接使用PCR无法检测转录产物，C错误； D、植物体细胞杂交需筛选出融合的杂种细胞（如通过选择培养基），并在植株阶段筛选性状优良的个体，D正确。 故选C。 7．(24-25高二下·福建福州福清·期末)PCR可看作生物体外特殊的DNA复制过程。如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链延伸的基础。下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的DNA水解，为PCR提供原料 B．PCR扩增时反应体系需加入模板、RNA引物、含Mg²⁺的缓冲液等成分 C．③为变性，使用90-95℃的高温处理是为断开引物与模板间形成的氢键 D．⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间 【答案】D 【详解】A、①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的RNA单链水解，留下DNA单链为模板合成双链DNA，A错误； B、PCR扩增时需在试管内加入模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶以及含Mg²⁺的缓冲液等成分，B错误； C、③过程为变性，变性过程使用90~95℃的高温处理是为了让双链DNA的氢键断裂，获得单链DNA，C错误； D、⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间，D正确。 故选D。 8．(24-25高二下·天津滨海新区·期末)如图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄植物的过程示意图，下列叙述错误的是（    ） A．过程A需要限制酶和DNA连接酶的参与，可将重组质粒直接侵染植物细胞 B．过程B可用处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 C．抗病毒基因整合到番茄细胞的染色体DNA上需要借助T-DNA的转移 D．转基因抗病毒番茄植株是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 【答案】A 【详解】A、过程A构建重组质粒需限制酶和DNA连接酶，但重组质粒不能直接侵染植物细胞，需借助农杆菌等载体，A错误； B、Ca2+处理农杆菌可使其处于感受态，利于吸收周围DNA分子，B正确； C、农杆菌Ti质粒的T−DNA可将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上，C正确； D、通过抗病毒接种实验，观察番茄是否抗病，可鉴定培育是否成功，D正确。 故选A。 9．(24-25高二下·四川眉山·期末)细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，将苏云金杆菌的 Bt 基因经改造后插入 Ti 质粒的 T—DNA 中构建基因表达载体，过程如下图所示。再用农杆菌转化获得了较强抗虫能力的抗虫棉。下列相关叙述错误的是（    ） 注：F1-F3, R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；p35s为启动子；Kanr表示卡那霉素抗性基因；HygBr表示潮霉素B抗性基因。 A．用人工合成的1—1362基因序列替换天然序列利用了密码子的简并性 B．在筛选转化成功的细胞时，常用含有潮霉素B的培养基进行筛选 C．构建基因表达载体时插入两个p35s启动子能促进目的基因的表达 D．提取抗虫棉的基因组DNA利用PCR技术检测目的基因时应选择引物F1和R2 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、密码子的简并性是指一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码。用人工合成的1−1362基因序列替换天然序列，由于细菌和棉花对密码子偏好不同，通过替换基因序列改变密码子，但编码的氨基酸不变，这正是利用了密码子的简并性，A正确； B、由图可知，基因表达载体中含有潮霉素B抗性基因（HygBr），且其位置在T-DNA序列内，当将该基因表达载体导入棉花细胞后，成功转化的细胞会含有HygBr基因，能在含有潮霉素B的培养基上生长，而未转化的细胞则不能生长，所以在筛选转化成功的细胞时，常用含有潮霉素B的培养基进行筛选，B正确； C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。构建基因表达载体时插入两个p35s启动子，可以为目的基因的转录提供更多的起始位点，从而促进目的基因的表达，C正确； D、PCR扩增目的基因时，引物应在目的基因的两端，所以为检测棉花植株是否导入目的基因，应选用的引物是F3和R2，D错误。 故选D。 10．(24-25高二下·河北邢台·期末)为提高水稻的产量，科研人员将EcCAT、OsGLO1、EcgCL*TSR与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列相关说法错误的是（　　） A．EcCAT基因和OsGLO1基因以DNA的不同链为模板进行转录 B．不可利用卡那霉素筛选成功导入目的基因的水稻细胞 C．T-DNA插入水稻细胞质的DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 D．为防止基因污染，可将外源α-淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻 【答案】C 【详解】A、转录时RNA聚合酶和模板链的3'端结合，RNA链沿5'→3'端延伸，而图中OsGLO1基因和EcCAT基因的启动子方向是相反的，所以OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板，A正确； B、由图可知，卡那霉素抗性基因不在T-DNA片段中，而目的基因是整合到T-DNA上进入水稻细胞的，所以不可利用卡那霉素筛选成功导入目的基因的水稻细胞，B正确； C、T-DNA是农杆菌Ti质粒上的片段，农杆菌转化法中，T-DNA整合到水稻细胞核DNA中，不是细胞质DNA，C错误； D、将外源α-淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻，通过产生α-淀粉酶分解淀粉使花粉失去活性，导致花粉不育，防止基因污染（花粉传播外源基因 ），D正确。 故选C。 11．(24-25高二下·四川达州普通高中·期末)天然β-淀粉酶耐热性较差，难以满足工业化生产需求。通过PCR对天然β-淀粉酶基因进行改造，将其导入大肠杆菌表达后，获得了一种耐高温的β-淀粉酶。与天然酶相比，改造后的酶在第476位发生了氨基酸替换，由天冬氨酸改变为天冬酰胺。下列叙述正确的是（    ） A．PCR技术在此过程中实现了对β-淀粉酶基因的定点突变 B．根据新的氨基酸序列可逆推出唯一对应的基因编码序列 C．对β-淀粉酶的改造实质是改变氨基酸的结构来改造功能 D．这种设计并合成耐高温的β-淀粉酶的技术属于基因工程 【答案】A 【详解】A、PCR技术通过设计特定引物可在扩增过程中引入定点突变，实现对β-淀粉酶基因的改造，A正确； B、由于遗传密码的简并性（多个密码子编码同一氨基酸），无法从氨基酸序列逆推出唯一的基因编码序列，B错误； C、对酶的改造实质是通过基因修饰改变氨基酸序列，进而影响蛋白质结构及功能，而非直接改变氨基酸结构，C错误； D、设计并合成耐高温酶属于蛋白质工程（以基因工程为基础），而非单纯基因工程，D错误。 故选A。 12．(24-25高二下·四川南充·期末)病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IF来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．将hCD46基因接入质粒应选用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ B．将重组质粒变为线性DNA应选用限制酶AgeⅠ和NotⅠ C．为获取大量胚胎用于移植，可用促性腺激素处理小鼠a，使其超数排卵 D．构建出的既表达hCD46又敲除IF基因的小鼠对麻疹病毒具有高易感性 【答案】B 【详解】A、结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI，A正确； B、为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段，B错误； C、为获取大量胚胎用于移植，可用促性腺激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备，C正确； D、构建的既表达hCD46受体又敲除IF基因的小鼠，能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，D正确。 故选B。 13．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)质粒P有2个EcoRI、1个SacI、1个BamH三种限制酶的酶切位点。BamH酶切位点位于两个EcoRI酶切位点正中间，以下是不同酶切产物的电泳图谱：泳道①是未酶切的质粒P电泳条带。②到④分别为三种酶单酶切质粒P产物的电泳条带，⑤到⑦为双酶切质粒P产物的条带。以下说法正确的是（    ） A．电泳时片段移动方向是从正极到负极 B．图中②、③分别是SacI和EcoRI的酶切产物 C．泳道⑦为SacI和EcoRI酶切产物 D．泳道①②表明酶切后质粒P碱基数增大 【答案】C 【详解】A、电泳时，DNA片段带有负电荷，在电场中会从负极向正极移动，A错误; B、质粒P有2个EcoRI、1个SacI、1个BamH酶切位点。EcoRI有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，片段较小；SacI有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。观察电泳图谱，②和③都是一个条带，且片段大小相同，因此图中②可以是是SacI的酶切产物，但③不是EcoRI酶切产物，B错误; C、EcoRI有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段；SacI有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。SacI和EcoRI双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑦有3个条带，可推测泳道⑦为SacI和EcoRI酶切产物，C正确; D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。    故选C。 14．(24-25高二下·江西上进联考·期末)研究人员利用基因工程技术制备乳腺生物反应器生产某种药用蛋白，已知该药用蛋白基因的mRNA序列为5'-UUACUUCCUG··CAAGUUUCAU-3',经逆转录得到cDNA,在其两端添加限制酶识别序列后利用PCR技术扩增，将扩增后的DNA与启动子A等元件重组构建基因表达载体，如下图所示。下列叙述正确的是（    ） A．含该药用蛋白基因的启动子，构建基因表达载体前需将其去除 B．由于启动子A具有组织特异性，该药用蛋白基因只在乳腺细胞中表达 C．PCR扩增时两种引物分别是5'-GAATTCTTACTT-3'和5'-CTGCAGATGAAA-3' D．构建的基因表达载体还需通过显微注射的方法导入雌性动物的乳腺细胞中 【答案】BC 【详解】A、启动子是DNA上RNA聚合酶识别和结合的位点，mRNA中不含启动子（启动子不被转录），药用蛋白基因的mRNA经逆转录得到的cDNA仅包含编码区序列，无需去除启动子，A错误； B、乳腺生物反应器中使用的启动子A通常是乳腺特异性启动子，其特点是仅在乳腺细胞中启动下游基因的转录，使药用蛋白基因特异性在乳腺细胞中表达，B正确； C、已知mRNA的序列为5'-UUACUUCCUG··CAAGUUUCAU-3'，逆转录得到cDNA序列为5'-ATGAAACTTTG……CAGGAAGTAA-3'，由此可知与cDNA互补的另一条链的序列为5'-TTACTTCCTG··CAAGTTTCAT-3'，利用PCR技术对cDNA进行扩增，PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，且转录的方向为启动子到终止子（DNA模板链的3'→5'），并结合题意可知，要在引物5'端加上限制酶EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列，因此两种引物分别是5'-GAATTCTTACTT-3'和5'-CTGCAGATGAAA-3'，C正确； D、构建的基因表达载体还需通过显微注射的方法导入受精卵（雌性）中，最后发育的转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产药用蛋白，D错误。 故选BC。 15．(24-25高二下·内蒙古呼和浩特和林格尔县民族中学·期末)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，临床上广泛用于治疗病毒感染性疾病。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶。下列有关叙述正确的是（　　） A．过程①依据的原理是DNA半保留复制，需要用到成对的引物 B．过程②构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间 C．过程③中Ti质粒的T-DNA能携带目的基因整合到根瘤农杆菌的染色体DNA中 D．过程④需要控制培养基中植物激素的种类和比例，以防愈伤组织细胞发生分化 【答案】ABD 【详解】A、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外对DNA进行大量复制的技术，因为DNA分子的两条链均要复制，故需要成对的引物，A正确； B、启动子负责与RNA聚合酶结合启动转录，终止子负责终止转录，因此构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行表达，B正确； C、根瘤农杆菌是原核生物，无染色体，C错误； D、该过程是要利用愈伤组织细胞生产干扰素，因此应控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化，D正确。 故选ABD。 16．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量。其原理是在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当子链延伸至探针处时，探针水解，使荧光监测系统接收到荧光信号，如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．引物中（G+C）含量越高，其与模板DNA结合的稳定性则越低 B．若引物1、2之间易发生碱基互补配对，则不能进行有效检测 C．实验后期荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等耗尽 D．若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入52个荧光探针 【答案】AD 【详解】A、碱基C和G之间可形成三个氢键，故引物中（G+C）含量越高，其与模板DNA结合的稳定性就越高，A错误； B、如果引物1和引物2互补或引物自身发生碱基互补配对，那这两个引物或引物自身就会结合到一起，无法再和模板结合，不能做到有效检测，所以必须避免两个引物之间互补以及引物自身发生碱基互补配对，B正确； C、当子链延伸至探针处时，探针水解，使荧光监测系统接收到荧光信号，实验后期荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等耗尽，C正确； D、若某次PCR反应共产生52个等长的DNA，说明至少扩增了6次，其余为不等长的DNA，根据扩增过程可知，DNA每扩增一次，就水解一个探针，则至少需加入26-1=63个荧光探针，D错误。 故选AD。 17．(24-25高二下·黑龙江大庆萨尔图区大庆实验中学·期末)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子（基因中的非编码序列）能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccI酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，AccI酶的识别位点为5'-GTATAC-3'，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列说法正确的是（　　） A．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸序列不同，数目相同 B．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3' C．若电泳结果只能观察到大约460bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 D．GT杂合型水稻品种经AccI酶切后电泳结果为3条条带 【答案】CD 【分析】用PCR扩增DNA片段的过程中，脱氧核苷酸只能加在引物3'端，子链延长方向是5'→3'，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氢核苷酸单链片段作引物。 【详解】A、Wx基因第226位碱基G突变为T，导致内含子无法正常剪接。内含子属于非编码序列，但其剪接异常可能导致mRNA序列改变，进而使翻译出的淀粉合成酶氨基酸序列和数目均可能不同，A错误； B、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，B错误； C、GG 型：Wx基因第226位为G，内含子正常剪接，PCR扩增片段中含AccI识别位点（5'-GTATAC-3'），经酶切后会产生两个片段；TT型：碱基突变为T，导致AccI识别位点消失，因此酶切后仍为完整的条带，故仅观察到460bp条带时，该水稻为TT型，C正确； D、若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，D正确。 故选CD。 18．(24-25高二下·江西金太阳·期末)我国科学家利用逆境诱导型启动子OsNAC6调控水稻锌指蛋白在高盐胁迫下的表达，实现了作物在干旱条件下的产量提升。下图为OsNAC6与锌指蛋白基因融合后形成的融合序列的结构示意图，其转录的模板链为a链。下列叙述错误的是（    ） A．高盐胁迫下，DNA聚合酶与OsNAC6结合，进而合成锌指蛋白 B．体外扩增融合序列时，应选用引物1和4 C．1个融合序列在体外扩增n次需要2n+1－2个引物 D．可以采用农杆菌转化法将含有融合序列的表达载体导入水稻细胞 【答案】AB 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】A、高盐胁迫下，RNA聚合酶与OsNAC6结合，启动转录，进而合成锌指蛋白，A错误； B、转录的模板链为a链，根据启动子OsNAC6方向可知，题图中a链左侧为3'端，右侧为5'端，因此体外扩增融合序列时，应选用引物2和3，B错误； C、1 个 DNA 分子体外扩增 n 次，得到 2n 个 DNA 分子，新合成的子链数为 2 n+1 −2 ，而合成每条子链都需要一个引物，所以需要 2 n+1 −2 个引物，C正确； D、将目的基因导入水稻细胞也可用农杆菌转化法，所以可以采用农杆菌转化法将含有融合序列的表达载体导入水稻细胞，D正确。 故选AB。 19．(24-25高二下·河北部分学校·期末)研究人员将从某种细菌中提取的耐盐基因a导入水稻细胞，获得了可在盐碱地种植的耐盐水稻新品种。下列关于该过程中相关操作的表述，正确的是（　　） A．原核生物可以为真核生物提供目的基因 B．构建基因表达载体时，可用识别不同序列但切出相同的黏性末端的限制酶酶切以防止反向连接 C．将含有a基因的表达载体导入水稻细胞需要借助标记基因进行筛选和鉴别 D．检测出水稻细胞中a基因成功表达后，还需要在个体水平上进行耐盐检测 【答案】ACD 【详解】A、题意显示，研究人员将从某种细菌中提取的耐盐基因a导入水稻细胞，获得了可在盐碱地种植的耐盐水稻新品种，细菌为原核生物，而水稻为真核生物，据此可推测，原核生物可以为真核生物提供目的基因，A正确； B、构建基因表达载体时，可用识别不同序列的限制酶切割目的基因和质粒，进而可以使目的基因的两端和质粒的两个切口均含有不同的黏性末端（但质粒的两个黏性末端需要和目的基因两端的黏性末端相同），这样可以防止反向连接，B错误； C、将含有a基因的表达载体导入水稻细胞需要借助标记基因进行筛选和鉴别，进而筛选出带有目的基因的受体细胞，C正确； D、检测出水稻细胞中a基因成功表达后，还需要在个体水平上进行耐盐检测，据此可以鉴定耐盐水稻是否培育成功，D正确。 故选ACD。 20．(24-25高二下·山东聊城·期末)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列说法错误的是（    ） A．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 B．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况 【答案】AC 【详解】A、这些基因在叶绿体外合成，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，A错误； B、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1基因和EcCAT基因的启动子启动转录的方向不同，因此OsGLOl、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板，B正确； C、卡那霉素不在T-DNA上，应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞，C错误； D、可用抗原-抗体杂交技术检测是否有相应的蛋白质产生，从而检测四种酶在转基因棉花中的表达情况，D正确。 故选AC。 21．(24-25高二下·广西桂林·期末)1973年，博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，这一实验标志着基因工程技术的诞生。下列相关叙述错误的是（　　） A．可利用显微注射法将重组质粒注入大肠杆菌体内 B．该实验证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞 C．该实验成功的基础之一是真核生物和原核生物共用一套密码子 D．利用PCR技术可检测非洲爪蟾核糖体蛋白基因是否转录出mRNA 【答案】AD 【详解】A、显微注射法通常用于将目的基因导入动物细胞（如受精卵），而大肠杆菌作为原核生物，常用Ca²⁺处理法使其处于感受态以吸收重组质粒。因此，A错误； B、该实验通过重组质粒在大肠杆菌中成功表达，直接证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，B正确； C、真核生物与原核生物共用一套遗传密码，这是非洲爪蟾基因能在大肠杆菌中表达的基础，C正确； D、PCR技术用于扩增特定DNA片段，而检测mRNA需通过逆转录为cDNA后再进行PCR（RT-PCR），直接使用PCR无法检测RNA，D错误。 故选AD。 22．(24-25高二下·新疆阿克苏第一中学·期末)反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程如图所示。 回答下列问题： (1)将Ⅰ过程得到的菌液接种到充满N₂的密闭试管中进行Ⅱ过程，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基上获得单菌落。与Ⅰ相比，Ⅱ所用培养基中还需要添加的物质是_______。培养瘤胃微生物时，除考虑营养物质外，还要考虑______、_______和渗透压等条件。 (2)分离出某真菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左向右，启动子通常具有物种特异性，为使大肠杆菌产生该酶，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择_的启动子，以图中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 ①W基因转录的模板链是________。利用PCR技术对W基因进行扩增时子链延伸的方向是________。 ②与质粒中启动子结合的酶是________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择________的启动子。 ③限制酶主要是从________中分离纯化出来的。应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 ④据下图分析，利用PCR技术获取W基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的_______，需扩增________次后得到W目的基因。 【答案】(1) 琼脂 温度 pH (2) 乙链 5'→3' RNA聚合酶 大肠杆菌 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ 乙、丙 3 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）将I得到的菌液接种到充满N2的密闭试管II中，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基上获得单菌落。与I相比，II所用培养基为固体培养基，需要添加的物质是琼脂。微生物的培养条件有适宜的营养物质(碳源、氮源、无机盐等)、温度、pH、渗透压(控制培养液的浓度)等，因此培养瘤胃微生物时，除考虑营养物质外，还要考虑温度、pH和渗透压等条件。 （2）①W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链；利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，子链延伸方向为5'→3'； ②启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA聚合酶；根据题干信息“启动子通常具有物种特异性”，目标是使大肠杆菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择大肠杆菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择大肠杆菌启动子； ③限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的；根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“放线菌质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒； ④DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸。根据图中W基因的位置和方向，应选择乙、丙作为引物；第一次循环扩增出来的新片段很长，第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因。 23．(24-25高二下·湖北黄冈中学·期末)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是__________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的指数级扩增。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落_______（填序号），出现菌落④的可能原因是________________________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路（不需写实验结果）____________________________。 【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌 (2) ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3)设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行；在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌；在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小） 【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 【详解】（1）从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，常用的接种方法是稀释涂布平板法。因此，将采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，获得研磨液后，采用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基上。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。 （2） PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。产生的原因是发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中。 （3）本实验的目的是验证该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长， 因此实验设计的单一变量为是否有竞争铁离子的环境，因变量为两种菌体的生长情况，为此设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 24．(24-25高二下·浙江宁波·期末)粮食安全是“国之大者”，大豆是重要的农产品，改良大豆种子尤为重要。科研人员为研究大豆P34蛋白基因启动子（简称P启动子）的调控活性，将P启动子与GUS基因（一种报告基因，用于指示外源基因的表达情况；b链为转录模板链）融合，如图所示。通过农杆菌转化法导入烟草进行研究，旨在为大豆品质改良提供有力工具。 注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同 回答下列问题： (1)获得P启动子。据图分析，以大豆基因组DNA为模板，选取______（填数字）作引物进行PCR，可获得P启动子克隆。 (2)构建P-GUS基因表达载体。为了确保P启动子与GUS基因融合，且P-GUS基因能与Ti质粒高效连接，则需要在克隆P启动子的两种引物的______（5'或3'）端分别连接________两种限制酶识别序列，并用______两种限制酶对Ti质粒进行酶切。 (3)将P-GUS基因表达载体导入受体细胞和植物组织培养。先用______处理农杆菌，使细胞处于感受态，再将表达载体导入农杆菌，将其接种在含______的固体培养基中进行培养，筛选转化成功的农杆菌。再用农杆菌侵染经______的烟草叶片，置于MS培养基中，暗环境下培养3天，_______处理后，转移至分化培养基中，待根系发达后移栽至土中。 (4)P-GUS基因的检测和鉴定。可通过______技术确定P-GUS基因是否导入。为检验最终的实验目的是否达到，还应检测______（“P启动子”或“GUS基因”）在烟草各组织中的表达量。 【答案】(1)2和3 (2) 5’ BamHI、EcoRI BamHI、HindⅢ (3) Ca2+/CaCl2 卡那霉素 消毒 脱菌 (4) PCR/DNA分子杂交（答出1点即可） GUS基因 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）为获得P启动子，以大豆基因组DNA为模板，选取引物2、3进行PCR。 （2）由于耐高温的DNA聚合酶是从引物的3’端连接脱氧核苷酸，因此需要在引物的5’端加上限制酶的识别序列，为确保P启动子与GUS基因融合，引物的5’端需要连接BamHI、EcoRI。为P-GUS基因能与Ti质粒高效连接，利用BamHI、HindⅢ两种限制酶对Ti质粒进行酶切。 （3）将P-GUS基因表达载体导入受体细胞和植物组织培养。先用Ca2+/CaCl2处理农杆菌，使细胞处于感受态，再将表达载体导入农杆菌，将其接种在含卡那霉素的固体培养基中进行培养，筛选转化成功的农杆菌。再用农杆菌侵染经消毒的烟草叶片，置于MS培养基中，暗环境下培养3天，脱菌处理后，转移至分化培养基中，待根系发达后移栽至土中。 （4）通过PCR技术确定P-GUS基因是否导入，为检验最终的实验目的是否达到，还应检测GUS基因在烟草各组织中的表达量。 25．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)为构建效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1中的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录出来的短链RNA与目的基因发生碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，能敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 (1)大肠杆菌的LacZ基因表达产物能使X-gal分解产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因。大肠杆菌在含_______的培养基上（添加了X-gal）培养，出现_______色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 (2)Cas9的表达量与敲除效率有关，但表达过量会对大肠杆菌产生毒性。为评估毒性和敲除效率，分别用ABCDE启动子对Cas9进行转录，结果如图2。其结果表明，启动子_____对细胞毒性最小。综合考量敲除效率和毒性，应选择启动子______作用于该系统。 (3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在LacZ基因被成功敲除的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为_____（填选项）。 A．含有质粒1和质粒2  B．只有质粒1 C．只有质粒2         D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板中筛选出质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，请简要写出实验设计思路并预测实验结果。________。 【答案】(1) 四环素和卡那霉素 白 (2) C A (3) B 平板中以蔗糖为唯一碳源无抗生素，且置于37℃环境中培养，生长出来的菌落即为质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因，其转录出来的短链RNA与目的基因（LacZ基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal分解产生蓝色物质，将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 （2）Cas9的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C对应的菌落数最高，因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A的菌落数和敲除率均较高，因此综合考虑，应选择启动子A作用于该系统。 （3）①质粒2为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1，B正确，ACD错误。 故选B。 ②试管2加入蔗糖，质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的生长繁殖，因此试管2含质粒2的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，实验设计思路和预测实验结果为：在以蔗糖为唯一碳源且无抗生素的平板，在37℃环境中培养，能生长出来的菌落即为质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌。 26．(24-25高二下·吉林松原宁江区吉林油田高级中学·期末)大刍草是玉米的原始祖先，具有较强的抗病抗逆特性，为玉米育种提供了原始的遗传材料。研究发现大刍草基因组中有一个D基因仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究D基因表达对卵细胞的影响，科研工作者设计了如图实验。据图回答： (1)D基因在大刍草卵细胞中不转录，可能卵细胞中D基因的________（结构）出现问题，无法启动转录过程。 (2)按如图所示，将重组的基因表达载体导入农杆菌前，先用________处理农杆菌细胞，使其处于一种________的生理状态。 (3)让农杆菌侵染大刍草愈伤组织，在愈伤组织培养基中需添加________和________，以便筛选导入融合基因的植物细胞。 (4)为确定大刍草基因组中B基因与育性相关，研究者用转基因技术进行一系列实验，将一段T-DNA插入到B基因中，致使该基因失活，记为b，再进行杂交。为方便确定实验中的子代植株的基因型，研究者据B基因、T-DNA的序列设计了3种引物，如图所示： 具体操作时，提取待测植株的总DNA，分别用“引物I+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否能扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR扩增）。推测结果：如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则植株的基因型为________；如果_______，则植株的基因型为BB；如果___________，则植株的基因型为bb。 【答案】(1)启动子 (2) Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子 (3) 潮霉素 荧光素 (4) Bb 仅引物“Ⅱ+Ⅲ”组能完成扩增 仅引物“Ⅰ+Ⅲ”组能完成扩增 【分析】分析：分析题图：①表示将基因表达载体导入农杆菌细胞；②表示利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。 【详解】（1） 转录是指以DNA 的一条链为模板合成RNA的过程，启动转录需要启动子发挥作用。D基因在大刍草卵细胞中不转录，从基因结构角度来看，很可能是卵细胞中D基因的启动子出现问题，导致无法启动转录过程。 （2）将重组的基因表达载体导入农杆菌前，通常先用Ca2+（或(CaCl2) 处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，这种状态被称为感受态。 （3）T-DNA中含有潮霉素抗性基因和LUC基因，则利用农杆菌侵染大刍草愈伤组织时，可在含有潮霉素和荧光素的培养基中进行筛选，能抗潮霉素且在培养基中能发出荧光的则为导入了融合基因的受体细胞。 （4）当植株基因型为Bb时，因为含有B基因和插入T-DNA 后的b基因。用 “引物 I+Ⅲ”组合进行PCR，引物I能与T- DNA结合，引物 Ⅲ 能与B基因部分结合，可完成扩增；用“Ⅱ+Ⅲ” 组合进行PCR，引物Ⅱ能与B基因结合，引物Ⅲ能与B基因部分结合，也可完成扩增。所以如果引物“I+Ⅲ” 组及 “Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则植株的基因型为Bb。当植株基因型为BB时，不含T-DNA，仅用“Ⅱ+Ⅲ” 组合能进行PCR扩增。当植株基因型为bb时，只有插入T-DNA 后的b基因。用 “引物I+Ⅲ”组合进行PCR，引物I 能与T-DNA 结合，引物Ⅲ能与b基因中与 B 基因同源的部分结合，可完成扩增；引物I和引物Ⅱ方向不对，不能用于扩增，引物I和引物Ⅲ由于DNA分子太大，不能完成扩增，所以如果仅引物“Ⅰ+Ⅲ” 组进能行PCR能完成扩增，则植株的基因型为bb。 27．(24-25高二下·甘肃定西临洮县·期末)我国科研团队从水稻中筛选出能调控耐高温性状的关键基因QT12，并将QT12基因导入水稻品种“华占”，获得的改良品种在高温下产量与品质均提升。回答下列问题： (1)科研团队利用PCR扩增QT12基因，引物是扩增过程的关键。根据QT12基因设计的四种引物如图所示，选用的引物组合应为________（选填“a”“b”“c”或“d”），理由是________。 (2)构建基因表达载体时，需要将QT12基因与启动子、终止子等连接，其中启动子的作用是________。若以质粒DNA分子为运载体，质粒上有标记的潮霉素抗性基因，则利用抗生素可初步筛选出含重组载体的水稻细胞，方法是________。 (3)将含QT12基因的表达载体导入水稻细胞后，需要通过________技术将单个细胞培育成完整植株。现要验证水稻的改良品种在高温下表现出更高的产量，请简要叙述实验思路和预期结果：________。 【答案】(1) b、c PCR扩增时，引物会结合在模板链的3'端并从自身的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) 作为RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因转录 将导入目的基因的水稻细胞接 种在含有潮霉素的培养基上，能生长的细胞即为含重组载体的细胞 (3) 植物组织培养 将转入QT12基因的“华占”水稻（实验组）和普通“华占”水稻（对照组）分别种植在高温条件下，其他培养条件保持一致且适宜，成熟后统计并比较两组水稻的产量；预期结果：实验组水稻的产量显著高于对照组。 【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）PCR扩增需要引物与模板链的3'端互补配对，且两个引物需分别结合在目的基因（QT12）的两条链上、方向相反，b引物可与QT12基因上游链的3'端配对，c引物可与下游链的3'端配对，能实现目的基因的特异性扩增；而a、d引物的结合方向/位置无法满足PCR扩增的要求。故选用的引物组合应为b、c。 （2）启动子的作用是：作为RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动目的基因（QT12）的转录； 利用抗生素初步筛选含重组载体的水稻细胞的方法是：将水稻细胞接种在含潮霉素的选择培养基上培养，能存活的细胞即为含有重组载体（含潮霉素抗性基因）的细胞。   （3）植物细胞具有全能性，可通过脱分化、再分化将单个细胞培育成完整植株。将含QT12基因的表达载体导入水稻细胞后，需要通过植物组织培养技术将单个细胞培育成完整植株。要验证水稻的改良品种在高温下表现出更高的产量，实验思路：将转入QT12基因的“华占”水稻（实验组）和普通水稻（对照组）分别种植在高温条件下，其他培养条件保持一致且适宜，成熟后统计并比较两组水稻的产量；预期结果：实验组水稻的产量显著高于对照组。 28．(24-25高二下·黑龙江佳木斯桦南县第一中学·期末)人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X-gal，从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列问题：    (1)过程①最好选用的限制酶方案是_______。 A．EcoRV和EcoRI B．BamHI和EcoRI C．HcoRV和BamHI D．只有BamHI (2)图中①过程叫做_______，②过程常采用的方法是_____，由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是_______。在注射型接种之前，需采用________方法对乙肝病毒外壳蛋白进行检测与鉴定。 (3)可用PCR技术迅速获取大量目的基因，在PCR反应缓冲液中一般要添加_______，以便激活DNA聚合酶的活性。目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是。扩增完成后，常采用_____的方法来鉴定PCR的产物。 (4)为了筛选，获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入_______，培养一段时间挑选出呈________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量的目的菌。在用稀释涂布平板法对目的菌进行计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为_______。 【答案】(1)B (2) 基因表达载体的构建 用Ca2+处理 指导合成乙肝病毒外壳蛋白 抗原-抗体杂交 (3) Mg2+ TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活琼脂糖凝胶电泳 (4) 青霉素和X-gal 白色 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）过程①是基因表达载体的构建，此过程中需要使用限制酶切割目的基因和质粒，选用的限制酶应该能够同时切割目的基因和质粒，并且不会破坏目的基因和质粒的重要结构，结合示意图，选择的限制酶是BamHI和EcoRI。 故选B。 （2）图中①过程是将目的基因与质粒连接形成重组质粒，这个过程叫做基因表达载体的构建。将重组质粒导入大肠杆菌（微生物细胞）常采用感受态细胞法，即先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态细胞，易于吸收重组质粒。由图中过程③可知，目的基因最终指导合成了乙肝病毒外壳，所以该目的基因的具体功能是指导合成乙肝病毒外壳蛋白。对乙肝病毒外壳蛋白进行检测与鉴定常采用抗原 - 抗体杂交的方法，因为蛋白质具有抗原性，能与相应抗体特异性结合。 （3）在 PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+，Mg2+可以激活 DNA 聚合酶的活性，使其更好地发挥催化作用。PCR 技术需要在高温条件下进行变性、复性和延伸等过程。TaqDNA 聚合酶是耐高温的 DNA 聚合酶，而大肠杆菌 DNA 聚合酶在高温下会失活，所以目前在 PCR 反应中使用 TaqDNA 聚合酶而不使用大肠杆菌 DNA 聚合酶。扩增完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定 PCR 的产物，不同大小的 DNA 片段在电泳中的迁移速率不同，从而可以对 PCR 产物进行鉴定。 （4）基因表达载体的标记基因作用是鉴定筛选含有目的基因的重组质粒，为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中还应额外加入青霉素，选用质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。由于lacZ基因被坏，因此培养一段时间挑选出呈白色的菌落进一步培养获得大量的目的菌。在用稀释涂布平板法对目的菌进行计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。 29．(24-25高二下·黑龙江大庆让胡路区大庆中学·期末)低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题： 限制酶 识别序列 限制酶 识别序列 EcoR I 5'G↓AATTC3' Xma I 5'C↓CCGGG3' BamH I 5'G↓GATCC3' Asc I 5'G↓GCGCGGG3' Sph I 5'CGTAC↓G3 Mun I 5'C↓AATTG3 Sau3A 5'↓GATC3 (1)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物________对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的5'端添加________（“Sph I”或“Sau3A”或“Mun I”）识别序列。 (2)根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶_________切割Ti质粒，并通过_________酶进行连接，连接后导入农杆菌，在培养基中添加_______来筛选成功导入质粒的农杆菌。 (3)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是________。 A．引物特异性不佳 B．复性温度太高 C．变性温度不够 (4)现已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，利用________技术对其进行检测，结果表明转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变________，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 【答案】(1) ①④ Mun Ⅰ (2) EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ DNA连接 氨苄青霉素 (3)A (4) PCR 启动子 【分析】PCR反应过程：变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）PCR扩增是从模板链的3'→5'，结合图示可知，要扩增CBFs基因需要引物①④。为了保证目的基因成功转录，首先CBFs基因应插入质粒的启动子和终止子之间，其次目的基因的转录方向应与Ti质粒上的转录方向一致，可使用EcoR I和Sph I切割质粒（AmPr为氨苄青霉素抗性基因，在后期的筛选中需要使用，不能使用BamH I酶切，Sau3A也能识别并切割BamH I酶切位点），由于使用EcoR I会破坏目的基因结构的完整性，可使用Mun I切割目的基因，即上游引物的5′端添加Mun I识别序列，下游引物的5′端添加Sau3A识别序列。 （2）结合目的基因和质粒，CBFs基因应插入质粒的启动子和终止子之间，EcoR I会破坏目的基因结构的完整性，AmPr为氨苄青霉素抗性基因，在后期的筛选中需要使用，需要选择限制酶EcoR I和Sph I切割Ti质粒，并通过DNA连接酶进行连接，连接后导入农杆菌。成功导入重组Ti质粒的农杆菌含有氨苄青霉素抗性基因，因此在培养基中添加氨苄青霉素来筛选成功导入质粒的农杆菌。 （3）A、PCR结果中显示出小分子非目标条带，说明引物可以和非目的基因复制起始端互补配对，从而扩增出非目的基因，A正确； B、若复性温度太高，则可能导致引物不能与目的基因模板链结合，从而不能扩增目的基因，也无法扩增非目的基因，B错误； C、变性温度不够，氢键无法充分断裂，DNA（目的基因和非目的基因）无法解旋形成单链，不能完成PCR扩增，C错误。 故选A。 （4）检测转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA，可以利用核酸分子杂交技术，也可以结合逆转录的方法和PCR技术进行检测。RNA聚合酶识别和结合的是DNA上的启动子，为了有利于基因的表达，后续还应通过改变启动子，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 30．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)无核葡萄品质优良，但抗寒性差。我国科学家以中国野生葡萄资源中抗寒性最强的山葡萄为材料，对抗寒基因Va的功能展开相关研究。 (1)通过前期研究结果，科研人员推测Va基因的产物可能为转录因子。转录因子是一类特定的蛋白，可以调控______与启动子的结合。 (2)研究者预通过PCR扩增Va基因，可通过分析Va蛋白的氨基酸序列，依据这些氨基酸所对应的_____推测mRNA序列以确定DNA序列，进而设计特异性引物，并在引物的_______端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR，利用______凝胶电泳分离并纯化DNA片段。 (3)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是______。 A．DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Va基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因 (4)为进一步验证Va基因的转录激活功能，科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中（图1）。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①敲除GAL4的原因是_____。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统（图2）实现对GAL4的敲除，sgRNA（一种小RNA）有引导作用，使Cas9酶在配对区域定点切割，导致基因丧失功能，因此sgRNA序列必须以_______为设计依据。如果要获得基因敲除酵母AH109菌株，应用_____法导入CRISPR/Cas9基因表达载体。 ②为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的_____组，此外还需额外添加______，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ③研究人员运用GAL4基因和pCG质粒构建了pG-GAL4重组载体，并将其导入酵母菌作为对照组1，那么实验组的处理是导入______。另外，还需设置一个对照组2，即导入______，然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。 ④预测实验组和对照组1、2的菌落生成及颜色情况分别是：______、有菌落和蓝色和______。 【答案】(1)RNA聚合酶 (2) 密码子 5' 琼脂糖 (3)C (4) 避免酵母菌细胞中产生具有转录激活功能的蛋白 GAL4基因中的一段特异性序列 Ca2+处理 B X-α-gal pG-Va重组载体 PG载体 蓝色，有菌落 不会出现蓝色物质，也无菌落生长 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录。转录因子是一类特定的蛋白，可以调控RNA聚合酶与启动子的结合。 （2）研究者预通过PCR扩增Va基因，可通过分析Va蛋白的氨基酸序列，依据这些氨基酸所对应的密码子推测mRNA序列以确定DNA序列，进而设计特异性引物，并在引物的5'端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR，利用琼脂糖凝胶电泳分离并纯化DNA片段。 （3）A、若DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染，其他葡萄细胞基因组DNA中可能含有与目的基因不同的序列，在PCR扩增时可能会产生额外的条带，A正确； B、如果每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，那么在PCR扩增过程中，除了目的基因片段被扩增出来，还会有引物结合到另外的位点并进行扩增，从而出现额外的条带，B正确； C、在基因组中Va基因有2个拷贝，这2个拷贝的序列完全相同，那么在PCR扩增时，引物会特异性地结合到这2个拷贝上，扩增出的产物是相同的，只会出现一条阳性条带，不会出现另外一条额外的条带，C错误； D、在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因，在 PCR 扩增时，引物可能会非特异性地结合到这个高度相似的基因上，从而扩增出另外一条条带，D正确。 故选C。 （4）①GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，敲除GAL4的目的是避免酵母菌细胞中产生具有转录激活功能的蛋白。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现对GAL4的敲除，sgRNA序列必须以GAL4基因中的一段特异性序列为设计依据，这样该序列可以与GAL4基因中的特定序列结合，并在该部位实现切割，进而得到敲除GAL4基因的酵母菌。在基因工程中，若受体细胞是酵母菌，应用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 ②依据题干信息，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，重组的载体中含有编码色氨酸合成酶的基因和具有转录激活功能的Va基因，AH109菌株的基因中含有HIS3基因可以编码组氨酸合成酶，所以若重组成功，就可以合成色氨酸和组氨酸，为了能够筛选得到重组酵母，所用培养基配方中无需添加色氨酸和组氨酸，故选B。若用显色反应进行验证，依据题干信息，MEL1基因可以编码α-半乳糖苷酶，可分解X-α-gal产生蓝色物质，所以培养基中需额外添加X-α-gal。 ③研究人员运用GAL4基因和pG质粒构建了pG-GAL4重组载体，并将其导入酵母菌作为对照组1，那么实验组的处理是导入pG-Va重组载体。另外，还需设置一个对照组2，即只导入PG载体，然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。 ④对照组1导入pG-GAL4重组载体，其中含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。对照组2只导入PG载体，无菌落接种，且不含有MEL1基因，所以不会出现蓝色物质，也无菌落生长；实验组导入pG-Va重组载体，也含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。 31．(24-25高二下·陕西铜川王益区王益中学·期末)为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用基因工程将水稻的耐低磷基因OSPTF转移到大豆植株中，部分实验过程如图所示。回答下列问题： (1)在对目的基因进行切割时，应选择限制酶______，用于基因工程的质粒除了需要图中所示结构外，还需要有______，目的基因插入质粒的位置是______。 (2)将①导入大豆植株体细胞通常需要借助农杆菌，利用了农杆菌______的特点，荧光蛋白基因的作用是______。 (3)研究人员欲对转基因大豆在低磷条件下对磷元素吸收能力进行检测，实验思路为：______。 【答案】(1) BamHⅠ和HindⅢ 启动子、终止子、复制原点 启动子和终止子之间 (2) 能将Ti质粒上的T-DNA转移被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上 便于重组DNA分子的筛选 (3)将生理状态相似的多组野生大豆植株与多组转基因大豆植株分别置于低磷溶液中进行培养，其他条件相同且适宜，一段时间后检测两类植物培养液中磷元素含量 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：（1）目的基因的获取，获取方法包括：从基因文库中获取、PCR扩增技术和人工合成法。（2）基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，基因表达载体的组成包括：启动子、目的基因、终止子和标记基因。（3）将目的基因导入受体细胞，根据不同的对象采用不同的导入方法，对植物细胞可以采用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；对于动物采用显微注射技术；对于微生物一般采用Ca2+转化法。（4）目的基因的检测与鉴定，分子水平上的检测方法包括：DNA分子杂交法、分子杂交法和抗原-抗体杂交法；也可以进行个体水平上的鉴定，如抗性实验等。 【详解】（1）为了构建重组DNA分子，目的基因和质粒需要有相同的黏性末端，需要用相同的限制酶对目的基因所在的DNA和质粒进行酶切，若仅选择EcoRⅠ进行酶切，目的基因、质粒会发生环化，目的基因和质粒反向拼接，因此应选择两种限制酶进行酶切，若选择EcoRⅠ和HindⅢ或者BamHⅠ和EcoRⅠ，则会产生非目的基因片段，非目的基因片段也会和质粒结合，因此选择EcoRⅠ和HindⅢ。用于基因工程的质粒除了需要图中所示结构外，还需要有启动子、终止子、复制原点。为了保证目的基因的正常表达，目的基因插入质粒的位置是启动子和终止子之间。 （2）由于农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA转移被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上，因此将①导入大豆植株体细胞通常需要借助农杆菌。含有重组DNA分子的农杆菌含有荧光，不含重组DNA分子的农杆菌不发荧光，因此荧光蛋白基因的作用是便于重组DNA分子的筛选。 （3）实验目的是探究转基因大豆在低磷条件下对磷元素吸收能力，自变量是大豆植株种类（野生大豆植株与转基因大豆植株），检测指标是培养液中磷元素含量，因此实验思路是将生理状态相似的多组野生大豆植株与多组转基因大豆植株分别置于低磷溶液中进行培养，其他条件相同且适宜，一段时间后检测两类植物培养液中磷元素含量。 32．(24-25高二下·河南许昌·期末)黄瓜是我们常见的瓜果之一，是中国各地夏季主要菜蔬之一。在冬季利用温室大棚生产反季节黄瓜经济效益显著，但易受冻害而造成减产。科研人员利用转基因技术培育出了抗冻黄瓜，过程如图所示。回答下列问题。 (1)构建基因表达载体时若选择限制酶BamH I切割抗冻蛋白基因，则需要选择限制酶______切割质粒，但其缺点是______(答出2点即可)。为避免此情况的出现，需要选择限制酶______切割抗冻蛋白基因，同时选择限制酶______切割质粒。 (2)图中将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞的方法是______。该过程会发生2次DNA分子之间的拼接，分别是______。 (3)将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞后，需要进行______才能获得转基因黄瓜植株，该过程使用的培养基一般要添加蔗糖，其作用是______(答出2点即可)。 【答案】(1) Sau3AⅠ 易造成质粒和目的基因的自身环化以及反向连接 EcoRI和BamHⅠ Sau3AI和EcoRI (2) 农杆菌转化法 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上和插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞染色体DNA上 (3) 植物组织培养 提供碳源、能源、调节渗透压 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1） 由图示可知，限制酶BamHⅠ和Sau3A Ⅰ切割DNA后会产生相同的黏性末端，若选择单一限制酶BamH Ⅰ切割抗冻蛋白基因，则需要选择限制酶Sau3A Ⅰ切割质粒才能实现二者的连接。用单一限制酶切割质粒和目的基因片段，易造成质粒和目的基因的自身环化以及反向连接，而双酶切可以避免以上情况的发生。因抗冻蛋白基因内部有Sau3A Ⅰ切割位点，故使用限制酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割含有抗冻蛋白基因的DNA片段。限制酶BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割DNA后会产生相同的黏性末端，需要使用限制酶Sau3A Ⅰ和EcoR Ⅰ切割质粒， （2）图中将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞的方法是农杆菌转化法。利用该方法获得转基因黄瓜细胞过程中会发生2次DNA分子之间的拼接，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接是将插入了目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。 （3）将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞后，通过植物组织培养技术获得的转基因黄瓜植株，该过程的原理是植物细胞的全能性，该过程使用的培养基一般要添加蔗糖，蔗糖的作用是提供碳源、能源、调节渗透压，进而保证植物组织培养技术的正常进行。 33．(24-25高二下·吉林白城洮南第一中学·期末)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力，将人的干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以从家蚕细胞中提取干扰素用于制药。请回答下列问题： (1)在人的DNA分子上获取干扰素基因时，要用到限制酶。图1是该基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。EcoRV酶切出来的线性载体P1为__________末端，其位点切割的化学键是__________，该化学键是存在于__________。 A．G碱基与A碱基之间的键    B．G碱基与C碱基之间的键 C．A碱基与T碱基之间的键    D．两个核苷酸之间的键 (2)在此基因工程操作过程中的核心步骤是__________。启动子位于干扰素基因的__________，是__________识别和结合的部位。 (3)人的干扰素基因一般来自cDNA文库，cDNA克隆技术是通过__________将mRNA转化为互补DNA（cDNA），并将其重组至载体中进行复制筛选的技术。 (4)通过PCR技术可大量获取目的基因，PCR技术的原理是__________。用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。如图1载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为的__________脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。 【答案】(1) 平 磷酸二酯键 D (2) 构建基因表达载体 上游 RNA 聚合酶 (3)部分基因 (4) DNA分子半保留复制 胸腺嘧啶（T） DNA连接 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）由图可知，EcoRV酶切出来的线性载体P1为平末端，内切酶切割的化学键是磷酸二酯键，其是两个核苷酸之间的键，两个碱基之间通过氢键相连，ABC错误，D正确。 故选D。 （2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，启动子位于干扰素基因的上游，其与RNA聚合酶结合后，启动转录。 （3）cDNA文库包含了某种生物的部分基因，而基因文库包含了某种生物的全部基因，cDNA克隆技术是通过部分基因将mRNA转化为互补DNA（cDNA），并将其重组至载体中进行复制筛选的技术。 （4）PCR技术的原理是DNA分子半保留复制。用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸，如图1载体P1用酶处理，根据碱基互补配对原则可知，在两端各添加了一个碱基为的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，形成P2；常用DNA连接酶连接目的基因和质粒形成重组质粒。 34．(24-25高二下·山东青岛第六十七中学·期末)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。    (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为______。选用图甲中的Smal对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择_______对Ti质粒进行完全酶切，将其中产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是______。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_______进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_______bp，则一定为反向重组质粒。 人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。    (2)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是______。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要的酶分别是_______。 (3)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_______。 【答案】(1) 复制原点 SmaI、XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 200 (2) SalI EcoRI EcoRI、SalI、MunI、XhoI、DNA连接酶、DNA聚合酶 (3)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 【分析】用单一限制酶切目的基因和质粒，可能会造成自身环化或反向连接，故通常需要用两种限制酶对目的基因和质粒进行切割。 【详解】（1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点，是复制开始的地方。由于BamHⅠ切割会破坏终止子，故不能用其切割质粒。为了方便后续的检测，需要选择两种不同的限制酶切割质粒，用Smal对抗除草剂基因X进行完全酶切，可以选择SmaⅠ和XbaⅠ或SmaⅠ和PstⅠ进行切割，质粒上一侧为黏性末端，一侧为平末端，而目的基因的两侧均为平末端，故需要用DNA聚合酶将黏性末端补平。由于DNA聚合酶只能从缺口的3'端添加脱氧核苷酸，DNA聚合酶无法补平PstⅠ切割产生的黏性末端，故应该选择SmaⅠ和XbaⅠ切割质粒。构建重组质粒后，重组质粒上含有一个SmaⅠ识别位点和一个SpeⅠ识别位点，经切割后会产生一长一短两种片段，且有卡那霉素的抗性基因，经卡那霉素筛选后可以存活的大肠杆菌可能含重组质粒，可以选择重组质粒上有酶切位点的SmaI和SpeI对质粒进行切割，根据模板链可知，目的基因的转录方向应该是从左向右，若目的基因正向插入，则重组质粒中SmaⅠ识别位点位于目的基因的右侧，用SmaI和SpeI对质粒进行切割，较短的片段长度大概550bp；若目的基因反向插入，则重组质粒中SmaⅠ识别位点位于目的基因的左侧，用SmaI和SpeI对质粒进行切割，较短的片段长度大概200bp。 （2）由题目所给载体的序列可知：荧光蛋白基因中有EcoRⅠ切割位点，在不破坏荧光蛋白基因的前提下，只能选择MunⅠ、XhoⅠ切割载体，由于启动子中含有这两种酶的识别序列，故不能用这两种酶切割启动子，MunⅠ和EcoRI是同尾酶，XhoⅠ和SalI是同尾酶，故可以用EcoRI和SalI切割调控序列，由于荧光蛋白基因的转录方向为从右向左，故在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶SalI，在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRI。该实验中，需要用EcoRI和SalI切割调控序列，MunⅠ、XhoⅠ切割载体，需要用DNA连接酶构建基因表达载体，PCR扩增的过程中还需要耐高温的DNA聚合酶，共需要6种酶的参与，即EcoRI、SalI、MunI、XhoI、DNA连接酶、DNA聚合酶。 （3）含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明含F1～F6与R扩增产物的载体上有RNA聚合酶的结合位点，即含有完整的启动子，可以正常的表达；含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，说明荧光蛋白基因未表达，可能是由于F7与R扩增产物不含完整启动子，荧光基因不表达。 35．(24-25高二下·江苏东台·期末)抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽A基因及D基因进行融合形成AD基因（部分过程如图1所示），然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。 (1)AD基因复制和表达所需要的原料有______。 (2)PCR的基本过程包括：①变性→②→______③延伸。PCR过程中反应体系所处温度最高的是过程______（填序号）。A基因表达以a链为模板，D基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物______和引物_______的5'端添加互补序列。 (3)为了能使AD基因与图2所示pC穿梭质粒定向连接，需要在AD基因两端加上限制酶______和_______的识别序列，构建重组质粒后导入酵母细胞。用选择性培养基对受体菌进行培养、筛选，从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择性培养基应______。在酵母细胞中，重组质粒以______为起点进行复制。 (4)酸腐病是由白地霉引起的柑橘贮藏期常见的病害之一。为研究抗菌肽AD（以下简称抗菌肽）对白地霉的抑菌效果，现用无菌打孔器在果实相同部位打孔，每个打孔处接种相同体积的处理液，比较15天后的病斑直径。各组处理及结果见下表： 组别 1 2 3 接种处理方式 接种一定体积的病原菌孢子悬浮液 先接种病原菌孢子悬浮液，2h后再加入抗菌肽溶液 抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液混合，培养2h后接种 15天后病斑直径/mm 41.3 28.7 11.2 表中数据表明抗菌肽对白地霉_______（从“是”、“否”中选填）有抑菌效果，且抑菌效果最好的处理组别是______，处理效果最好的可能原因是______。 【答案】(1)脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 (2) 退火/复性 ① X Z (3) BamHI SalI 含氨苄青霉素、不含亮氨酸 O2 (4) 是 3 抗菌肽与病原菌孢子充分接触，能更有效发挥作用 【分析】1、基因工程中，目的基因可通过PCR获取，其流程为：温度超过90℃变性；温度降为50℃左右复性；温度升为72℃左右延伸。 2、虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源 （提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质。 【详解】（1）AD基因复制、转录、翻译所需要的原料分别是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸。 （2）PCR的基本过程包括：①变性→②退火→③延伸。PCR过程中反应体系所处温度最高的是过程①变性。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要在引物X和引物Z的5′端添加互补序列。这是因为X引物用于扩增A基因，而Z引物用于扩增D基因，并且这两个基因需要在PCR1过程中实现重叠延伸。通过在X和Z的5′端添加互补序列，可以确保在PCR1过程中，两个基因能够按照预期的方式进行重叠和延伸。 （3）HindⅢ在质粒上具有两个酶切位点，不宜选用，故需要在AD基因两端加上限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列，重组质粒上含有控制亮氨酸合成基因与氨苄青霉素抗性基因，与普通培养基相比，该选择性培养基应不含亮氨酸、含有氨苄青霉素，酵母细胞是真核细胞，故重组质粒以O2为起点进行复制。 （4）表中数据表明抗菌肽对白地霉有一定的抑菌效果，且抑菌效果最好的处理组别是3，3组抗菌肽与病原菌孢子充分接触，能更有效发挥作用。 地 城 考点03 基因工程的应用 1．(24-25高二下·吉林长春长春汽车经济技术开发区第三中学·期末)现有甲、乙两不同物种的二倍体纯合植物，甲植物（2n=14）的光合产量高于乙植物，但乙植物（2n=20）更适宜在盐碱地种植（相关性状均由核基因控制）。现要利用甲、乙两种植物培育出高产、耐盐的植株。下列技术不可行的是（    ） A．两种植物杂交后，得到的F1再利用单倍体育种，可较快获得所需植株 B．将乙种植物耐盐基因导入甲种植物的体细胞中，可培育出具有耐盐性状的甲种植物 C．利用植物体细胞杂交技术，可以获得高产、耐盐的四倍体杂种植株 D．诱导两种植物的花粉融合后培育成幼苗，再用秋水仙素处理可培育出所需植株 【答案】A 【分析】根据题干信息“要利用甲、乙两种植株各自优势，培育出高产、耐盐的植株”，由于存在生殖隔离，不能采用杂交育种，基因工程和植物体细胞杂交都能克服远缘杂交不亲和障碍，实现不同种间的杂交，获得优良性状。 【详解】A、甲（2n=14）和乙（2n=20）为不同物种，杂交后F1为异源二倍体（染色体组为14+20），减数分裂时染色体无法联会，无法形成正常配子，因此无法通过单倍体育种获得可育植株，A错误； B、通过基因工程将乙的耐盐基因导入甲，属于转基因技术，可定向获得耐盐性状的甲种植物，B正确； C、植物体细胞杂交技术融合甲、乙的原生质体，形成四倍体杂种细胞（染色体数目为14+20=34），培育的植株同时具备高产和耐盐性状，C正确； D、甲、乙花粉（n=7和n=10）融合后形成异源二倍体（17条染色体），经秋水仙素处理染色体加倍为四倍体（34条），可能具备双亲性状，即可培育出所需植株，D正确。 故选A。 2．(24-25高二下·陕西西安南开高级中学·期末)继乳腺生物反应器之后，科学家又培育出膀胱生物反应器：将人的生长激素基因导入小鼠受精卵，经培育获得膀胱上皮细胞可以合成并分泌人的生长激素的转基因小鼠。下列有关叙述错误的是（    ） A．将人的生长激素基因导入小鼠受精卵，是因为受精卵具有全能性 B．需要在人的生长激素基因首端加上小鼠膀胱上皮细胞特异性启动子 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制 D．用PCR技术可检测人的生长激素基因在小鼠细胞内是否转录和翻译 【答案】D 【详解】A、受精卵的全能性最高，容易发育为完整个体，因此常作为转基因动物的受体细胞，A正确； B、启动子决定基因表达的组织特异性，需在目的基因前添加膀胱上皮细胞特异性启动子，确保其在该细胞中表达，B正确； C、乳腺生物反应器需雌性个体且哺乳期才能获取产物，而膀胱生物反应器可通过尿液收集产物，不受性别限制，C正确； D、PCR技术可检测人的生长激素基因在小鼠细胞内是否转录，但是无法检测是否翻译（需抗原-抗体杂交技术），D错误。 故选D。 3．(24-25高二下·广东东莞·期末)次生代谢产物X是某植物细胞在微生物侵害等胁迫过程中产生的防御物质，可用于药物生产。其研发流程为：筛选高产细胞→确定细胞生长和产物X合成的关系（如图）→大量生产X。下列叙述错误的是（    ） A．应先培养大量细胞，后改变条件使细胞停止生长来大量生产X B．可将微生物菌体作为诱导因子加入培养基中，进而提高X产量 C．X的工厂化生产需要将高产植物的外植体培养成完整植株后提取 D．可以通过改造酵母菌等微生物的基因，利用发酵工程生产X 【答案】C 【详解】A、据实验结果可知，细胞停止生长后才开始大量合成X，为了大量获取X，应先培养大量细胞，后改变条件使细胞停止生长，A 正确； B、微生物侵害等胁迫可诱导植物细胞产生X ，将微生物菌体作为诱导因子加入培养基，可提高X 产量，B 正确； C、X 的工厂化生产利用植物细胞培养技术，不需要培养成完整植株，直接培养高产细胞即可提取，C 错误； D、可通过基因工程改造酵母菌等微生物，导入相关基因，利用发酵工程生产X ，D 正确。 故选C。 4．(24-25高二下·四川南充·期末)研究者将抗虫融合基因cv与耐草甘膦基因ce构建在同一T-DNA中，并利用农杆菌转化法导入水稻细胞，培育出了抗虫耐除草剂的转基因水稻。下列叙错误的是（    ） A．农杆菌Ti质粒上的T-DNA，能整合到受体细胞的染色体DNA上 B．转基因水稻种植时可减少农药的使用，进而降低农药对环境的污染 C．将转基因水稻与普通水稻间行种植的主要目的是增加基因的多样性 D．转基因水稻获批上市后，必须严格实行标识制度，保证消费者的知情权 【答案】C 【详解】A、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，这是农杆菌转化法的关键步骤，A正确； B、抗虫转基因水稻可减少杀虫剂使用，耐除草剂特性允许使用特定除草剂，从而减少其他除草剂的使用，降低环境污染，B正确； C、将转基因水稻与普通水稻间行种植的主要目的是评估其生长情况及环境影响，而非增加基因多样性，C错误； D、我国对转基因产品实行标识制度，要求明确标注转基因成分，保障消费者知情权，D正确。 故选C。 5．(24-25高二下·吉林松原宁江区吉林油田高级中学·期末)下列生物技术操作不会达成预期目标的是（　　） A．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 B．将胰岛素基因表达质粒转入酵母菌，筛选获得产胰岛素工程菌 C．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 D．将花青素代谢相关基因导入植物体细胞，再经组织培养获得具有特定花色的植株 【答案】A 【详解】A、将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，可以培育出产低乳糖牛乳的奶牛，如果导入奶牛乳腺细胞，体细胞无法发育为完整个体，则不能达成预期目标，A错误； B、酵母菌作为真核生物，具备表达复杂蛋白质的机制，将胰岛素基因表达质粒转入后，可通过筛选获得工程菌，B正确； C、改造后的T细胞（如CAR-T细胞）能特异性识别癌细胞并激活免疫应答，属于细胞免疫治疗，C正确； D、植物体细胞导入目的基因后，经植物组织培养可发育为完整植株，基因表达可改变花色，D正确。 故选A。 6．(24-25高二下·河南开封·期末)为解决草莓品种抗虫性差和因病毒积累导致品种退化的问题，育种工作者进行了以下尝试：①利用草莓茎尖进行组织培养；②将草莓细胞与抗虫植物细胞进行体细胞杂交；③对草莓愈伤组织细胞进行液体悬浮培养。下列叙述错误的是（    ） A．①技术可以获得草莓脱毒苗 B．②技术的原理是细胞膜的流动性 C．③技术不能得到草莓新品种 D．用基因工程技术可培育抗虫品种 【答案】B 【分析】植物组织培养：1、过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）经过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，最后发育成植株（新植体）。决定植物脱分化和再分化的关键因素是植物激素的种类和比例，特别是生长素和细胞分裂素的协同作用在组织培养过程中非常重要。2、原理：植物细胞的全能性。3、应用：植物繁殖的新途径（快速繁殖优良品种、作物脱毒、人工种子）、作物新品种的培育（单倍体育种和突变体的利用）、细胞产物的工厂化生产。 【详解】A、茎尖分生区细胞病毒极少，通过组织培养可获得脱毒苗，A正确； B、体细胞杂交需细胞膜流动性实现融合，但整个技术还需细胞全能性形成植株，B错误； C、液体悬浮培养仅增殖细胞，未诱发遗传变异，无法得到新品种，C正确； D、基因工程可导入抗虫基因，培育抗虫草莓，D正确。 故选B。 7．(24-25高二下·湖北武汉重点中学5G联合体·期末)乳腺生物反应器是通过转基因技术，将外源基因导入动物（如牛、羊）基因组中，并使其在乳腺组织特异性表达，利用动物乳腺高效合成、分泌蛋白的能力，在乳汁中生产药用蛋白或其他高价值产品的生物技术体系。下列说法错误的是（    ） A．在构建基因表达载体时，要在外源基因序列上游加上能在乳腺中特异性表达的基因的启动子 B．与利用转基因大肠杆菌生产蛋白相比，乳腺生物反应器得到的蛋白活性更高 C．培育的转基因动物体内，只有乳腺组织细胞中才含有外源基因 D．乳腺生物反应器具有产量高、成本低、产品质量好和易提取等优点 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因表达载体的构建需要乳腺组织特异性启动子，以驱动外源基因在乳腺中表达。启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，决定基因的转录方向和组织特异性，A正确； B、大肠杆菌为原核生物，缺乏内质网、高尔基体等加工系统，无法对真核生物的蛋白质进行正确折叠和修饰，而动物乳腺细胞为真核细胞，能完成这些加工，故蛋白活性更高，B正确； C、转基因动物的所有体细胞均含有外源基因（因导入受精卵或早期胚胎细胞），但外源基因仅在乳腺细胞中因启动子调控而表达，其他细胞中不表达，C错误； D、乳腺生物反应器通过乳汁直接获取产物，无需复杂设备，动物饲养成本低，且真核系统生产的蛋白结构更完整，D正确。 故选C。 8．(24-25高二下·福建龙岩·期末)下列有关基因工程应用的说法，错误的是（    ） A．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于基因工程的应用 B．将药用蛋白基因导入到动物乳腺细胞中，可培育出乳腺生物反应器 C．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质 D．相比天然产物提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高 【答案】B 【详解】A、通过基因工程将分解石油的基因导入细菌，使其获得降解能力，属于基因工程的应用，A正确； B、乳腺生物反应器需将药用蛋白基因导入动物受精卵，使其在乳腺细胞中表达，而非直接导入乳腺细胞（体细胞无法传代），B错误； C、将富含必需氨基酸的蛋白质基因导入农作物，可改良其营养价值，属于基因工程改良品质的应用，C正确； D、基因工程通过微生物发酵生产酶，可避免天然提取中的杂质干扰，纯度更高，D正确。 故选B。 9．(24-25高二下·天津河北区·期末)采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列说法正确的是（    ） A．该转基因羊无法将人凝血因子基因传递给后代 B．该转基因羊的所有细胞都含有人凝血因子基因并可以正常表达 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛 D．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 【答案】C 【详解】A、转基因羊的生殖细胞若含有人凝血因子基因，则可通过有性生殖传递给后代。通常基因工程中，目的基因会整合到受精卵的基因组中，因此转基因羊能传递该基因，A错误； B、转基因羊的所有细胞均含有人凝血因子基因（因源于受精卵分裂分化），但基因表达具有选择性，仅在乳腺细胞等特定细胞中表达，B错误； C、乳腺生物反应器需雌性个体分泌乳汁，而膀胱生物反应器可从雌雄个体的尿液中收集产物，受体选择不受性别限制，来源更广泛，C正确； D、乳腺细胞是高度分化的体细胞，无法发育为完整个体。需将表达载体导入受精卵，经胚胎发育形成转基因个体，D错误。 故选C。 10．(24-25高二下·广东深圳龙华区·期末)聚羟基丁酸酯（PHB）是一种可降解塑料，可由木质素转化合成。某研究团队将关键代谢基因整合到微生物基因组中，并对工程菌进行驯化和筛选，实现了木质素向PHB的高效转化。下列叙述正确的是（　　） A．木质素为工程菌提供碳源，无需添加其他营养物质 B．对工程菌进行的驯化和筛选是通过选择培养基实现的 C．关键代谢基因整合到微生物基因组实现了诱变育种 D．获得PHB的工程菌需要利用提取、分离和纯化等技术 【答案】B 【详解】A、木质素主要提供碳源，但微生物生长还需氮源、无机盐等，仅木质素无法满足所有营养需求，A错误； B、驯化和筛选工程菌时，选择培养基能抑制其他微生物生长，从而筛选出目标菌株，B正确； C、关键代谢基因整合到微生物属于基因工程（转基因技术），而非诱变育种（由物理、化学等因素诱导基因突变），C错误； D、“获得PHB的工程菌”需通过基因工程构建和筛选，而提取、分离和纯化技术用于获取PHB产物本身，D错误。 故选B。 11．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)科学家们致力于通过基因工程手段解决各种医学和工业难题。下列关于基因工程技术应用的叙述，错误的是（　　） A．目前利用基因工程技术可以生产细胞因子、抗体和疫苗等 B．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐受问题 C．将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，可培育转基因抗病植物 D．利用基因工程菌来生产工业用酶的优点是酶纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高 【答案】B 【详解】A、基因工程技术在医学领域应用广泛，可通过工程菌或动物细胞培养生产细胞因子（如干扰素）、抗体（如单克隆抗体）和疫苗（如乙肝疫苗）等生物制品，A正确； B、应将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵等，使转基因奶牛乳腺细胞表达肠乳糖酶来降低乳汁乳糖，直接导入乳腺细胞无法稳定遗传和表达，B错误； C、抗病基因可来源于病毒（如病毒外壳蛋白基因）或真菌（如几丁质酶基因），导入植物后可增强抗病性，C正确； D、基因工程菌能高效生产高纯度工业酶，且成本低，D正确。 故选B。 12．(24-25高二下·四川广元·期末)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面展示出了广阔的应用前景。下列叙述错误的是（　　） A．我国转基因抗虫棉的成功培育，实现了基因由微生物向植物的定向转移 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，可培育出产低乳糖牛乳的奶牛 C．通过构建基因工程菌，可利用发酵技术大量生产加工转化糖浆所需的淀粉酶 D．膀胱生物反应器优于乳腺生物反应器的方面包括不受性别、发育时期等限制 【答案】B 【详解】A、抗虫棉的Bt毒蛋白基因来自苏云金杆菌，属于微生物基因向植物的转移，且基因工程能实现定向改造，A正确； B、将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞无法直接培育出稳定产低乳糖牛乳的个体，正确方法是将该基因与乳腺特异性启动子连接后导入受精卵，使转基因奶牛在乳汁中表达乳糖酶，B错误； C、淀粉酶可将淀粉水解为葡萄糖，用于生产转化糖浆，构建基因工程菌通过发酵生产淀粉酶是可行技术，C正确； D、膀胱生物反应器可从尿液中收集产物，不受性别和发育阶段限制，而乳腺反应器仅限雌性哺乳期，D正确。 故选B。 13．(24-25高二下·江苏徐州邳州·期末)下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是（    ） A．若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C．利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞 D．为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组 【答案】C 【详解】A、成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成，不含启动子序列，故若某基因是从人的细胞内提取 mRNA 经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，A正确； B、在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'-端进行子链合成，B正确； C、导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞，通常是受精卵，C错误； D、要使目的基因在乳腺细胞中表达，需要在目的基因的上游加上乳腺蛋白基因的启动子，D正确。 故选C。 14．(24-25高二下·天津和平区·期末)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（　　） A．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 B．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 C．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 D．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 【答案】A 【分析】若遗传物质改变发生在生殖细胞或受精卵中，则可能遗传；若发生在体细胞中，通常不会遗传。 【详解】A、腺苷酸脱氨酶基因转入的是患者的淋巴细胞（体细胞），体细胞的基因改变不会通过生殖细胞传递给子代，A正确； B、胰岛素基因导入大肠杆菌的质粒中，质粒作为遗传物质会随细菌分裂传递给后代，B错误； C、植物体细胞导入基因后经组织培养，属于无性繁殖，遗传物质变化会保留在子代植株中，C错误； D、肠乳糖酶基因导入的是受精卵，发育成的个体生殖细胞也含此基因，可遗传给子代，D错误。 故选A。 15．(24-25高二下·四川遂宁·期末)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔的应用前景，下列相关叙述正确的是（    ） A．利用乳腺生物反应器制备药用蛋白时，只需要将目的基因导入乳腺细胞即可表达获得 B．培育转基因植物时，用电刺激处理受体细胞可增加细胞壁通透性，利于重组质粒导入 C．在同等养殖条件下，转入外源生长激素基因的鲤鱼的生长繁殖速率比非转基因鲤鱼高 D．将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌或酵母菌的基因组中生产的凝乳酶活性可能不同 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、利用乳腺生物反应器时，需将目的基因导入受精卵而非乳腺细胞，因为只有受精卵能发育为个体，使目的基因在乳腺中特异性表达。若仅导入乳腺细胞，无法稳定遗传且无法持续产生产物，A错误； B、培育转基因植物时，常用农杆菌转化法或基因枪法导入重组质粒。电刺激法（电穿孔法）多用于微生物或动物细胞，B错误； C、外源生长激素基因的表达可促进转基因鲤鱼生长，但繁殖速率受性腺发育、能量分配等因素影响，过量生长激素可能抑制生殖能力，因此生长速率高≠繁殖速率高，C错误； D、大肠杆菌（原核）与酵母菌（真核）的蛋白质加工系统不同，酵母菌可能对凝乳酶进行正确折叠和修饰，而大肠杆菌无法完成，导致酶活性差异，D正确。 故选D。 16．(24-25高二下·山东滨州·期末)某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法错误的是（    ） A．制备的膀胱生物反应器，只有在膀胱细胞中才能表达W蛋白基因 B．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白需用相同的启动子 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 D．将含有W蛋白基因的表达载体导入山羊受精卵中可使用显微注射法 【答案】B 【分析】膀胱生物反应器有着和乳腺生物反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易，不会对动物造成伤害。与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物性别和年龄的限制。 【详解】A、膀胱生物反应器中，W蛋白基因需与膀胱上皮细胞特异性启动子结合，因此只能在膀胱细胞中表达，A正确； B、乳腺生物反应器使用乳腺特异性启动子，而膀胱生物反应器需用膀胱特异性启动子，两者启动子不同，B错误； C、乳腺生物反应器需雌性个体且处于泌乳期，而膀胱反应器可从任何性别和年龄个体的尿液中获取产物，C正确； D、显微注射法是动物转基因常用方法，导入受精卵可实现目的基因的稳定遗传，D正确。 故选B。 17．(24-25高二下·江西九师联盟·期末)白僵菌是一种真菌，能寄生到松毛虫等农业害虫体内致其死亡，但对环境和温血动物安全无害，被广泛用于害虫防治。由苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白可以使多种害虫死亡。某研究小组尝试使用农杆菌转化法，将Bt基因转入白僵菌中以加强白僵菌对害虫的防治效果。实验使用的Bt基因与Ti质粒如下图。下列叙述正确的是（    ） A．为构建基因表达载体应用BamHI和NheI切割Bt基因和Ti质粒 B．采用转基因白僵菌防治农业害虫对环境的污染较小，属于化学防治 C．培养含重组质粒的白僵菌时，培养基上发绿色荧光的菌落即为目的菌 D．除了对转基因白僵菌进行分子水平的检测外，还应对其进行抗虫实验 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，需将Bt基因整合到T-DNA中，且不能破坏Bt基因，因此构建基因表达载体应使用限制酶BamH I，切割 Bt基因和 Ti质粒，再将二者进行连接，若用BamHI和NheI切割Ti质粒，会导致T-DNA中终止子丢失，A错误； B、采用转基因白僵菌防治农业害虫对环境的污染较小，属于生物防治，B错误； C、构建基因表达载体时，用BamH I切割质粒时会破坏绿色荧光蛋白基因，因此含重组质粒的白僵菌中不含绿色荧光蛋白基因，因此培养基上发绿色荧光的菌落不是导入重组DNA的目的菌，可能是导入空质粒的菌体，C错误； D、除了对转基因白僵菌进行分子水平的检测外，还应对其进行抗虫实验，在个体水平上检测转基因生物是否被赋予了目的基因所控制的性状，D正确。 故选D。 18．(24-25高二下·浙江杭州联谊学校·期末)PYL9基因是一种重要的脱落酸受体基因。科学家通过基因工程使番茄中原有的PYL9基因过量表达。实验发现，与普通番茄相比，这种转基因番茄抗旱性更强。下列分析合理的是（    ） A．PYL9基因存在于野生型和转基因番茄中 B．PYL9基因过量表达使番茄对脱落酸敏感度下降 C．PYL9基因过量表达促进了番茄气孔开放 D．PYL9基因过量表达增强抗旱性是偶然现象 【答案】A 【详解】A、PYL9基因是番茄本身存在的基因，转基因操作使其过量表达，因此野生型和转基因番茄中均含有该基因，A正确； B、PYL9基因编码脱落酸受体，过量表达会增加受体数量，增强对脱落酸的敏感度，B错误； C、脱落酸通过促进气孔关闭减少水分流失，PYL9过量表达会加强这一作用，导致气孔关闭，C错误； D、基因过量表达是人为设计的实验，抗旱性增强是预期结果，并非偶然现象，D错误。 故选A。 19．(24-25高二下·河南三门峡·期末)研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器用其获得人体特殊功能蛋白W，基本过程如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．图中①和③过程代表的操作分别是显微注射和胚胎移植 B．转基因动物乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的遗传信息不同 C．需用激素对代孕母体进行同期发情处理 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受转基因动物性别和年龄的限制 【答案】B 【详解】A、图中①表示将目的基因导入受体细胞，利用受精卵作为重组表达载体的宿主细胞常采用显微注射的方法将载体注入，③表示胚胎移植，A正确； B、转基因动物乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是体细胞有丝分裂再经分化而来，遗传信息相同，B错误； C、对代孕母体进行同期发情处理，以使其子宫处于与供体相同的生理状态，C正确； D、由于只有雌性动物哺乳期才能产奶，因此与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受转基因动物性别和年龄的限制，D正确。 故选B。 20．(24-25高二下·江西南昌中学·期末)基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述正确的是（　　） A．通过X射线处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于基因工程技术的应用 B．将乙烯合成相关基因导入番茄，获得的延熟番茄储存时间大大延长 C．将人生长激素基因直接导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰 D．通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，进而可以从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于诱变育种，A错误； B、若将乙烯合成相关基因导入番茄，获得的转基因番茄能合成更多的乙烯，使得果实成熟加快，不利于储存，B错误； C、由于大肠杆菌缺乏对蛋白质进行加工和分装的内质网和高尔基体，因此与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰，C正确； D、作为膀胱生物反应器的山羊体内所有细胞都含有目的基因，但是只有在膀胱细胞中才能表达目的基因，D错误。 故选C。 21．(24-25高二下·山东菏泽·期末)蛛丝有超强韧性，科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中，获得乳腺生物反应器，在基因工程中可通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术检测目的基因是否导入受体细胞。下列说法错误的是（    ） A．PCR过程中为了减少非特异性扩增，可增加引物长度且适当降低复性温度 B．科学家将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．在凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．如果电泳结果显示羊体细胞中含有蛛丝蛋白基因，则其乳汁中含有蛛丝蛋白 【答案】ACD 【详解】A、PCR过程中，增加引物长度可提高特异性，但降低复性温度会促进引物与非目标序列结合，导致非特异性扩增增加，A错误； B、乳腺生物反应器的构建需将目的基因与乳腺组织特异性启动子等调控元件重组，确保目的基因在乳腺细胞中表达，B正确； C、核酸染料通常直接加入凝胶中，而非载样缓冲液，载样缓冲液主要含指示剂（如溴酚蓝），C错误； D、电泳结果显示羊体细胞中含有蛛丝蛋白基因，并不意味着其乳汁中都含有蛛丝蛋白，是否表达出蛛丝蛋白还需进一步鉴定（利用抗原-抗体杂交方法进行鉴定），D错误。 故选ACD。 22．(24-25高二下·河北衡水枣强县枣强中学·期末)空军军医大学西京医院于2024年3月10日在世界上首次实施一例“基因编辑猪一人”异种肝移植手术，成功将一只多基因编辑猪的全肝移植到一位脑死亡患者体内，这为解决人体移植器官短缺的问题带来了曙光。下列叙述正确的是（　　） A．与猪相比，灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒更少 B．基因改造的猪肝脏可能导入了某种调节因子抑制抗原决定基因的表达 C．基因改造过程中可能用到了限制酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等 D．器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题 【答案】BCD 【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、由于猪与人类的亲缘关系比灵长类远，因此，与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少，因此猪更适合用于解决人类移植器官短缺的问题，A错误； B、科学家还试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造，如设法导入了某种调节因子抑制抗原决定基因的表达，再结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，B正确； C、基因改造需用限制酶切割DNA，DNA连接酶连接目的基因与载体，而PCR扩增目的基因时需耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶），C正确； D、器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题，因此克隆避免免疫排出的器官是医学界的难题，D正确。 故选BCD。 23．(24-25高二下·辽宁丹东·期末)水杨酸广泛应用于水体消毒，但使用过量会导致水生动物运动能力、繁殖能力和抵抗力降低，严重影响水生动物的产量。科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备如图甲的水杨酸生物传感器，为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题：    (1)除了限制酶外，构建重组质粒过程中还要用_______酶，图中启动子的作用是______。 (2)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为可被细胞分解的龙胆酸，mrfp基因能表达产生红色荧光蛋白，为构建水杨酸羟化酶基因与mrfp基因的融合基因，在利用PCR技术分别获取水杨酸羟化酶基因与mrfp基因过程中，需要给图乙中的4种引物的_______端添加限制酶的识别序列，A、B 2种引物的末端应分别添加图甲中_______、_______限制酶的识别序列；C、D 2种引物的末端应分别添加图甲中_______、_______限制酶的识别序列。 (3)为检测水杨酸生物传感器对水杨酸的敏感程度，进行如下实验，结果如下表： 组别 甲 乙 丙 红色荧光强度 + 无 +++ 注：“+”数量越多表示荧光强度越高 研究小组选取成功导入重组质粒的大肠杆菌若干随机均分为甲、乙、丙三组，甲组培养环境为含较低浓度水杨酸的培养液，丙组的培养环境是_______，由该实验可推知，重组质粒中目的基因的表达程度受到环境中_______的调控。 (4)综上所述，成功导入重组质粒的大肠杆菌，可在环境治理中起到的作用是________。 【答案】(1) DNA连接 RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA (2) 5’ SalI XhoI SalI HindIII (3) 含较高浓度水杨酸的培养液 水杨酸浓度 (4)当水体中有水杨酸存在（或过量）时，能发出红色荧光并清除水体中的水杨酸（或监测水体中水杨酸的含量并清除水体中的水杨酸）或（实现对水杨酸的动态检测和清除） 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）限制酶能识别双链DNA特定的核苷酸序列，切割双链DNA分子，DNA连接酶能将DNA片段连接起来，除了限制酶外，构建重组质粒过程中还要用DNA连接酶，启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA。 （2）DNA复制的方向是从子链的5'→3'，利用PCR技术分别获取水杨酸羟化酶基因与mrfp基因过程中，需要给图乙中的4种引物的5'端添加限制酶的识别序列，由图甲中重组质粒的结构来看，水杨酸羟化酶基因两侧的限制酶为SalI和XhoI，结合图乙中水杨酸羟化酶基因转录时的模板链可知转录方向，引物B添加XhoI限制酶的识别序列，引物A添加SalI限制酶的识别序列，同理，mrfp基因两侧的限制酶为SalI和HindIII，结合图乙中mrfp基因转录时模板链可知转录方向，引物C添加SalI限制酶的识别序列，引物D添加HindIII限制酶的识别序列。 （3）水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为可被细胞分解的龙胆酸，mrfp基因能表达产生红色荧光蛋白，丙组的荧光强度大于甲组，甲组的培养环境为含较低浓度水杨酸的培养液，推测丙组的培养环境是含较高浓度水杨酸的培养液，由此推知荧光强度与水杨酸浓度有关，故重组质粒中目的基因的表达程度受到环境中水杨酸浓度的调控。 （4）成功导入重组质粒的大肠杆菌，可在环境治理中起到的作用是当水体中有水杨酸存在（或过量）时，能发出红色荧光并清除水体中的水杨酸（或监测水体中水杨酸的含量并清除水体中的水杨酸）或（实现对水杨酸的动态检测和清除）。 24．(24-25高二下·陕西安康·期末)血清白蛋白（HSA）是人体血浆中最主要的蛋白质，具有多种生物学功能。科学家对植物细胞进行基因改造，使它们能够生产HSA，基本技术流程如图所示，Ti质粒中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。回答下列问题： (1)为获取大量的HSA基因用于基因表达载体的构建，通常采用PCR技术对HSA基因进行扩增。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，缓冲液中一般需要添加Mg2+，其原因是________。PCR扩增前需要设置PCR仪的循环次数，每次循环可以分为________三步。 (2)组建重组Ti质粒的过程中需要用到的酶有________HSA基因需要插入Ti质粒中的________部位，原因是________。 (3)为检测转基因植物是否表达出HSA，可从转基因植物中提取蛋白质，用________的抗体进行抗原一抗体杂交；也可在所提取的蛋白溶液中加入无色物质K，若蛋白溶液呈现________，说明HSA基因翻译出蛋白质。 (4)科学家还利用乳腺生物反应器来批量生产HSA。科学家将HSA基因与在乳腺中特异表达的基因的__________等调控元件重组在一起，该操作的目的是________。 【答案】(1) DNA聚合酶需要Mg2+激活 变性、复性和延伸 (2) DNA连接酶、限制酶（和TaqDNA聚合酶） T-DNA T-DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上 (3) 抗HSA蛋白 蓝色 (4) 启动子 特异性驱动乳腺细胞中的HSA基因转录出相应的mRNA 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）Mg2+的作用：Mg2+是Taq酶（热稳定DNA聚合酶）的激活剂 。在PCR反应中，Taq酶需要在Mg2+存在的条件下才能发挥正常的催化活性，从而催化DNA的合成。PCR循环步骤：每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。变性是指在高温（一般为90 - 95℃）下，双链DNA解旋成为单链；复性是指温度降低（一般为55 - 60℃）时，引物与模板单链的互补序列配对结合；延伸是指在Taq酶的作用下（一般为70 - 75℃），以dNTP为原料，从引物的3'端开始合成与模板链互补的新的DNA链。 （2）组建重组Ti质粒的过程中需要用到限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，用于切割Ti质粒和获取HSA基因；DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，将切割后的Ti质粒和HSA基因连接形成重组Ti质粒。HSA基因需要插入Ti质粒中的T - DNA部位。原因是T - DNA（可转移DNA）可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，这样就能使HSA基因随着受体细胞染色体DNA的复制而复制，稳定地遗传给后代。 （3）为检测转基因植物是否表达出HSA，可从转基因植物中提取蛋白质，用抗HSA的抗体进行抗原 - 抗体杂交。如果出现杂交带，说明转基因植物表达出了HSA。也可在所提取的蛋白溶液中加入无色物质K，由题干可知：基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色，故若蛋白溶液呈现蓝色，说明HSA基因翻译出蛋白质。 （4）科学家将HSA基因与在乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。该操作的目的是特异性驱动乳腺细胞中的HSA基因转录出相应的mRNA。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，将HSA基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组，就可以利用该启动子的特异性，让HSA基因在乳腺细胞中启动转录和翻译，从而在乳腺细胞中合成HSA。 25．(24-25高二下·内蒙古通辽科左中旗民族职专?实验高中·期末)人的血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲利用基因工程来大量生产HSA。图1为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，其中Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Neo表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的三条途径如图2所示。请回答下列问题： (1)据图1分析，在构建基因表达载体时，选择限制酶______切割质粒和目的基因，双酶切法的两个优点是______、______。 (2)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322质粒而非重组质粒）的干扰，目的基因导入后进行筛选，若筛选用甲、乙两种培养基，两种培养基的差异为______，含重组质粒的受体细胞在培养基上的生长情况为______。 (3)将农杆菌与水稻圆叶片进行共培养，旨在让Ti质粒的______进入水稻受体细胞。三种方法中，为检测目的基因的表达情况，均可提取受体细胞的蛋白质，用抗人血清蛋白（HSA）的抗体进行______实验。 (4)科学家培养出一种转基因羊，其膀胱上皮细胞可以合成人的血清蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过______法导入山羊的______细胞。与“乳腺生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”不受______限制，受体来源更广泛。 【答案】(1) EcoRI和PstI 避免目的基因和质粒的自身环化 避免目的基因和质粒进行反向（随意）连接 (2) 一组培养基中含有新霉素，另一组培养基中含有氨苄青霉素 在含有新霉素的培养基上能生长，在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长 (3) T-DNA 抗原—抗体杂交 (4) 显微注射 受精卵 性别和年龄 【分析】基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1） 据图1可知，BamHI会切割目的基因，TthⅢ1与其他两种限制酶中的一种同时使用会切掉质粒中的复制原点，而EcoRI和PstI这两种酶能切割质粒和目的基因，不会破坏复制原点，且能得到不同的黏性末端，可以避免目的基因和质粒的环化，同时避免目的基因和质粒进行反向连接，因此在构建基因表达载体时，选择EcoRI和PstI作为切割质粒和目的基因的限制酶。 （2） 分析图1可知，PstI破坏了氨苄青霉素抗性基因（Ampr），构建的重组质粒无氨苄青霉素抗性基因，但具有新霉素抗性基因，两组培养基中，一组培养基中有新霉素，另一组培养基中有氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞只能在含有新霉素的培养基上能生长，在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长。 （3）将农杆菌与水稻圆叶片进行共培养，旨在让Ti质粒的T-DNA进入水稻受体细胞。为检测目的基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，利用的原理是抗原—抗体特异性结合，所以用抗人血清蛋白（HSA）的抗体进行抗原—抗体杂交实验来检测人的血清蛋白（HSA）。 （4）将重组质粒通过显微注射法导入动物的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞。“乳腺生物反应器”只能从哺乳期雌性奶牛的乳汁中获取产物，与“乳腺生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”的优点是雌性和雄性奶牛的尿液中都可提取到产物，且不受性别、年龄等限制，因而受体来源更广泛。 26．(24-25高二下·贵州遵义区县一中·期末)C1-INH是一种重要的血浆蛋白，可以防止过度炎症反应和血管通透性增加，通常用于治疗遗传性血管性水肿。从基因文库获取C1-INH基因后，PCR大量扩增，研究人员将C1-INH基因与乳腺中特异性表达基因的启动子等调控元件重组在一起导入兔子的受体细胞中，发育到泌乳期后就可以从转基因兔子的乳汁获得人类需要的C1-INH。请回答下列问题： 识别位点 限制酶 识别位点 限制酶 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' EcoR I 5'-CAG↓CTG-3' 3'-GTC↑GAC-5' Pvu Ⅱ 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5′ BamH I 5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5′ Hind Ⅲ 5'-↓GATC-3' 3'-CTAG↑-5' Sau3A I 5'-G↓GTACC-3' 3'-CCATG↑G-5' Kpn I (1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，高温处理的目的是_______。图1中应选择的引物是______。 (2)为了让目的基因正确插入运载体上，需要在引物的_______端添加限制酶的识别序列。 (3)结合图2中运载体上的限制酶的识别序列以及表格中具体的切割位点分析，扩增的C1-INH基因两端分别应添加________两种不同限制酶的识别序列。 (4)将基因表达载体导入动物受精卵中的方法是______法。基于上述制备乳腺生物反应器的技术原理，还可以开发转基因兔子膀胱生物反应器，与乳腺生物反应器相比，其优点有_______（答出1点）。 【答案】(1) 使DNA分子解开双螺旋 ①④ (2)5' (3)Pvu Ⅱ和EcoR Ⅰ (4) 显微注射 不受年龄、性别、发育时期的限制 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、PCR扩增的过程：（1）变性（90℃ 以上）：DNA受热后解聚为单链。（2）复性（50℃ 左右）：两条引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸（72℃ 左右）：溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，依据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】（1）利用PCR技术扩增目的基因的过程中，高温处理的目的是使得DNA分子解开双螺旋，便于引物的结合。复制时子链的合成方向是5'→3'，故应该选用引物①④。 （2）为了让目的基因正确插入运载体上，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列，因为3'端要连接脱氧核苷酸。 （3）使用BamH Ⅰ酶切会破坏标记基因．使用 Hind Ⅲ酶切会破坏启动子，使用Pst Ⅰ酶切会破坏终止子，Kpn Ⅰ的酶切位点不在启动子和终止子之间， Sau3AⅠ的酶切位点与BamH Ⅰ酶一样，也会破坏标记 基因，故最终选用的限制酶为Pvu Ⅱ和EcoR Ⅰ。 （4）将基因表达载体导入动物受精卵中的方法是显微注射法，与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别、年龄与发育时期的限制。 27．(24-25高二下·江西景德镇·期末)人血清白蛋白（HSA）是人血浆中所含蛋白质的主要成分，除了维持血液渗透压、抗凝血和清除自由基的功能外，在临床上广泛用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等。由于HSA治疗剂量大，且血液来源不足，导致产量无法满足市场需求。探索基因重组HSA的表达方式，通过对紫花苜（MedicagoSativaL．）和黑麦草组织培养和植株再生条件的优化，分别建立了其遗传转化体系，通过农杆菌介导法将HSA基因分别导入紫花苜蓿和黑麦草中，经基因组PCR和Westernblotting鉴定，获得了可表达rHSA的转基因紫花苜蓿株系和转基因黑麦草株系。 限制酶 BamHI EcoRI BgII 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -G↓AATTC- -A↓GATCT- (1)基因工程中除质粒外，______和_______也可作为载体。若用重组质粒转化农杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的农杆菌作为受体细胞，原因是______；利用PCR技术从基因组DMA中扩增HAS基因时，所用的引物越短，引物特异性越_______（填“高”或“低”），原因是因为______。 (2)步骤②利用农杆菌转化法将目的基因分别导入紫花苜蓿和黑麦草，3天后转入含有________的选择培养基筛选抗性愈伤组织。若要检测紫花苜蓿或黑麦草是否产生了HAS，一般采用______技术。 (3)经限制酶切后，目的基因和质粒存在_________种连接情况，为确定是哪种连接方式，可用限制酶________对重组质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小，电泳结果长度为________kb的片段的重组质粒即为所需的表达载体。 【答案】(1) 动植物病毒 噬菌体 未处理的农杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱 低 引物较短，特异性弱，导致同时扩增出目的基因和其他DNA片段 (2) 潮霉素 抗原抗体杂交 (3) 2 BamHⅠ和EcoRⅠ 45 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）基因工程中除质粒外，动植物病毒和噬菌体也可作为载体，它们都能将外源基因导入受体细胞。若用重组质粒转化农杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的农杆菌作为受体细胞，原因是未处理的农杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱。利用PCR技术从基因组DMA中扩增HAS基因时，所用的引物越短，引物特异性越低，因为引物较短，特异性弱，导致同时扩增出目的基因和其他DNA片段。 （2）步骤②利用农杆菌转化法将目的基因分别导入紫花苜蓿和黑麦草，3天后转入含有潮霉素的选择培养基筛选抗性愈伤组织。这是因为重组质粒上带有潮霉素抗性基因，只有成功转化的细胞才能在含有潮霉素的培养基上生长。不使用含有卡那霉素的选择培养基的原因是卡那霉素抗性基因位于T-DNA序列之外，而农杆菌转化法只能将 Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 。若要检测紫花苜蓿或黑麦草是否产生了HAS，一般采用抗原抗体杂交技术。 （3）由于限制酶BamHI和BgII切割后形成的粘性末端相同，经限制酶切后，会出现目的基因和质粒正常连接和未连接两种连接情况。由图可知，Ti质粒上还存在限制酶BamHI和EcoRI的酶切位点，且两者酶切后产生的粘性末端不一样，故可用限制酶BamHI和EcoRI对重组质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小，电泳结果长度为25+20=45kb的片段的重组质粒即为所需的表达载体。 28．(24-25高二下·广东茂名普通高中·)多发性骨髓瘤（MM）是最常见的血液恶性肿瘤之一，全球每年病死患者约10万。B细胞成熟抗原（BCMA）是属于肿瘤坏死超家族的一种跨膜糖蛋白，BCMA在MM细胞中高表达，在正常组织和造血干细胞中不表达，是治疗MM的一个理想靶点。CAR - T细胞是利用基因工程制备的一种T细胞，其表面的嵌合抗原受体CAR能直接识别肿瘤细胞的特异性靶抗原BCMA。改造后的T细胞经体外扩增培养后，回输到患者体内进行肿瘤治疗。下图是利用基因工程制备CAR - T细胞并发挥作用的流程，回答下列问题： (1)CAR基因由三部分序列组成，过程①需要用__________酶处理以获得CAR基因。利用基因工程制备CAR - T细胞的核心步骤是__________（填序号）。 (2)利用PCR技术获得CAR基因需要设计引物，需要在引物的__________（填3'或5'）端添加限制酶的识别序列。在PCR反应体系中，除引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、4种脱氧核糖核苷酸外还需加入__________。 (3)改造后的T细胞经体外扩增培养时，不仅要确保适宜的气体和__________的环境条件，还要定期更换培养液，这样做的目的是__________。 (4)在治疗过程中，CAR的功能是__________。请推断用CAR - T细胞免疫疗法的效果显著且持久的原因是__________。 【答案】(1) DNA连接酶 ② (2) 5' 模板/CAR基因 (3) 无菌、无毒 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害 (4) 胞外结构区特异性识别多发性骨髓瘤细胞表面的B细胞成熟抗原（BCMA），传递信息至胞内信号区，激活T细胞 CAR-T细胞增殖产生新的CAR-T细胞，并形成记忆细胞 【分析】①表示获得目的基因，②表示构建基因表达载体，③表示把目的基因导入受体细胞。 【详解】（1）图中过程①是将3个DNA片段连接起来构成CAR基因，所以需要DNA连接酶；基因工程的核心步骤是②表达载体的构建。 （2）PCR技术中，延伸是发生在引物的3'端，为了完整扩增基因，引物的限制酶识别序列应添加至5'端；PCR过程需要加入模板、四种脱氧核糖核苷酸原料、引物、Taq酶和缓冲液。 （3）动物细胞培养需要一个无菌无毒的环境，还需要定期更换培养基，清楚代谢废物，来避免代谢废物对细胞的危害。 （4）“CAR-T细胞是利用基因工程制备的一种T细胞，其表面的嵌合抗原受体CAR能直接识别肿瘤细胞的特异性靶抗原BCMA”，所以CAR基因的功能是胞外结构区特异性识别多发性骨髓瘤细胞表面的B细胞成熟抗原（BCMA），传递信息至胞内信号区，激活T细胞；特异性免疫能够持久的原因是免疫过程中细胞会增殖，同时会产生记忆细胞。 29．(24-25高二下·福建厦门·期末)研究人员构建了远红光可控的分泌肿瘤坏死因子 （TNF）的工程细胞，并将其植入肿瘤切除部位，有效调动机体局部的免疫反应，为癌症治疗提供新思路。调控原理和主要模块的部分结构如图 1。 回答下列问题： (1)构建模块 1和模块 2的过程需使用____酶。 (2)为使远红光的诱导效果更高效，启动子 1应为____（填“诱导型启动子”或“持续表达型启动子”）。在远红光照射下，____（填物质）可激活启动子 PF促进 TNF 合成与分泌。 (3)研究人员测定了多个工程细胞在黑暗条件和远红光照射下的 TNF分泌量，结果如图 2据图分析，应选用____号工程细胞开展后续动物实验，理由是____。 (4)研究人员希望工程细胞在远红光照射下能同时分泌 TNF、IFN两种免疫活性物质，以增强疗效。请据此要求提出一个改造模块 2的简单思路____。 【答案】(1)限制酶、DNA连接酶 (2) 持续表达型启动子 BIdD二聚体 (3) 7 7号工程细胞在黑暗条件下不分泌TNF，在远红光条件下分泌TNF量最大，光控效果最佳 (4)在模块2中启动子PF后加入IFN基因和TNF基因 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，需要用到限制酶、DNA连接酶。 【详解】（1）限制酶用于切割DNA片段，DNA连接酶用于连接模块1和模块2的DNA片段。构建重组质粒需要这两种酶，故构建模块 1和模块 2的过程需使用限制酶、DNA连接酶。 （2）持续表达型启动子可保证模块1中的光敏元件持续表达，为远红光诱导提供基础，使远红光的诱导效果更高效；远红光激活光敏元件后，由图可知，产生BIdD二聚体，该物质结合启动子PF并激活TNF 基因表达。 （3） 图2显示，7号细胞在黑暗条件下TNF分泌量为0，远红光下分泌量最高，表明其光控响应最灵 敏，适合用于后续动物实验。 （4） 要使工程细胞在远红光照射下能同时分泌TNF、IFN两种免疫活性物质，以增强疗效，可在启动子 PF后并列插入TNF基因和IFN基因，使两者受同一启动子调控，远红光诱导时两种免疫因子同时表达并分泌。 30．(24-25高二下·广东清远·期末)CRISPR/Cas9系统可表达sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到特定基因上并对基因进行切割，可应用于基因的敲除。单纯性少毛症的发生与角蛋白基因（Krt71）的突变有关。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对小鼠的Krt71基因进行编辑。Krt71基因的部分序列和基因编辑技术流程见图。回答下列问题： (1)Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。Cas9蛋白的功能与基因工程常用的______酶功能类似。对Krt71基因进行编辑时，质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因______（填“序列1”“序列2”或“序列3”）的部分碱基序列相同。 (2)质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为______。过程③通常将受精卵培养至______阶段。 (3)与直接导入质粒pUC57相比，将Krt71－sgRNA和Cas9－mRNA直接注入小鼠受精卵，可减少转录的时间从而快速启动基因编辑过程；同时可降低外源基因整合到______的风险。 (4)敲除Krt71基因后对小鼠的毛发生长情况和毛发量等方面进行表型分析。该实验构建了单纯性少毛症小鼠模型，其研究价值是______（答出一点即可）。 【答案】(1) 限制（或限制性内切核酸） 序列3 (2) 启动子 桑葚胚（或囊胚） (3)基因组/细胞核/DNA/染色体 (4)用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。故Cas9蛋白的功能与基因工程常用的限制酶功能类似。由于Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因，而Krt71基因在序列3中含有TGG序列（序列1和2不含NGG），因此需要sgRNA能识别序列3的部分碱基序列，进而通过Cas9蛋白切割序列3的相应位点，故质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因序列3的部分碱基序列相同，保证转录形成的Krt71-sgRNA能通过碱基互补配对识别序列3。 （2）过程①为转录，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因转录形成RNA，即质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为启动子，胚胎移植时应选发育良好的桑葚胚或囊胚阶段的胚胎进行移植。 （3）由于质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上，因此将目的基因与质粒构建形成表达载体后，可能会将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，而将Krt71－sgRNA和Cas9－mRNA直接注入小鼠受精卵，则可降低外源基因整合到受体细胞的染色体DNA上的风险。 （4）敲除Krt71基因的生物体不在有Krt71基因的表达产物，会表现出相应的性状，相当于利用减法原理去除相应基因，来观察该基因的功能，因此该实验构建的单纯性少毛症小鼠模型，可用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗。 31．(24-25高二下·北京丰台区·期末)研究者常利用 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑或敲除植物的感病基因 A，培育抗病新品种。有人认为转入的Cas9基因等有潜在风险，研究者尝试优化该技术。 (1)转入 CRISPR/Cas9基因后， 会表达形成 sgRNA-Cas9 复合体。sgRNA 能与A 基因序列互补配对，引导Cas9蛋白切割双链DNA 实现A 基因的敲除。Cas9蛋白的作用类似于基因工程基本工具中的_________。 (2)培育过程如图1所示： ①将 CRISPR/Cas9基因导入野生型植株TO: 第一步：将编码sgRNA 的基因和 Cas9 蛋白的基因整合到 Ti质粒上； 第二步：将含 Ti 质粒的溶液滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞/受精卵中。 若整合成功，细胞中通常仅插入一份 T-DNA 拷贝。 ②筛选转基因植物T1：收获种子并种植在含潮霉素的_________培养基上，筛选得到转基因植株T1。T1 的基因型为_________。 ③T1 植株自交得到T2，设计 Cas9基因特异性引物做PCR，PCR 结果为阴性的植株为所需植株，理由是_________。 (3)我国科研团队构建了一种转基因配子自动清除系统（TGAC 系统），该系统如图2所示，按图1方法培育得到植株T1′和T2′。 TGAC 系统发挥机制的原理：植物进行减数分裂通过毒素基因B，在生殖细胞发育阶段杀死携带转基因元件的配子。为实现这一目的，需要选择特定的启动子，请从下表中选择最佳启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是_________、________、________。可预测转基因元件清除的植株占T2′植株的比例为_________。 启动子 特异性 P1 所有体细胞中表达 P2 花粉发育后期表达 P3 卵细胞特异性表达 P4 极核细胞特异性表达 注：极核细胞和卵细胞是由同一个大孢子细胞有丝分裂产生的，若极核细胞死亡会导致卵细胞受精后无法发育。 (4)对比（2）与（3）分析，TGAC 系统在基因工程的应用与推广中有哪些优势_________? 【答案】(1)限制酶 (2) 选择 aa 筛选出细胞中不含sgRNA 和Cas9等外源基因的植株，彻底避免植株及后代可能对环境的污染 (3) P4 （或P2） P2 （或 P4） P3 100% (4)该系统可以自动清除含有外源基因元件的配子，所得后代全部为非转基因植株，可大大节省时间和人工成本，缩短育种年限，提高转基因产品的安全性 【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】（1）在基因工程中，限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定部位切割DNA分子。由题可知，Cas9蛋白能在sgRNA引导下切割双链DNA实现A基因的敲除，其作用类似于基因工程基本工具中的限制酶。 （2）要筛选转基因植物，需要使用选择培养基，含潮霉素的培养基可筛选出含有潮霉素抗性基因（一般与目的基因同时整合到Ti质粒上）的转基因植株。利用 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑或敲除植物的感病基因 A，那么T1的基因型为aa。T1植株自交得到T2 ，若设计Cas9基因特异性引物做PCR，PCR结果为阴性，说明该植株不含Cas9基因。因为我们的目的是敲除感病基因A且避免转入基因的潜在风险，筛选出细胞中不含sgRNA 和Cas9等外源基因的植株，彻底避免植株及后代可能对环境的污染，所以是所需植株。 （3）植物进行减数分裂通过毒素基因B在生殖细胞发育阶段杀死携带转基因元件的配子。要实现这一目的，启动子应在生殖细胞发育阶段发挥作用，且要能作用于花粉和卵细胞相关细胞。P2在花粉发育后期表达，可用于花粉相关；P3在卵细胞特异性表达，可用于卵细胞；对于极核细胞（和卵细胞由同一个大孢子细胞有丝分裂产生），也需要其携带的转基因元件被清除，所以选择P4，因此最佳启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是P2、P4、P3，T1'为杂合子（假设为Aa，A为含转基因元件的），自交产生T2' ，正常情况下后代基因型及比例为AA:Aa:aa = 1:2:1。由于携带转基因元件的配子被清除（假设A配子被清除），则实际产生的后代只有aa，所以转基因元件清除的植株占T2'植株的比例为100%。 （4）对比（2）与（3），TGAC系统在基因工程的应用与推广中的优势在于：该系统可以自动清除含有外源基因元件的配子，所得后代全部为非转基因植株，可大大节省时间和人工成本，缩短育种年限，提高转基因产品的安全性。 32．(24-25高二下·湖北黄冈·期末)水稻纹枯病是由立枯丝核菌引起的全球性水稻病害，可导致高达30%的产量损失。中国农科院团队发现，利用CRISPR-Cas9敲除Os11基因可显著增强水稻对纹枯病的抗性。回答下列问题： (1)立枯丝核菌是一种真菌，其感染水稻叶鞘和叶片后诱导水稻Os11基因表达糖转运蛋白，再通过劫持水稻糖转运蛋白获取营养，促进侵染。糖转运蛋白位于水稻细胞的________上，其合成和加工需要________等具膜细胞器的参与。 (2)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（sgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因，工作原理如图1所示。 ①构建CRISPR/Cas9重组质粒，需要的工具酶有________，如果用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞，则在进行过程①时选用________作为载体。 ②过程③~⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，sgRNA的碱基序列应与________互补配对。 ③科研人员利用了PCR技术和________技术鉴定Os11基因是否被敲除，据图2分析，PCR过程中需要添加的引物为________，若无目标PCR产物，则说明基因敲除成功。 (3)有人担忧抗病转基因水稻可能通过花粉传播影响野生水稻。请提出解决方案：________（任写一点）。 【答案】(1) 细胞膜 内质网、高尔基体、线粒体 (2) 限制酶、DNA连接酶 Ti质粒 目标基因（或靶基因或0s11基因）的特定区段 琼脂糖凝胶电泳 引物2和引物3 (3)将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻中（或种植隔离带）（或培育雄性不育系） 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）糖转运蛋白具有运输糖的功能，位于水稻细胞的细胞膜上，它可以将细胞内的糖转运到细胞外供立枯丝核菌获取，糖转运蛋白属于分泌蛋白，其合成场所是核糖体，然后进入内质网进行初步加工，内质网以“出芽”的形式形成囊泡，将蛋白质运输到高尔基体，高尔基体对蛋白质进行进一步加工和包装，再形成囊泡将蛋白质分泌到细胞外，整个过程由线粒体供能，其中内质网、高尔基体、线粒体为具膜细胞器。 （2）①构建重组质粒时，需要用限制酶切割目的基因和运载体，以产生相同的黏性末端或平末端，然后再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来，所以需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶，农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。水稻是单子叶植物，若用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞，可对农杆菌进行改造，选用Ti质粒作为载体。 ②由题干可知，Cas9蛋白在单链向导RNA（sgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因，所以sgRNA的碱基序列应与目标基因（或靶基因或0s11基因）的特定区段互补配对，这样才能引导Cas9蛋白准确地切割目标基因。 ③科研人员利用了PCR技术和琼脂糖凝胶电泳鉴定Os11基因是否被敲除，PCR技术可以在体外大量扩增目的基因片段，然后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，PCR过程中，DNA子链延伸的方向为5’到3’，故选择引物2和引物3。 （3）可将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻中（或种植隔离带）（或培育雄性不育系），将α-淀粉酶会分解淀粉，是花粉不育，以此来解决抗病转基因水稻可能通过花粉传播影响野生水稻的问题。 地 城 考点04 蛋白质工程 1．(24-25高二下·宁夏固原·期末)下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（　　） A．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出的第二代基因工程 B．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础的 C．蛋白质工程的实质就是基因工程，二者没有本质上的区别 D．通过蛋白质工程可以产生自然界不存在的蛋白质，实现人类生产和生活的需要 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程是在基因工程的基础上，针对现有蛋白质的不足（如功能弱、稳定性差等），通过改造基因来优化蛋白质，因此被称为 “第二代基因工程”，A正确； B、蛋白质工程的核心是 “根据蛋白质的结构规律和功能关系，定向改造或创造新蛋白质”，因此必须以蛋白质的结构、功能关系为基础，B正确； C、蛋白质工程和基因工程有本质区别： 基因工程：将自然界已有的基因导入受体细胞，生产自然界已存在的蛋白质； 蛋白质工程：通过改造基因（或合成新基因），生产自然界不存在的、符合人类需求的蛋白质，C错误； D、蛋白质工程的目标是定向改造或创造新蛋白质，因此可以产生自然界原本不存在的蛋白质，满足人类生产（如工业酶）、生活（如医药蛋白）的需求，D正确。 故选C。 2．(24-25高二下·河南天一大联考·期末)干扰素是一种具有抗病毒、免疫调节等重要功能的蛋白质。科研人员为了提高干扰素的稳定性和活性，利用蛋白质工程对其进行改造。下表是改造前后干扰素的相关参数对比，据此分析，下列有关叙述错误的是（　　） 对比项目 改造前 改造后 热稳定性（在50℃下活性保留时间） 2小时 8小时 与受体的结合亲和力 相对较弱 相对较强 氨基酸数量 166个 166个 第17位氨基酸 半胱氨酸 丝氨酸 A．蛋白质工程可通过改变氨基酸的种类来改造蛋白质 B．第17位氨基酸的替换可能降低了干扰素对高温的敏感性 C．改造前后氨基酸数量不变，说明蛋白质工程未改变相关基因结构 D．改造后干扰素与受体的结合亲和力增强，这可能提高其生物学效应 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程可以通过定点突变等方法改变蛋白质的氨基酸序列，从而改变其结构和功能，该过程中第17位氨基酸从Cys变为Ser，说明通过改变氨基酸种类来改造蛋白质，A正确； B、改造后干扰素的热稳定性显著提高（从2小时到8小时），说明第17位氨基酸的替换（Cys→Ser）可能减少了高温下蛋白质的不稳定性，B正确； C、氨基酸数量不变，但第17位发生替换，说明基因发生了定点突变（如碱基对的替换），因此基因结构被改变，C错误； D、与受体结合亲和力增强（从“相对较弱”到“相对较强”）可能使干扰素更容易与靶细胞受体结合，从而增强其抗病毒或免疫调节功能，提高生物学效应，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·贵州遵义区县一中·期末)AI与蛋白质工程结合将引发下一代生物技术革命，AI预测可加速蛋白质结构解析、功能优化和设计，蛋白质工程基于蛋白质结构和功能，定点突变或片段替换进行改造蛋白质。下列叙述正确的是（　　） A．蛋白质工程的设计思路和天然蛋白质合成的过程是一样的 B．基因工程可以制造出大自然中没有的蛋白质满足人类的需求 C．多肽链上的氨基酸被替换，对应的mRNA上碱基序列也改变 D．蛋白质工程是基因工程的延伸，得到的产物一定会对人类有益的 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程的设计思路是从预期的蛋白质功能出发→设计结构→推测氨基酸序列→确定脱氧核苷酸序列，而天然蛋白质的合成遵循中心法则（DNA→mRNA→蛋白质），两者方向相反，A错误； B、基因工程只能通过重组现有基因生产自然界已有的蛋白质，无法直接创造全新蛋白质；而蛋白质工程通过改造基因可合成自然界不存在的蛋白质，B错误； C、多肽链中氨基酸的替换由mRNA上密码子改变导致，而密码子由DNA碱基序列决定，因此对应的mRNA碱基序列必然发生改变，C正确； D、蛋白质工程产物可能因结构改变产生未知功能或毒性，并非必然有益，D错误。 故选C。 4．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 【答案】D 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】A、由题干可知，题图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，而蛋白质工程的主要依据是蛋白质的预期功能，因此图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能，A正确； B、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能遗传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，B正确； C、合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体在受体细胞中表达，这属于基因工程技术，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，因此图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，D错误。 故选D。 5．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可用于治疗病毒感染等，但其体外保存相当困难。若将干扰素中的某个半胱氨酸替换成丝氨酸，则可延长其保存时间。下列有关叙述错误的是（　　） A．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 B．对干扰素进行蛋白质分子设计必须从预期的干扰素功能出发 C．对干扰素进行改造需通过直接改造干扰素的分子结构来实现 D．蛋白质空间结构复杂是蛋白质工程实施难度较大的重要原因 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程的目标是通过改造或合成基因，定向改变蛋白质结构，从而获得满足人类需求的蛋白质，A正确； B、蛋白质工程的设计思路是从预期的蛋白质功能出发，逆向推测应有的结构及对应的脱氧核苷酸序列，因此设计干扰素必须以其功能为出发点，B正确； C、蛋白质工程并非直接改造蛋白质分子结构，而是通过修改控制该蛋白质合成的基因来实现对蛋白质的改造，直接改造蛋白质无法遗传且难以操作，C错误； D、蛋白质的空间结构复杂且功能依赖特定构象，导致设计难度大，这是蛋白质工程实施困难的重要原因，D正确。 故选C。 6．(24-25高二下·陕西西安南开高级中学·期末)AI与蛋白质工程结合将引发下一代生物技术革命，AI预测可加速蛋白质结构解析、功能优化和设计，蛋白质工程基于蛋白质结构和功能，定点突变或片段替换进行改造蛋白质。下列叙述错误的是（    ） A．蛋白质工程的设计思路和天然蛋白质合成的过程有差异 B．蛋白质工程是基因工程的延伸，得到的产物一定会对人类有益的 C．多肽链上的氨基酸被替换，对应的mRNA上碱基序列也改变 D．蛋白质工程可以制造出大自然中没有的蛋白质满足人类的需求 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程的设计思路是先设计预期的蛋白质结构，再推导出应有的氨基酸序列及对应的基因序列，而天然蛋白质的合成遵循中心法则（DNA→RNA→蛋白质），两者过程相反，因此设计思路存在差异，A正确； B、蛋白质工程以基因工程为基础，属于其延伸，但改造后的蛋白质可能因结构变化产生不可预知的影响，并非一定会对人类有益，B错误； C、多肽链的氨基酸被替换是由于基因中碱基对的替换、增添或缺失，导致转录出的mRNA碱基序列发生改变，因此对应的mRNA碱基序列必然改变，C正确； D、蛋白质工程通过改造或合成基因，能够合成自然界不存在的蛋白质，D正确。 故选B。 7．(24-25高二下·陕西渭南临渭区·期末)通过蛋白质工程可以改造蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程只需要改造蛋白质，基因工程只需要改造基因 B．天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同 C．蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列 D．蛋白质工程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发最终推测出脱氧核苷酸序列 【答案】D 【详解】A、蛋白质工程通过修改基因来改变蛋白质，并非直接改造蛋白质；基因工程直接改造基因，两者均涉及基因操作，A错误； B、天然蛋白质合成遵循中心法则（DNA→RNA→蛋白质），而蛋白质工程逆向设计（功能→结构→基因），过程不同，B错误； C、蛋白质工程仅需改变关键氨基酸以优化功能，而非全部序列，C错误； D、蛋白质工程通过修改基因来改变蛋白质，蛋白质工程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发最终推测出脱氧核苷酸序列，D正确。 故选D。 8．(24-25高二下·海南直辖县级行政单位定安县部分学校·期末)蛋白质工程流程如图所示，在生产过程中，若将人胰岛素 A 链上 1 个天冬氨酸替换为甘氨酸，B 链末端增加 2 个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列叙述错误的是（　　） A．可通过基因工程方法生产 B．比人胰岛素多了 2 个肽键 C．与人胰岛素有相同的受体 D．图中物质 a 是 mRNA 【答案】D 【详解】A、人工长效胰岛素需要对天然的胰岛素进行改造，需要蛋白质工程进行生产，而蛋白质工程属于第二代基因工程，A正确； B、长效胰岛素与人的胰岛素相比，多了两个氨基酸，故多了两个肽键，B正确； C、长效胰岛素与人的胰岛素都作用于相同的受体，降低血糖，C正确； D、物质a表示具有一定氨基酸序列的多肽链，D错误。 故选D。 9．(24-25高二下·陕西西安西咸新区·期末)Cry蛋白是苏云金芽孢杆菌的主要杀虫蛋白。研究人员利用基因的定点突变技术将Cry蛋白第282位的丙氨酸和第283位的亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（　　） A．根据Cry蛋白的氨基酸序列能推测出多种相应的mRNA序列 B．Cry蛋白的毒性提高了7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构 C．改造Cry蛋白应从Cry蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构 D．经改造后的苏云金芽孢杆菌中的Cry蛋白毒性提高这一性状可遗传 【答案】C 【详解】A、由于密码子的简并性（多个密码子编码同一氨基酸），根据氨基酸序列推测mRNA序列时存在多种可能性，A正确； B、蛋白质功能由其空间结构决定，氨基酸替换可能改变结构从而增强毒性，B正确； C、蛋白质工程应先设计目标蛋白结构，再反向推导基因序列进行改造，而非直接根据原基因序列设计，C错误； D、基因定点突变属于可遗传变异，改造后的性状可通过遗传传递，D正确。 故选C。 10．(24-25高二下·辽宁丹东·期末)通过人工合成Bt基因部分序列与天然Bt基因的另一部分序列进行拼接构成重组的Bt基因，将之与T-DNA构成穿梭质粒，可提高农杆菌的转化效率，大大提高了培育抗虫棉的成功率，过程如下图。下列相关叙述正确的是（    ） A．如图过程是对基因进行操作，因而不属于蛋白质工程 B．本实例是将重组质粒直接导入棉花愈伤组织细胞，再进行组织培养获得抗虫棉 C．本实例中，可用卡那霉素和潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞 D．通过该过程能定向改造抗虫蛋白分子的结构，使之更加符合人类需要 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、蛋白质工程需要对基因进行改造，图中也属于蛋白质工程，A错误； B、本实例需要先将重组质粒导入农杆菌中，再用农杆菌去侵染棉花细胞，B错误； C、农杆菌转化法中是T-DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，根据T-DNA的左边界和右边界判断，能导入植物细胞的抗性基因只有潮霉素抗性基因，所以只能用潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞，C错误； D、改造基因后定向改造了抗虫蛋白分子的结构，更符合人类的需要，D正确。 故选D。 11．(24-25高二下·新疆哈密伊州区哈密第十五中学·期末)下列案例是通过实施蛋白质工程获得的是（    ） A．在山羊乳腺生物反应器中表达出人α-抗胰蛋白酶 B．对胰岛素进行改造，使其成为速效性药品 C．利用乳腺生物反应器大量生产干扰素 D．含外源生长激素基因的超级小鼠的培育 【答案】B 【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求；（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质） 2、基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径。 【详解】A、山羊乳腺生物反应器表达人α-抗胰蛋白酶属于基因工程，A不符合题意； B、对胰岛素进行改造，使其成为速效性药品，改造后的蛋白质不是自然界中原有的蛋白质，该技术属于蛋白质工程，B符合题意； C、乳腺生物反应器生产干扰素为基因工程应用，未涉及蛋白质结构改造，C不符合题意； D、将外源生长激素基因导入小鼠体内培育超级小鼠，属于基因工程技术，D不符合题意。 故选B。 12．(24-25高二下·四川南充·期末)甲酸脱氢酶（FDH）是将CO2还原为甲酸的重要生物催化剂，但其催化活性和热稳定性仍存在一定的局限。研究者们提出利用蛋白质工程改FDH性能的策略。下列叙述错误的是（    ） A．新FDH的预期功能，是合成和改造FDH基因的主要依据 B．改造后的FDH基因需要加上起始密码子等调控元件才能表达 C．可利用基因的定点突变技术进行碱基替换，从而实现氨基酸序列的改变 D．具有优异性能的FDH突变体，为解决温室效应和能源危机提供了新思路 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。所以要利用蛋白质工程钙造FDH性能，应依据新FDH的预期功能，合成和改造FDH基因，A正确； B、起始密码子位于mRNA上，属于翻译的起始信号，改造后的FDH基因需要加上启动子等调控元件才能表达，B错误； C、基因定点突变技术通过替换特定碱基改变对应的密码子，从而改变氨基酸序列，导致该基因转录出的mRNA上密码子改变，从而改变氨基酸序列，C正确； D、改进后的FDH催化活性和热稳定性高，可高效催化CO2还原为甲酸，有助于减少温室气体并生产能源物质，D正确。 故选B。 13．(24-25高二下·四川绵阳·期末)链霉菌是抗生素的主要产生者。科学家期望通过基因工程改造链霉菌，提高其活性物质的表达量。下列说法正确的是（　　） A．在基因工程的基本操作过程中，只能通过PCR获取目的基因 B．为避免目的基因与载体反向连接，可用2种限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段 C．若选用的限制酶识别序列为5'-↓GATC-3'，切割后产生的是平末端 D．若通过蛋白质工程获得新的抗生素，第一步操作应该是获取目的基因 【答案】B 【详解】A、获取目的基因的方法包括PCR扩增、从基因组文库中直接分离、化学合成法等，并非只能通过PCR，A错误； B、使用两种不同的限制酶切割载体和目的基因，可产生不同的黏末端，确保目的基因定向插入载体，避免反向连接，B正确； C、识别序列5'-↓GATC-3'的切割位点在G前，切割后产生的是黏性末端（如Sau3AⅠ酶切后形成5'-GATC-3'的黏性末端），而非平末端，C错误； D、蛋白质工程的第一步是根据预期蛋白质的功能设计结构，而非直接获取目的基因，D错误。 故选B。 14．(24-25高二下·广东东莞·期末)2024年诺贝尔化学奖授予了在蛋白质研究领域做出卓越贡献的科学家，其中戴米斯·哈萨比斯和约翰·江珀开发的AI工具AlphaFold实现了蛋白质三维结构的高效预测。下列相关叙述错误的是（    ） A．肽链上氨基酸之间能形成氢键等，从而使肽链盘曲折叠 B．蛋白质工程的基本思路是从设计预期的蛋白质结构出发 C．AlphaFold可以为蛋白质工程改造蛋白质提供技术支持 D．AlphaFold预测的蛋白质结构需要通过实验进行验证 【答案】B 【分析】氨基酸在核糖体中通过脱水缩合形成多肽链，而脱水缩合是指一个氨基酸分子的羧基（-COOH ）和另一个氨基酸分子的氨基（-NH2）相连接，同时脱出一分子水的过程；连接两个氨基酸的化学键是肽键。 【详解】A、肽链的盘曲折叠依赖于氨基酸之间的氢键等化学键，如α螺旋和β折叠的形成均与氢键有关，A正确； B、蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发设计结构，而非直接以结构为起点，B错误； C、AlphaFold通过预测蛋白质三维结构，可为蛋白质工程提供结构基础，辅助改造蛋白质，C正确； D、AI预测的蛋白质结构需通过实验（如X射线晶体衍射）验证其准确性，D正确。 故选B。 15．(24-25高二下·天津滨海新区·期末)枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。将枯草杆菌蛋白酶分子的天冬氨酸（99）和谷氨酸（156）改成赖氨酸，可使其在一定条件下的活力提高。下列说法错误的是（    ） A．完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现 B．蛋白质工程需要直接改造蛋白质 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息，并表达出蛋白质 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程通过修改基因来改变蛋白质结构，因为基因控制蛋白质的合成，故替换氨基酸需改造基因，A正确； B、蛋白质工程并非直接改造蛋白质，而是通过基因修饰或合成新基因来实现，直接改造蛋白质无法遗传，B错误； C、经基因改造后的酶活性变化由基因决定，属于可遗传变异，C正确； D、蛋白质工程最终目的是获得所需蛋白质，需先设计基因序列再表达，D正确。 故选B。 16．(24-25高二下·江西萍乡·期末)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。在此过程中，需要（　　） A．研究绿色荧光蛋白的氨基酸序列和空间结构 B．直接对绿色荧光蛋白分子进行显微操作 C．利用基因的定点突变技术对GFP基因进行碱基的改造 D．构建含GFP基因、启动子、终止密码子等的基因表达载体 【答案】AC 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、科研人员以GFP基因为材料，获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。在此过程中，需要研究绿色荧光蛋白的氨基酸序列和空间结构，进而通过蛋白质工程获得多种荧光蛋白，A正确； B、上述操作不是通过直接对绿色荧光蛋白分子进行显微操作进行的，B错误； C、利用基因的定点突变技术对GFP基因进行碱基的改造可能获得多种荧光蛋白，C正确； D、终止密码子位于mRNA上，基因表达载体上含终止子而不是终止密码子，D错误。 故选AC。 17．(24-25高二下·黑龙江龙东十校联盟·期末)水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。流程如下图所示。 有关叙述正确的是（　　） A．物质a是氨基酸序列（多肽链），物质b是mRNA B．物质b可能不同，但合成的蛋白质空间构象一般相同 C．在这项研究中，目前可行的直接操作对象是基因 D．蛋白质工程原则上只能改造自然界中已存在的蛋白质 【答案】ABC 【详解】A、据图可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA，A正确； B、在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象一般相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子，B正确； C、蛋白质工程要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过基因来完成，目前可行的直接操作对象是基因，C正确； D、蛋白质工程对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，D错误。 故选ABC。 18．(24-25高二下·内蒙古部分学校·期末)玉米中赖氨酸含量较低，原因是赖氨酸含量升高会抑制相关酶的活性，如图所示。科研人员将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米中游离的赖氨酸含量得以提高。下列叙述错误的是（    ）    A．基因工程能够实现对AK基因和DHDPS基因特定位置的定点突变 B．改造后的AK和DHDPS的氨基酸序列发生了改变，蛋白质结构没有改变 C．改造后的AK和DHDPS与赖氨酸结合的能力增强，导致反馈抑制作用更明显 D．该研究体现了蛋白质工程可以生产自然界没有的蛋白质 【答案】BC 【详解】A、基因工程可通过目的基因扩增时设计合适的引物实现基因的定点碱基替换，因此基因工程能够实现对AK基因和DHDPS基因特定位置的定点突变，A正确； B、蛋白质的结构多样性与构成蛋白质的氨基酸的种类、数量、排列顺序以及肽链的空间结构有关，改造后的AK和DHDPS的氨基酸序列发生了改变，因此蛋白质结构也发生了改变，B错误； C、改造后的AK和DHDPS与赖氨酸结合的能力增强，使赖氨酸通过反馈作用对DHDPS的抑制作用减弱，从而使游离的赖氨酸含量得以提高，C错误； D、该研究属于蛋白质工程，蛋白质工程可以通过改造基因从而生产自然界没有的蛋白质，D正确。 故选BC。 19．(24-25高二下·河北部分名校·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的部分过程，获得的基因DNA可导入大肠杆菌进行表达，字母表示相关物质，数字代表相关过程。下列叙述错误的是（    ） A．a表示多肽链，b表示mRNA，步骤④需要用逆转录酶 B．利用蛋白质工程获得的mRNA序列与动物细胞内干扰素mRNA序列不一定相同 C．①②③表示中心法则中遗传信息流动的部分过程 D．用蛋白质工程生产干扰素所用的基因表达载体不需要启动子和终止子 【答案】ACD 【分析】蛋白质工程的流程是从预期蛋白质功能出发，推测氨基酸序列，进而推导出对应基因的核苷酸序列，此过程属于中心法则的逆向应用；由于密码子具有简并性，推导的 mRNA 序列与动物细胞内原序列可能不同。 【详解】A、分析图可知，a表示多肽链，b表示mRNA，步骤④是直接通过相应的脱氧核苷酸序列合成基因DNA，不需要逆转录酶，A错误； B、密码子具有简并性，一种氨基酸可能对应几种密码子，所以由氨基酸序列得到的mRNA上的碱基序列不是唯一的，具有多样性，B正确； C、①表示转录，②表示翻译，③表示多肽链的加工过程，其中①②是中心法则中遗传信息流动的部分过程，C错误； D、基因表达载体必须包含启动子、终止子、目的基因和标记基因等，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是转录终止的信号，缺少启动子和终止子基因无法表达，D错误。 故选ACD。 20．(24-25高二下·辽宁抚顺六校协作体·期末)水蛭素是由65个氨基酸组成的单链多肽，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性，基本思路如图所示。下列有关叙述错误的是（    ） A．物质b是mRNA，物质b到物质a的过程表示翻译 B．根据物质a只能推测出一种对应的DNA序列 C．对水蛭素的改造是通过改造水蛭素基因来完成的 D．通过蛋白质工程只能生产自然界中已存在的蛋白质 【答案】BD 【详解】A、物质a是多肽链，物质b是mRNA，物质b到物质a的过程表示翻译，A正确； B、由于密码子的简并现象，根据多肽链的氨基酸系列能推测出多种对应的DNA序列，B错误； C、蛋白质工程是通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，对水蛭素的改造是通过改造水蛭素基因来完成的，C正确； D、蛋白质工程可以改造自然界已有的蛋白质，也可以生成自然界中不存在的蛋白质，D错误。 故选BD。 21．(24-25高二下·江苏无锡·期末)科研人员将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，研发出了速效胰岛素类似物产品并在临床上广泛应用。下列叙述正确的有（    ） A．该过程属于蛋白质工程，生产的速效胰岛素类似物自然界不存在 B．胰岛素改造思路与中心法则的信息流动方向是一致的 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物想要达到预期的疗效，还需检测其高级结构是否正确 【答案】AD 【分析】蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 【详解】A、该工程通过对天然胰岛素的氨基酸序列进行改造，属于蛋白质工程，改造后生产的蛋白质（速效胰岛素类似物）是自然界不存在的，A正确； B、天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的基本思路与中心法则相反，B错误； C、蛋白质工程的实质是对基因进行改造，需要用限制酶和DNA连接酶等工具，不需要蛋白酶，C错误； D、物质的结构决定功能，蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，胰岛素类似物想要达到预期的疗效，还需检测其高级结构是否正确，D正确。 故选AD。 22．(24-25高二下·贵州安顺·期末)水蛭素(Hirudin)是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，若将其第47位天冬酰胺替换成赖氨酸，可以提高其抗凝血活性，能有效预防和治疗血栓，流程如下图1所示。 回答下列问题： (1)利用蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性，直接操作对象是_______。 (2)天然水蛭素产量有限，若利用基因工程制备重组水蛭素，可从_______细胞获取mRNA后，通过逆转录、修饰、PCR等获得目的基因。相较于普通酶而言，PCR过程中所用的DNA聚合酶具有的特点是_______。 (3)构建基因表达载体过程如图2所示，为使目的基因与质粒高效连接，应选用的限制酶是_______，原因是_______。若采用大肠杆菌作为受体细胞，应选择颜色为_______的大肠杆菌菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良水蛭素的工程菌株。 【答案】(1)水蛭素基因 (2) 水蛭唾液腺 耐高温 (3) XmaⅠ和BglⅡ 这两种限制酶切割产生的黏性末端与目的基因的黏性末端相同 白色 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，其直接操作的对象是水蛭素基因。 （2）水蛭素(Hirudin)是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，若利用基因工程制备重组水蛭素，可从水蛭唾液腺细胞获取mRNA后，通过逆转录、修饰、PCR等获得目的基因。PCR过程需要高温使DNA变性，所以该过程中所用的DNA聚合酶具有耐高温的特点。 （3）由图可知，限制酶Xmal和BglⅡ切割产生的黏性末端分别与目的基因两端的黏性末端相同，使目的基因与质粒高效连接，应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ。mlacZ的表达产物会使菌落呈蓝色，否则菌落呈白色，由于Xmal和BglⅡ破坏mlacZ基因，所以重组质粒中mlacZ基因被破坏，应选择颜色为白色的大肠杆菌菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良水蛭素的工程菌株。 23．(24-25高二下·吉林长春朝阳区长春外国语学校·期末)人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，但给心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白，会诱发颅内出血。研究表明，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸（密码子UGU）换成丝氨酸（密码子UCU），制造出性能优异的t-PA改良蛋白，能显著降低颅内出血的副作用。某研究小组利用重叠延伸方法对t-PA基因进行定点突变，其改良过程如图1所示。回答下列问题。 (1)科学家将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于_______范畴。获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是_______（选择正确编号并排序）。 ①t－PA蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t-PA基因序列③检验t－PA蛋白的结构和功能④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白 (2)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。引物b中突变位点的碱基和引物c中突变位点的碱基分别为_______。 (3)重叠延伸过程中，用于PCR3的是AB上链和CD下链，请在下图中  中标注两条链方向_________（填“5”或“3”）。 (4)据图可知，利用PCR3获得大量的t-PA改良基因，需要的引物是_______，引物的作用是_______。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因_______（答两点）。 (5)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶_______切开，才能与t-PA突变基因高效连接。 (6)mlacZ表达产物会使细胞呈黄色，使菌落呈现黄色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有_______的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的表型是_______。 【答案】(1) 蛋白质工程 ①④②⑤③ (2)G/鸟嘌呤和C/胞嘧啶 (3) (4) 引物a和引物d 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 复性的温度过低、引物特异性不高 (5)XmaⅠ、BglⅡ (6) 新霉素 （具有新霉素抗性且)菌落呈白色 【分析】根据图示可知，通过重叠延伸PCR实现对t-PAt-PA基因的定点诱变，根据目的基因两端的黏性末端可知，目的基因和质粒应该均用BglⅡ和XmaⅠ同时切割。 【详解】（1）由题干信息可知，生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t－PA蛋白，因此属于蛋白质工程。蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能、设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，因此获得性能优良的t－PA突变蛋白的正确顺序是①t-PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t-PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t－PA蛋白→③检验t-PA蛋白的结构和功能。 （2）已知t－PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t－PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t－PA基因上链与第84位密码子对应位置发生的碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t－PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与t－PA基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C。 （3）PCR3中AB上链和CD下链既作为模板链，又作为引物延伸子链，由于DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此两条链的方向是。 （4）利用PCR3获得大量的t-PA改良基因，扩增的是完整的目的基因，两种引物的结合部位应该在目的基因的两端，应该选择引物a、d，DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。出现非目的序列产物的原因有：引物设计太短（或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性）、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。 （5）根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。 （6）在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，可以在培养基中加入新霉素，筛选出含重组质粒的大肠杆菌。由于构建基因表达载体时，mlacZ基因被破坏，故可以在该培养基上，含重组质粒的大肠杆菌可以存活且菌落呈白色。 24．(24-25高二下·广东潮州·期末)水蛭唾液腺分泌的水蛭素(Hiruan)是一种优良的凝血酶抑制剂，在血栓治疗上有着重要的医学价值，但天然的水蛭素的临床活性较低，如果将水蛭素分子中第47位的天冬酰胺替换成赖氨酸，其分子活性会提高20倍。如图表示改造 Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。回答下列问题： (1)获取目的基因：从水蛭唾液腺细胞中获取_______反转录得到cDNA后，利用PCR引物在 Hirudin基因内部碱基进行替换，需要在__________(填引物)中设计特定的碱基，从而对 Hirudin 基因进行改造以获得改良的 Hirudin 蛋白。 (2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11与 Hirudin改良基因高效连接，应选用___________对pCLY11进行酶切。与单酶切相比，采用双酶切的优点有___________(答两点)。 (3)将经蛋白质工程改造后得到的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如下图所示。推测两种蛋白酶水解处理后，酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的_______(填“种类”或“含量”)有关。 (4)得到控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因后，利用基因工程可以制备乳腺生物反应器，让哺乳动物批量生产高抗凝血活性的水蛭蛋白，此时需要将______与______等调控原件重组在一起。某生物兴趣小组同学大胆推测，用类似方法制备膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的__________(写出两点)的限制。 【答案】(1) mRNA/信使RNA 引物2和引物3 (2) XmaⅠ和BglⅡ 可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接 (3)种类 (4) 控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因（药用蛋白基因） 乳腺中特异表达的基因的启动子 性别和生理状态 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）可以从水蛭唾液腺细胞中获取mRNA反转录得到cDNA。因为引物与模板链互补配对进行扩增，要在基因内部引入特定碱基对实现替换，需要在引物2和引物3中设计特定的碱基。 （2）Hirudin改良基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶Xmal和BglⅡ切割产生的黏性末端能与Hirudin改良基因的黏性末端碱基互补，要想把Hirudin改良基因与质粒pCLY11(运载体)拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶XmaI和BglⅡ切。与单酶切相比，采用双酶切的优点有可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。 （3）据图可知，水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，水解产物中的肽含量随着时间的延长均上升，且差别不大，而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终明显高于经酶乙处理的酶解产物的抗凝血活性；据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因可能是对水蛭蛋白进行酶解时所用酶的种类不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。 （4）得到控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因后，利用基因工程可以制备乳腺生物反应器，让哺乳动物批量生产高抗凝血活性的水蛭蛋白，此时需要将控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因（药用蛋白基因）与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控原件重组在一起。与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器的优势在于不受转基因动物性别和生理状态的限制，因为尿液是无论雌雄、无论不同年龄都是要产生的。 25．(24-25高二下·福建福州福清·期末)水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题： (1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是__________，物质b是__________。 (2)若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要实验思路为：将改造后的水蛭素基因与__________的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过__________导入哺乳动物的__________。 (3)与该方法相比，诱变育种的缺点是（写出两点）__________。 (4)除乳腺生物反应器外，也可利用大肠杆菌为受体生产水蛭素，其中用__________生产的水蛭素活性更高，原因是__________。 (5)为检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用__________通过__________技术进行检测。 【答案】(1) 多肽链 mRNA (2) 乳腺蛋白基因 显微注射法 受精卵 (3)突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料 (4) 乳腺生物反应器 大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对水蛭素进行加工，而乳腺生物反应器产生的水蛭素可经过加工具有活性 (5) 抗水蛭素的抗体 抗原-抗体杂交 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因。根据这个流程，物质a是多肽链，它是根据预期蛋白质结构推测出的氨基酸序列连接而成的，物质b是mRNA，基因转录形成mRNA，再由mRNA翻译形成蛋白质。 （2）将改造后的水蛭素基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过显微注射法导入哺乳动物的受精卵。 （3）突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料。 （4）利用乳腺生物反应器生产的水蛭素活性更高。原因是大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，无法对水蛭素进行加工修饰；而乳腺生物反应器是真核生物细胞，有内质网和高尔基体等细胞器，能够对水蛭素进行加工修饰，使其空间结构更接近天然水蛭素，从而具有更高的活性 （5）检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用抗水蛭素的抗体通过抗原-抗体杂交技术进行检测。 26．(24-25高二下·广西钦州·期末)研究者利用图中质粒构建重组DNA分子并导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，从而解决了胰岛素药源不足的问题。回答下列问题：    注：图中几种限制酶识别序列和切割位点分别为：BamHI：5'-G↓GATCC-3'，EcoRI：5'-G↓AATTC-3'，SmaI：5′-CCC↓GGG-3'，SalI：5'-G↓TCGA-3'，LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，以颜色不同为依据直接筛选含重组DNA分子菌体的方法称为“蓝白斑”法。 (1)提取胰岛B细胞中的总RNA，通过一定方法分离纯化出mRNA，经________得到cDNA，然后设计引物利用PCR扩增胰岛素基因。选择胰岛B细胞提取RNA的原因是______。 (2)已知胰岛素基因的α链为编码链，据图1分析，利用PCR扩增胰岛素基因时，需对引物①～④进行特殊处理。PCR所需的引物组合是_______，在引物②的______（填“3'端”或“5'端”）添加BamHI识别序列和强启动子，该片段扩增4次循环，需要消耗引物______个。 (3)为确保目的基因正确插入图2的载体中，需要选择的限制酶组合是_______。已知胰岛素基因α链的碱基序列为5′-TTTAAAGGG…-3'，强启动子的碱基序列为5'-GCTGCATG-3'，写出胰岛素基因上游引物的18个碱基序列：5′-_______3'。 (4)“蓝白斑”法是基因工程中常用的筛选方法。简述将目的基因导入大肠杆菌并筛选工程菌的过程：______。 (5)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。请写出获取赖脯胰岛素的流程：________。 【答案】(1) 逆（反）转录 胰岛B细胞表达胰岛素基因 (2) ②③ 5'端 30 (3) BamHI和SalI GGATCCGCTGCATGTTTA (4)经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养--段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌 (5)从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定 。 【详解】（1）先提取胰岛B细胞中的总RNA，通过一定方法分离纯化出胰岛素基因的mRNA，经逆转录过程得到cDNA，然后设计引物并利用PCR扩增胰岛素基因。选择胰岛B细胞提取RNA是因为胰岛素基因在胰岛B细胞中选择性表达。 （2）DNA复制的方向是从模板链的3'开始，因此PCR所需的引物组合是②③；引物使DNA聚合酶能够从3'端开始连接脱氧核苷酸，据图1所示，在构建重组DNA分子时需要用到BamHI和SalI识别序列，已知胰岛素基因的α链为转录模板，因此在引物②的5′端添加BamHI识别序列和强启动子，DNA扩增时，每条单链需要一个引物，1个DNA分子复制4次，共得到24=16个DNA分子，32条单链，因为DNA分子是半保留复制，最初的两条母链不需要复制，所以需要的引物数是32-2=30，需要消耗引物30个。 （3）据图1所示，在构建重组DNA分子时需要用到BamHI和SalI识别序列，已知胰岛素基因的α链为转录模板，因此在引物②的5′端添加BamHI识别序列和强启动子，在引物③的5′端添加SalI识别序列。为确保胰岛素基因正确插入图2的载体中，需选择的限制酶组合是BamHⅠ和SalⅠ。已知胰岛素基因α链的碱基序列为5'—TTTAAAGGG…—3'，强启动子的碱基序列为5'—GCTGCATG—3'，在胰岛素基因上游还要有BamH的识别序列5'-G↓GATCC-3，按图所示顺序，则胰岛素基因上游引物的18个碱基序列为5'—GGATCCGCTGCATGTTTA—3' （4）将胰岛素基因导入大肠杆菌并利用“蓝白斑”法筛选工程菌的过程为：经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，筛选出白色的菌落即为工程菌。 （5）获取赖脯胰岛素的流程可概括为：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质。 地 城 考点05 生物技术的安全与伦理问题 1．(24-25高二下·河南天一大联考·期末)随着生物技术的飞速发展，生物技术的安全性与伦理问题日益受到关注。下列相关叙述正确的是（　　） ①基因编辑技术可能会引发“设计完美婴儿”等伦理争议，破坏人类遗传多样性 ②转基因作物的种植可能会导致基因污染，对生态环境造成潜在威胁 ③生殖性克隆人涉及伦理问题，而治疗性克隆不涉及伦理问题 ④生物武器具有传染性强、危害大等特点，被国际社会严格禁止 A．①②④ B．①②③ C．②③④ D．①③④ 【答案】A 【详解】①基因编辑技术若用于人类生殖细胞，可能通过人为选择特定基因改变后代遗传信息，导致基因库单一化，破坏遗传多样性，并引发伦理争议，①正确； ②转基因作物的外源基因可能通过杂交扩散到野生植物中，造成基因污染，威胁生态系统的稳定性，②正确； ③治疗性克隆虽以医疗为目的，但涉及胚胎的利用和销毁，仍存在伦理争议（如胚胎是否具有生命权），③错误； ④生物武器具有强传染性和高危害性，国际社会通过《禁止生物武器公约》严格禁止其研发和使用，④正确。 综上①②④正确，BCD错误，A正确。 故选A。 2．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)下列关于生物技术的应用、安全性与伦理问题的叙述，错误的是（　　） A．大田种转基因抗虫棉时，间隔种植少量非转基因棉，以维持田间物种多样性 B．α-淀粉酶阻断淀粉储存使花粉失活，可将其基因与目的基因共转入植物，防止转基因花粉传播 C．我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 D．任何国家都应严格禁止生产和使用生物武器 【答案】A 【详解】A、间隔种植非转基因棉的主要目的是作为害虫的庇护所，延缓害虫对转基因抗虫棉产生抗性，A错误； B、将α-淀粉酶基因与目的基因共转入植物，可阻断花粉中淀粉的储存，导致花粉失活，从而防止转基因植物通过花粉传播基因污染，B正确； C、我国政府明确反对生殖性克隆人实验，但对治疗性克隆持支持态度，C正确； D、根据《禁止生物武器公约》，所有缔约国均承诺禁止生产和使用生物武器，D正确。 故选A。 3．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)随着克隆羊“多莉”、克隆犬“龙龙”等克隆动物的不断出现，克隆人似乎离我们越来越近了。下列叙述错误的是（　　） A．生殖性克隆人的出现有可能破坏现有的家庭和社会结构 B．治疗性克隆是为了进行医学研究和治疗，仍需监管审查 C．虽然生殖性克隆人存在伦理问题，但克隆技术已经成熟 D．生殖性克隆和治疗性克隆属于无性繁殖，与试管婴儿原理不同 【答案】C 【详解】A、生殖性克隆人可能导致家庭关系混乱（如克隆人与供体身份冲突），并引发社会伦理争议，A正确； B、治疗性克隆虽用于医学治疗，但涉及胚胎操作和潜在伦理风险，仍需严格监管，B正确； C、目前动物克隆技术仍存在成功率低、克隆个体健康问题等技术瓶颈，生殖性克隆人技术远未成熟，C错误； D、生殖性克隆和治疗性克隆均通过核移植实现，属于无性繁殖；而试管婴儿需体外受精形成受精卵，属于有性生殖，D正确。 故选C。 4．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)下列有关生物技术叙述正确的是（    ） A．转基因作物的长期、大规模种植不利于侵染力更强的害虫的出现 B．我国允许治疗性克隆的研究，但严禁任何形式的生殖性克隆人行为 C．只要有证据表明某种转基因食品有害，就应全面禁止转基因技术在食品上的应用 D．生物武器包括致病菌类、病毒类、毒品类、生化毒剂类等，能对动植物和人类造成严重危害 【答案】B 【分析】基因工程的应用：①植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。②动物基因工程：提高动物生长速度；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物，如乳腺生物反应器和膀胱生物反应器。③基因治疗是把正常基因导入病人的体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗的目的，这是治疗遗传病最有效的手段。 【详解】A、转基因作物长期种植会对害虫产生自然选择压力，导致抗性害虫逐渐增多，反而可能促进侵染力更强的害虫出现，A错误； B、我国政策明确支持治疗性克隆，但严格禁止生殖性克隆人，符合伦理规范，B正确； C、转基因技术的应用需科学评估，单一有害案例不能全盘否定技术本身，应具体分析并加强监管，C错误； D、生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，毒品类（如海洛因）属于违禁药物，不属于生物武器，D错误。 故选B。 5．(24-25高二下·浙江嘉兴·期末)2021年4月15日，《中华人民共和国生物安全法》正式实施，下列做法和分析符合生物安全法的是（　　） A．不发展、不生产生物武器 B．可以开展人类的生殖性克隆 C．转基因食品由于制作时已被灭活，无需风险评估 D．将目的基因转入叶绿体的农作物不影响周围物种 【答案】A 【详解】A、《中华人民共和国生物安全法》明确规定禁止开发、制造或持有生物武器，因此“不发展、不生产生物武器”符合法律规定，A正确； B、生殖性克隆人违背伦理且被法律明文禁止，B错误； C、转基因食品需经过严格的安全评估和审批流程，即使灭活仍需风险评估，C错误； D、将目的基因转入叶绿体DNA中，由于叶绿体基因属于母系遗传（花粉中不含叶绿体），可减少基因通过花粉扩散到其他物种的风险，但并不代表对周围物种没有影响，如转基因抗虫棉会导致周围的物种更多地被害虫破坏，D错误。 故选A。 6．(24-25高二下·黑龙江哈尔滨师范大学附属中学·期末)生物技术就像一把“双刃剑”，它既可以造福人类，也可能在使用不当时给人类带来潜在的危害。下列叙述错误的是（　　） A．我国保留生物武器的研发项目以应对国外生物武器及其技术和设备的威胁 B．干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，但也存在导致肿瘤发生的风险 C．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染 D．随着基因组编辑技术的发展，科学家可以在体内和体外对基因进行敲除、插入 【答案】A 【详解】A、根据《禁止生物武器公约》，我国在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，因此“保留生物武器的研发项目”违反公约，A错误； B、干细胞具有自我更新和分化潜能，若体外培养时失去调控可能异常增殖形成肿瘤，B正确； C、转基因作物的花粉可能通过媒介传播至野生近缘种，导致基因污染，需通过隔离种植等措施防范，C正确； D、基因组编辑技术可在体内直接修改基因，或在体外培养细胞中编辑后回输体内，D正确。 故选A。 7．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)生物技术是一把双刃剑，它的发展既可以造福人类，同时也伴随着潜在的风险和挑战。下列有关叙述错误的是（　　） A．生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等 B．生物武器具有传染性强、攻击范围广等特点 C．治疗性克隆的目的是用于医学研究和治疗，无需监管审查 D．生殖性克隆涉及细胞核移植技术，我国政府不接受任何生殖性克隆人实验 【答案】C 【详解】A、生物武器包括致病菌类（如炭疽杆菌）、病毒类（如天花病毒）和生化毒剂类（如肉毒杆菌毒素），A正确； B、生物武器具有传染性强、作用范围广、危害时间长等特点，B正确； C、治疗性克隆虽用于医学研究和治疗，但涉及胚胎操作和伦理问题，需接受严格的监管审查，C错误； D、生殖性克隆需通过核移植技术培育个体，我国政府明确反对生殖性克隆人实验，D正确。 故选C。 8．(24-25高二下·黑龙江绥化肇东第四中学校·期末)下列关于生物技术的安全性及伦理问题的观点，错误的是（    ） A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质 B．生殖性克隆人问题带来了巨大的伦理挑战 C．反对“设计试管婴儿”的原因之一是试管婴儿技术属于无性繁殖方式 D．生物武器具有传染性强、作用范围广等特点，应严格禁止 【答案】C 【详解】A、转基因植物需严格筛选目的基因，防止产生有害物质（如毒素或过敏原），该观点正确，符合安全规范，A正确； B、生殖性克隆人涉及伦理争议（如个体独特性、社会关系混乱等），确实带来巨大挑战，B正确； C、试管婴儿技术通过体外受精形成胚胎，属于有性生殖，反对“设计试管婴儿”的伦理原因在于基因筛选可能引发歧视或伦理滥用，而非繁殖方式，C错误； D、生物武器具有强传染性、广危害性，国际公约明确禁止，D正确。 故选C。 9．(24-25高二下·河北衡水桃城区衡水第二中学·期末)转基因作物因其抗旱、抗寒、抗虫等能力而备受关注。下列关于转基因作物的叙述，错误的是（　　） A．转基因作物被食用后，其基因就整合到人的基因组中 B．种植的转基因作物可以与传统的农业种植区相隔离 C．可对转基因作物进行标识管理，让消费者有选择权 D．转基因作物的安全性涉及其是否会产生毒性或过敏蛋白 【答案】A 【详解】A、转基因作物的基因是DNA片段，食用后会被人体消化系统分解为脱氧核苷酸，无法直接整合到人的基因组中，A错误； B、转基因作物可能通过花粉传播与其他作物杂交，因此需与传统种植区隔离以减少基因污染风险，B正确； C、标识管理是保障消费者知情权和选择权的必要措施，符合生物安全伦理要求，C正确； D、转基因作物的安$ 专题03 基因工程 5大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程 考点05 生物技术的安全与伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具 1．(24-25高二下·宁夏固原·期末)基因工程技术的实施必须具备的四个必要条件是（　　） A．目的基因、DNA聚合酶、载体、受体细胞 B．工具酶、目的基因、载体、受体细胞 C．模板DNA、信使RNA、质粒、标记基因 D．重组DNA、RNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶 2．(24-25高二下·甘肃临夏州·期末)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，下列关于操作流程的叙述错误的是（　　） A．DNA溶于酒精，某些蛋白质不溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质 B．通常不选用哺乳动物血液作为实验材料，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核 C．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液静置于4℃冰箱中几分钟后，DNA存在于上清液中 D．可利用二苯胺试剂鉴定丝状物的主要成分——DNA，沸水浴后观察是否出现蓝色 3．(24-25高二下·新疆乌鲁木齐101中学·期末)限制酶的作用特点是（　　） A．识别特定RNA序列 B．切割双链DNA中特定磷酸二酯键 C．催化DNA双链随机断裂 D．连接DNA片段 4．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．可选择新鲜洋葱、香蕉、菜花或猪肝等作为实验材料 B．在4℃冰箱中进行过滤液沉淀是为了防止DNA被降解 C．加入预冷酒精后需用玻璃棒沿一个方向搅拌滤液 D．鉴定时将丝状物直接加入二苯胺试剂中并沸水加热 5．(24-25高二下·甘肃武威·期末)用A和B两种限制酶同时和分别处理某DNA分子，酶切位点及酶切产物的电泳鉴定结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．图中X代表的碱基对数为4500bp B．图中Y是限制酶A的酶切位点 C．图乙中①代表限制酶A，②代表限制酶B D．用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到4个末端 6．(24-25高二下·陕西渭南临渭区·期末)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”及“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验的叙述正确的是（    ） A．DNA溶于酒精，某些蛋白质不溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质 B．向含DNA的试管中加入二苯胺试剂，混合后即可比较观察颜色变化 C．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小和构象有关，与凝胶浓度无关 D．电泳凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来 7．(24-25高二下·甘肃武威·期末)在利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关操作正确的是（　　） A．利用定性滤纸进行过滤，以去除杂质，提高DNA的含量和纯度 B．研磨洋葱时，加入适量的研磨液瓦解细胞膜，充分释放核DNA C．该实验利用了DNA可溶于酒精而某些蛋白质不溶于酒精的原理 D．将白色丝状物加入4mL二苯胺试剂中沸水浴，以利于发生颜色反应 8．(24-25高二下·青海西宁城北区青海三江源民族中学·期末)下列关于基因工程的叙述，正确的是（　　） A．“分子缝合针”是限制性内切核酸酶 B．DNA连接酶和载体是构建重组质粒必需的工具酶 C．限制酶和DNA连接酶的作用都与磷酸二酯键有关 D．转基因烟草操作过程中常用烟草花叶病毒作载体 9．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法错误的是（　　） A．DNA连接酶和DNA聚合酶均能形成磷酸二酯键 B．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上 C．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割RNA片段 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不会剪切自身的DNA 10．(24-25高二下·江苏镇江六校等校联考·期末)某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。相关叙述不正确的是（    ）    A．为了方便对材料进行处理，也可以用新鲜猪血来代替猪肝用于DNA的粗提取 B．过程⑤加入酒精后，也可将溶液倒入离心管离心后取沉淀物 C．过滤液放入4℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性 D．提取到的丝状物先溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热后变蓝 11．(24-25高二下·贵州遵义区县一中·期末)培育转基因抗虫棉时，需要将Bt抗虫基因进行“切割”、改造和“拼接”；将重组DNA导入棉花细胞内并表达。下列有关基因工程叙述正确的是（　　） A．限制酶、RNA聚合酶可作用于DNA上的磷酸二酯键 B．T4DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的DNA片段 C．1种限制酶切割只有1个酶切位点的质粒时产生1个5′端 D．构建的基因表达载体上应具备启动子、终止子等调控元件 12．(24-25高二下·四川绵阳·期末)图是家庭版DNA的粗提取的过程。若该实验得到的DNA鉴定效果不明显，则可能的原因不包括（　　） A．实验所选用的材料中DNA含量较低 B．实验过程中酒精未预冷时，DNA被降解 C．粗提取的DNA中含有较多的杂质 D．鉴定时所用甲紫溶液失效，且未沸水浴加热 13．(24-25高二下·重庆第一中学校·期末)蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1-4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（    ） A．若用限制酶从该DNA片段中直接切取蛛丝蛋白基因，则会破坏2个磷酸二酯键 B．若用PCR技术获取蛛丝蛋白基因，则设计的引物应分别结合在1、4部位 C．若以蜘蛛核DNA为模板，至少需经过6次循环才可以获得32个等长的蛛丝蛋白基因 D．利用凝胶电泳检测PCR产物时，需将产物与核酸染料混合以便实时观察电泳进程 14．(24-25高二下·四川南充·期末)几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示）如下表所示。据表推测，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 A．限制酶使特定核苷酸序列特定部位的磷酸二酯键断开 B．BamHⅠ和Bel Ⅰ识别的核苷酸序列都能被Sau3A Ⅰ识别 C．SmaⅠ切割DNA 片段后形成的黏性末端，可用E.coli DNA连接酶连接 D．BamHⅠ切割产生的DNA片段能与BelⅠ切割产生的DNA片段相连接 15．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)用Xho I和Sal I两种限制酶分别处理同一DNA片段（限制酶在对应切点均能切开）。酶切位点及酶切产物电泳结果分别如图1和图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 B．解旋酶与图1中的两种限制酶均能催化氢键断裂 C．图2泳道②中可能是用Xho Ⅰ处理得到的酶切产物 D．用两种限制酶同时处理该DNA电泳后可得到6种条带 16．(24-25高二下·黑龙江大庆萨尔图区大庆实验中学·期末)下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是（　　） 限制酶 AluI BamHI SmaI Sau3AI 识别序列 切割位点 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑ A．BamHI和Sau3AI切割产生的片段能够相连，连接后的片段两者都能再切割 B．SmaI和AluI切割一次需切断2个氢键，增加2个游离的磷酸基团 C．①③连接时可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶，但后者连接效率低 D．②④⑤对应的识别序列均能被限制酶Sau3AI识别并切割 17．(24-25高二下·广东佛山·期末)关于DNA的粗提取和鉴定的实验，下列叙述错误的是（　　） A．将研磨液倒入垫有滤纸的漏斗中过滤以去除杂质 B．研磨液需在4℃的冰箱中放置几分钟后再取上清液 C．加入酒精出现丝状物后，用玻璃棒沿一个方向搅拌 D．溶解的DNA粗提物在沸水浴中与二苯胺反应呈蓝色 18．(24-25高二下·辽宁葫芦岛·期末)下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（　　） A．解旋酶、限制酶、DNA连接酶 B．DNA连接酶、限制酶、解旋酶 C．限制酶、解旋酶、DNA连接酶 D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶 19．(24-25高二下·青海西宁大通县·期末)“工欲善其事，必先利其器”，基因工程的实施也需要借助“工具”才能完成。下列相关叙述错误的是（　　） A．限制酶可以将DNA水解为脱氧核糖核苷酸 B．T4DNA连接酶可以连接DNA片段的平末端 C．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的作用对象相同 D．动植物病毒和噬菌体也可以作为基因工程中的载体 20．(24-25高二下·广西河池·期末)如图依次表示了BamHI和Sau3AI两种限制的识别序列与切割位点，据图分析，下列有关叙述正确的是（　　） A．二者的识别序列都由4个核苷酸组成 B．二者切割DNA分子可产生相同的黏性末端 C．二者切割DNA分子产生的片段不能相连接 D．能被Sau3AI切割的DNA也一定能被BamHI切割 21．(24-25高二下·河北邯郸复兴中学·期末)关于DNA是粗提取与鉴定的实验，依据的原理是（    ） A．DNA在NaCl溶液中的溶解度，随NaCl浓度的不同而不同 B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA C．DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于有机溶剂 D．在沸水中，DNA遇二甲苯会出现蓝色反应 22．(24-25高二下·湖南娄底部分普通高中·期末)现有一长度为3 000个碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制酶切割后进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1；用酶B单独酶切，结果如图2；用酶H和酶B同时酶切，结果如图3.下列相关叙述错误的是（　　） A．酶B和酶H有相同的识别并切割位点 B．酶H在该DNA分子上有2个识别并切割的位点 C．酶B和酶H同时切割时，有3个识别并切割的位点 D．酶B和酶H同时切割后，能够产生完全相同的DNA片段 23．(24-25高二下·河北衡水桃城区衡水第二中学·期末)下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，其中PAM序列是一个短DNA序列，单链向导RNA可引导Cas9内切酶到特定的基因位点进行切割。下列叙述错误的是（　　） A．Cas9内切酶能将脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开 B．细菌细胞中的限制酶也能起到类似Cas9内切酶的作用 C．Cas9内切酶定点切割与向导RNA和目标DNA结合无关 D．双链DNA的断裂修复过程需要DNA聚合酶的催化 24．(24-25高二下·江苏宿迁泗阳县·期末)关于“花菜DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．研磨前先用液氮冷冻处理花菜，有利于DNA的释放 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精这一原理来粗提DNA D．鉴定DNA时将丝状物或沉淀物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热出现蓝色 25．(24-25高二下·辽宁葫芦岛·期末)下列关于DNA的粗提取与鉴定实验，说法错误的是（　　） A．鸡血、猪肝等动物细胞可作为实验材料提取DNA，但方法可能有所不同 B．将洋葱研磨液过滤到烧杯中，需要在4℃冰箱放置几分钟，再弃上清液 C．利用DNA溶于酒精但某些蛋白质不溶于酒精的原理可以分离DNA和蛋白质 D．将粗提取的DNA（白色丝状物）溶解在2mol/L的NaCl溶液中用来进行鉴定 26．(24-25高二下·黑龙江绥化肇东第四中学校·期末)用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的是（　　）    A．图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同 B．图1中X代表的碱基对数为5500 C．推测图1中Y是限制酶B的酶切位点 D．推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 27．(24-25高二下·内蒙古巴彦淖尔·期末)某目的基因的两端含有限制酶EcoRI识别和切割的位点，使用单酶切割容易产生目的基因与质粒反向连接现象。用于扩增、检测目的基因是否正确连接的相关引物1～引物5如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．EcoRI酶切可使目的基因两端产生不同的黏性末端 B．目的基因与质粒反向连接会改变mRNA合成的方向 C．扩增目的基因时，选用的引物是1、5或引物2、3 D．检测目的基因与质粒是否正确连接时，可选用引物2、4 28．(24-25高二下·河北石家庄·期末)某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含目的基因的DNA片段，用限制酶进行酶切后，再用所得片段进行基因工程后续操作。下列叙述正确的是（　　） A．若将Spe I和Nhe I切出的末端连接形成片段，则该片段不能再被二者识别并切割 B．PCR中一个引物的序列为 5’ - TGCGCAGT -  3’，第3轮循环需消耗4个该引物 C．步骤①所用的酶是Nhe I和Cfo I，酶切后共产生2个游离的磷酸基团 D．酶切片段和载体连接时，仅可使用E.coli DNA连接酶催化磷酸二酯键合成 1．(24-25高二下·河南天一大联考·期末)乙肝疫苗是通过基因工程将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的基因导入酵母菌中表达，再利用发酵工程大规模生产获得的。已知HBsAg不能被酵母菌分泌到细胞外。下列相关叙述错误的是（　　）地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 A．为了提高转基因的成功率，可以通过PCR技术扩增基因 B．可以利用抗HBsAg抗体在分子水平上检测基因的表达产物 C．可利用酵母菌大量生产乙肝疫苗，在发酵之前需要对菌种进行扩大培养 D．发酵结束后从培养液中提取HBsAg，并对提取的HBsAg进行纯化、灭活 2．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析错误的是（　　）    A．泳道2与泳道1相比较，条带2变窄 B．出现条带1是因为O2蛋白与指示探针结合 C．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同 D．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合 3．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)将一段编码序列（CDS）插入到一个载体上，将该载体命名为pVN2024。如图A所示，将CDS插入到载体的SacⅡ位点，该位点位于lacZ基因的MCS区（含多个酶切位点），CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstI的酶切位点。为确认CDS的大小和插入方向，科研人员用不同的限制酶切割重组质粒并进行电泳，结果如图B。下列叙述正确的是（    ） （A图为载体示意图，方框内表示载体中限制酶识别位点）；（B图为不同限制酶切割产物的电泳示意图，M为标准电泳条带） A．SpeI酶切可用于判断CDS插入的方向 B．CDS插入时方向与lacZ基因的方向相同 C．CDS长度为2.6kb，在距一端0.5kb处有一个EcoRI识别位点 D．若重组质粒同时用EcoRI和SpeI酶切，电泳能检测到5个不同条带 4．(24-25高二下·陕西渭南临渭区·期末)聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，通过模拟生物体内DNA的自然复制过程，在体外特异性地去复制特定的DNA片段，它的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。下列说法正确的是（    ） A．利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶 B．PCR的每次循环包括复性、变性、延伸3个阶段 C．PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度控制PCR进程 D．复性时引物之间通过碱基互补配对结合 5．(24-25高二下·山东东营·期末)研究发现，果聚蔗糖酶（LSase）第404位氨基酸与其热稳定性密切相关。为提升LSase的热稳定性，科研人员以野生型LSase基因为模板，设计引物改变LSase第404位氨基酸对应的碱基序列，实现对氨基酸的定点替换，相关流程如图所示。已知大肠杆菌含有20种合成蛋白质的氨基酸，F和R代表突变引物，DpnI能特异性的水解甲基化的DNA。下列说法错误的是（　　） A．若要选出热稳定性最强的LSase，至少需要设计19对突变引物 B．推测混合处理是让质粒发生变性与复性，新合成的子链未甲基化 C．对突变质粒进行进一步扩增时，可继续使用突变引物F和R D．采用琼脂糖凝胶电泳技术不能区分出原始质粒与突变质粒 6．(24-25高二下·山东德州·期末)利用生物技术培育新品种、制备生物产品时都需要进行筛选或检测。下列说法错误的是（　　） A．用发酵工程生产柠檬酸钠时，应采用过滤、沉淀等方法获得产品 B．用 96 孔板筛选杂交瘤细胞时，每个孔中尽量只接种一个细胞 C．培育乳腺生物反应器时，可用 PCR 检测目的基因是否转录出 mRNA D．用植物体细胞杂交培育作物新品种时，需对杂种细胞和杂种植株进行筛选 7．(24-25高二下·福建福州福清·期末)PCR可看作生物体外特殊的DNA复制过程。如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链延伸的基础。下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的DNA水解，为PCR提供原料 B．PCR扩增时反应体系需加入模板、RNA引物、含Mg²⁺的缓冲液等成分 C．③为变性，使用90-95℃的高温处理是为断开引物与模板间形成的氢键 D．⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间 8．(24-25高二下·天津滨海新区·期末)如图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄植物的过程示意图，下列叙述错误的是（    ） A．过程A需要限制酶和DNA连接酶的参与，可将重组质粒直接侵染植物细胞 B．过程B可用处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 C．抗病毒基因整合到番茄细胞的染色体DNA上需要借助T-DNA的转移 D．转基因抗病毒番茄植株是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 9．(24-25高二下·四川眉山·期末)细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，将苏云金杆菌的 Bt 基因经改造后插入 Ti 质粒的 T—DNA 中构建基因表达载体，过程如下图所示。再用农杆菌转化获得了较强抗虫能力的抗虫棉。下列相关叙述错误的是（    ） 注：F1-F3, R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；p35s为启动子；Kanr表示卡那霉素抗性基因；HygBr表示潮霉素B抗性基因。 A．用人工合成的1—1362基因序列替换天然序列利用了密码子的简并性 B．在筛选转化成功的细胞时，常用含有潮霉素B的培养基进行筛选 C．构建基因表达载体时插入两个p35s启动子能促进目的基因的表达 D．提取抗虫棉的基因组DNA利用PCR技术检测目的基因时应选择引物F1和R2 10．(24-25高二下·河北邢台·期末)为提高水稻的产量，科研人员将EcCAT、OsGLO1、EcgCL*TSR与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列相关说法错误的是（　　） A．EcCAT基因和OsGLO1基因以DNA的不同链为模板进行转录 B．不可利用卡那霉素筛选成功导入目的基因的水稻细胞 C．T-DNA插入水稻细胞质的DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 D．为防止基因污染，可将外源α-淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻 11．(24-25高二下·四川达州普通高中·期末)天然β-淀粉酶耐热性较差，难以满足工业化生产需求。通过PCR对天然β-淀粉酶基因进行改造，将其导入大肠杆菌表达后，获得了一种耐高温的β-淀粉酶。与天然酶相比，改造后的酶在第476位发生了氨基酸替换，由天冬氨酸改变为天冬酰胺。下列叙述正确的是（    ） A．PCR技术在此过程中实现了对β-淀粉酶基因的定点突变 B．根据新的氨基酸序列可逆推出唯一对应的基因编码序列 C．对β-淀粉酶的改造实质是改变氨基酸的结构来改造功能 D．这种设计并合成耐高温的β-淀粉酶的技术属于基因工程 12．(24-25高二下·四川南充·期末)病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IF来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．将hCD46基因接入质粒应选用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ B．将重组质粒变为线性DNA应选用限制酶AgeⅠ和NotⅠ C．为获取大量胚胎用于移植，可用促性腺激素处理小鼠a，使其超数排卵 D．构建出的既表达hCD46又敲除IF基因的小鼠对麻疹病毒具有高易感性 13．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)质粒P有2个EcoRI、1个SacI、1个BamH三种限制酶的酶切位点。BamH酶切位点位于两个EcoRI酶切位点正中间，以下是不同酶切产物的电泳图谱：泳道①是未酶切的质粒P电泳条带。②到④分别为三种酶单酶切质粒P产物的电泳条带，⑤到⑦为双酶切质粒P产物的条带。以下说法正确的是（    ） A．电泳时片段移动方向是从正极到负极 B．图中②、③分别是SacI和EcoRI的酶切产物 C．泳道⑦为SacI和EcoRI酶切产物 D．泳道①②表明酶切后质粒P碱基数增大 14．(24-25高二下·江西上进联考·期末)研究人员利用基因工程技术制备乳腺生物反应器生产某种药用蛋白，已知该药用蛋白基因的mRNA序列为5'-UUACUUCCUG··CAAGUUUCAU-3',经逆转录得到cDNA,在其两端添加限制酶识别序列后利用PCR技术扩增，将扩增后的DNA与启动子A等元件重组构建基因表达载体，如下图所示。下列叙述正确的是（    ） A．含该药用蛋白基因的启动子，构建基因表达载体前需将其去除 B．由于启动子A具有组织特异性，该药用蛋白基因只在乳腺细胞中表达 C．PCR扩增时两种引物分别是5'-GAATTCTTACTT-3'和5'-CTGCAGATGAAA-3' D．构建的基因表达载体还需通过显微注射的方法导入雌性动物的乳腺细胞中 15．(24-25高二下·内蒙古呼和浩特和林格尔县民族中学·期末)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，临床上广泛用于治疗病毒感染性疾病。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶。下列有关叙述正确的是（　　） A．过程①依据的原理是DNA半保留复制，需要用到成对的引物 B．过程②构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间 C．过程③中Ti质粒的T-DNA能携带目的基因整合到根瘤农杆菌的染色体DNA中 D．过程④需要控制培养基中植物激素的种类和比例，以防愈伤组织细胞发生分化 16．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量。其原理是在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当子链延伸至探针处时，探针水解，使荧光监测系统接收到荧光信号，如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．引物中（G+C）含量越高，其与模板DNA结合的稳定性则越低 B．若引物1、2之间易发生碱基互补配对，则不能进行有效检测 C．实验后期荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等耗尽 D．若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入52个荧光探针 17．(24-25高二下·黑龙江大庆萨尔图区大庆实验中学·期末)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子（基因中的非编码序列）能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccI酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，AccI酶的识别位点为5'-GTATAC-3'，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列说法正确的是（　　） A．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸序列不同，数目相同 B．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3' C．若电泳结果只能观察到大约460bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 D．GT杂合型水稻品种经AccI酶切后电泳结果为3条条带 18．(24-25高二下·江西金太阳·期末)我国科学家利用逆境诱导型启动子OsNAC6调控水稻锌指蛋白在高盐胁迫下的表达，实现了作物在干旱条件下的产量提升。下图为OsNAC6与锌指蛋白基因融合后形成的融合序列的结构示意图，其转录的模板链为a链。下列叙述错误的是（    ） A．高盐胁迫下，DNA聚合酶与OsNAC6结合，进而合成锌指蛋白 B．体外扩增融合序列时，应选用引物1和4 C．1个融合序列在体外扩增n次需要2n+1－2个引物 D．可以采用农杆菌转化法将含有融合序列的表达载体导入水稻细胞 19．(24-25高二下·河北部分学校·期末)研究人员将从某种细菌中提取的耐盐基因a导入水稻细胞，获得了可在盐碱地种植的耐盐水稻新品种。下列关于该过程中相关操作的表述，正确的是（　　） A．原核生物可以为真核生物提供目的基因 B．构建基因表达载体时，可用识别不同序列但切出相同的黏性末端的限制酶酶切以防止反向连接 C．将含有a基因的表达载体导入水稻细胞需要借助标记基因进行筛选和鉴别 D．检测出水稻细胞中a基因成功表达后，还需要在个体水平上进行耐盐检测 20．(24-25高二下·山东聊城·期末)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列说法错误的是（    ） A．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 B．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况 21．(24-25高二下·广西桂林·期末)1973年，博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，这一实验标志着基因工程技术的诞生。下列相关叙述错误的是（　　） A．可利用显微注射法将重组质粒注入大肠杆菌体内 B．该实验证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞 C．该实验成功的基础之一是真核生物和原核生物共用一套密码子 D．利用PCR技术可检测非洲爪蟾核糖体蛋白基因是否转录出mRNA 22．(24-25高二下·新疆阿克苏第一中学·期末)反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程如图所示。 回答下列问题： (1)将Ⅰ过程得到的菌液接种到充满N₂的密闭试管中进行Ⅱ过程，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基上获得单菌落。与Ⅰ相比，Ⅱ所用培养基中还需要添加的物质是_______。培养瘤胃微生物时，除考虑营养物质外，还要考虑______、_______和渗透压等条件。 (2)分离出某真菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左向右，启动子通常具有物种特异性，为使大肠杆菌产生该酶，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择_的启动子，以图中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 ①W基因转录的模板链是________。利用PCR技术对W基因进行扩增时子链延伸的方向是________。 ②与质粒中启动子结合的酶是________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择________的启动子。 ③限制酶主要是从________中分离纯化出来的。应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 ④据下图分析，利用PCR技术获取W基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的_______，需扩增________次后得到W目的基因。 23．(24-25高二下·湖北黄冈中学·期末)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是__________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的指数级扩增。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落_______（填序号），出现菌落④的可能原因是________________________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路（不需写实验结果）____________________________。 24．(24-25高二下·浙江宁波·期末)粮食安全是“国之大者”，大豆是重要的农产品，改良大豆种子尤为重要。科研人员为研究大豆P34蛋白基因启动子（简称P启动子）的调控活性，将P启动子与GUS基因（一种报告基因，用于指示外源基因的表达情况；b链为转录模板链）融合，如图所示。通过农杆菌转化法导入烟草进行研究，旨在为大豆品质改良提供有力工具。 注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同 回答下列问题： (1)获得P启动子。据图分析，以大豆基因组DNA为模板，选取______（填数字）作引物进行PCR，可获得P启动子克隆。 (2)构建P-GUS基因表达载体。为了确保P启动子与GUS基因融合，且P-GUS基因能与Ti质粒高效连接，则需要在克隆P启动子的两种引物的______（5'或3'）端分别连接________两种限制酶识别序列，并用______两种限制酶对Ti质粒进行酶切。 (3)将P-GUS基因表达载体导入受体细胞和植物组织培养。先用______处理农杆菌，使细胞处于感受态，再将表达载体导入农杆菌，将其接种在含______的固体培养基中进行培养，筛选转化成功的农杆菌。再用农杆菌侵染经______的烟草叶片，置于MS培养基中，暗环境下培养3天，_______处理后，转移至分化培养基中，待根系发达后移栽至土中。 (4)P-GUS基因的检测和鉴定。可通过______技术确定P-GUS基因是否导入。为检验最终的实验目的是否达到，还应检测______（“P启动子”或“GUS基因”）在烟草各组织中的表达量。 25．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)为构建效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1中的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录出来的短链RNA与目的基因发生碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，能敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 (1)大肠杆菌的LacZ基因表达产物能使X-gal分解产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因。大肠杆菌在含_______的培养基上（添加了X-gal）培养，出现_______色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 (2)Cas9的表达量与敲除效率有关，但表达过量会对大肠杆菌产生毒性。为评估毒性和敲除效率，分别用ABCDE启动子对Cas9进行转录，结果如图2。其结果表明，启动子_____对细胞毒性最小。综合考量敲除效率和毒性，应选择启动子______作用于该系统。 (3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在LacZ基因被成功敲除的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为_____（填选项）。 A．含有质粒1和质粒2  B．只有质粒1 C．只有质粒2         D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板中筛选出质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，请简要写出实验设计思路并预测实验结果。________。 26．(24-25高二下·吉林松原宁江区吉林油田高级中学·期末)大刍草是玉米的原始祖先，具有较强的抗病抗逆特性，为玉米育种提供了原始的遗传材料。研究发现大刍草基因组中有一个D基因仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究D基因表达对卵细胞的影响，科研工作者设计了如图实验。据图回答： (1)D基因在大刍草卵细胞中不转录，可能卵细胞中D基因的________（结构）出现问题，无法启动转录过程。 (2)按如图所示，将重组的基因表达载体导入农杆菌前，先用________处理农杆菌细胞，使其处于一种________的生理状态。 (3)让农杆菌侵染大刍草愈伤组织，在愈伤组织培养基中需添加________和________，以便筛选导入融合基因的植物细胞。 (4)为确定大刍草基因组中B基因与育性相关，研究者用转基因技术进行一系列实验，将一段T-DNA插入到B基因中，致使该基因失活，记为b，再进行杂交。为方便确定实验中的子代植株的基因型，研究者据B基因、T-DNA的序列设计了3种引物，如图所示： 具体操作时，提取待测植株的总DNA，分别用“引物I+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否能扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR扩增）。推测结果：如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则植株的基因型为________；如果_______，则植株的基因型为BB；如果___________，则植株的基因型为bb。 27．(24-25高二下·甘肃定西临洮县·期末)我国科研团队从水稻中筛选出能调控耐高温性状的关键基因QT12，并将QT12基因导入水稻品种“华占”，获得的改良品种在高温下产量与品质均提升。回答下列问题： (1)科研团队利用PCR扩增QT12基因，引物是扩增过程的关键。根据QT12基因设计的四种引物如图所示，选用的引物组合应为________（选填“a”“b”“c”或“d”），理由是________。 (2)构建基因表达载体时，需要将QT12基因与启动子、终止子等连接，其中启动子的作用是________。若以质粒DNA分子为运载体，质粒上有标记的潮霉素抗性基因，则利用抗生素可初步筛选出含重组载体的水稻细胞，方法是________。 (3)将含QT12基因的表达载体导入水稻细胞后，需要通过________技术将单个细胞培育成完整植株。现要验证水稻的改良品种在高温下表现出更高的产量，请简要叙述实验思路和预期结果：________。 28．(24-25高二下·黑龙江佳木斯桦南县第一中学·期末)人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X-gal，从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列问题：    (1)过程①最好选用的限制酶方案是_______。 A．EcoRV和EcoRI B．BamHI和EcoRI C．HcoRV和BamHI D．只有BamHI (2)图中①过程叫做_______，②过程常采用的方法是_____，由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是_______。在注射型接种之前，需采用________方法对乙肝病毒外壳蛋白进行检测与鉴定。 (3)可用PCR技术迅速获取大量目的基因，在PCR反应缓冲液中一般要添加_______，以便激活DNA聚合酶的活性。目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是。扩增完成后，常采用_____的方法来鉴定PCR的产物。 (4)为了筛选，获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入_______，培养一段时间挑选出呈________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量的目的菌。在用稀释涂布平板法对目的菌进行计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为_______。 29．(24-25高二下·黑龙江大庆让胡路区大庆中学·期末)低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题： 限制酶 识别序列 限制酶 识别序列 EcoR I 5'G↓AATTC3' Xma I 5'C↓CCGGG3' BamH I 5'G↓GATCC3' Asc I 5'G↓GCGCGGG3' Sph I 5'CGTAC↓G3 Mun I 5'C↓AATTG3 Sau3A 5'↓GATC3 (1)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物________对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的5'端添加________（“Sph I”或“Sau3A”或“Mun I”）识别序列。 (2)根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶_________切割Ti质粒，并通过_________酶进行连接，连接后导入农杆菌，在培养基中添加_______来筛选成功导入质粒的农杆菌。 (3)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是________。 A．引物特异性不佳 B．复性温度太高 C．变性温度不够 (4)现已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，利用________技术对其进行检测，结果表明转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变________，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 30．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)无核葡萄品质优良，但抗寒性差。我国科学家以中国野生葡萄资源中抗寒性最强的山葡萄为材料，对抗寒基因Va的功能展开相关研究。 (1)通过前期研究结果，科研人员推测Va基因的产物可能为转录因子。转录因子是一类特定的蛋白，可以调控______与启动子的结合。 (2)研究者预通过PCR扩增Va基因，可通过分析Va蛋白的氨基酸序列，依据这些氨基酸所对应的_____推测mRNA序列以确定DNA序列，进而设计特异性引物，并在引物的_______端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR，利用______凝胶电泳分离并纯化DNA片段。 (3)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是______。 A．DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Va基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因 (4)为进一步验证Va基因的转录激活功能，科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中（图1）。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①敲除GAL4的原因是_____。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统（图2）实现对GAL4的敲除，sgRNA（一种小RNA）有引导作用，使Cas9酶在配对区域定点切割，导致基因丧失功能，因此sgRNA序列必须以_______为设计依据。如果要获得基因敲除酵母AH109菌株，应用_____法导入CRISPR/Cas9基因表达载体。 ②为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的_____组，此外还需额外添加______，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ③研究人员运用GAL4基因和pCG质粒构建了pG-GAL4重组载体，并将其导入酵母菌作为对照组1，那么实验组的处理是导入______。另外，还需设置一个对照组2，即导入______，然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。 ④预测实验组和对照组1、2的菌落生成及颜色情况分别是：______、有菌落和蓝色和______。 31．(24-25高二下·陕西铜川王益区王益中学·期末)为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用基因工程将水稻的耐低磷基因OSPTF转移到大豆植株中，部分实验过程如图所示。回答下列问题： (1)在对目的基因进行切割时，应选择限制酶______，用于基因工程的质粒除了需要图中所示结构外，还需要有______，目的基因插入质粒的位置是______。 (2)将①导入大豆植株体细胞通常需要借助农杆菌，利用了农杆菌______的特点，荧光蛋白基因的作用是______。 (3)研究人员欲对转基因大豆在低磷条件下对磷元素吸收能力进行检测，实验思路为：______。 32．(24-25高二下·河南许昌·期末)黄瓜是我们常见的瓜果之一，是中国各地夏季主要菜蔬之一。在冬季利用温室大棚生产反季节黄瓜经济效益显著，但易受冻害而造成减产。科研人员利用转基因技术培育出了抗冻黄瓜，过程如图所示。回答下列问题。 (1)构建基因表达载体时若选择限制酶BamH I切割抗冻蛋白基因，则需要选择限制酶______切割质粒，但其缺点是______(答出2点即可)。为避免此情况的出现，需要选择限制酶______切割抗冻蛋白基因，同时选择限制酶______切割质粒。 (2)图中将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞的方法是______。该过程会发生2次DNA分子之间的拼接，分别是______。 (3)将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞后，需要进行______才能获得转基因黄瓜植株，该过程使用的培养基一般要添加蔗糖，其作用是______(答出2点即可)。 33．(24-25高二下·吉林白城洮南第一中学·期末)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力，将人的干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以从家蚕细胞中提取干扰素用于制药。请回答下列问题： (1)在人的DNA分子上获取干扰素基因时，要用到限制酶。图1是该基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。EcoRV酶切出来的线性载体P1为__________末端，其位点切割的化学键是__________，该化学键是存在于__________。 A．G碱基与A碱基之间的键    B．G碱基与C碱基之间的键 C．A碱基与T碱基之间的键    D．两个核苷酸之间的键 (2)在此基因工程操作过程中的核心步骤是__________。启动子位于干扰素基因的__________，是__________识别和结合的部位。 (3)人的干扰素基因一般来自cDNA文库，cDNA克隆技术是通过__________将mRNA转化为互补DNA（cDNA），并将其重组至载体中进行复制筛选的技术。 (4)通过PCR技术可大量获取目的基因，PCR技术的原理是__________。用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。如图1载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为的__________脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。 34．(24-25高二下·山东青岛第六十七中学·期末)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。    (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为______。选用图甲中的Smal对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择_______对Ti质粒进行完全酶切，将其中产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是______。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_______进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_______bp，则一定为反向重组质粒。 人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。    (2)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是______。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要的酶分别是_______。 (3)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_______。 35．(24-25高二下·江苏东台·期末)抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽A基因及D基因进行融合形成AD基因（部分过程如图1所示），然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。 (1)AD基因复制和表达所需要的原料有______。 (2)PCR的基本过程包括：①变性→②→______③延伸。PCR过程中反应体系所处温度最高的是过程______（填序号）。A基因表达以a链为模板，D基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物______和引物_______的5'端添加互补序列。 (3)为了能使AD基因与图2所示pC穿梭质粒定向连接，需要在AD基因两端加上限制酶______和_______的识别序列，构建重组质粒后导入酵母细胞。用选择性培养基对受体菌进行培养、筛选，从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择性培养基应______。在酵母细胞中，重组质粒以______为起点进行复制。 (4)酸腐病是由白地霉引起的柑橘贮藏期常见的病害之一。为研究抗菌肽AD（以下简称抗菌肽）对白地霉的抑菌效果，现用无菌打孔器在果实相同部位打孔，每个打孔处接种相同体积的处理液，比较15天后的病斑直径。各组处理及结果见下表： 组别 1 2 3 接种处理方式 接种一定体积的病原菌孢子悬浮液 先接种病原菌孢子悬浮液，2h后再加入抗菌肽溶液 抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液混合，培养2h后接种 15天后病斑直径/mm 41.3 28.7 11.2 表中数据表明抗菌肽对白地霉_______（从“是”、“否”中选填）有抑菌效果，且抑菌效果最好的处理组别是______，处理效果最好的可能原因是______。 1．(24-25高二下·吉林长春长春汽车经济技术开发区第三中学·期末)现有甲、乙两不同物种的二倍体纯合植物，甲植物（2n=14）的光合产量高于乙植物，但乙植物（2n=20）更适宜在盐碱地种植（相关性状均由核基因控制）。现要利用甲、乙两种植物培育出高产、耐盐的植株。下列技术不可行的是（    ）地 城 考点03 基因工程的应用 A．两种植物杂交后，得到的F1再利用单倍体育种，可较快获得所需植株 B．将乙种植物耐盐基因导入甲种植物的体细胞中，可培育出具有耐盐性状的甲种植物 C．利用植物体细胞杂交技术，可以获得高产、耐盐的四倍体杂种植株 D．诱导两种植物的花粉融合后培育成幼苗，再用秋水仙素处理可培育出所需植株 2．(24-25高二下·陕西西安南开高级中学·期末)继乳腺生物反应器之后，科学家又培育出膀胱生物反应器：将人的生长激素基因导入小鼠受精卵，经培育获得膀胱上皮细胞可以合成并分泌人的生长激素的转基因小鼠。下列有关叙述错误的是（    ） A．将人的生长激素基因导入小鼠受精卵，是因为受精卵具有全能性 B．需要在人的生长激素基因首端加上小鼠膀胱上皮细胞特异性启动子 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制 D．用PCR技术可检测人的生长激素基因在小鼠细胞内是否转录和翻译 3．(24-25高二下·广东东莞·期末)次生代谢产物X是某植物细胞在微生物侵害等胁迫过程中产生的防御物质，可用于药物生产。其研发流程为：筛选高产细胞→确定细胞生长和产物X合成的关系（如图）→大量生产X。下列叙述错误的是（    ） A．应先培养大量细胞，后改变条件使细胞停止生长来大量生产X B．可将微生物菌体作为诱导因子加入培养基中，进而提高X产量 C．X的工厂化生产需要将高产植物的外植体培养成完整植株后提取 D．可以通过改造酵母菌等微生物的基因，利用发酵工程生产X 4．(24-25高二下·四川南充·期末)研究者将抗虫融合基因cv与耐草甘膦基因ce构建在同一T-DNA中，并利用农杆菌转化法导入水稻细胞，培育出了抗虫耐除草剂的转基因水稻。下列叙错误的是（    ） A．农杆菌Ti质粒上的T-DNA，能整合到受体细胞的染色体DNA上 B．转基因水稻种植时可减少农药的使用，进而降低农药对环境的污染 C．将转基因水稻与普通水稻间行种植的主要目的是增加基因的多样性 D．转基因水稻获批上市后，必须严格实行标识制度，保证消费者的知情权 5．(24-25高二下·吉林松原宁江区吉林油田高级中学·期末)下列生物技术操作不会达成预期目标的是（　　） A．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 B．将胰岛素基因表达质粒转入酵母菌，筛选获得产胰岛素工程菌 C．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 D．将花青素代谢相关基因导入植物体细胞，再经组织培养获得具有特定花色的植株 6．(24-25高二下·河南开封·期末)为解决草莓品种抗虫性差和因病毒积累导致品种退化的问题，育种工作者进行了以下尝试：①利用草莓茎尖进行组织培养；②将草莓细胞与抗虫植物细胞进行体细胞杂交；③对草莓愈伤组织细胞进行液体悬浮培养。下列叙述错误的是（    ） A．①技术可以获得草莓脱毒苗 B．②技术的原理是细胞膜的流动性 C．③技术不能得到草莓新品种 D．用基因工程技术可培育抗虫品种 7．(24-25高二下·湖北武汉重点中学5G联合体·期末)乳腺生物反应器是通过转基因技术，将外源基因导入动物（如牛、羊）基因组中，并使其在乳腺组织特异性表达，利用动物乳腺高效合成、分泌蛋白的能力，在乳汁中生产药用蛋白或其他高价值产品的生物技术体系。下列说法错误的是（    ） A．在构建基因表达载体时，要在外源基因序列上游加上能在乳腺中特异性表达的基因的启动子 B．与利用转基因大肠杆菌生产蛋白相比，乳腺生物反应器得到的蛋白活性更高 C．培育的转基因动物体内，只有乳腺组织细胞中才含有外源基因 D．乳腺生物反应器具有产量高、成本低、产品质量好和易提取等优点 8．(24-25高二下·福建龙岩·期末)下列有关基因工程应用的说法，错误的是（    ） A．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于基因工程的应用 B．将药用蛋白基因导入到动物乳腺细胞中，可培育出乳腺生物反应器 C．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质 D．相比天然产物提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高 9．(24-25高二下·天津河北区·期末)采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列说法正确的是（    ） A．该转基因羊无法将人凝血因子基因传递给后代 B．该转基因羊的所有细胞都含有人凝血因子基因并可以正常表达 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛 D．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 10．(24-25高二下·广东深圳龙华区·期末)聚羟基丁酸酯（PHB）是一种可降解塑料，可由木质素转化合成。某研究团队将关键代谢基因整合到微生物基因组中，并对工程菌进行驯化和筛选，实现了木质素向PHB的高效转化。下列叙述正确的是（　　） A．木质素为工程菌提供碳源，无需添加其他营养物质 B．对工程菌进行的驯化和筛选是通过选择培养基实现的 C．关键代谢基因整合到微生物基因组实现了诱变育种 D．获得PHB的工程菌需要利用提取、分离和纯化等技术 11．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)科学家们致力于通过基因工程手段解决各种医学和工业难题。下列关于基因工程技术应用的叙述，错误的是（　　） A．目前利用基因工程技术可以生产细胞因子、抗体和疫苗等 B．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐受问题 C．将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，可培育转基因抗病植物 D．利用基因工程菌来生产工业用酶的优点是酶纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高 12．(24-25高二下·四川广元·期末)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面展示出了广阔的应用前景。下列叙述错误的是（　　） A．我国转基因抗虫棉的成功培育，实现了基因由微生物向植物的定向转移 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，可培育出产低乳糖牛乳的奶牛 C．通过构建基因工程菌，可利用发酵技术大量生产加工转化糖浆所需的淀粉酶 D．膀胱生物反应器优于乳腺生物反应器的方面包括不受性别、发育时期等限制 13．(24-25高二下·江苏徐州邳州·期末)下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是（    ） A．若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C．利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞 D．为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组 14．(24-25高二下·天津和平区·期末)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（　　） A．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 B．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 C．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 D．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 15．(24-25高二下·四川遂宁·期末)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔的应用前景，下列相关叙述正确的是（    ） A．利用乳腺生物反应器制备药用蛋白时，只需要将目的基因导入乳腺细胞即可表达获得 B．培育转基因植物时，用电刺激处理受体细胞可增加细胞壁通透性，利于重组质粒导入 C．在同等养殖条件下，转入外源生长激素基因的鲤鱼的生长繁殖速率比非转基因鲤鱼高 D．将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌或酵母菌的基因组中生产的凝乳酶活性可能不同 16．(24-25高二下·山东滨州·期末)某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法错误的是（    ） A．制备的膀胱生物反应器，只有在膀胱细胞中才能表达W蛋白基因 B．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白需用相同的启动子 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 D．将含有W蛋白基因的表达载体导入山羊受精卵中可使用显微注射法 17．(24-25高二下·江西九师联盟·期末)白僵菌是一种真菌，能寄生到松毛虫等农业害虫体内致其死亡，但对环境和温血动物安全无害，被广泛用于害虫防治。由苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白可以使多种害虫死亡。某研究小组尝试使用农杆菌转化法，将Bt基因转入白僵菌中以加强白僵菌对害虫的防治效果。实验使用的Bt基因与Ti质粒如下图。下列叙述正确的是（    ） A．为构建基因表达载体应用BamHI和NheI切割Bt基因和Ti质粒 B．采用转基因白僵菌防治农业害虫对环境的污染较小，属于化学防治 C．培养含重组质粒的白僵菌时，培养基上发绿色荧光的菌落即为目的菌 D．除了对转基因白僵菌进行分子水平的检测外，还应对其进行抗虫实验 18．(24-25高二下·浙江杭州联谊学校·期末)PYL9基因是一种重要的脱落酸受体基因。科学家通过基因工程使番茄中原有的PYL9基因过量表达。实验发现，与普通番茄相比，这种转基因番茄抗旱性更强。下列分析合理的是（    ） A．PYL9基因存在于野生型和转基因番茄中 B．PYL9基因过量表达使番茄对脱落酸敏感度下降 C．PYL9基因过量表达促进了番茄气孔开放 D．PYL9基因过量表达增强抗旱性是偶然现象 19．(24-25高二下·河南三门峡·期末)研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器用其获得人体特殊功能蛋白W，基本过程如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．图中①和③过程代表的操作分别是显微注射和胚胎移植 B．转基因动物乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的遗传信息不同 C．需用激素对代孕母体进行同期发情处理 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受转基因动物性别和年龄的限制 20．(24-25高二下·江西南昌中学·期末)基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述正确的是（　　） A．通过X射线处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于基因工程技术的应用 B．将乙烯合成相关基因导入番茄，获得的延熟番茄储存时间大大延长 C．将人生长激素基因直接导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰 D．通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，进而可以从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的 21．(24-25高二下·山东菏泽·期末)蛛丝有超强韧性，科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中，获得乳腺生物反应器，在基因工程中可通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术检测目的基因是否导入受体细胞。下列说法错误的是（    ） A．PCR过程中为了减少非特异性扩增，可增加引物长度且适当降低复性温度 B．科学家将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．在凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．如果电泳结果显示羊体细胞中含有蛛丝蛋白基因，则其乳汁中含有蛛丝蛋白 22．(24-25高二下·河北衡水枣强县枣强中学·期末)空军军医大学西京医院于2024年3月10日在世界上首次实施一例“基因编辑猪一人”异种肝移植手术，成功将一只多基因编辑猪的全肝移植到一位脑死亡患者体内，这为解决人体移植器官短缺的问题带来了曙光。下列叙述正确的是（　　） A．与猪相比，灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒更少 B．基因改造的猪肝脏可能导入了某种调节因子抑制抗原决定基因的表达 C．基因改造过程中可能用到了限制酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等 D．器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题 23．(24-25高二下·辽宁丹东·期末)水杨酸广泛应用于水体消毒，但使用过量会导致水生动物运动能力、繁殖能力和抵抗力降低，严重影响水生动物的产量。科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备如图甲的水杨酸生物传感器，为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题：    (1)除了限制酶外，构建重组质粒过程中还要用_______酶，图中启动子的作用是______。 (2)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为可被细胞分解的龙胆酸，mrfp基因能表达产生红色荧光蛋白，为构建水杨酸羟化酶基因与mrfp基因的融合基因，在利用PCR技术分别获取水杨酸羟化酶基因与mrfp基因过程中，需要给图乙中的4种引物的_______端添加限制酶的识别序列，A、B 2种引物的末端应分别添加图甲中_______、_______限制酶的识别序列；C、D 2种引物的末端应分别添加图甲中_______、_______限制酶的识别序列。 (3)为检测水杨酸生物传感器对水杨酸的敏感程度，进行如下实验，结果如下表： 组别 甲 乙 丙 红色荧光强度 + 无 +++ 注：“+”数量越多表示荧光强度越高 研究小组选取成功导入重组质粒的大肠杆菌若干随机均分为甲、乙、丙三组，甲组培养环境为含较低浓度水杨酸的培养液，丙组的培养环境是_______，由该实验可推知，重组质粒中目的基因的表达程度受到环境中_______的调控。 (4)综上所述，成功导入重组质粒的大肠杆菌，可在环境治理中起到的作用是________。 24．(24-25高二下·陕西安康·期末)血清白蛋白（HSA）是人体血浆中最主要的蛋白质，具有多种生物学功能。科学家对植物细胞进行基因改造，使它们能够生产HSA，基本技术流程如图所示，Ti质粒中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。回答下列问题： (1)为获取大量的HSA基因用于基因表达载体的构建，通常采用PCR技术对HSA基因进行扩增。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，缓冲液中一般需要添加Mg2+，其原因是________。PCR扩增前需要设置PCR仪的循环次数，每次循环可以分为________三步。 (2)组建重组Ti质粒的过程中需要用到的酶有________HSA基因需要插入Ti质粒中的________部位，原因是________。 (3)为检测转基因植物是否表达出HSA，可从转基因植物中提取蛋白质，用________的抗体进行抗原一抗体杂交；也可在所提取的蛋白溶液中加入无色物质K，若蛋白溶液呈现________，说明HSA基因翻译出蛋白质。 (4)科学家还利用乳腺生物反应器来批量生产HSA。科学家将HSA基因与在乳腺中特异表达的基因的__________等调控元件重组在一起，该操作的目的是________。 25．(24-25高二下·内蒙古通辽科左中旗民族职专?实验高中·期末)人的血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲利用基因工程来大量生产HSA。图1为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，其中Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Neo表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的三条途径如图2所示。请回答下列问题： (1)据图1分析，在构建基因表达载体时，选择限制酶______切割质粒和目的基因，双酶切法的两个优点是______、______。 (2)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322质粒而非重组质粒）的干扰，目的基因导入后进行筛选，若筛选用甲、乙两种培养基，两种培养基的差异为______，含重组质粒的受体细胞在培养基上的生长情况为______。 (3)将农杆菌与水稻圆叶片进行共培养，旨在让Ti质粒的______进入水稻受体细胞。三种方法中，为检测目的基因的表达情况，均可提取受体细胞的蛋白质，用抗人血清蛋白（HSA）的抗体进行______实验。 (4)科学家培养出一种转基因羊，其膀胱上皮细胞可以合成人的血清蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过______法导入山羊的______细胞。与“乳腺生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”不受______限制，受体来源更广泛。 26．(24-25高二下·贵州遵义区县一中·期末)C1-INH是一种重要的血浆蛋白，可以防止过度炎症反应和血管通透性增加，通常用于治疗遗传性血管性水肿。从基因文库获取C1-INH基因后，PCR大量扩增，研究人员将C1-INH基因与乳腺中特异性表达基因的启动子等调控元件重组在一起导入兔子的受体细胞中，发育到泌乳期后就可以从转基因兔子的乳汁获得人类需要的C1-INH。请回答下列问题： 识别位点 限制酶 识别位点 限制酶 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' EcoR I 5'-CAG↓CTG-3' 3'-GTC↑GAC-5' Pvu Ⅱ 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5′ BamH I 5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5′ Hind Ⅲ 5'-↓GATC-3' 3'-CTAG↑-5' Sau3A I 5'-G↓GTACC-3' 3'-CCATG↑G-5' Kpn I (1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，高温处理的目的是_______。图1中应选择的引物是______。 (2)为了让目的基因正确插入运载体上，需要在引物的_______端添加限制酶的识别序列。 (3)结合图2中运载体上的限制酶的识别序列以及表格中具体的切割位点分析，扩增的C1-INH基因两端分别应添加________两种不同限制酶的识别序列。 (4)将基因表达载体导入动物受精卵中的方法是______法。基于上述制备乳腺生物反应器的技术原理，还可以开发转基因兔子膀胱生物反应器，与乳腺生物反应器相比，其优点有_______（答出1点）。 27．(24-25高二下·江西景德镇·期末)人血清白蛋白（HSA）是人血浆中所含蛋白质的主要成分，除了维持血液渗透压、抗凝血和清除自由基的功能外，在临床上广泛用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等。由于HSA治疗剂量大，且血液来源不足，导致产量无法满足市场需求。探索基因重组HSA的表达方式，通过对紫花苜（MedicagoSativaL．）和黑麦草组织培养和植株再生条件的优化，分别建立了其遗传转化体系，通过农杆菌介导法将HSA基因分别导入紫花苜蓿和黑麦草中，经基因组PCR和Westernblotting鉴定，获得了可表达rHSA的转基因紫花苜蓿株系和转基因黑麦草株系。 限制酶 BamHI EcoRI BgII 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -G↓AATTC- -A↓GATCT- (1)基因工程中除质粒外，______和_______也可作为载体。若用重组质粒转化农杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的农杆菌作为受体细胞，原因是______；利用PCR技术从基因组DMA中扩增HAS基因时，所用的引物越短，引物特异性越_______（填“高”或“低”），原因是因为______。 (2)步骤②利用农杆菌转化法将目的基因分别导入紫花苜蓿和黑麦草，3天后转入含有________的选择培养基筛选抗性愈伤组织。若要检测紫花苜蓿或黑麦草是否产生了HAS，一般采用______技术。 (3)经限制酶切后，目的基因和质粒存在_________种连接情况，为确定是哪种连接方式，可用限制酶________对重组质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小，电泳结果长度为________kb的片段的重组质粒即为所需的表达载体。 28．(24-25高二下·广东茂名普通高中·)多发性骨髓瘤（MM）是最常见的血液恶性肿瘤之一，全球每年病死患者约10万。B细胞成熟抗原（BCMA）是属于肿瘤坏死超家族的一种跨膜糖蛋白，BCMA在MM细胞中高表达，在正常组织和造血干细胞中不表达，是治疗MM的一个理想靶点。CAR - T细胞是利用基因工程制备的一种T细胞，其表面的嵌合抗原受体CAR能直接识别肿瘤细胞的特异性靶抗原BCMA。改造后的T细胞经体外扩增培养后，回输到患者体内进行肿瘤治疗。下图是利用基因工程制备CAR - T细胞并发挥作用的流程，回答下列问题： (1)CAR基因由三部分序列组成，过程①需要用__________酶处理以获得CAR基因。利用基因工程制备CAR - T细胞的核心步骤是__________（填序号）。 (2)利用PCR技术获得CAR基因需要设计引物，需要在引物的__________（填3'或5'）端添加限制酶的识别序列。在PCR反应体系中，除引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、4种脱氧核糖核苷酸外还需加入__________。 (3)改造后的T细胞经体外扩增培养时，不仅要确保适宜的气体和__________的环境条件，还要定期更换培养液，这样做的目的是__________。 (4)在治疗过程中，CAR的功能是__________。请推断用CAR - T细胞免疫疗法的效果显著且持久的原因是__________。 29．(24-25高二下·福建厦门·期末)研究人员构建了远红光可控的分泌肿瘤坏死因子 （TNF）的工程细胞，并将其植入肿瘤切除部位，有效调动机体局部的免疫反应，为癌症治疗提供新思路。调控原理和主要模块的部分结构如图 1。 回答下列问题： (1)构建模块 1和模块 2的过程需使用____酶。 (2)为使远红光的诱导效果更高效，启动子 1应为____（填“诱导型启动子”或“持续表达型启动子”）。在远红光照射下，____（填物质）可激活启动子 PF促进 TNF 合成与分泌。 (3)研究人员测定了多个工程细胞在黑暗条件和远红光照射下的 TNF分泌量，结果如图 2据图分析，应选用____号工程细胞开展后续动物实验，理由是____。 (4)研究人员希望工程细胞在远红光照射下能同时分泌 TNF、IFN两种免疫活性物质，以增强疗效。请据此要求提出一个改造模块 2的简单思路____。 30．(24-25高二下·广东清远·期末)CRISPR/Cas9系统可表达sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到特定基因上并对基因进行切割，可应用于基因的敲除。单纯性少毛症的发生与角蛋白基因（Krt71）的突变有关。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对小鼠的Krt71基因进行编辑。Krt71基因的部分序列和基因编辑技术流程见图。回答下列问题： (1)Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。Cas9蛋白的功能与基因工程常用的______酶功能类似。对Krt71基因进行编辑时，质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因______（填“序列1”“序列2”或“序列3”）的部分碱基序列相同。 (2)质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为______。过程③通常将受精卵培养至______阶段。 (3)与直接导入质粒pUC57相比，将Krt71－sgRNA和Cas9－mRNA直接注入小鼠受精卵，可减少转录的时间从而快速启动基因编辑过程；同时可降低外源基因整合到______的风险。 (4)敲除Krt71基因后对小鼠的毛发生长情况和毛发量等方面进行表型分析。该实验构建了单纯性少毛症小鼠模型，其研究价值是______（答出一点即可）。 31．(24-25高二下·北京丰台区·期末)研究者常利用 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑或敲除植物的感病基因 A，培育抗病新品种。有人认为转入的Cas9基因等有潜在风险，研究者尝试优化该技术。 (1)转入 CRISPR/Cas9基因后， 会表达形成 sgRNA-Cas9 复合体。sgRNA 能与A 基因序列互补配对，引导Cas9蛋白切割双链DNA 实现A 基因的敲除。Cas9蛋白的作用类似于基因工程基本工具中的_________。 (2)培育过程如图1所示： ①将 CRISPR/Cas9基因导入野生型植株TO: 第一步：将编码sgRNA 的基因和 Cas9 蛋白的基因整合到 Ti质粒上； 第二步：将含 Ti 质粒的溶液滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞/受精卵中。 若整合成功，细胞中通常仅插入一份 T-DNA 拷贝。 ②筛选转基因植物T1：收获种子并种植在含潮霉素的_________培养基上，筛选得到转基因植株T1。T1 的基因型为_________。 ③T1 植株自交得到T2，设计 Cas9基因特异性引物做PCR，PCR 结果为阴性的植株为所需植株，理由是_________。 (3)我国科研团队构建了一种转基因配子自动清除系统（TGAC 系统），该系统如图2所示，按图1方法培育得到植株T1′和T2′。 TGAC 系统发挥机制的原理：植物进行减数分裂通过毒素基因B，在生殖细胞发育阶段杀死携带转基因元件的配子。为实现这一目的，需要选择特定的启动子，请从下表中选择最佳启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是_________、________、________。可预测转基因元件清除的植株占T2′植株的比例为_________。 启动子 特异性 P1 所有体细胞中表达 P2 花粉发育后期表达 P3 卵细胞特异性表达 P4 极核细胞特异性表达 注：极核细胞和卵细胞是由同一个大孢子细胞有丝分裂产生的，若极核细胞死亡会导致卵细胞受精后无法发育。 (4)对比（2）与（3）分析，TGAC 系统在基因工程的应用与推广中有哪些优势_________? 32．(24-25高二下·湖北黄冈·期末)水稻纹枯病是由立枯丝核菌引起的全球性水稻病害，可导致高达30%的产量损失。中国农科院团队发现，利用CRISPR-Cas9敲除Os11基因可显著增强水稻对纹枯病的抗性。回答下列问题： (1)立枯丝核菌是一种真菌，其感染水稻叶鞘和叶片后诱导水稻Os11基因表达糖转运蛋白，再通过劫持水稻糖转运蛋白获取营养，促进侵染。糖转运蛋白位于水稻细胞的________上，其合成和加工需要________等具膜细胞器的参与。 (2)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（sgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因，工作原理如图1所示。 ①构建CRISPR/Cas9重组质粒，需要的工具酶有________，如果用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞，则在进行过程①时选用________作为载体。 ②过程③~⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，sgRNA的碱基序列应与________互补配对。 ③科研人员利用了PCR技术和________技术鉴定Os11基因是否被敲除，据图2分析，PCR过程中需要添加的引物为________，若无目标PCR产物，则说明基因敲除成功。 (3)有人担忧抗病转基因水稻可能通过花粉传播影响野生水稻。请提出解决方案：________（任写一点）。 1．(24-25高二下·宁夏固原·期末)下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（　　）地 城 考点04 蛋白质工程 A．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出的第二代基因工程 B．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础的 C．蛋白质工程的实质就是基因工程，二者没有本质上的区别 D．通过蛋白质工程可以产生自然界不存在的蛋白质，实现人类生产和生活的需要 2．(24-25高二下·河南天一大联考·期末)干扰素是一种具有抗病毒、免疫调节等重要功能的蛋白质。科研人员为了提高干扰素的稳定性和活性，利用蛋白质工程对其进行改造。下表是改造前后干扰素的相关参数对比，据此分析，下列有关叙述错误的是（　　） 对比项目 改造前 改造后 热稳定性（在50℃下活性保留时间） 2小时 8小时 与受体的结合亲和力 相对较弱 相对较强 氨基酸数量 166个 166个 第17位氨基酸 半胱氨酸 丝氨酸 A．蛋白质工程可通过改变氨基酸的种类来改造蛋白质 B．第17位氨基酸的替换可能降低了干扰素对高温的敏感性 C．改造前后氨基酸数量不变，说明蛋白质工程未改变相关基因结构 D．改造后干扰素与受体的结合亲和力增强，这可能提高其生物学效应 3．(24-25高二下·贵州遵义区县一中·期末)AI与蛋白质工程结合将引发下一代生物技术革命，AI预测可加速蛋白质结构解析、功能优化和设计，蛋白质工程基于蛋白质结构和功能，定点突变或片段替换进行改造蛋白质。下列叙述正确的是（　　） A．蛋白质工程的设计思路和天然蛋白质合成的过程是一样的 B．基因工程可以制造出大自然中没有的蛋白质满足人类的需求 C．多肽链上的氨基酸被替换，对应的mRNA上碱基序列也改变 D．蛋白质工程是基因工程的延伸，得到的产物一定会对人类有益的 4．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 5．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可用于治疗病毒感染等，但其体外保存相当困难。若将干扰素中的某个半胱氨酸替换成丝氨酸，则可延长其保存时间。下列有关叙述错误的是（　　） A．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 B．对干扰素进行蛋白质分子设计必须从预期的干扰素功能出发 C．对干扰素进行改造需通过直接改造干扰素的分子结构来实现 D．蛋白质空间结构复杂是蛋白质工程实施难度较大的重要原因 6．(24-25高二下·陕西西安南开高级中学·期末)AI与蛋白质工程结合将引发下一代生物技术革命，AI预测可加速蛋白质结构解析、功能优化和设计，蛋白质工程基于蛋白质结构和功能，定点突变或片段替换进行改造蛋白质。下列叙述错误的是（    ） A．蛋白质工程的设计思路和天然蛋白质合成的过程有差异 B．蛋白质工程是基因工程的延伸，得到的产物一定会对人类有益的 C．多肽链上的氨基酸被替换，对应的mRNA上碱基序列也改变 D．蛋白质工程可以制造出大自然中没有的蛋白质满足人类的需求 7．(24-25高二下·陕西渭南临渭区·期末)通过蛋白质工程可以改造蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程只需要改造蛋白质，基因工程只需要改造基因 B．天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同 C．蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列 D．蛋白质工程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发最终推测出脱氧核苷酸序列 8．(24-25高二下·海南直辖县级行政单位定安县部分学校·期末)蛋白质工程流程如图所示，在生产过程中，若将人胰岛素 A 链上 1 个天冬氨酸替换为甘氨酸，B 链末端增加 2 个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列叙述错误的是（　　） A．可通过基因工程方法生产 B．比人胰岛素多了 2 个肽键 C．与人胰岛素有相同的受体 D．图中物质 a 是 mRNA 9．(24-25高二下·陕西西安西咸新区·期末)Cry蛋白是苏云金芽孢杆菌的主要杀虫蛋白。研究人员利用基因的定点突变技术将Cry蛋白第282位的丙氨酸和第283位的亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（　　） A．根据Cry蛋白的氨基酸序列能推测出多种相应的mRNA序列 B．Cry蛋白的毒性提高了7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构 C．改造Cry蛋白应从Cry蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构 D．经改造后的苏云金芽孢杆菌中的Cry蛋白毒性提高这一性状可遗传 10．(24-25高二下·辽宁丹东·期末)通过人工合成Bt基因部分序列与天然Bt基因的另一部分序列进行拼接构成重组的Bt基因，将之与T-DNA构成穿梭质粒，可提高农杆菌的转化效率，大大提高了培育抗虫棉的成功率，过程如下图。下列相关叙述正确的是（    ） A．如图过程是对基因进行操作，因而不属于蛋白质工程 B．本实例是将重组质粒直接导入棉花愈伤组织细胞，再进行组织培养获得抗虫棉 C．本实例中，可用卡那霉素和潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞 D．通过该过程能定向改造抗虫蛋白分子的结构，使之更加符合人类需要 11．(24-25高二下·新疆哈密伊州区哈密第十五中学·期末)下列案例是通过实施蛋白质工程获得的是（    ） A．在山羊乳腺生物反应器中表达出人α-抗胰蛋白酶 B．对胰岛素进行改造，使其成为速效性药品 C．利用乳腺生物反应器大量生产干扰素 D．含外源生长激素基因的超级小鼠的培育 12．(24-25高二下·四川南充·期末)甲酸脱氢酶（FDH）是将CO2还原为甲酸的重要生物催化剂，但其催化活性和热稳定性仍存在一定的局限。研究者们提出利用蛋白质工程改FDH性能的策略。下列叙述错误的是（    ） A．新FDH的预期功能，是合成和改造FDH基因的主要依据 B．改造后的FDH基因需要加上起始密码子等调控元件才能表达 C．可利用基因的定点突变技术进行碱基替换，从而实现氨基酸序列的改变 D．具有优异性能的FDH突变体，为解决温室效应和能源危机提供了新思路 13．(24-25高二下·四川绵阳·期末)链霉菌是抗生素的主要产生者。科学家期望通过基因工程改造链霉菌，提高其活性物质的表达量。下列说法正确的是（　　） A．在基因工程的基本操作过程中，只能通过PCR获取目的基因 B．为避免目的基因与载体反向连接，可用2种限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段 C．若选用的限制酶识别序列为5'-↓GATC-3'，切割后产生的是平末端 D．若通过蛋白质工程获得新的抗生素，第一步操作应该是获取目的基因 14．(24-25高二下·广东东莞·期末)2024年诺贝尔化学奖授予了在蛋白质研究领域做出卓越贡献的科学家，其中戴米斯·哈萨比斯和约翰·江珀开发的AI工具AlphaFold实现了蛋白质三维结构的高效预测。下列相关叙述错误的是（    ） A．肽链上氨基酸之间能形成氢键等，从而使肽链盘曲折叠 B．蛋白质工程的基本思路是从设计预期的蛋白质结构出发 C．AlphaFold可以为蛋白质工程改造蛋白质提供技术支持 D．AlphaFold预测的蛋白质结构需要通过实验进行验证 15．(24-25高二下·天津滨海新区·期末)枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。将枯草杆菌蛋白酶分子的天冬氨酸（99）和谷氨酸（156）改成赖氨酸，可使其在一定条件下的活力提高。下列说法错误的是（    ） A．完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现 B．蛋白质工程需要直接改造蛋白质 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息，并表达出蛋白质 16．(24-25高二下·江西萍乡·期末)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。在此过程中，需要（　　） A．研究绿色荧光蛋白的氨基酸序列和空间结构 B．直接对绿色荧光蛋白分子进行显微操作 C．利用基因的定点突变技术对GFP基因进行碱基的改造 D．构建含GFP基因、启动子、终止密码子等的基因表达载体 17．(24-25高二下·黑龙江龙东十校联盟·期末)水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。流程如下图所示。 有关叙述正确的是（　　） A．物质a是氨基酸序列（多肽链），物质b是mRNA B．物质b可能不同，但合成的蛋白质空间构象一般相同 C．在这项研究中，目前可行的直接操作对象是基因 D．蛋白质工程原则上只能改造自然界中已存在的蛋白质 18．(24-25高二下·内蒙古部分学校·期末)玉米中赖氨酸含量较低，原因是赖氨酸含量升高会抑制相关酶的活性，如图所示。科研人员将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米中游离的赖氨酸含量得以提高。下列叙述错误的是（    ）    A．基因工程能够实现对AK基因和DHDPS基因特定位置的定点突变 B．改造后的AK和DHDPS的氨基酸序列发生了改变，蛋白质结构没有改变 C．改造后的AK和DHDPS与赖氨酸结合的能力增强，导致反馈抑制作用更明显 D．该研究体现了蛋白质工程可以生产自然界没有的蛋白质 19．(24-25高二下·河北部分名校·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的部分过程，获得的基因DNA可导入大肠杆菌进行表达，字母表示相关物质，数字代表相关过程。下列叙述错误的是（    ） A．a表示多肽链，b表示mRNA，步骤④需要用逆转录酶 B．利用蛋白质工程获得的mRNA序列与动物细胞内干扰素mRNA序列不一定相同 C．①②③表示中心法则中遗传信息流动的部分过程 D．用蛋白质工程生产干扰素所用的基因表达载体不需要启动子和终止子 20．(24-25高二下·辽宁抚顺六校协作体·期末)水蛭素是由65个氨基酸组成的单链多肽，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性，基本思路如图所示。下列有关叙述错误的是（    ） A．物质b是mRNA，物质b到物质a的过程表示翻译 B．根据物质a只能推测出一种对应的DNA序列 C．对水蛭素的改造是通过改造水蛭素基因来完成的 D．通过蛋白质工程只能生产自然界中已存在的蛋白质 21．(24-25高二下·江苏无锡·期末)科研人员将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，研发出了速效胰岛素类似物产品并在临床上广泛应用。下列叙述正确的有（    ） A．该过程属于蛋白质工程，生产的速效胰岛素类似物自然界不存在 B．胰岛素改造思路与中心法则的信息流动方向是一致的 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物想要达到预期的疗效，还需检测其高级结构是否正确 22．(24-25高二下·贵州安顺·期末)水蛭素(Hirudin)是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，若将其第47位天冬酰胺替换成赖氨酸，可以提高其抗凝血活性，能有效预防和治疗血栓，流程如下图1所示。 回答下列问题： (1)利用蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性，直接操作对象是_______。 (2)天然水蛭素产量有限，若利用基因工程制备重组水蛭素，可从_______细胞获取mRNA后，通过逆转录、修饰、PCR等获得目的基因。相较于普通酶而言，PCR过程中所用的DNA聚合酶具有的特点是_______。 (3)构建基因表达载体过程如图2所示，为使目的基因与质粒高效连接，应选用的限制酶是_______，原因是_______。若采用大肠杆菌作为受体细胞，应选择颜色为_______的大肠杆菌菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良水蛭素的工程菌株。 23．(24-25高二下·吉林长春朝阳区长春外国语学校·期末)人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，但给心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白，会诱发颅内出血。研究表明，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸（密码子UGU）换成丝氨酸（密码子UCU），制造出性能优异的t-PA改良蛋白，能显著降低颅内出血的副作用。某研究小组利用重叠延伸方法对t-PA基因进行定点突变，其改良过程如图1所示。回答下列问题。 (1)科学家将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于_______范畴。获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是_______（选择正确编号并排序）。 ①t－PA蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t-PA基因序列③检验t－PA蛋白的结构和功能④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白 (2)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。引物b中突变位点的碱基和引物c中突变位点的碱基分别为_______。 (3)重叠延伸过程中，用于PCR3的是AB上链和CD下链，请在下图中  中标注两条链方向_________（填“5”或“3”）。 (4)据图可知，利用PCR3获得大量的t-PA改良基因，需要的引物是_______，引物的作用是_______。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因_______（答两点）。 (5)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶_______切开，才能与t-PA突变基因高效连接。 (6)mlacZ表达产物会使细胞呈黄色，使菌落呈现黄色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有_______的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的表型是_______。 24．(24-25高二下·广东潮州·期末)水蛭唾液腺分泌的水蛭素(Hiruan)是一种优良的凝血酶抑制剂，在血栓治疗上有着重要的医学价值，但天然的水蛭素的临床活性较低，如果将水蛭素分子中第47位的天冬酰胺替换成赖氨酸，其分子活性会提高20倍。如图表示改造 Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。回答下列问题： (1)获取目的基因：从水蛭唾液腺细胞中获取_______反转录得到cDNA后，利用PCR引物在 Hirudin基因内部碱基进行替换，需要在__________(填引物)中设计特定的碱基，从而对 Hirudin 基因进行改造以获得改良的 Hirudin 蛋白。 (2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11与 Hirudin改良基因高效连接，应选用___________对pCLY11进行酶切。与单酶切相比，采用双酶切的优点有___________(答两点)。 (3)将经蛋白质工程改造后得到的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如下图所示。推测两种蛋白酶水解处理后，酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的_______(填“种类”或“含量”)有关。 (4)得到控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因后，利用基因工程可以制备乳腺生物反应器，让哺乳动物批量生产高抗凝血活性的水蛭蛋白，此时需要将______与______等调控原件重组在一起。某生物兴趣小组同学大胆推测，用类似方法制备膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的__________(写出两点)的限制。 25．(24-25高二下·福建福州福清·期末)水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题： (1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是__________，物质b是__________。 (2)若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要实验思路为：将改造后的水蛭素基因与__________的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过__________导入哺乳动物的__________。 (3)与该方法相比，诱变育种的缺点是（写出两点）__________。 (4)除乳腺生物反应器外，也可利用大肠杆菌为受体生产水蛭素，其中用__________生产的水蛭素活性更高，原因是__________。 (5)为检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用__________通过__________技术进行检测。 26．(24-25高二下·广西钦州·期末)研究者利用图中质粒构建重组DNA分子并导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，从而解决了胰岛素药源不足的问题。回答下列问题：    注：图中几种限制酶识别序列和切割位点分别为：BamHI：5'-G↓GATCC-3'，EcoRI：5'-G↓AATTC-3'，SmaI：5′-CCC↓GGG-3'，SalI：5'-G↓TCGA-3'，LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，以颜色不同为依据直接筛选含重组DNA分子菌体的方法称为“蓝白斑”法。 (1)提取胰岛B细胞中的总RNA，通过一定方法分离纯化出mRNA，经________得到cDNA，然后设计引物利用PCR扩增胰岛素基因。选择胰岛B细胞提取RNA的原因是______。 (2)已知胰岛素基因的α链为编码链，据图1分析，利用PCR扩增胰岛素基因时，需对引物①～④进行特殊处理。PCR所需的引物组合是_______，在引物②的______（填“3'端”或“5'端”）添加BamHI识别序列和强启动子，该片段扩增4次循环，需要消耗引物______个。 (3)为确保目的基因正确插入图2的载体中，需要选择的限制酶组合是_______。已知胰岛素基因α链的碱基序列为5′-TTTAAAGGG…-3'，强启动子的碱基序列为5'-GCTGCATG-3'，写出胰岛素基因上游引物的18个碱基序列：5′-_______3'。 (4)“蓝白斑”法是基因工程中常用的筛选方法。简述将目的基因导入大肠杆菌并筛选工程菌的过程：______。 (5)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。请写出获取赖脯胰岛素的流程：________。 1．(24-25高二下·河南天一大联考·期末)随着生物技术的飞速发展，生物技术的安全性与伦理问题日益受到关注。下列相关叙述正确的是（　　）地 城 考点05 生物技术的安全与伦理问题 ①基因编辑技术可能会引发“设计完美婴儿”等伦理争议，破坏人类遗传多样性 ②转基因作物的种植可能会导致基因污染，对生态环境造成潜在威胁 ③生殖性克隆人涉及伦理问题，而治疗性克隆不涉及伦理问题 ④生物武器具有传染性强、危害大等特点，被国际社会严格禁止 A．①②④ B．①②③ C．②③④ D．①③④ 2．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)下列关于生物技术的应用、安全性与伦理问题的叙述，错误的是（　　） A．大田种转基因抗虫棉时，间隔种植少量非转基因棉，以维持田间物种多样性 B．α-淀粉酶阻断淀粉储存使花粉失活，可将其基因与目的基因共转入植物，防止转基因花粉传播 C．我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 D．任何国家都应严格禁止生产和使用生物武器 3．(24-25高二下·吉林吉林永吉实验高级中学等校·期末)随着克隆羊“多莉”、克隆犬“龙龙”等克隆动物的不断出现，克隆人似乎离我们越来越近了。下列叙述错误的是（　　） A．生殖性克隆人的出现有可能破坏现有的家庭和社会结构 B．治疗性克隆是为了进行医学研究和治疗，仍需监管审查 C．虽然生殖性克隆人存在伦理问题，但克隆技术已经成熟 D．生殖性克隆和治疗性克隆属于无性繁殖，与试管婴儿原理不同 4．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)下列有关生物技术叙述正确的是（    ） A．转基因作物的长期、大规模种植不利于侵染力更强的害虫的出现 B．我国允许治疗性克隆的研究，但严禁任何形式的生殖性克隆人行为 C．只要有证据表明某种转基因食品有害，就应全面禁止转基因技术在食品上的应用 D．生物武器包括致病菌类、病毒类、毒品类、生化毒剂类等，能对动植物和人类造成严重危害 5．(24-25高二下·浙江嘉兴·期末)2021年4月15日，《中华人民共和国生物安全法》正式实施，下列做法和分析符合生物安全法的是（　　） A．不发展、不生产生物武器 B．可以开展人类的生殖性克隆 C．转基因食品由于制作时已被灭活，无需风险评估 D．将目的基因转入叶绿体的农作物不影响周围物种 6．(24-25高二下·黑龙江哈尔滨师范大学附属中学·期末)生物技术就像一把“双刃剑”，它既可以造福人类，也可能在使用不当时给人类带来潜在的危害。下列叙述错误的是（　　） A．我国保留生物武器的研发项目以应对国外生物武器及其技术和设备的威胁 B．干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，但也存在导致肿瘤发生的风险 C．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染 D．随着基因组编辑技术的发展，科学家可以在体内和体外对基因进行敲除、插入 7．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)生物技术是一把双刃剑，它的发展既可以造福人类，同时也伴随着潜在的风险和挑战。下列有关叙述错误的是（　　） A．生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等 B．生物武器具有传染性强、攻击范围广等特点 C．治疗性克隆的目的是用于医学研究和治疗，无需监管审查 D．生殖性克隆涉及细胞核移植技术，我国政府不接受任何生殖性克隆人实验 8．(24-25高二下·黑龙江绥化肇东第四中学校·期末)下列关于生物技术的安全性及伦理问题的观点，错误的是（    ） A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质 B．生殖性克隆人问题带来了巨大的伦理挑战 C．反对“设计试管婴儿”的原因之一是试管婴儿技术属于无性繁殖方式 D．生物武器具有传染性强、作用范围广等特点，应严格禁止 9．(24-25高二下·河北衡水桃城区衡水第二中学·期末)转基因作物因其抗旱、抗寒、抗虫等能力而备受关注。下列关于转基因作物的叙述，错误的是（　　） A．转基因作物被食用后，其基因就整合到人的基因组中 B．种植的转基因作物可以与传统的农业种植区相隔离 C．可对转基因作物进行标识管理，让消费者有选择权 D．转基因作物的安全性涉及其是否会产生毒性或过敏蛋白 10．(24-25高二下·四川绵阳外国语学校·期末)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述合理的是（    ） A．我国允许用基因编辑技术对基因进行敲除、插入等，设计“完美试管婴儿” B．玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物可防止基因污染 C．转基因微生物制成的生物武器危害性大，应禁止，是因为人体不会对制造的新病毒产生免疫反应 D．生殖性克隆人能丰富人类基因的多样性，我国允许在特定人群中进行相关实验 11．(24-25高二下·山东东营·期末)关于生物技术的安全性与伦理问题，下列说法错误的是（　　） A．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 B．将α-淀粉酶基因转入植物中可防止转基因花粉的传播 C．生殖性克隆人研究不能丰富人类基因的多样性 D．应该运用科学的方法控制并合理使用生物技术 12．(24-25高二下·浙江丽水·期末)生物技术安全和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是（　　） A．转基因作物上市前无需通过食品和环境安全评价 B．生物武器利用致病微生物、毒素等形成杀伤力 C．治疗性克隆可解决器官移植时的免疫排斥问题 D．设计试管婴儿技术可减少遗传病的发生概率 13．(24-25高二下·江西丰城第九中学·期末)下列关于生物技术的安全性和伦理问题的叙述，正确的是（    ） A．只要有证据表明产品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．转基因植物的叶绿体基因组不会进入生殖细胞 C．通过基因编辑技术破坏受精卵中的 CCR5 基因，使婴儿天生抵抗艾滋病的做法，可能引发不可预知的后果 D．依据中国法律，在严格监管和伦理审查下，基因编辑技术不可用于治疗性克隆研究 14．(24-25高二下·辽宁大连·期末)生物技术是把双刃剑，造福人类的同时也带来了安全性和伦理问题，人们必须高度重视。下列叙述正确的是（    ） A．从早期胚胎中提取ES细胞用于治疗白血病，并不及伦理问题 B．转基因作物可能通过花粉传播外源基因，进而引发基因污染问题 C．严禁借助体外受精技术筛选早期胚胎性别，设计试管婴儿 D．干细胞的研究具有广阔的应用前景，应大力发展、无需监管 15．(24-25高二下·陕西西安西咸新区·期末)生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也带来了安全与伦理方面的挑战。下列叙述正确的是（　　） A．将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染 B．生物武器是用病毒类、干扰素及生化毒剂类等来形成杀伤力的 C．生殖性克隆是为了获得治疗所需的克隆细胞，应给予一定支持 D．转基因农作物可能引起食品安全问题，但对生态环境没有影响 16．(24-25高二下·江苏徐州邳州·期末)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列相关叙述错误的是（    ） A．转基因生物引发安全性问题的原因之一是外源基因插入宿主基因组的部位不唯一 B．“试管婴儿”、“设计试管婴儿”均利用了体外受精技术、胚胎移植技术和遗传学诊断技术 C．我国禁止生殖性克隆人的实验，对治疗性克隆实验也严格审查 D．生物武器是利用致病微生物或毒素等生物活性物质来形成杀伤力 17．(24-25高二下·江西景德镇·期末)生物技术就像一把“双刃剑”。我们在利用生物技术造福人类的同时还应规避生物技术可能带来的潜在危害。下列关于生物技术及伦理和安全的叙述，正确的是（　　） A．我国政府主张全面禁止和彻底销毁生物武器 B．目的基因来自自然界，培育出的转基因植物就不会有安全性问题 C．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性和治疗性克隆实验 D．生物武器包括致毒品、病菌类、病毒类、生化毒剂类等 18．(24-25高二下·江苏淮安·期末)生物技术的应用涉及到很多安全性和伦理问题，下列相关叙述错误的是（    ） A．蛋白质工程可创造自然界中没有的蛋白质，可能会产生新的过敏原 B．上市的转基因产品都经过了安全性审核，但仍必须标注是否存在转基因成分 C．我国禁止生殖性克隆，所以“设计试管婴儿”技术不合法 D．因生物武器的极大危害性，一切试图发展、生产、储存生物武器的行为必须禁止 19．(24-25高二下·江西新余·期末)生物技术的安全性与伦理性一直是人类关注和讨论的热点问题。下列叙述正确的是（    ） A．转基因食品应该添加标注，并注明可能的危害 B．基因编辑技术可用于疾病预防领域研究，但不能用于设计完美婴儿 C．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 D．治疗性克隆是无性生殖，生殖性克隆是有性生殖 20．(24-25高二下·四川绵阳南山中学·期末)生物技术在农业、医学和环境保护等领域具有广泛应用，但同时也带来了一些伦理和安全问题。下列叙述正确的是（　　） A．可以对胚胎进行基因编辑获得抗艾滋病的孩子 B．只要有证据证明转基因产品不安全，就应禁止转基因技术的研究 C．若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全问题 D．将玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中可以防止基因污染 21．(24-25高二下·黑龙江牡丹江第二高级中学·期末)生物工程技术如同一把双刃剑，既给人类带来了便利，同时也引发了人们对其安全性的担忧。下列叙述正确的是（    ） A．中国政府禁止生殖性克隆人，但不反对治疗性克隆 B．生物武器会对人类安全造成极大威胁 C．研究转基因农作物时应防止转基因花粉的传播 D．转基因生物可能会造成“外来物种”入侵，影响生态系统的遗传多样性 22．(24-25高二下·吉林长春朝阳区长春外国语学校·期末)下列关于生物技术的应用、安全性与伦理问题的叙述，正确的是（    ） A．大田种植转基因抗虫棉时会间隔种植少量非转基因的棉花供棉铃虫取食，目的是维持棉田物种多样性 B．由于α-淀粉酶可阻断淀粉储藏使花粉失活，因此可将α-淀粉酶基因和目的基因一起转入植物，防止转基因花粉的传播 C．生殖性克隆和治疗性克隆都涉及体细胞核移植技术，我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 D．利用转基因新型致病菌可使具有某种易感基因的民族感染，而施放国的人却不易感染，任何国家都应严禁生产和使用生物武器 23．(24-25高二下·河北邢台·期末)第四代试管婴儿技术解决的主要问题是女方高龄、卵细胞老化，该技术借助捐献者的优势卵泡将原本的劣势卵泡进行“换壳”，最终保证优质胚胎的形成，其过程如图所示。下列有关叙述合理的是（　　） A．第四代试管婴儿技术给所有不孕不育患者带来福音 B．图中新生儿因涉及三个亲代因而面临社会伦理问题 C．获取的精子即可与核移植的体外培养成熟的卵子结合 D．母体并不会对移植后的早期胚胎发生免疫排斥反应 24．(24-25高二下·江西南昌中学·期末)治疗性克隆的一般流程是把患者（供体）体细胞移植到去核卵母细胞中形成重构胚，再把重构胚体外培养到囊胚，然后从中分离出ES细胞，并诱导ES细胞定向分化为所需的特定细胞类型用于移植。下列说法正确的是（　　） A．供体细胞注入去核卵母细胞后还需诱导融合 B．ES细胞在核遗传上和供体细胞相同 C．治疗性克隆不会面临伦理问题 D．治疗性克隆可解决器官移植时的免疫排斥问题 25．(24-25高二下·河北·期末)下列关于生物技术的安全性和伦理问题的叙述，正确的是（    ） A．只要有证据表明产品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．转基因植物的叶绿体基因组不会进入生殖细胞 C．通过基因编辑技术破坏受精卵中的CCR5 基因，使婴儿天生抵抗艾滋病的做法，可能引发不可预知的后果 D．依据中国法律，在严格监管和伦理审查下，基因编辑技术可用于治疗性克隆研究 试卷第1页，共3页 3 / 3 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 5大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程 考点05 生物技术的安全与伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 B A B D D D B C B A 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 D D C C B D A A A B 题号 21 22 23 24 25 26 27 28 答案 AB ABD CD BD BC AD ABC AB 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 D C C C C C D A D C 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 A B C BC ABD AD CD AB ACD AC 题号 21 答案 AD 22．(1) 琼脂 温度 pH (2) 乙链 5'→3' RNA聚合酶 大肠杆菌 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ 乙、丙 3 23．(1) 稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌 (2) ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3)设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行；在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌；在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小） 24．(1)2和3 (2) 5’ BamHI、EcoRI BamHI、HindⅢ (3) Ca2+/CaCl2 卡那霉素 消毒 脱菌 (4) PCR/DNA分子杂交（答出1点即可） GUS基因 25．(1) 四环素和卡那霉素 白 (2) C A (3) B 平板中以蔗糖为唯一碳源无抗生素，且置于37℃环境中培养，生长出来的菌落即为质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌 26．(1)启动子 (2) Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子 (3) 潮霉素 荧光素 (4) Bb 仅引物“Ⅱ+Ⅲ”组能完成扩增 仅引物“Ⅰ+Ⅲ”组能完成扩增 27．(1) b、c PCR扩增时，引物会结合在模板链的3'端并从自身的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) 作为RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因转录 将导入目的基因的水稻细胞接 种在含有潮霉素的培养基上，能生长的细胞即为含重组载体的细胞 (3) 植物组织培养 将转入QT12基因的“华占”水稻（实验组）和普通“华占”水稻（对照组）分别种植在高温条件下，其他培养条件保持一致且适宜，成熟后统计并比较两组水稻的产量；预期结果：实验组水稻的产量显著高于对照组。 28．(1)B (2) 基因表达载体的构建 用Ca2+处理 指导合成乙肝病毒外壳蛋白 抗原-抗体杂交 (3) Mg2+ TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活琼脂糖凝胶电泳 (4) 青霉素和X-gal 白色 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 29．(1) ①④ Mun Ⅰ (2) EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ DNA连接 氨苄青霉素 (3)A (4) PCR 启动子 30．(1)RNA聚合酶 (2) 密码子 5' 琼脂糖 (3)C (4) 避免酵母菌细胞中产生具有转录激活功能的蛋白 GAL4基因中的一段特异性序列 Ca2+处理 B X-α-gal pG-Va重组载体 PG载体 蓝色，有菌落 不会出现蓝色物质，也无菌落生长 31．(1) BamHⅠ和HindⅢ 启动子、终止子、复制原点 启动子和终止子之间 (2) 能将Ti质粒上的T-DNA转移被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上 便于重组DNA分子的筛选 (3)将生理状态相似的多组野生大豆植株与多组转基因大豆植株分别置于低磷溶液中进行培养，其他条件相同且适宜，一段时间后检测两类植物培养液中磷元素含量 32．(1) Sau3AⅠ 易造成质粒和目的基因的自身环化以及反向连接 EcoRI和BamHⅠ Sau3AI和EcoRI (2) 农杆菌转化法 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上和插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞染色体DNA上 (3) 植物组织培养 提供碳源、能源、调节渗透压 33．(1) 平 磷酸二酯键 D (2) 构建基因表达载体 上游 RNA 聚合酶 (3)部分基因 (4) DNA分子半保留复制 胸腺嘧啶（T） DNA连接 34．(1) 复制原点 SmaI、XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 200 (2) SalI EcoRI EcoRI、SalI、MunI、XhoI、DNA连接酶、DNA聚合酶 (3)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 35．(1)脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 (2) 退火/复性 ① X Z (3) BamHI SalI 含氨苄青霉素、不含亮氨酸 O2 (4) 是 3 抗菌肽与病原菌孢子充分接触，能更有效发挥作用 地 城 考点03 基因工程的应用 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A D C C A B C B C B 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 B B C A D B D A B C 题号 21 22 答案 ACD BCD 23．(1) DNA连接 RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA (2) 5’ SalI XhoI SalI HindIII (3) 含较高浓度水杨酸的培养液 水杨酸浓度 (4)当水体中有水杨酸存在（或过量）时，能发出红色荧光并清除水体中的水杨酸（或监测水体中水杨酸的含量并清除水体中的水杨酸）或（实现对水杨酸的动态检测和清除） 24．(1) DNA聚合酶需要Mg2+激活 变性、复性和延伸 (2) DNA连接酶、限制酶（和TaqDNA聚合酶） T-DNA T-DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上 (3) 抗HSA蛋白 蓝色 (4) 启动子 特异性驱动乳腺细胞中的HSA基因转录出相应的mRNA 25．(1) EcoRI和PstI 避免目的基因和质粒的自身环化 避免目的基因和质粒进行反向（随意）连接 (2) 一组培养基中含有新霉素，另一组培养基中含有氨苄青霉素 在含有新霉素的培养基上能生长，在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长 (3) T-DNA 抗原—抗体杂交 (4) 显微注射 受精卵 性别和年龄 26．(1) 使DNA分子解开双螺旋 ①④ (2)5' (3)Pvu Ⅱ和EcoR Ⅰ (4) 显微注射 不受年龄、性别、发育时期的限制 27．(1) 动植物病毒 噬菌体 未处理的农杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱 低 引物较短，特异性弱，导致同时扩增出目的基因和其他DNA片段 (2) 潮霉素 抗原抗体杂交 (3) 2 BamHⅠ和EcoRⅠ 45 28．(1) DNA连接酶 ② (2) 5' 模板/CAR基因 (3) 无菌、无毒 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害 (4) 胞外结构区特异性识别多发性骨髓瘤细胞表面的B细胞成熟抗原（BCMA），传递信息至胞内信号区，激活T细胞 CAR-T细胞增殖产生新的CAR-T细胞，并形成记忆细胞 29．(1)限制酶、DNA连接酶 (2) 持续表达型启动子 BIdD二聚体 (3) 7 7号工程细胞在黑暗条件下不分泌TNF，在远红光条件下分泌TNF量最大，光控效果最佳 (4)在模块2中启动子PF后加入IFN基因和TNF基因 30．(1) 限制（或限制性内切核酸） 序列3 (2) 启动子 桑葚胚（或囊胚） (3)基因组/细胞核/DNA/染色体 (4)用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗 31．(1)限制酶 (2) 选择 aa 筛选出细胞中不含sgRNA 和Cas9等外源基因的植株，彻底避免植株及后代可能对环境的污染 (3) P4 （或P2） P2 （或 P4） P3 100% (4)该系统可以自动清除含有外源基因元件的配子，所得后代全部为非转基因植株，可大大节省时间和人工成本，缩短育种年限，提高转基因产品的安全性 32．(1) 细胞膜 内质网、高尔基体、线粒体 (2) 限制酶、DNA连接酶 Ti质粒 目标基因（或靶基因或0s11基因）的特定区段 琼脂糖凝胶电泳 引物2和引物3 (3)将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻中（或种植隔离带）（或培育雄性不育系） 地 城 考点04 蛋白质工程 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 C C C D C B D D C D 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 B B B B B AC ABC BC ACD BD 题号 21 答案 AD 22．(1)水蛭素基因 (2) 水蛭唾液腺 耐高温 (3) XmaⅠ和BglⅡ 这两种限制酶切割产生的黏性末端与目的基因的黏性末端相同 白色 23．(1) 蛋白质工程 ①④②⑤③ (2)G/鸟嘌呤和C/胞嘧啶 (3) (4) 引物a和引物d 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 复性的温度过低、引物特异性不高 (5)XmaⅠ、BglⅡ (6) 新霉素 （具有新霉素抗性且)菌落呈白色 24．(1) mRNA/信使RNA 引物2和引物3 (2) XmaⅠ和BglⅡ 可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接 (3)种类 (4) 控制高抗凝血活性的水蛭蛋白合成的基因（药用蛋白基因） 乳腺中特异表达的基因的启动子 性别和生理状态 25．(1) 多肽链 mRNA (2) 乳腺蛋白基因 显微注射法 受精卵 (3)突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料 (4) 乳腺生物反应器 大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对水蛭素进行加工，而乳腺生物反应器产生的水蛭素可经过加工具有活性 (5) 抗水蛭素的抗体 抗原-抗体杂交 26．(1) 逆（反）转录 胰岛B细胞表达胰岛素基因 (2) ②③ 5'端 30 (3) BamHI和SalI GGATCCGCTGCATGTTTA (4)经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养--段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌 (5)从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质 地 城 考点05 生物技术的安全与伦理问题 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A A C B A A C C A B 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 A A C B A B A C B D 题号 21 22 23 24 25 答案 ABCD BCD BD ABD CD 试卷第1页，共3页 3 / 3 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $