重难点04 基因工程的综合应用（期末真题汇编）高二生物下学期人教版

**基本信息** 聚焦基因工程综合应用，汇编多地区期末试题，融合科技前沿情境与实验分析，突出科学思维与探究实践能力考查。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |单选题|16|限制酶作用、PCR技术、农杆菌转化法等|结合电泳图谱（如第1题）、质粒结构（如第10题）分析，考查工具酶与载体构建| |多选题|8|基因表达载体构建、目的基因检测等|通过双酶切选择（如第17题）、重组质粒筛选（如第22题），强化科学推理| |解答题|8|蛋白质工程、转基因操作流程等|以抗冻甘薯培育（第27题）、t-PA蛋白改良（第30题）为情境，综合考查实验设计与结果分析|

重难点 04 基因工程的综合应用 一、单选题 1．(24-25高二下·福建漳州艺术实验学校·期末)研究人员利用农杆菌转化法将大豆中的耐盐碱基因（GsERF6基因）转入水稻细胞中，培育高表达GsERF6基因的耐盐碱水稻，图甲为研究人员构建的GsERF6基因表达载体，其中新霉素基因是用于筛选转化的植物细胞的标记基因；图乙为研究人员对转化的植物细胞进行目的基因检测的电泳图谱，其中M：DNAmarker；-：阴性对照；+：阳性对照；1：转基因水稻DNA。下列叙述错误的是（    ） A．可利用含新霉素的MS培养基筛选转化的水稻细胞 B．新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的同一条链上 C．阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6 D．据电泳图推断目的基因片段大小约为1000bp，尚需测序以确定其是否为目的基因 2．(24-25高二下·新疆阿克苏第一中学·期末)科学家从某植物中提取乙烯受体基因（Ers1），通过基因工程技术将Ers1基因反向连接到质粒中，筛选出转入反义Ers1基因的该种植物，其果实的储藏期将延长，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增时，需在Ers1基因左右两端分别添加XhoI、HpaI酶切序列 B．筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素，过程④包括脱分化和再分化 C．转基因植物中反义Ers1基因和Ers1基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补 D．若目的基因成功转入植物细胞中，则可检测到Kanr和hyg的表达产物 3．(24-25高二下·宁夏固原·期末)红梅杏是固原市的特色水果之一，带动了当地农民的收入。其色泽鲜艳、富含果糖和葡萄糖以及人体需要的微量元素、成熟期能保留足够的水分而口感鲜嫩，因此享誉全国。有人试图利用苏云金芽孢杆菌Bt毒蛋白基因培育抗虫红梅杏，以降低生产成本和环境污染，设计了如下图的方案。下列有关该研究说法错误的是（　　） A．通过基因工程技术培育的抗虫红梅杏，有利于保护环境 B．完成过程①→②一般选用双酶切法 C．在植株⑤中检测到Bt毒蛋白基因，就代表抗虫红梅杏已经培育成功 D．过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理 4．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是（    ） 注：箭头表示识别序列中切断部位。 A．KpnI和Acc65I切割形成的黏性末端相同 B．BamHI与MboI切割后的产物可以通过DNA连接酶连接，连接后序列可能无法被BamHI再次切开 C．用EcoRI和HhaI切割获取的目的基因含有4个游离的磷酸基团，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解 D．若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化 5．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 6．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析正确的是（    ） A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因能翻译，但不能转录 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因无法表达 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白和无Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入受体细胞 7．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T-DNA插入的具体位置。下列叙述正确的是（    ） A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其拟核上 B．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．若用PCR技术扩增循环n次，需要2n-1个引物 8．(24-25高二下·吉林长春外五县·期末)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述错误的是（　　） A．PCR过程每次循环分3步，其中温度最低的是复性 B．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ C．②链从L到R的方向为3'→5′，①②链均可作为子链合成的模板 D．物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 9．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。如图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果。下列有关说法错误的是（　　） A．该抗虫机制可能是抑制害虫的食物消化从而使其死亡 B．此实验中的因变量是棉花植株所含的基因种类和饲喂时间 C．根据虫体质量和每株棉铃数量判断，NaPI+StPinlA组抗虫效果最佳 D．将抗虫基因传入植物体内时，除了采用花粉管通道法外，还可以采用农杆菌转化法 10．(24-25高二下·辽宁丹东·期末)通过人工合成Bt基因部分序列与天然Bt基因的另一部分序列进行拼接构成重组的Bt基因，将之与T-DNA构成穿梭质粒，可提高农杆菌的转化效率，大大提高了培育抗虫棉的成功率，过程如下图。下列相关叙述正确的是（    ） A．如图过程是对基因进行操作，因而不属于蛋白质工程 B．本实例是将重组质粒直接导入棉花愈伤组织细胞，再进行组织培养获得抗虫棉 C．本实例中，可用卡那霉素和潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞 D．通过该过程能定向改造抗虫蛋白分子的结构，使之更加符合人类需要 11．(24-25高二下·宁夏银川一中·期末)下图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是（    ）    A．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3'→5'方向延伸 C．在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/4 D．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，引物A延伸需要耐高温的DNA聚合酶 12．(24-25高二下·辽宁大连·期末)某DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，经Sau3AI处理后会形成4个大小不同的片段；若用BamHI处理，则只会形成2个大小不同的片段。Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述正确的是（    ） 限制酶名称 识别序列及切割位点 BamHI G↓GATCC Sau3AI ↓GATC A．Sau3AI和BamHI切割产生的不全是黏性末端 B．该DNA分子上有一个BamHI的酶切位点 C．用两种酶共同处理该DNA分子，会形成4个片段 D．Sau3AI和BamHI切割产生的片段能够相连，但重组片段不能再被二者切割 13．(24-25高二下·山东威海·期末)重叠延伸PCR是一种能够在体外实现不同来源DNA片段定向重组的技术。具体原理是：通过利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，借助重叠链的延伸将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，其过程如下图所示。下列说法错误的是（    ） A．PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同 B．PCR3反应体系中经变性和复性后的DNA单链理论上有4种结合的可能 C．重叠链延伸生成融合基因时需要加入引物 D．PCR4中需要添加的引物是引物1和4 14．(24-25高二下·福建福州福清·期末)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果（番茄品种）细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述错误的是（　　） A．可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录 B．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶III C．利用PCR从海鱼中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 D．要用含有卡那霉素的选择培养基筛选含抗冻基因的番茄细胞 15．(24-25高二下·福建福州福清·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a完全切割，再把得到的产物用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述正确的是（　　） A．限制酶a和b切出的DNA片段能相互连接后可被限制酶a识别切割 B．限制酶切割DNA分子一次可断开1个磷酸二酯键产生1分子水 C．仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段 D．该DNA上含有3个a酶的切割位点，5个b酶的切割位点 16．(24-25高二下·天津红桥区·期末)干扰素是一种广谱抗病毒制剂；是具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。下列相关分析错误的是（    ） A．过程①可以用PCR技术获取干扰素基因 B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶和引物 C．过程③操作要注意干扰素基因应包含启动子、终止子及标记基因等结构 D．过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定 二、多选题 17．(24-25高二下·吉林长春外五县·期末)研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因（如图1），构建GmNF-YA19基因表达载体（如图2）并转化烟草。下列叙述错误的是（　　） A．应选用限制酶KpnI和EcoRI切割含目的基因的DNA片段和载体 B．启动子为位于基因上游的DNA片段，是DNA聚合酶识别和结合的部位 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来 D．正确导入GmNF-YA19基因的细胞可在含有氨苄青霉素的培养基中生长 18．(24-25高二下·山东东营·期末)利用小球藻生产生物柴油，具有广阔的开发利用前景。科学家从酵母菌中提取DGAT基因（DGAT：二酸甘油酰基转移酶，合成油脂重要基因），导入到小球藻中增强小球藻油脂代谢途径，最终获得高产油脂小球藻。已知质粒上EcoRI酶切位点与XbaI酶切位点间最短间隔为300bp。下列说法正确的是（　　） A．扩增产物的长度决定PCR延伸的时间，引物的G/C含量决定复性的温度 B．若采用PCR技术对一个DGAT基因进行扩增，则复制n代共需要引物2n+1-2个 C．pB121载体中使用酵母菌的启动子可让DGAT基因在小球藻中更好表达 D．由电泳结果可知a为构建成功的重组质粒，b为未连接目的基因的空质粒 19．(24-25高二下·四川绵阳外国语学校·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA 片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（    ） a酶切割产物（bp） b酶再次切割产物（bp） 2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200 A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．同时使用酶a和酶b对目的基因所在的片段和质粒进行切割，可保证二者正确连接 C．a酶与b酶切出的黏性末端相互连接后的序列不可再被a酶切割 D．仅用a酶切割该DNA分子需要消耗6个水分子，增加了3个游离的磷酸基团 20．(24-25高二下·河北衡水枣强中学·期末)Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，因此可以插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长。形成瘤状组织（冠瘿），影响植物的正常生理功能。冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱（一种氨基酸衍生物），为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列叙述正确的是（　　） A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其最终表达产物可用来催化合成冠瘿碱 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上·且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 21．(24-25高二下·江西抚州·期末)科研人员构建可表达H-M3融合蛋白的重组质粒并导入受体细胞，该质粒的部分结构如图所示，其中M3编码序列表达标签短肽M3。下列有关叙述正确的是（    ） A．为了使H基因和M3编码序列产生相同黏性末端，只能用同种限制酶进行切割 B．H基因和M3编码序列通过磷酸二酯键相连 C．图中H基因以甲链作为模板进行转录 D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合有9种 22．(24-25高二下·江西景德镇·期末)如图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstI、EcoRI和HinIⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，假设用两种限制酶同时处理目的基因和质粒，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。下列相关分析正确的是（　　）    A．目的基因就是指编码蛋白质的基因 B．图中选择了EcoRI和HindⅢ两种限制酶同时切割人生长素基因和质粒 C．含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是在丙中能存活，在乙中不能存活 D．过程①所用到的组织细胞是人垂体组织细胞，③过程的目的是将平末端处理为黏性末端 23．(24-25高二下·河北沧州泊头文宇中学·期末)无缝克隆技术（In-Fusion技术）是一种先进的DNA重组技术，用于将目标DNA片段插入载体中。其中In-Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp（bp为碱基对）末端序列的线性DNA分子，过程如图所示。下列关于该技术的叙述正确的是（　　） A．推测In-Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B．PCR扩增目的基因时，需在引物5'端添加与载体相同的特定序列 C．利用In-Fusion技术构建图示重组载体时，可避免目的基因与载体的反向连接 D．当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，该方法将无法使用 24．(24-25高二下·湖南岳阳·期末)FSHD是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示，已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。下列说法正确的是（　　） A．DUX4反义基因通过抑制DUX4基因的转录过程来抑制DUX4基因的表达 B．可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入患病组织细胞 C．利用图中信息构建反义基因表达载体时，选择的限制酶应为Hind III和BamHI D．利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测DUX4反义基因是否导入受体细胞 三、解答题 25．(24-25高二下·甘肃白银部分学校·期末)某基因工程中，质粒与目的基因的结构如图所示，相关限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 BclⅠ BglⅡ 识别序列及切割位点 -T↓GATCA- -A↓GATCT- (1)将切割后的目的基因和质粒进行连接需要用到_______酶。 (2)标记基因的作用是________。检测发现某细胞中存在标记基因，是否说明该细胞已经成功导入目的基因？_______（填“是”或“否”），原因是________。 (3)通过上述过程得到的重组质粒是否均为目的质粒？________（填“是”或“否”），原因是________。 26．(24-25高二下·重庆第一中学校·期末)反刍动物具有特殊的器官——瘤胃，瘤胃中恒定的温度和厌氧的环境为多种微生物提供了生长繁殖的有利条件。图1是从瘤胃中分离纤维素分解菌的流程图。回答下列问题： （滚管培养：吸取一定体积的菌液注入盛有50℃左右液体状态的培养基的试管中，振荡均匀后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，这样带菌培养基在试管内壁立即凝固成一薄层，经培养后可在培养基内或表面长出肉眼可见的菌落。） (1)上述实验筛选的微生物的代谢类型为____；菌落特征可作为鉴定菌种的依据，常用的菌落特征包括 ____等（答出两点）。 (2)滚管培养法____（填“能”或“不能”）用于细菌计数；若不能，请说明理由，若能，请写出计算结果所需要知道的相关数据：____。 (3)分离出的某细菌（解淀粉芽孢杆菌）其W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，为使大肠杆菌产生该酶，以图2中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。 限制酶 BamHI EcoRI Mfel Kpnl HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT ①W基因转录的模板链是____。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____的启动子。 ②在构建基因表达载体时，应使用限制酶____切割图中质粒，使用限制酶____切割图中含W基因的DNA片段。 27．(24-25高二下·吉林长春长春汽车经济技术开发区第三中学·期末)抗冻蛋白基因TmAFP是从黄粉虫幼虫体内分离得到的基因，其编码的蛋白质具有很强的抗冻活性。科学家成功将TmAFP基因导入甘薯中，并使甘薯获得抗冻能力，减少霜冻对甘薯的损害，提高甘薯的产量和质量。图1为基因工程操作可能用到的6种限制酶的识别序列（箭头表示切割位点），图2表示培育抗冻甘薯新品种的流程。回答下列问题： (1)获得的抗冻蛋白基因TmAFP可利用____技术大量扩增，其依据的原理是____。该过程需在含____的缓冲液中加入适量的模板DNA、分别与两条模板链结合的____、4种脱氧核苷酸及____等。 (2)过程②将构建的基因表达载体导入根瘤农杆菌之前，一般先用____处理农杆菌。 (3)分析图1信息，进行①过程前，选择限制酶____切割质粒P1，选择限制酶____切割抗冻蛋白基因TmAFP，这样可以防止质粒、目的基因自身环化和反向拼接。 (4)若要从个体生物学水平鉴定培育的转基因甘薯植株是否具有抗冻的特性，应进行的操作是_____。 28．(24-25高二下·吉林白山五校·期末)有研究表明CDKN2B基因与小鼠的寿命有关，科学家将该基因导入小鼠体内，统计其寿命是否高于正常小鼠。图1表示CDKN2B基因与相关限制酶酶切位点，该基因转录出的mRNA碱基序列与A链的碱基序列相同（T、U视为相同的碱基），图2为质粒简图，回答下列问题： (1)科学家首先采用PCR技术对目的基因进行扩增。PCR过程中每一循环有两次升温一次降温，其中降温的目的是_________。 (2)科学家在构建基因表达载体过程时，目的基因应插在_________和_________之间才能正常表达。单独使用限制酶HindⅢ分别切割目的基因和载体后产生黏性末端。携带CDKN2B基因的重组质粒成功导入细胞后，发现约一半的细胞中没有检测到CDKN2B蛋白，原因是_________。为了避免这种现象的发生，应对以上方法进行改进，改进措施为_________。 (3)若想让一个转入了目的基因的受精卵发育成多个个体，可以采用_________技术，该技术可以看作动物_________的方法之一、 29．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)MS2噬菌体是一种RNA病毒，其遗传物质由控制合成A蛋白、衣壳蛋白（CP）、复制酶（REP）等蛋白的基因组成。A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，颗粒中含REP，缺乏REP时噬菌体不能增殖形成噬菌斑。将逆转录得到的MS2基因组中的REP基因拆分成REP-a和REP-b基因片段，并将REP-a基因与X基因融合，将REP-b基因与Y基因融合，若X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，则会使REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，相关过程如下图。回答下列问题： (1)若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有______（填“互补末端”或“不同末端”）的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因。重叠PCR中_______过程所需温度最低。若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助_______酶将两个片段连接起来。 (2)质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含______段。质粒1的表达产物________与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs。 (3)将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成_________，图中培养基出现阳性结果，则说明__________。 30．(24-25高二下·辽宁县域重点高中·期末)t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。若将t-PA蛋白第84位的氨基酸由半胱氨酸（密码子是UGU）替换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。回答下列问题：    (1)在PCR技术中高温变性的目的是_______，若PCR扩增没有获得扩增产物，下列解释合理的有_______。 ①复性温度过高②缓冲液中缺少镁离子③引物之间互补配对 (2)图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是5'-______-3'（写出3个碱基）。重叠延伸得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因与质粒pCLY11成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限制酶酶切序列，请写出PCR3扩增中引物a的碱基序列5'-_______-3'（写出15个碱基）。 (3)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白。将t-PA改良基因与_______启动子连接构建表达载体，通过_______法将重组质粒导入受精卵，将受精卵培养至______阶段时，可以进行胚胎分割。 (4)受精卵发育成的转基因母牛在进入______期后，从转基因牛的乳汁中提取t-PA，对t-PA进行活性检测时，应以t-PA溶液为阳性对照，以________为阴性对照。 31．(24-25高二下·河北保定·期末)长期使用抗生素容易使致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其抗菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和能够促进伤口愈合的潜在能力成为最有前景的抗菌药物之一。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子：CCA）替换成苏氨酸（密码子：ACA）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图甲所示，使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白。图乙表示相关的目的基因、载体及限制酶。PCLY11为质粒，新霉素和四环素为抗生素。回答下列问题： (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA对应碱基序列中第______位的碱基替换掉，基因转录模板链上相应位点碱基的变化为______。 (2)由图甲分析，大引物PCR定点诱变技术中，设计的诱变引物的碱基序列为5'-______（写出8个碱基）-3'。利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要______个循环才能获得相应的大引物模板。 (3)据图乙分析，应选择限制酶______切割PCLY11，才能使其与改良t-PA蛋白基因高效连接。改良t-PA蛋白基因与质粒PCLY11构建基因表达载体时，需要用DNA连接酶催化______键的形成。 (4)在筛选过程中，应该选择不含______（填基因种类）的大肠杆菌作为受体细胞，以便在选择培养基中筛选出导入了重组基因表达载体的大肠杆菌。 32．(24-25高二下·辽宁葫芦岛·期末)科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHI、BglⅡ、EcoRI三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列如下（↓表示切割位置）。 回答下列问题： (1)过程①需要______酶的催化，过程②通过PCR技术实现，在PCR体系中，添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性_______（填“降低”或“升高”）。进行PCR时，需要在两种引物的_________端（5'/3'）添加限制酶BglⅡ的识别序列。 (2)用限制酶BglⅡ切割DGAT1，用限制酶_____切割pCAMBIA，将充分酶切后的产物混合，加入DNA连接酶进行连接。 (3)回收电泳凝胶中大小约为_______bp的DNA对大肠杆菌进行转化，用含有______的培养基进行筛选并提取重组质粒。最终获得的重组质粒不一定符合要求，原因是_____。 (4)转基因技术在动植物领域、微生物领域均已取得广泛的成果，下列有关转基因技术的叙述，正确的是_____。 ①我国对农业转基因生物实行了标识制度 ②转基因技术本身是中性的，应理性看待该技术 ③转基因植物的基因来自自然界，不会产生安全性问题 ④只要有证据表明转基因产品有害，就应该禁止转基因技术的应用 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 重难点 04 基因工程的综合应用 一、单选题 1．(24-25高二下·福建漳州艺术实验学校·期末)研究人员利用农杆菌转化法将大豆中的耐盐碱基因（GsERF6基因）转入水稻细胞中，培育高表达GsERF6基因的耐盐碱水稻，图甲为研究人员构建的GsERF6基因表达载体，其中新霉素基因是用于筛选转化的植物细胞的标记基因；图乙为研究人员对转化的植物细胞进行目的基因检测的电泳图谱，其中M：DNAmarker；-：阴性对照；+：阳性对照；1：转基因水稻DNA。下列叙述错误的是（    ） A．可利用含新霉素的MS培养基筛选转化的水稻细胞 B．新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的同一条链上 C．阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6 D．据电泳图推断目的基因片段大小约为1000bp，尚需测序以确定其是否为目的基因 【答案】B 【详解】A、根据题干可知，新霉素基因是用于筛选转化的植物细胞的标记基因，故可利用含新霉素的MS培养基筛选转化的水稻细胞，A正确； B、转录的方向从启动子到终止子，结合图可知，新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的不同链上，B错误； C、实验的目的是对转化的植物细胞进行目的基因检测，阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6，C正确； D、根据阳性对照组电泳结果可知，目的基因的长度大约为1000bp，1号电泳结果与阳性对照组相同，说明其长度与目的基因相同，但要确定是否是目的基因，还需要进行测序，D正确。 故选B。 2．(24-25高二下·新疆阿克苏第一中学·期末)科学家从某植物中提取乙烯受体基因（Ers1），通过基因工程技术将Ers1基因反向连接到质粒中，筛选出转入反义Ers1基因的该种植物，其果实的储藏期将延长，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增时，需在Ers1基因左右两端分别添加XhoI、HpaI酶切序列 B．筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素，过程④包括脱分化和再分化 C．转基因植物中反义Ers1基因和Ers1基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补 D．若目的基因成功转入植物细胞中，则可检测到Kanr和hyg的表达产物 【答案】D 【详解】A、依题意，Ers1基因的转录方向由左向右，据图可知，质粒中限制酶HpaI靠近启动子，限制酶XhoI靠近终止子，若要将Ers1基因反向连接到质粒中，则需在Ers1基因左右两端分别添加XhoI、HpaI酶切序列，A正确； B、基因表达载体中含有潮霉素抗性基因，筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素。受体细胞经脱分化和再分化后形成转基因植株，因此过程④包括脱分化和再分化，B正确； C、反义Ersl基因转录的模板链和Ersl基因的模板链互补，因此，反义Ersl基因和Ersl基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补，C正确； D、农杆菌侵染植物细胞后，其中的T-DNA转移至植物的染色体上，依题意，LB、RB分别T-DNA的左右边界，标记基因Kanr不在T-DNA上，hyg在T-DNA上，因此，若目的基因成功转入植物细胞中，且相关基因都能正常表达，也只能检测到hyg的表达产物，D错误。 故选D。 3．(24-25高二下·宁夏固原·期末)红梅杏是固原市的特色水果之一，带动了当地农民的收入。其色泽鲜艳、富含果糖和葡萄糖以及人体需要的微量元素、成熟期能保留足够的水分而口感鲜嫩，因此享誉全国。有人试图利用苏云金芽孢杆菌Bt毒蛋白基因培育抗虫红梅杏，以降低生产成本和环境污染，设计了如下图的方案。下列有关该研究说法错误的是（　　） A．通过基因工程技术培育的抗虫红梅杏，有利于保护环境 B．完成过程①→②一般选用双酶切法 C．在植株⑤中检测到Bt毒蛋白基因，就代表抗虫红梅杏已经培育成功 D．过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理 【答案】C 【详解】A、通过基因工程培育抗虫红梅杏，植株自身可表达 Bt 毒蛋白实现抗虫，能减少农药的使用量，从而降低环境污染、保护生态环境，A正确； B、过程①—②是构建重组 Ti 质粒（将 Bt 毒蛋白基因与 Ti 质粒连接），为了避免目的基因（Bt 毒蛋白基因）和载体（Ti 质粒）发生 “自身环化”，同时保证目的基因与载体的正确连接方向，通常会选择双酶切法（用两种不同的限制酶切割目的基因和载体），B正确； C、基因工程培育抗虫植株的 “成功标准”，不仅要求目的基因（Bt 毒蛋白基因）导入受体细胞并稳定存在，还需要目的基因能正常转录、翻译（表达出 Bt 毒蛋白），且植株表现出抗虫性状。仅检测到 Bt 毒蛋白基因的存在，无法确定基因是否表达、植株是否具有抗虫能力，因此不能代表培育成功，C错误； D、过程④—⑤是 “植物细胞培养再生植株”，依据的是植物细胞的全能性（已分化的植物细胞，在适宜条件下能发育成完整的新植株），D正确。 故选C。 4．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是（    ） 注：箭头表示识别序列中切断部位。 A．KpnI和Acc65I切割形成的黏性末端相同 B．BamHI与MboI切割后的产物可以通过DNA连接酶连接，连接后序列可能无法被BamHI再次切开 C．用EcoRI和HhaI切割获取的目的基因含有4个游离的磷酸基团，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解 D．若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化 【答案】C 【详解】A、观察KpnI和Acc65I的识别序列和切点：KpnI（-GGTAC↓C-），Acc65I（-G↓GTACC-），二者切割形成的黏性末端都是GTAC-，A正确； B、BamHI与MboI切割形成的黏性末端相同（都是GATC-)），可以通过DNA连接酶连接，连接后序列不一定能被BamHI特异性识别，故不一定会被BamHI再次切开，B正确； C、用EcoRI和HhaI切割获取目的基因，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解，获取的目的基因由两条反向平行的DNA链组成，只含有2个游离的磷酸基团，C错误； D、若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，切割后形成的黏性末端完全相同，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化，D正确。 故选C。 5．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 【答案】D 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】A、由题干可知，题图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，而蛋白质工程的主要依据是蛋白质的预期功能，因此图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能，A正确； B、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能遗传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，B正确； C、合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体在受体细胞中表达，这属于基因工程技术，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，因此图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，D错误。 故选D。 6．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析正确的是（    ） A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因能翻译，但不能转录 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因无法表达 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白和无Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入受体细胞 【答案】C 【详解】A、若检测到Bt抗虫蛋白，说明基因已完成转录和翻译，A错误； B、若检测到mRNA但无蛋白质，说明基因完成转录但翻译受阻，B错误； C、若检测到抗虫基因但无mRNA，可能是基因反向插入导致无法转录，C正确； D、由题干信息可知，“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”，说明导入受体细胞的DNA分子含有目的基因，D错误。 故选C。 7．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T-DNA插入的具体位置。下列叙述正确的是（    ） A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其拟核上 B．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．若用PCR技术扩增循环n次，需要2n-1个引物 【答案】B 【分析】农杆菌的转化作用原理：农杆菌细胞中含有Ti质粒，其上的T-DNA在侵染植物细胞时，会整合到植物细胞的染色体DNA上；把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】A、农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其Ti质粒上，A错误； B、不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置，B正确； C、耐高温的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误； D、扩增循环n次，得到2n个DNA分子，共有2n+1条DNA单链，只有最初的两条母链不需要引物，共需要2n+1-2个引物，D错误。 故选B。 8．(24-25高二下·吉林长春外五县·期末)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述错误的是（　　） A．PCR过程每次循环分3步，其中温度最低的是复性 B．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ C．②链从L到R的方向为3'→5′，①②链均可作为子链合成的模板 D．物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 【答案】C 【详解】A、PCR过程每次循环分3步，即变性，复性、延伸，其中温度最低的是复性，A正确； B、以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23=8，则需消耗引物③的数目为（8×2-2）÷2=7，B正确； C、根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5'→3'，图中①②链均可作为子链合成的模板，C错误； D、物质③的 5′端添加了某序列，根据DNA半保留复制特点，至少需经 2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。 故选C。 9．(24-25高二下·陕西西安新城区·期末)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。如图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果。下列有关说法错误的是（　　） A．该抗虫机制可能是抑制害虫的食物消化从而使其死亡 B．此实验中的因变量是棉花植株所含的基因种类和饲喂时间 C．根据虫体质量和每株棉铃数量判断，NaPI+StPinlA组抗虫效果最佳 D．将抗虫基因传入植物体内时，除了采用花粉管通道法外，还可以采用农杆菌转化法 【答案】B 【详解】A、蛋白酶抑制剂可抑制害虫蛋白酶活性，使害虫无法消化食物，可能致其死亡，A正确； B、因变量是随自变量变化而变化的量，本实验自变量是棉花植株所含基因种类和饲喂时间，因变量是虫体质量、每株棉铃数量，B错误； C、由图可知，NaPI+StPinlA组虫体质量低、每株棉铃数量多，抗虫效果最佳，C正确； D、将基因导入植物细胞，可用花粉管通道法、农杆菌转化法等，D正确。 故选B。 10．(24-25高二下·辽宁丹东·期末)通过人工合成Bt基因部分序列与天然Bt基因的另一部分序列进行拼接构成重组的Bt基因，将之与T-DNA构成穿梭质粒，可提高农杆菌的转化效率，大大提高了培育抗虫棉的成功率，过程如下图。下列相关叙述正确的是（    ） A．如图过程是对基因进行操作，因而不属于蛋白质工程 B．本实例是将重组质粒直接导入棉花愈伤组织细胞，再进行组织培养获得抗虫棉 C．本实例中，可用卡那霉素和潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞 D．通过该过程能定向改造抗虫蛋白分子的结构，使之更加符合人类需要 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、蛋白质工程需要对基因进行改造，图中也属于蛋白质工程，A错误； B、本实例需要先将重组质粒导入农杆菌中，再用农杆菌去侵染棉花细胞，B错误； C、农杆菌转化法中是T-DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，根据T-DNA的左边界和右边界判断，能导入植物细胞的抗性基因只有潮霉素抗性基因，所以只能用潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞，C错误； D、改造基因后定向改造了抗虫蛋白分子的结构，更符合人类的需要，D正确。 故选D。 11．(24-25高二下·宁夏银川一中·期末)下图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是（    ）    A．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3'→5'方向延伸 C．在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/4 D．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，引物A延伸需要耐高温的DNA聚合酶 【答案】A 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种脱氧核糖核苷酸，A错误； B、引物是子链合成延伸基础，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，故子链沿着模板链的3'→5'方向延伸，B正确； C、第三轮循环即DNA复制3次，共形成8个DNA，其中只有2个两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，含量为1/4，且在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，C正确； D、利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶（高温变性时解旋），引物A延伸需要耐高温的DNA聚合酶，D正确。 故选A。 12．(24-25高二下·辽宁大连·期末)某DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，经Sau3AI处理后会形成4个大小不同的片段；若用BamHI处理，则只会形成2个大小不同的片段。Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述正确的是（    ） 限制酶名称 识别序列及切割位点 BamHI G↓GATCC Sau3AI ↓GATC A．Sau3AI和BamHI切割产生的不全是黏性末端 B．该DNA分子上有一个BamHI的酶切位点 C．用两种酶共同处理该DNA分子，会形成4个片段 D．Sau3AI和BamHI切割产生的片段能够相连，但重组片段不能再被二者切割 【答案】C 【详解】A、Sau3AI和BamHI的识别序列分别为↓GATC和G↓GATCC，BamH I和Sau3A I两种限制酶切割后形成的都是黏性末端，均为GATC，A错误； B、该DNA分子上有4个Sau3A I的酶切位点，经Sau3A I处理后形成4个DNA片段，可知该DNA分子为环状DNA，用BamH I处理后，得到2个DNA片段，说明该DNA分子上有2个BamH I的酶切位点，B错误； C、由于BamHI的识别序列G↓GATCC包含Sau3AI的识别序列↓GATC，凡是能被BamHI识别的序列都能被Sau3AI识别，用两种酶共同处理该DNA分子，相当于只用Sau3AI切割，最终会形成4个片段，C正确； D、两种酶切割产生的黏性末端（GATC和GATCC）可互补连接，但重组后的序列可能保留Sau3AI的切点，仍可被Sau3AI切割，D错误。 故选C。 13．(24-25高二下·山东威海·期末)重叠延伸PCR是一种能够在体外实现不同来源DNA片段定向重组的技术。具体原理是：通过利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，借助重叠链的延伸将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，其过程如下图所示。下列说法错误的是（    ） A．PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同 B．PCR3反应体系中经变性和复性后的DNA单链理论上有4种结合的可能 C．重叠链延伸生成融合基因时需要加入引物 D．PCR4中需要添加的引物是引物1和4 【答案】C 【详解】 A、PCR1 扩增 A 基因，PCR2 扩增 B 基因，二者模板分别是 A 基因和 B 基因，引物是针对 A 基因和 B 基因设计的不同引物，所以 PCR1 与 PCR2 反应体系中的模板与引物种类不同，A 正确；    B 、PCR3 反应体系中有来自 PCR1 和 PCR2 的产物，经变性和复性后，DNA 单链理论上有 4 种结合可能：PCR1 产物的两条单链结合、PCR2 产物的两条单链结合、PCR1 产物的一条单链与 PCR2 产物的一条单链正向结合、PCR1 产物的一条单链与 PCR2 产物的一条单链反向结合，B 正确；    C、重叠链延伸生成融合基因时，利用的是 PCR1 和 PCR2 产物的重叠链，不需要额外加入引物，C 错误； D、PCR4 是对融合基因进行扩增，要扩增完整的融合基因，需要添加的引物是引物 1 和 4，D 正确。 故选C。 14．(24-25高二下·福建福州福清·期末)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果（番茄品种）细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述错误的是（　　） A．可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录 B．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶III C．利用PCR从海鱼中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 D．要用含有卡那霉素的选择培养基筛选含抗冻基因的番茄细胞 【答案】D 【详解】A、可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录，这属于分子水平的检测，A正确； B、限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因影响后续的筛选，限制酶Ⅱ有两个识别位点，会影响目的基因连接在正确的位置，因此选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶Ⅲ，B正确； C、利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物，目的是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C正确； D、四环素抗性基因位于T-DNA上，要用含四环素的选择培养基筛选含抗冻基因表达载体的受体细胞，D错误。 故选D。 15．(24-25高二下·福建福州福清·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a完全切割，再把得到的产物用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述正确的是（　　） A．限制酶a和b切出的DNA片段能相互连接后可被限制酶a识别切割 B．限制酶切割DNA分子一次可断开1个磷酸二酯键产生1分子水 C．仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段 D．该DNA上含有3个a酶的切割位点，5个b酶的切割位点 【答案】C 【详解】A、由图可以看出限制酶a和b切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，但是连接后没有限制酶a的识别序列，不能被限制酶识别切割，A错误； B、限制酶切割的是DNA双链，一次可断开2个磷酸二酯键，消耗2分子水，B错误； CD、限制酶a可以把原有DNA切成4段，说明有该DNA分子上有3个切口，即限制酶a的识别序列有3个，限制酶b把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，再把大小是1400的DNA切成大小分别为800和600两个片段，说明限制酶b在该DNA分子上有2个切口，即b酶的识别序列有2个，仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段，C正确，D错误。 故选C。 16．(24-25高二下·天津红桥区·期末)干扰素是一种广谱抗病毒制剂；是具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。下列相关分析错误的是（    ） A．过程①可以用PCR技术获取干扰素基因 B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶和引物 C．过程③操作要注意干扰素基因应包含启动子、终止子及标记基因等结构 D．过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定 【答案】C 【详解】A、过程①表示获取目的基因——干扰素基因，该过程可采用PCR技术获取干扰素基因，然后应用限制酶酶切，A正确； B、②表示通过PCR技术扩增目的基因，其利用原理是DNA双链复制，该过程需用到耐高温的热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）和引物，B正确； C、过程③操作要注意最终构建的基因表达载体上有干扰素基因、启动子、终止子及标记基因，C错误； D、过程④为目的基因导入，最后需对酵母菌分泌的干扰素与人体内干扰素的功能活性进行比较，以确定转基因产品的功能活性与人体的相同，D正确。 故选C。 二、多选题 17．(24-25高二下·吉林长春外五县·期末)研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因（如图1），构建GmNF-YA19基因表达载体（如图2）并转化烟草。下列叙述错误的是（　　） A．应选用限制酶KpnI和EcoRI切割含目的基因的DNA片段和载体 B．启动子为位于基因上游的DNA片段，是DNA聚合酶识别和结合的部位 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来 D．正确导入GmNF-YA19基因的细胞可在含有氨苄青霉素的培养基中生长 【答案】AB 【详解】A、根据图中信息﹐在质粒的启动子和终止子中间含有PvuⅡ、KpnI和EcoRⅠ三种限制酶切割位点，由于KpnI在质粒中不止一个识别位点，用其切割会丢失终止子，因此最好选用PvuⅡ和EcoRⅠ进行切割，且在目的基因的两端也存在着两种酶的识别位点，即应选用PvuⅡ和EcoRI两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，这样可以保证目的基因和质粒正向连接﹐避免发生自身环化，A错误； B、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，B错误； C、终止子是转录终止的位置， C正确； D、载体上含有氨苄青霉素抗性基因，正确导入GmNF-YA19基因的细胞可在含有氨苄青霉素的培养基中生长，D正确。 故选AB。 18．(24-25高二下·山东东营·期末)利用小球藻生产生物柴油，具有广阔的开发利用前景。科学家从酵母菌中提取DGAT基因（DGAT：二酸甘油酰基转移酶，合成油脂重要基因），导入到小球藻中增强小球藻油脂代谢途径，最终获得高产油脂小球藻。已知质粒上EcoRI酶切位点与XbaI酶切位点间最短间隔为300bp。下列说法正确的是（　　） A．扩增产物的长度决定PCR延伸的时间，引物的G/C含量决定复性的温度 B．若采用PCR技术对一个DGAT基因进行扩增，则复制n代共需要引物2n+1-2个 C．pB121载体中使用酵母菌的启动子可让DGAT基因在小球藻中更好表达 D．由电泳结果可知a为构建成功的重组质粒，b为未连接目的基因的空质粒 【答案】ABD 【详解】A、PCR过程分为变性、复性、延伸三步。延伸时间由Taq酶的延伸速率和扩增产物（目的基因）的长度决定。片段越长，Taq酶需要的延伸时间越久（因为要合成更长的子链）。 复性温度与引物的G - C含量正相关。G - C碱基对含3个氢键，A - T含2个氢键；G - C含量越高，引物与模板结合越稳定，因此需要更高的复性温度来保证引物与模板特异性结合，A正确； B、PCR扩增目的基因时，引物作用是“启动子链延伸”，每个新合成的DNA链都需要引物。 假设初始为1个双链DGAT基因，复制n代后，DNA总数为2n个。每个DNA分子有2条链，其中新合成的链数为2 ×2n − 2 =2n+1  −2（总链数减去原始模板的2条链），则复制n代共需要引物2n+1-2个，B正确； C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有物种特异性。酵母菌的启动子是为酵母菌基因表达优化的，小球藻的RNA聚合酶可能无法识别酵母菌的启动子，无法驱动DGAT基因高效转录。若要让DGAT基因在小球藻中更好表达，应使用小球藻自身的启动子（或适合小球藻的启动子），C错误； D、电泳的核心原理是“分子量越小，迁移速率越快”。  重组质粒：插入目的基因后，分子量比空质粒大（空质粒无目的基因插入）。 空质粒：分子量小，电泳时迁移速率更快，条带更靠下；重组质粒分子量更大，迁移速率更慢，条带更靠上。 结合电泳图，  a条带靠上（分子量更大），为插入目的基因的重组质粒；  b条带靠下（分子量更小），为未连接目的基因的空质粒，D正确。 故选ABD。 19．(24-25高二下·四川绵阳外国语学校·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA 片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（    ） a酶切割产物（bp） b酶再次切割产物（bp） 2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200 A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．同时使用酶a和酶b对目的基因所在的片段和质粒进行切割，可保证二者正确连接 C．a酶与b酶切出的黏性末端相互连接后的序列不可再被a酶切割 D．仅用a酶切割该DNA分子需要消耗6个水分子，增加了3个游离的磷酸基团 【答案】BD 【分析】1、切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。它们能够识别双链 DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键断开的实质就是发生水解反应（每切割一个磷酸酯键都需要消耗一个水分子），即将连接两个核苷酸的磷酸基团从双酯键状态转变成单酯键状态，生成一个具有游离3'羟基的末端和一个具有游离的5'磷酸基团。根据题干信息可知，酶a和酶b均为限制酶。 2、大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式—黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。根据图文信息可知，酶a的识别序列是-AGATCT-，在A和G之间切割，酶b的识别序列是-AGATCT-，在G和G之间切割。由此可知酶a和酶b是同尾酶，即识别序列不同，但能产生相同的黏性末端。 3、限制酶是重组DNA技术的基本工具，在基因表达载体的构建中被使用。为了防止目的基因和质粒（载体）发生自身环化和反向连接，在基因表达载体的构建中往往采用双酶切的方法。双酶切法的实质是酶切后使目的基因产生两种不同的黏性末端，分别与载体的两端定向连接。 【详解】A、根据表格信息，a酶可以把该线性DNA分子切成4个大小不同的片段，说明该DNA分子上有3个a酶的切割位点，即a酶的识别序列有3个；b酶把2100 bp的DNA切成2个片段，大小分别为1900 bp和200 bp，把1400 bp的DNA切成2个片段，大小分别为800 bp和600 bp，把500 bp的DNA切成切成2个片段，大小分别为200 bp和300 bp。说明b酶在2100 bp、1400 bp、500 bp这三个DNA片段共有3个切割位点，即b酶的识别序列有3个，A正确； B、酶a和酶b是同尾酶，目的基因和质粒的两端因同尾酶切割均产生相同的黏性末端，这样不仅目的基因和质粒容易发生自身环化，而且目的基因和质粒的连接也容易发生反向连接，B错误； C、由一对同尾酶分别产生的黏性末端结合形成的“杂交位点”，一般不能再被原来任何一种同尾酶所识别和切割，C正确； D、限制酶通过催化磷酸二酯键的水解反应来切割DNA，因DNA分子是双链结构，限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段，需断裂两个磷酸二酯键，消耗两个水分子，并产生2个游离的磷酸基团，这记作切割一次。该DNA分子含有3个a酶的识别位点，需切割3次，则该DNA分子需要消耗6个水分子，增加6个游离的磷酸基团，D错误。 故选BD。 20．(24-25高二下·河北衡水枣强中学·期末)Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，因此可以插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长。形成瘤状组织（冠瘿），影响植物的正常生理功能。冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱（一种氨基酸衍生物），为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列叙述正确的是（　　） A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其最终表达产物可用来催化合成冠瘿碱 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上·且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 【答案】ABC 【详解】A、冠瘿碱合成基因整合后，表达产物是催化冠瘿碱合成的酶，可催化合成冠瘿碱，A 正确； B、生长素基因和细胞分裂素基因会使植物过度生长形成冠瘿，为保证转基因植物正常生长，需剔除这两个基因，B 正确； C、目的基因需插入 T - DNA，且不能破坏左右边界序列（保证 T - DNA 转移和整合 ），C 正确； D、Vir 基因表达的 Vir 蛋白能切割 T - DNA，不可替换，标记基因用于筛选重组 DNA，无需替换 Vir 基因，D 错误。 故选ABC。 21．(24-25高二下·江西抚州·期末)科研人员构建可表达H-M3融合蛋白的重组质粒并导入受体细胞，该质粒的部分结构如图所示，其中M3编码序列表达标签短肽M3。下列有关叙述正确的是（    ） A．为了使H基因和M3编码序列产生相同黏性末端，只能用同种限制酶进行切割 B．H基因和M3编码序列通过磷酸二酯键相连 C．图中H基因以甲链作为模板进行转录 D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合有9种 【答案】BC 【详解】A、同尾酶能切割不同的 DNA 片段并产生相同黏性末端，A错误； B、H基因和M3编码序列连接是通过DNA连接酶形成磷酸二酯键相连，B正确； C、转录时，RNA 聚合酶沿模板链移动方向与转录出的 RNA 链延伸方向相同，所以新合成的RNA链左边为5'，右边为3'，对应的模板链左边应为3'，右边为5'。为甲链，C正确； D、为确定H基因正向连接到质粒中，应选择能特异性扩增出正向连接片段的引物组合，有效引物组合为4种，F2-R1，F1-R2，F3-R2，F3-R1，D错误。 故选BC。 22．(24-25高二下·江西景德镇·期末)如图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstI、EcoRI和HinIⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，假设用两种限制酶同时处理目的基因和质粒，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。下列相关分析正确的是（　　）    A．目的基因就是指编码蛋白质的基因 B．图中选择了EcoRI和HindⅢ两种限制酶同时切割人生长素基因和质粒 C．含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是在丙中能存活，在乙中不能存活 D．过程①所用到的组织细胞是人垂体组织细胞，③过程的目的是将平末端处理为黏性末端 【答案】CD 【详解】A、目的基因是指编码特定蛋白质的基因，也可包括调控该基因表达的序列等，并非仅指编码蛋白质的基因，A错误； B、由图可知，与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养基上生长，能在含有四环素的丙培养基上生长，因此是用EcoR I和Pst I两种限制酶同时切割人生长素基因和质粒，B错误； C、由B选项分析可知，目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，因此含有目的基因的大肠杆菌在培养基丙中能存活，在乙中不能存活，C正确； D、过程①需提取人生长激素基因的mRNA，该基因在垂体细胞中特异性表达，故组织细胞是人垂体组织细胞，过程③是逆转录合成cDNA 后，与质粒连接前的处理，目的是将平末端处理为黏性末端，D正确。 故选CD。 23．(24-25高二下·河北沧州泊头文宇中学·期末)无缝克隆技术（In-Fusion技术）是一种先进的DNA重组技术，用于将目标DNA片段插入载体中。其中In-Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp（bp为碱基对）末端序列的线性DNA分子，过程如图所示。下列关于该技术的叙述正确的是（　　） A．推测In-Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B．PCR扩增目的基因时，需在引物5'端添加与载体相同的特定序列 C．利用In-Fusion技术构建图示重组载体时，可避免目的基因与载体的反向连接 D．当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，该方法将无法使用 【答案】ABC 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：分子水平鉴定用抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、根据题意，In-Fusion酶可以替代限制酶和DNA连接酶，用于构建基因表达载体，A正确； B、根据题意“In-Fusion酶可以连接任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子”，因此PCR扩增目的基因时，需在引物5'端添加与载体相同的特定序列，以便于In-Fusion酶的连接，B正确； C、通过在目的基因与线性载体两端连入不同的15 bp末端序列，可实现目的基因的定向插入，从而避免目的基因与载体的反向连接，C正确； D、当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，将无法使用限制酶构建重组载体，但可设计15bp末端序列，使用In-Fusion酶来构建，D错误。 故选ABC。 24．(24-25高二下·湖南岳阳·期末)FSHD是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示，已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。下列说法正确的是（　　） A．DUX4反义基因通过抑制DUX4基因的转录过程来抑制DUX4基因的表达 B．可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入患病组织细胞 C．利用图中信息构建反义基因表达载体时，选择的限制酶应为Hind III和BamHI D．利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测DUX4反义基因是否导入受体细胞 【答案】BC 【详解】A、DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。因此，DUX4反义基因转录的 mRNA可与DUX4基因转录的 mRNA发生碱基互补配对，从而抑制其翻译过程导致DUX4蛋白无法合成，A 错误； B、当受体细胞为动物时可选用显微注射法，该病的治疗为将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的，因此可采用显微注射法将 DUX4反义基因表达载体导入患病组织，B 正确； C、DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，因此DUX4的反义基因的模板链为DUX4基因的编码链，子链延延伸的方向是5'→3'，所以DUX4基因右侧连接启动子，左侧连接终止子，构建DUX4反义基因表达载体，选用的限制酶为Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，C 正确； D 、由于DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，所以DUX4 基因序列制备的引物无法区分 DUX4 基因和反义基因，不能检测反义基因是否导入，D 错误。 故选BC。 三、解答题 25．(24-25高二下·甘肃白银部分学校·期末)某基因工程中，质粒与目的基因的结构如图所示，相关限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 BclⅠ BglⅡ 识别序列及切割位点 -T↓GATCA- -A↓GATCT- (1)将切割后的目的基因和质粒进行连接需要用到_______酶。 (2)标记基因的作用是________。检测发现某细胞中存在标记基因，是否说明该细胞已经成功导入目的基因？_______（填“是”或“否”），原因是________。 (3)通过上述过程得到的重组质粒是否均为目的质粒？________（填“是”或“否”），原因是________。 【答案】(1)DNA连接 (2) 对导入目的基因的细胞（或个体）进行初步筛选 否 导入了不含目的基因的空质粒的细胞中也含有标记基因 (3) 否 经Ⅰ和Ⅱ切割后的目的基因和质粒可以正向连接，也可以反向连接 【分析】构建重组质粒时，选择的限制酶既要保证在目的基因和质粒上都有，保证能切出相同的黏性末端，由不能破坏目的基因，一般选择两种酶切割，以避免自身环化和反向连接。 【详解】（1）将切割后的目的基因和质粒进行连接需要用到DNA连接酶。 （2）标记基因的作用就是便于筛选携带目的基因的重组DNA的受体细胞（或对导入目的基因的细胞（或个体）进行初步筛选）。导入了不含目的基因的空质粒的细胞中也含有标记基因，故检测发现某细胞中存在标记基因，不能说明该细胞已经成功导入目的基因。 （3）分析题图可知，经Ⅰ和Ⅱ切割后会产生相同的黏性末端，故经Ⅰ和Ⅱ切割后的目的基因和质粒可以正向连接，也可以反向连接，所以通过上述过程得到的重组质粒不一定都为目的质粒。 26．(24-25高二下·重庆第一中学校·期末)反刍动物具有特殊的器官——瘤胃，瘤胃中恒定的温度和厌氧的环境为多种微生物提供了生长繁殖的有利条件。图1是从瘤胃中分离纤维素分解菌的流程图。回答下列问题： （滚管培养：吸取一定体积的菌液注入盛有50℃左右液体状态的培养基的试管中，振荡均匀后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，这样带菌培养基在试管内壁立即凝固成一薄层，经培养后可在培养基内或表面长出肉眼可见的菌落。） (1)上述实验筛选的微生物的代谢类型为____；菌落特征可作为鉴定菌种的依据，常用的菌落特征包括 ____等（答出两点）。 (2)滚管培养法____（填“能”或“不能”）用于细菌计数；若不能，请说明理由，若能，请写出计算结果所需要知道的相关数据：____。 (3)分离出的某细菌（解淀粉芽孢杆菌）其W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，为使大肠杆菌产生该酶，以图2中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。 限制酶 BamHI EcoRI Mfel Kpnl HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT ①W基因转录的模板链是____。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____的启动子。 ②在构建基因表达载体时，应使用限制酶____切割图中质粒，使用限制酶____切割图中含W基因的DNA片段。 【答案】(1) 异养厌氧型 菌落的形状、大小、颜色等 (2) 能 （稀释度）、菌落数、加入培养基中的菌液体积 (3) 乙链 大肠杆菌 Mfe I、HindIII EcoRⅠ、HindⅢ 【分析】微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 【详解】（1）瘤胃内的环境是厌氧环境，其内的微生物以胃内的营养物质为食，所以筛选得到的微生物的代谢类型为异养厌氧型；菌落特征可以作为鉴定菌种的依据，常用的菌落特征包括菌落的形状、大小、颜色等。 （2）滚管培养法把一定体积的菌液注入液体状态的培养基，混合均匀后冷却形成固态培养基，稀释度足够时，每一个活菌都能在固态培养基上形成一个单菌落，可以计数活菌数，计算公式是（菌落数÷注射器吸取的菌液体积）×稀释度，所以要想得到计算结果，需要知道稀释度、菌落数、加入培养基中的菌液体积。 （3）①W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链。启动子通常具有物种特异性，操作的目标是使大肠杆菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择大肠杆菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择大肠杆菌启动子。 ②根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，由于EcoRI会将质粒切成片段，BamHI会破坏启动子序列，而MfeI和EcoRI会产生相同的黏性末端，所以结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 27．(24-25高二下·吉林长春长春汽车经济技术开发区第三中学·期末)抗冻蛋白基因TmAFP是从黄粉虫幼虫体内分离得到的基因，其编码的蛋白质具有很强的抗冻活性。科学家成功将TmAFP基因导入甘薯中，并使甘薯获得抗冻能力，减少霜冻对甘薯的损害，提高甘薯的产量和质量。图1为基因工程操作可能用到的6种限制酶的识别序列（箭头表示切割位点），图2表示培育抗冻甘薯新品种的流程。回答下列问题： (1)获得的抗冻蛋白基因TmAFP可利用____技术大量扩增，其依据的原理是____。该过程需在含____的缓冲液中加入适量的模板DNA、分别与两条模板链结合的____、4种脱氧核苷酸及____等。 (2)过程②将构建的基因表达载体导入根瘤农杆菌之前，一般先用____处理农杆菌。 (3)分析图1信息，进行①过程前，选择限制酶____切割质粒P1，选择限制酶____切割抗冻蛋白基因TmAFP，这样可以防止质粒、目的基因自身环化和反向拼接。 (4)若要从个体生物学水平鉴定培育的转基因甘薯植株是否具有抗冻的特性，应进行的操作是_____。 【答案】(1) PCR DNA半保留复制 Mg2+ 2种引物 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） (2)Ca2+ (3) SmaI、XbaI EcoRV、SpeI (4)将转基因植株种植在霜冻环境中，观察生长状况。 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）过程①称为逆转录（或反转录），该过程需要逆转录酶，通过该过程可获得相关的目的基因。获得的抗冻蛋白基因TmAFP可利用PCR技术大量扩增，该过程依据的原理是DNA半保留复制。PCR缓冲液中应含Mg2+，作为酶的激活剂，应含2种引物用来与模板链结合，应含热稳定DNA聚合酶（Taq酶），催化子链中磷酸二酯键的形成。 （2）过程②将构建的基因表达载体导入农杆菌之前，一般先用Ca2+处理农杆菌，从而使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，进而可提高转化效率。 （3）据图可知，为使目的基因能表达出蛋白质，目的基因应插入启动子和终止子之间，该位置有三种酶SmaI、XbaI和HindⅢ的识别序列，目的基因的左端要接在靠近启动子的位置，若切割质粒选择HindⅢ则不能使目的基因左端接在靠近启动子的位置，而SmaI和EcoRV切割产生的是平末端，XbaI和SpeI切割可产生相同的黏性末端，因此根据目的基因两端的序列，为了成功得到重组质粒P2，确保TmAFP基因插入载体中的方向正确，应选用限制酶SmaI、XbaI切割质粒P1，选用限制酶EcoRV、SpeI切割目的基因。 （4）若要从个体生物学水平鉴定培育的转基因甘薯植株是否具有抗冻的特性，需要进行个体生物学鉴定，具体操作为将转基因植株种植在霜冻环境中，观察生长状况。 28．(24-25高二下·吉林白山五校·期末)有研究表明CDKN2B基因与小鼠的寿命有关，科学家将该基因导入小鼠体内，统计其寿命是否高于正常小鼠。图1表示CDKN2B基因与相关限制酶酶切位点，该基因转录出的mRNA碱基序列与A链的碱基序列相同（T、U视为相同的碱基），图2为质粒简图，回答下列问题： (1)科学家首先采用PCR技术对目的基因进行扩增。PCR过程中每一循环有两次升温一次降温，其中降温的目的是_________。 (2)科学家在构建基因表达载体过程时，目的基因应插在_________和_________之间才能正常表达。单独使用限制酶HindⅢ分别切割目的基因和载体后产生黏性末端。携带CDKN2B基因的重组质粒成功导入细胞后，发现约一半的细胞中没有检测到CDKN2B蛋白，原因是_________。为了避免这种现象的发生，应对以上方法进行改进，改进措施为_________。 (3)若想让一个转入了目的基因的受精卵发育成多个个体，可以采用_________技术，该技术可以看作动物_________的方法之一、 【答案】(1)让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (2) 启动子 终止子 部分基因反向连接 同时用PstⅠ、EcoRⅠ分别对目的基因和载体进行酶切 (3) 胚胎分割 无性繁殖或克隆 【分析】1、PCR扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。2、构建基因表达载体过程时，目的基因应插在启动子和终止子之间才能正常表达 【详解】（1）PCR过程中每次循环两次升温（变性和延伸）和一次降温（复性），其中降温（复性）的目的是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （2）基因表达载体包括标记基因、目的基因，启动子和终止子，科学家在构建基因表达载体过程时，目的基因应插在启动子和终止子之间才能正常表达。单独使用限制酶HindⅢ切割目的基因和载体后，由于部分基因反向连接，导致携带CDKN2B基因的重组质粒成功导入细胞后，约一半的细胞中没有检测到CDKN2B蛋白。为了避免这种现象的发生，可以同时用两种酶进行切割，由于SmaⅠ会破坏CDKN2B基因，不能选用该酶切割，HindⅢ会破坏质粒的两种标记基因，不能选用该酶切，PstⅠ和EcoRⅠ能切下完整的CDKN2B基因，并不会破坏抗四环素基因，因此为了避免这种现象的发生，可以同时用PstⅠ、EcoRⅠ分别对目的基因和载体进行酶切。 （3）来自同一个胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此要让一个受精卵发育成多个个体，可采用胚胎分割技术，然后经移植获得多胎。胚胎分割得到的多个个体基因型相同，可看作无性繁殖或克隆的方法之一。 29．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)MS2噬菌体是一种RNA病毒，其遗传物质由控制合成A蛋白、衣壳蛋白（CP）、复制酶（REP）等蛋白的基因组成。A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，颗粒中含REP，缺乏REP时噬菌体不能增殖形成噬菌斑。将逆转录得到的MS2基因组中的REP基因拆分成REP-a和REP-b基因片段，并将REP-a基因与X基因融合，将REP-b基因与Y基因融合，若X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，则会使REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，相关过程如下图。回答下列问题： (1)若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有______（填“互补末端”或“不同末端”）的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因。重叠PCR中_______过程所需温度最低。若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助_______酶将两个片段连接起来。 (2)质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含______段。质粒1的表达产物________与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs。 (3)将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成_________，图中培养基出现阳性结果，则说明__________。 【答案】(1) 互补末端 复性 限制酶和DNA连接 (2) REP-b基因 A蛋白和CP (3) 噬菌斑 X、Y蛋白之间有相互作用 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有互补末端的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因；PCR一次循环过程包括变性—复性—延伸，其中复性过程所需温度最低（50℃左右）；若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接 酶（连接切割后的目的基因和运载体）将两个片段连接起来。 （2） 分析题意及题图可知， 质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含 REP-b基因片段；由题意可知，A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，结合图示可知，质粒1的表达产物包括A蛋白和衣壳蛋白（CP），故质粒1的表达产物A蛋白和CP与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后 形成VLPs。 （3）将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成噬菌斑（LPs侵染宿主后，如果形成噬菌斑，说明VLPs具有感染性）；培养基出现阳性结果（形成噬菌斑）表明X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，使得REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，从而使得VLPs能够感染宿主并形成噬菌斑 30．(24-25高二下·辽宁县域重点高中·期末)t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。若将t-PA蛋白第84位的氨基酸由半胱氨酸（密码子是UGU）替换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。回答下列问题：    (1)在PCR技术中高温变性的目的是_______，若PCR扩增没有获得扩增产物，下列解释合理的有_______。 ①复性温度过高②缓冲液中缺少镁离子③引物之间互补配对 (2)图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是5'-______-3'（写出3个碱基）。重叠延伸得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因与质粒pCLY11成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限制酶酶切序列，请写出PCR3扩增中引物a的碱基序列5'-_______-3'（写出15个碱基）。 (3)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白。将t-PA改良基因与_______启动子连接构建表达载体，通过_______法将重组质粒导入受精卵，将受精卵培养至______阶段时，可以进行胚胎分割。 (4)受精卵发育成的转基因母牛在进入______期后，从转基因牛的乳汁中提取t-PA，对t-PA进行活性检测时，应以t-PA溶液为阳性对照，以________为阴性对照。 【答案】(1) 使双链DNA解旋为单链（或破坏氢键） ①②③ (2) AGA CCCGGGTGAAACGCT (3) 乳腺中特异性表达的基因的 显微注射 桑葚胚或囊胚 (4) 泌乳 正常母牛乳汁（或非转基因母牛乳汁） 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子、终止子和标记基因等（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在PCR技术中高温变性的目的是使双链DNA解旋为单链，利用了DNA热变性原理。复性温度过高、引物之间互补配对都会影响模板与引物的结合，DNA聚合酶需要镁离子激活，故缓冲液中缺少镁离子，也会导致无扩增产物。故①②③均合理。 （2）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，半胱氨酸的密码子为UGU，相应的基因模板链（图中t-PA蛋白基因的上链）上的碱基序列是ACA，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA蛋白基因上链对应t-PA蛋白第84位氨基酸的碱基序列替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t - PA蛋白基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是AGA。重叠延伸得到的改良t - PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'，引物a对应的序列与非模板链相同，启动子在目的基因的上游，故限制酶酶切序列要添加与启动子相邻限制酶的序列，故PCR3扩增中引物a从5'至3'的碱基序列为5'-CCCGGGTGAAACGCT-3'。 （3）利用乳房生物反应器获得转基因产品，目的基因要与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚进行分割。由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。 （4）进入泌乳期后，转基因母牛才能分泌乳汁。对乳汁t - PA进行活性检测，应以t - PA溶液为阳性对照，以正常母牛乳汁（或非转基因母牛乳汁）为阴性对照，排除乳汁中其他蛋白质的干扰。 31．(24-25高二下·河北保定·期末)长期使用抗生素容易使致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其抗菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和能够促进伤口愈合的潜在能力成为最有前景的抗菌药物之一。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子：CCA）替换成苏氨酸（密码子：ACA）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图甲所示，使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白。图乙表示相关的目的基因、载体及限制酶。PCLY11为质粒，新霉素和四环素为抗生素。回答下列问题： (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA对应碱基序列中第______位的碱基替换掉，基因转录模板链上相应位点碱基的变化为______。 (2)由图甲分析，大引物PCR定点诱变技术中，设计的诱变引物的碱基序列为5'-______（写出8个碱基）-3'。利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要______个循环才能获得相应的大引物模板。 (3)据图乙分析，应选择限制酶______切割PCLY11，才能使其与改良t-PA蛋白基因高效连接。改良t-PA蛋白基因与质粒PCLY11构建基因表达载体时，需要用DNA连接酶催化______键的形成。 (4)在筛选过程中，应该选择不含______（填基因种类）的大肠杆菌作为受体细胞，以便在选择培养基中筛选出导入了重组基因表达载体的大肠杆菌。 【答案】(1) 154 G替换为T (2) CCTGTTAT 2 (3) XmaⅠ和NheⅠ 磷酸二酯 (4)NeoR、TetR/新霉素抗性基因、四环素抗性基因 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1） mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸为一个密码子，第51位的氨基酸对应的mRNA上的碱基为51×3=153，脯氨酸密码子为CCA，苏氨酸密码子为ACA，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，可将mRNA上154位的碱基替换，碱基具体变化为C变为A。模板链与mRNA碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基改变为G变为T。 （2） 由图可知，模板链方向为3'→5'，则诱变引物与转录非模板链碱基互补配对，则诱变引物序列与转录模板链相同，且需将模板连上154位碱基G变为T，则诱变引物序列位5'…CCTGTTAT…3'，利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，通常需要3个循环才能获得引物之间的序列，但图示PCR1中引物1为模板链的1端配对，因而需要2次循环即可获得图示的产物1，其中包含了大引物模板。 （3）据图乙中目的基因两端的黏性末端可知，应选择限制酶XmaⅠ和NheⅠ切割PCLY11，才能使其与改良t-PA蛋白基因高效连接，且不会导致反向链接。改良t-PA蛋白基因与质粒PCLY11构建基因表达载体时，需要用DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 （4）在筛选过程中，应该选择不含NeoR、TetR的大肠杆菌作为受体细胞，以便在选择培养基中筛选出导入了重组基因表达载体的大肠杆菌，即导入空质粒的大肠杆菌能在含有新霉素和四环素的培养基中均能生存，而导入基因表达载体的大肠杆菌只能在含有新霉素的培养基中生长。 32．(24-25高二下·辽宁葫芦岛·期末)科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHI、BglⅡ、EcoRI三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列如下（↓表示切割位置）。 回答下列问题： (1)过程①需要______酶的催化，过程②通过PCR技术实现，在PCR体系中，添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性_______（填“降低”或“升高”）。进行PCR时，需要在两种引物的_________端（5'/3'）添加限制酶BglⅡ的识别序列。 (2)用限制酶BglⅡ切割DGAT1，用限制酶_____切割pCAMBIA，将充分酶切后的产物混合，加入DNA连接酶进行连接。 (3)回收电泳凝胶中大小约为_______bp的DNA对大肠杆菌进行转化，用含有______的培养基进行筛选并提取重组质粒。最终获得的重组质粒不一定符合要求，原因是_____。 (4)转基因技术在动植物领域、微生物领域均已取得广泛的成果，下列有关转基因技术的叙述，正确的是_____。 ①我国对农业转基因生物实行了标识制度 ②转基因技术本身是中性的，应理性看待该技术 ③转基因植物的基因来自自然界，不会产生安全性问题 ④只要有证据表明转基因产品有害，就应该禁止转基因技术的应用 【答案】(1) 逆转录 降低 5' (2)BamH I (3) 3200 卡那霉素 重组质粒中目的基因存在正向连接和反向连接两种情况 (4)①② 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、基因的检测与鉴定。 【详解】（1）过程①是由RNA合成cDNA的逆转录过程，需要逆转录酶的催化；在PCR体系中，引物序列过短会导致其与多种序列结合的可能性增加，从而使其特异性降低；进行PCR时，DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，所以需要在两种引物的5'端添加限制酶Bgl Ⅱ的识别序列，这样在扩增后的目的基因两端才会有Bgl Ⅱ的识别位点。 （2）Bgl Ⅱ切割产生的黏性末端与BamH Ⅰ切割产生的黏性末端相同，所以用限制酶Bgl Ⅱ切割DGAT1，用限制酶BamH Ⅰ切割pCAMBIA，将充分酶切后的产物混合，加入DNA连接酶进行连接。 （3）质粒pCAMBIA大小为2400bp，目的基因DGAT1大小为800bp，重组质粒大小约为2400 + 800=3200bp，所以回收电泳凝胶中大小约为3200bp的DNA对大肠杆菌进行转化。质粒pCAMBIA上含有卡那霉素抗性基因，所以用含有卡那霉素的培养基进行筛选，最终获得的重组质粒不一定符合要求，原因是重组质粒中目的基因存在正向连接和反向连接两种情况。 （4）①我国对农业转基因生物实行了标识制度，让消费者有知情权，①正确； ②转基因技术本身是中性的，我们应理性看待该技术，充分发挥其优势，规避风险，②正确； ③转基因植物的基因虽然来自自然界，但转入的基因可能会对生物多样性、生态环境等产生潜在的安全性问题，③错误； ④如果有证据表明转基因产品有害，应该谨慎对待转基因技术的应用，而不是禁止，要权衡利弊，④错误。 综上所述，正确的是①②。 故选①②。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 重难点 04 基因工程的综合应用 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 B D C C D C B C B D 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 A C C D C C AB ABD BD ABC 题号 21 22 23 24 答案 BC CD ABC BC 25．(1)DNA连接 (2) 对导入目的基因的细胞（或个体）进行初步筛选 否 导入了不含目的基因的空质粒的细胞中也含有标记基因 (3) 否 经Ⅰ和Ⅱ切割后的目的基因和质粒可以正向连接，也可以反向连接 26．(1) 异养厌氧型 菌落的形状、大小、颜色等 (2) 能 （稀释度）、菌落数、加入培养基中的菌液体积 (3) 乙链 大肠杆菌 Mfe I、HindIII EcoRⅠ、HindⅢ 27．(1) PCR DNA半保留复制 Mg2+ 2种引物 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） (2)Ca2+ (3) SmaI、XbaI EcoRV、SpeI (4)将转基因植株种植在霜冻环境中，观察生长状况。 28．(1)让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (2) 启动子 终止子 部分基因反向连接 同时用PstⅠ、EcoRⅠ分别对目的基因和载体进行酶切 (3) 胚胎分割 无性繁殖或克隆 29．(1) 互补末端 复性 限制酶和DNA连接 (2) REP-b基因 A蛋白和CP (3) 噬菌斑 X、Y蛋白之间有相互作用 30．(1) 使双链DNA解旋为单链（或破坏氢键） ①②③ (2) AGA CCCGGGTGAAACGCT (3) 乳腺中特异性表达的基因的 显微注射 桑葚胚或囊胚 (4) 泌乳 正常母牛乳汁（或非转基因母牛乳汁） 31．(1) 154 G替换为T (2) CCTGTTAT 2 (3) XmaⅠ和NheⅠ 磷酸二酯 (4)NeoR、TetR/新霉素抗性基因、四环素抗性基因 32．(1) 逆转录 降低 5' (2)BamH I (3) 3200 卡那霉素 重组质粒中目的基因存在正向连接和反向连接两种情况 (4)①② 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $