抢分秘籍 生物技术与工程（回归教材知识清单）2026年高考生物终极冲刺讲练测

该高中生物学高考复习知识清单系统整合了生物技术与工程模块，涵盖发酵工程、细胞工程、基因工程及生物技术安全性与伦理问题四大章节，包含传统发酵技术、微生物培养、植物组织培养、单克隆抗体制备、基因工程工具与操作等核心知识点。 清单采用分章节知识梳理与要点总结结合的方式，如发酵工程设“易错警示”对比果酒果醋发酵差异，基因工程标注重组DNA技术工具及操作程序核心步骤，培养科学思维。习题演练含判断题及原因分析，强化知识应用，安全性与伦理部分引导态度责任，助力学生自主构建知识体系，辅助教师精准把握复习重点。

秘籍 生物技术与工程（回归教材知识）  第1章 发酵工程 1 1、 传统发酵技术的应用 1 2、 微生物的培养技术及应用 3 3、 发酵工程及其应用 6  第2章 细胞工程 8 1、 植物细胞工程 8 ① 作物繁殖的新途径 9 ② 作物新品种的培育 9 ③ 细胞产物的工厂化生产 10 2、 动物细胞工程 10 3、 胚胎工程 14  第3章 基因工程 16 1、 重组DNA技术的基本工具 16 2、 基因工程的基本操作程序 17 （1）目的基因的获取（教材P76） 17 （2） 基因表达载体的构建（核心步骤）（教材P80） 18 3、 基因工程的应用 19 4、 蛋白质工程的原理和应用（教材P93） 21  第4章 生物技术的安全性与伦理问题 22 1、 转基因产品的安全性 22 2、 关注生殖性克隆人 22 3、 禁止生物武器（教材P111） 23 第1章 发酵工程 传统发酵技术的应用 (1) 传统发酵技术（教材P5） 定义：直接利用原材料中 ，或利用 的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术，一般称为传统发酵技术。 特点：传统发酵以混合菌种的 ，通常是家庭式或作坊式的。 常见食品种类：腐乳酱、酱油、酒醋、泡菜和豆豉。 (2) 发酵 指人们利用 微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转 化为人类所需要的产物的过程。 (3) 常见发酵菌种及相应发酵产品 1　 乳酸菌 乳酸菌是 ，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸(反应简式①),可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。 · 泡菜的制作： a.制作原理 利用乳酸菌（原核生物）在无氧条件下进行乳酸发酵，将葡萄糖分解为乳酸，反应式： ，乳酸积累使泡菜具有酸味，且抑制其他杂菌的生长。 乳酸菌为异养厌氧型微生物。 b.实验材料与用具 材料：新鲜蔬菜（白菜、萝卜、黄瓜等）、食盐、清水、乳酸菌（或利用蔬菜表面的野生乳酸菌）。 用具：泡菜坛（带水槽的密封坛）、菜刀、砧板、天平、漏斗等。 c.制作流程 配制盐水：用清水和食盐配制质量分数为 的盐水，将盐水煮沸冷却（ ）。 装坛：将新鲜蔬菜洗净、切分，装入泡菜坛中，装至半坛时放入蒜瓣、生姜等香辛料，继续装至八成满→倒入冷却后的盐水，使 →盖好坛盖，向坛盖边缘的水槽中注满水， 。 发酵：发酵过程注意经常向水槽中补充水，根据室内温度控制发酵时间。 d.注意事项 泡菜坛需选择无裂纹、无砂眼的，保证密封性能良好，避免氧气进入导致泡菜变质。 发酵过程中要保持坛盖水槽中的水始终充足， 。 泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量会 ，一般在发酵10天后亚硝酸盐含量降至安全水平，此时食用较为安全。 2　 酵母菌 酵母菌是一类单细胞真菌，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源，因此在一些 经常可以发现酵母菌的存在。 酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵(反应简式②),可用于酿酒、制作馒头和面包等。 温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适生长温度约为 · 果酒的制作 a.制作原理 果酒制作：酵母菌（真核生物）在无氧条件下进行酒精发酵，反应式： ，适宜温度为18-25℃，此温度下酵母菌繁殖速度快，发酵效率高。 b.实验材料与用具 材料：新鲜葡萄（或苹果）、洗洁精、体积分数为70%的酒精。 用具：榨汁机、发酵瓶（或泡菜坛）、玻璃棒、pH试纸、滤纸等。 c.制作流程 果酒制作：挑选新鲜葡萄→用清水冲洗1-2次（ 导致野生酵母菌流失）→去除枝梗→榨汁→将葡萄汁装入发酵瓶（留约 空间，防止 ）→密封发酵（每隔12小时左右 瓶盖排气， ）→10-12天后取样检测，可通过嗅味和品尝判断发酵是否完成。 d.注意事项 发酵器具需清洗干净并用70%酒精消毒，防止杂菌污染。 果酒发酵过程中，严格控制无氧环境，若有氧会导致酵母菌进行有氧呼吸，不产生酒精。 3　 醋酸菌 醋酸菌（原核生物）在 ，先将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转化为醋酸，反应式： ，适宜温度为 ，需要持续通入无菌空气。 · 果醋的制作 a.实验材料与用具 材料：发酵好的葡萄酒、体积分数为70%的酒精。 用具：榨汁机、发酵瓶（或泡菜坛）、玻璃棒、pH试纸、滤纸等。 b.制作流程 果醋制作：当果酒发酵完成后，打开瓶盖，通入无菌空气→接种醋酸菌→保持30-35℃温度发酵→7-8天后，若发酵液 ，且pH值下降到 左右，说明果醋发酵完成。 c.注意事项 发酵器具需清洗干净并用70%酒精消毒，防止杂菌污染。 果醋发酵时需 ，可通过在发酵瓶上安装气泵持续通气。 4　 其他发酵菌种 毛霉：毛霉（真核生物）等微生物产生的蛋白酶和脂肪酶，将豆腐中的蛋白质分解为 ，将脂肪分解为甘油和脂肪酸，使腐乳具有独特的风味。 毛霉的生长适宜温度为15-18℃，需要保持一定的湿度。 产品：腐乳。 易错警示 果酒和果醋发酵过程的区别 1、 菌种不同； 2、 氧气条件不同：果酒发酵需无氧发酵，果醋发酵过程需充足的氧气； 3、 温度不同：果酒发酵温度为18-30℃，果醋为30-35℃。 故果酒转为果醋发酵需要提供氧气并适当提高温度。 (4) 传统发酵技术与工业发酵的区别（教材P8） 传统发酵技术：没有接种菌种，而是利用了 。 菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的 。 工业发酵：工业上大规模生产时，通常会先通过微生物培养技术获得 ，再将它们接种到物料中进行发酵，可以缩短 ，确保 。 微生物的培养技术及应用 (1) 培养基的配制（教材P9） ①培养基的分类 A. 按物理状态分： 液体培养基：不含凝固剂（如 ），呈液体状态，适用于微生物的 、 及代谢产物的 。 固体培养基：呈固体状态的培养基。在液体培养基中加入 后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一。 半固体培养基：加入少量凝固剂，用于观察微生物的运动、鉴定菌种、测定噬菌体的效价。 B. 按用途分： 选择培养基：加入某种化学物质， 不需要的微生物生长， 所需微生物生长，如以尿素为唯一氮源的培养基可筛选尿素分解菌。 鉴别培养基：加入某种 ，用于 不同种类的微生物，如伊红美蓝培养基可鉴别大肠杆菌（形成黑色带有金属光泽的菌落）。 通用培养基：含有微生物生长所需的基本营养物质，用于培养多种微生物，如牛肉膏蛋白胨培养基。 要点总结 1． 固体培养基和液体培养基的主要区别：固体培养基加入了凝固剂琼脂。 2． 选择培养基：加入某种化学物质，抑制或阻止不需要的微生物生长，一般只有所需菌种可生长； 3． 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的微生物，培养基上可以有多种菌种生长，但是只有能发生特殊反应的菌落被鉴别出来。 2、培养基配方（教材P10） （1）一般都含有 等营养物质。 碳源：提供微生物生长所需碳元素的物质，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、石油等，是微生物合成细胞物质和代谢产物的主要原料。 氮源：提供微生物生长所需氮元素的物质，如尿素、牛肉膏、蛋白胨、硝酸盐等，用于合成蛋白质、核酸等。 水：微生物细胞的主要组成成分，参与代谢反应，运输营养物质和代谢产物。 无机盐：如钾、钠、钙、镁、磷、硫等，作为酶的辅助因子，维持细胞的渗透压和pH值。 （2）培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O₂的需求。 如:乳酸杆菌:添加 ;霉菌:将pH调至 ;细菌:将pH调至 ;厌氧微生物:提供 。 (2) 无菌技术（教材P10） 1　 针对对象：消毒和灭菌工作主要包括两个方面：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 2　 分类 A. 消毒：是指使用 的物理、化学或生物等方法杀死物体 微生物。 a. 煮沸消毒法：在100℃煮沸5～6 min, 可以杀死微生物的 营养细胞和一部分芽孢。 b. 巴氏消毒法：针对于一些不耐高温 的液体，如牛奶，即 在62～65℃消毒30 min或80～90℃处理 30s～1min, 可以杀死牛奶中的绝大多数微 生物，并且不破坏牛奶的营养成分。 c. 化学药物消毒：酒精 擦拭双手、用氯气消毒水源等。 d. 紫外线进行消 毒：接种室、接种箱或超净工作台在 使用前，可以用紫外线照射30 min, 以杀死 物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 B. 灭菌：则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 a. 湿热灭菌：利用沸水、流通蒸 汽或高压蒸汽进行灭 菌。其中高压 蒸汽灭菌的效果最好。 实验室常用的高压蒸 汽灭菌锅以水蒸气为介质，在 压力为100 kPa、温度为121℃的条件下，维持15～30min来。 b. 干热灭菌：将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160～170℃的热空气中维 持2～3h 。针对耐高温的和 需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸 管、培养皿等)、金属用具等。 c. 灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如涂 布器、接种环、接种针或其他金属用具，直 接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。此外，在接种过 程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位， 也可以通过火焰灼烧来灭菌。 要点总结 消毒和灭菌的区别 灭菌指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死部分微生物，条件温和。 (3) 微生物的纯培养（教材P11） ①常用纯培养方法 1）平板划线法：用 在固体培养基表面连续划线，将菌种逐步稀释，最终得到单个菌落，适用于微生物的分离和纯化。 · 基本过程：配制培养基—灭菌—倒平板—接种和分离酵母菌—培养酵母菌。 2） 稀释涂布平板法： 定义：将菌液进行一系列梯度稀释，然后取少量稀释液涂布在固体培养基表面，培养后得到单个菌落，适用于微生物的 。 过程： A、梯度稀释：将待测样品用无菌水或生理盐水进行系列梯度稀释（如10⁻¹、10⁻²…10⁻ⁿ），每级稀释需充分混匀。 B、涂布平板：取适宜稀释度的菌悬液（通常0.1-0.2mL）滴加到固体培养基平板表面，用无菌涂布器（经酒精灭菌冷却后）将菌液均匀涂布于整个平板表面。 C、培养：待菌液完全吸收后，将平板 （防止 ），置于适宜温度（如37℃）的恒温培养箱中培养一定时间（通常18-24h），使单个微生物细胞生长繁殖形成单菌落。 D、计数：选取菌落数在 之间的平板，统计菌落数量，按公式“菌落数=平板菌落数×稀释倍数/取样体积”计算样品中微生物浓度。 计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养 基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 菌。 计数原则：一般选择菌落数为30～300 的平板进行计数，在同一稀释 度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 计数结果偏小的原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察 到的只是一个菌落。 其他计数方法：显微镜直接计数。该方法利用特定的细菌计数板（细菌等较小的细胞）或血细胞计数板（酵母菌和霉菌孢子等）， 在显微镜下观察、计数；统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，故计数结果一般偏大。 易错警示 平板划线法只能用于纯化菌种，不能用于计数；稀释涂布平板既可以用于纯化菌种，又可以用来计数。 ②选择培养基：在微生物学中，将允许 的微生物生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。如用尿素为唯一氮源的培养基分离能产生脲酶的微生物； ③鉴别培养基：在培养基中加入某种特定的指示剂或化学药品，使培养后不同种类的微生物能呈现出不同的特征（如颜色变化、菌落形态差异等），从而达到鉴别目的的培养基。 例子： · 伊红-亚甲蓝培养基：用于鉴别 ，当大肠杆菌在该培养基上生长时，形成黑色带有金属光泽的菌落，而其他微生物则不会呈现这种特征； · 刚果红-纤维素培养基：用于鉴别分解 的菌，在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，若微生物能分解纤维素，其菌落周围会出现透明圈，反之则无； · 在含尿素的培养基中加入酚红指示剂，尿素分解菌会将尿素分解产生氨，使培养基pH升高，酚红由黄色变为红色，以此可鉴别尿素分解菌。 发酵工程及其应用 (1) 发酵工程基本环节（教材P22） 1　 菌种的选育 方法：自然选育、诱变育种、基因工程育种等 2　 扩大培养：一般使用液体培养基 3　 配制培养基、灭菌、接种 4　 发酵罐内的发酵：发酵过程是发酵工程的 ，需要严格控制发酵条件，保证微生物的生长和代谢朝着预期的方向进行。 发酵条件的控制：温度、pH等 · pH：例如，谷氨酸的发酵生产：在 条件下会积累 ；在 条件下则容易形成 。 · 溶解氧：对于需氧微生物，发酵过程中需要保证充足的溶解氧供应，可通过搅拌、通气等方式增加溶解氧含量；对于厌氧微生物，需严格控制无氧环境，可通过密封发酵罐或通入氮气排除氧气。 · 搅拌速度：搅拌可使培养基中的营养物质分布均匀，提高 含量，促进微生物的生长，但搅拌速度过快 ，需根据微生物的种类和发酵阶段调整搅拌速度。 5　 产品的分离提纯 如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用 等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的 措施来获得产品。 6　 获得产品 (2) 发酵工程的应用（教材P24） ①在食品工业中的应用 a. 生产传统发酵食品：利用发酵工程大规模生产啤酒、食醋、酱油、腐乳、泡菜等传统发酵食品，提高 。 b. 生产食品添加剂：生产柠檬酸、味精（谷氨酸钠）、维生素、甜味剂等食品添加剂，如利用黑曲霉发酵生产柠檬酸，利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，再转化为味精。 c. 酶制剂：目前，已有50多种酶制剂成功用于食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等方面。这些酶制剂除少数由动植物生产外，绝大多数也是通过发酵工程生产的。 ②在医药工业中的应用 a. 生产抗生素； b. 生产激素：利用基因工程菌发酵生产胰岛素、生长激素、促红细胞生成素等激素，如利用大肠杆菌发酵生产人胰岛素，用于治疗糖尿病。 c. 生产疫苗：利用微生物发酵生产乙肝疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗等，如乙肝疫苗是利用酵母菌表达乙肝表面抗原制成的，用于预防乙肝病毒感染。 ③在农牧业中的应用 a. 微生物肥料：微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的 等来 ， ， ，常见的有 、 等。有的微生物肥料还可以抑制 的生长，从而减少病害的发生。 b. 微生物农药：与传统的化学农药不同，微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。例如，苏云金杆菌可以用来防治80多种农林虫害；利用白僵菌可以防治玉米螟、松毛虫等虫害；一种放线菌产生的抗生素——井冈霉素可以用于防治水稻枯纹病。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。 c. 饲料添加剂：研究表明，微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%～80%,而且细菌生长繁殖速度很快。因此，许多国家以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过 ，即单细胞蛋白。用酵母菌等生产的单细胞蛋白可以作为食品添加剂；用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提。另外，在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。 易错警示 单细胞蛋白指的是微生物菌体本身，不是蛋白质。 ④其他方面的应用 随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。像这样的发酵原料的改变推动着发酵工业迅速发展，对解决资源短缺与环境污染问题具有重要意义。 自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在各种极端恶劣的环境(如高温、高压、高盐和低温等环境)中正常生活，对它们的研究已成为国际热点，其中一些极端微生物已应用于生产实践。例如，嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。 发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。 习题演练 (1)豆腐中的蛋白质被蛋白酶全部分解成了氨基酸(　　) 原因：　 (2)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件(　　) 原因：　 (3)当缺乏糖源和氧气时，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，进而转化成乙酸(　　) 原因：　 (4)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　　) 原因：　 (5)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　　) 原因：　 (6)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计(　　) 原因：　 (7)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数(　　) 原因：　 第2章 细胞工程 1. 植物细胞工程 (1) 植物组织培养技术（教材P34） 1　 定义：指将 的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成 的技术。 2　 原理：植物细胞的 ：细胞经 后，仍然具有产生 或分化成 的潜能。 3　 完整过程：外植体（离体的植物器官、组织或细胞）→ →愈伤组织（未分化的、不定形的薄壁组织团块）→再分化→胚状体或丛芽→完整植株。 脱分化： 的细胞失去其特有的结构和功能，转变成 的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块。需 光培养。 再分化：愈伤组织重新 出根、芽等器官。 光照培养，通过调整生长素和细胞分裂素的比例控制分化方向:生长素/细胞分裂素比例高促进根的分化，细胞分裂素/生长素比例高促进芽的分化，二者比例适中促进愈伤组织的形成。 4　 常用培养基：MS培养基。 5　 实验操作注意事项：全程 操作，外植体消毒（70%酒精消毒30s后用无菌水冲洗，再用质量分数为5% 溶液处理30min，最后无菌水冲洗干净），培养基需高压蒸汽灭菌。 6　 地位：是植物体细胞杂交、作物脱毒、单倍体育种等技术的基础。 易错警示 1、 脱分化过程不需要光照，因为光会诱导植物细胞分化，再分化过程需要； 2、 外植体不能灭菌，因为灭菌会导致植物细胞死亡。 (2) 植物体细胞杂交技术（教材P36） 1　 定义：指将 的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成 的技术。 2　 原理：细胞膜的 （原生质体融合阶段）、植物细胞的 （杂种细胞培育成植株阶段）。 3　 过程： a. 去壁：用 酶和 酶去除植物细胞壁，获得原生质体。 b. 原生质体融合：采用物理法（ 、 法）或化学法（ 诱导剂、 ）诱导不同植物的原生质体融合。 c. 再生细胞壁：融合后的原生质体重新形成细胞壁，标志着杂种细胞形成。 d. 植物组织培养：将杂种细胞培养成完整的杂种植株。 4　 意义：在打破 ，实现 ，培育 等方面展示出独特的优势。 易错警示 1、 植物体细胞杂交技术的终点是得到杂种植株，而不是得到杂种细胞就结束了； 2、 原生质体外没有细胞壁，不能放在清水中，会吸水涨破，需要放在等渗或略高渗溶液中。 (3) 植物细胞工程的应用（教材P39） 1　 作物繁殖的新途径 A. 微型繁殖： · 概念：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 · 优点：保持优良品种的 ；繁殖 ，可在短时间内获得大量种苗；不受 · 限制。 · 应用：花卉、果树、经济林木的大规模繁殖，如兰花、香蕉的工业化生产。 B. 作物脱毒： · 原因：很多 繁殖的植物感染的病毒很容易传给后代，病毒在作物体内逐年积累，导致作物产量降低，品质变差。 · 原理：植物顶端 附近（如茎尖）的病毒极少甚至无病毒，因为病毒在植物体内的运输速度慢于分生区细胞的分裂速度。 · 方法：切取植物 （如茎尖）进行组织培养，获得脱毒苗。 · 应用：马铃薯、草莓、甘蔗等作物的脱毒种植，大幅提高作物产量和品质。 2　 作物新品种的培育 A. 单倍体育种： · 过程：取植物花药进行 ，获得单倍体植株；用 处理单倍体幼苗，使染色体数目 ，得到纯合二倍体植株；筛选符合要求的品种。 · 优点：明显缩短 （一般2-3年）；能快速获得纯合子，排除杂种优势的干扰，便于性状稳定遗传。 · 应用：小麦、水稻、烟草等作物的新品种培育，如抗倒伏、抗病虫害的小麦品种。 B. 突变体的利用： · 原理：植物组织培养过程中，培养细胞一直处于 的状态，容易受到培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生 。 · 方法：对 进行诱变处理，然后筛选出具有优良性状的突变体，培育成新品种。 · 应用：培育抗盐碱、抗干旱、抗病虫害的作物品种，如抗除草剂的大豆品种；获得高产、优质的细胞产物突变体。 3　 细胞产物的工厂化生产 · 定义：指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其 的技术； · 技术：植物细胞培养； · 原理： ； · 产物类型：主要是职务的 代谢产物，如人参皂甙、紫杉醇、香料（如薄荷油）、生物碱等。 · 优点：生产效率高，可大规模工业化生产；不受 、 和 限制；减少对野生植物的依赖，保护生态环境。 · 实例：人参皂甙的工厂化生产，通过培养人参愈伤组织细胞，提取人参皂甙，产量远高于天然人参；紫杉醇的生产，从红豆杉细胞培养物中提取，用于治疗癌症。 易错警示 1、 作物脱毒，是使无性生殖的植物通过植物组织培养技术，后代不带或者少带病毒的技术，不是使后代抗病毒； 2、 单倍体育种过程，最终得到的是二倍体纯合子，而不是只得到单倍体； 3、 细胞产物的工厂化生产，使用的是植物细胞培养技术，原理是细胞增殖，没有体现细胞的全能性。 习题演练 (1)实验中除外植体需要灭菌外，使用的培养基和所有的器械也都要灭菌(　　) 原因： (2)愈伤组织是外植体经脱分化和再分化后形成的(　　) 原因：　 (3)无论脱分化还是再分化，过程中均需提供光照(　　) 原因：　 (4)植物组织培养过程中生长素和细胞分裂素的比例始终不变(　　) 原因：　 (5)同一株绿色开花植物不同部位的细胞经组织培养获得的植株基因型都是相同的(　　) 原因：　 (6)植物组织培养中，培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压(　　) 1. 动物细胞工程 (1) 动物细胞培养技术（教材P43） 1　 定义：指从动物体中取出相关的组织，将它 成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞 的技术。 2　 原理： （有丝分裂）。 3　 完整过程： A. 取材：取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（细胞分裂能力强），如小鼠胚胎、幼鼠的肝脏。 B. 分散处理：对新鲜取材的动物组织进行处理，或用 的方法，或用 酶、 酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞（避免胰蛋白酶处理时间过长，损伤 ）。 C. 体外培养的动物细胞分类：a、悬浮培养的细胞；b、贴壁细胞，有细胞贴壁（需要贴附于某些基质表面才能 ）、接触抑制（当贴壁细胞分裂生长到表面 时，细胞通常会停止 ）现象。 D. 原代培养：将分散的细胞制成细胞悬液，转移到培养瓶中培养。人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为 。 E. 传代培养：将分瓶后的细胞培养称为 。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用 收集；贴壁细胞需要重新用 酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。 4　 培养条件： A. 无菌、无毒环境：在体外培养细胞时，需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便 ，防止细胞 对细胞自身造成危害。 B. 营养条件：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为 培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入 等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。 C. 温度、pH和渗透压：哺乳动物细胞培养的温度多以 ℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为 。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。 D. 气体环境： 是细胞代谢所必需的，CO₂的主要作用是 。将细胞放在含有95% 和5% 的混合气体的 培养箱中进行培养。 (2) 干细胞培养及其应用（教材P46） 1　 干细胞分布：存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 2　 干细胞分类： · 胚胎干细胞(简称 细胞)存在于 中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能(图2-13)。 · 成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。 一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成 ，不具有发育成 。 ③特点：有着 能力及 潜能、与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。 ④医学上的应用： 造血干细胞：治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病； 神经干细胞：治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等) 诱导多能干细胞(简称 细胞)：通过体外诱导小鼠 ，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞。已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。 iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞的原因：诱导过程无须 ，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免 反应。 (3) 动物细胞融合技术（教材P48） 1　 定义：使两 个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术； 2　 起点：两 个或多个动物细胞； 3　 终点：一个细胞； 4　 促进细胞融合的方法：PEG 融合法、电融合法和 灭活病毒诱导法等； 5　 原理：细胞膜具有一定的流动性； 6　 动物细胞融合和植物体细胞杂交技术的区别： 终点 原理 细胞融合方法 动物细胞融合 细胞 细胞膜具有一定的流动性 PEG 融合法、电融合和 （特有） 植物体细胞杂交 杂种植株 细胞膜具有一定的流动性、植物细胞具有全能性 PEG 融合法、电融合法、离心法、 7　 主要应用：杂交瘤技术，用于生产单克隆抗体。 (4) 单克隆抗体及应用（教材P48-49） 1　 传统抗体的缺点：由动物免疫后血清提取得到，为多克隆抗体，产量 、纯度 、特异性 ，且易发生交叉反应。 2　 单克隆抗体的优点：特异性 （只针对一种抗原表位）、灵敏度 、可 制备。 3　 制备原理：B淋巴细胞能产生 ，但不能 ；骨髓瘤细胞能 ，但 。通过细胞融合获得的杂交瘤细胞，兼具B淋巴细胞的 产生能力和 的无限增殖能力。 4　 完整制备过程： A. 免疫小鼠：向小鼠体内注射特定 （如乙肝病毒表面抗原），使小鼠产生相应的 。 B. 细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞（含B淋巴细胞）与骨髓瘤细胞混合，用 或 诱导融合，得到融合细胞（包括B淋巴细胞自身融合、骨髓瘤细胞自身融合、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞）。 C. 第一次筛选：用 （HAT培养基）培养融合细胞，只有杂交瘤细胞能存活，未融合的 和融合的 的细胞都会死亡，只有 才能生长（HAT培养基抑制骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合体的增殖，B淋巴细胞自身融合体不能无限增殖，最终死亡）。 D. 第二次筛选： 和 ：对筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆培养，并通过抗原-抗体杂交技术检测，筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。 E. 单克隆抗体的提取：将阳性杂交瘤细胞在体外大规模培养，从 中提取抗体；或注射到小鼠腹腔内，从小鼠 中提取抗体（产量更高、纯度更高）。 ⑤单克隆抗体的应用： · 诊断疾病：制备 ，如乙肝病毒诊断试剂盒、艾滋病病毒诊断试剂盒，快速、准确检测病原体；检测 （如癌胚抗原CEA），用于癌症早期诊断。 · 治疗疾病： 生物导弹：将抗癌药物与单克隆抗体结合，利用单克隆抗体的特异性识别癌细胞表面的抗原，定向将药物输送到癌细胞，减少对正常细胞的损伤。 易错警示 生物导弹中，一般抗体只起导向作用，不治疗疾病，药物只起治疗作用，不能确定起作用的位置，两者各有其功能 免疫治疗：如用单克隆抗体治疗自身免疫病（如类风湿性关节炎）、癌症（如利妥昔单抗治疗淋巴瘤）。 · 科研应用：作为探针研究细胞表面抗原的分布和功能；用于蛋白质的定位、纯化和检测。 (5) 动物体细胞核移植技术（教材P52） 1　 定义：将动物一个细胞的 移入去核的 中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成 的技术。 2　 类型：胚胎细胞核移植（供体细胞为胚胎细胞，分化程度低，克隆成功率高）；体细胞核移植（供体细胞为体细胞，分化程度高，克隆成功率低）。 3　 体细胞核移植的完整过程（以克隆羊多莉为例）： A. 供体细胞准备：从供体高产奶牛身体的某一部位(如耳)上取体细胞，进行培养。 B. 受体细胞准备：从屠宰场收集牛卵巢，采集 ,在体外培养到 ，通过显微操作去除细胞核和第一极体，获得去核卵母细胞。 C. 细胞核移植：将供体细胞注入去核卵母细胞的细胞质中，通过 使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。 D. 用物理或化学方法(如电刺激、Ca²载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程。 E. 胚胎培养：将重组细胞在体外培养，发育至 阶段。 F. 胚胎移植：将胚胎移入受体(代孕)母牛体内。 G. 分娩：代孕母牛分娩，获得克隆牛。 ④原理：动物 （已分化的动物体细胞的细胞核仍含有本物种全套遗传信息，在适宜条件下可发育成完整个体）。 ⑤应用： · 畜牧生产：加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。 · 医药卫生： · 生产珍贵的医用蛋白； · 在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种 。以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免 反应。 · 研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程； · 克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因； · 克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。 · 保护濒危物种：有望增加濒危物种的存活数量。 ⑥存在问题：克隆动物成功率低（一般不足10%）；克隆动物存在健康问题（如体型过大、免疫缺陷、早衰等）；伦理争议（如人类克隆的伦理问题）。 习题演练 (1)将动物细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养(　　) 原因：　 (2)动物细胞在培养过程中都具有细胞贴壁的现象(　　) 原因：　 (3)动物体细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　　) 原因：　 (4)将抗原注入小鼠体内，是为了获得能产生相应抗体的B淋巴细胞(　　) (5)将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行诱导融合，培养液中融合后的细胞即杂交瘤细胞(　　) 原因：　 1. 胚胎工程 (1) 受精（教材P56） 1　 准备阶段1——精子获能 定义：刚刚排出的精子必须在雌性动物的 发生相应的生理变化后，才能获得 的生理现象。 精子获能方法：直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；将精子培养在人工配制的获能液（ 、 等）中使其获能等。 2　 准备阶段2——卵子的准备 卵子在 内发育到 时，才具备受精能力。 ③受精阶段 · 概念：精子和卵子结合形成合子（受精卵）的过程。 · 场所：雌性动物的 内。 · 过程： a、获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出 ，以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。 b、穿越透明带：在精子 的瞬间，卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进人透明带。然后，精子入卵。 c、卵细胞膜反应： 后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。 ④原核形成与融合：精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作 。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ,排出第二极体后，形成 。雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。 易错警示 1. 需要明确精子获能的原因和卵细胞需要发育到减数第二次分裂中期时，才具备受精能力； 2. 需要明确防止多精入卵三道防线的具体时间，避免混淆： 3. 精子释放出多种酶以溶解卵细胞膜外的一些结构：获能后的精子与卵子相遇时； 4. 卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进人透明带，时间：在精子触及卵细胞膜的瞬间； 5. 卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，时间：精子入卵后。 6. 受精的标志：观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志。 7. 受精完成的标志：雌雄原核融合形成合子。 (2) 胚胎早期发育（教材P58） 发育场所：输卵管和子宫。 发育阶段： ①卵裂期：在透明带内进行分裂，细胞 的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加； ②桑椹胚：受精卵经有丝分裂形成的细胞团，细胞数为32个左右，每个细胞都具有发育成 的潜能（全能性）； ③囊胚：细胞出现分化，内细胞团将来发育成 ，滋养层细胞将来发育成 ；囊胚腔逐渐扩大，胚胎从 中伸展出来的过程称为孵化； ④原肠胚：内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔，此时胚胎已具有三个胚层，进一步分化形成各种组织、器官和系统。 (3) 体外受精（教材P60） 概念：模拟体内受精，使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。 主要步骤： ①卵母细胞的 和 ： ②精子的 和 ： ③受精：获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。 (4) 胚胎移植（教材P61） · 概念：将雌性动物的 ，或者通过体外受精及其他方式得到的 ，移植到同种的、 相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。 · 意义：充分发挥雌性优良个体的 潜力，大大缩短供体本身的繁殖周期，提高繁殖效率。 · 生理学基础： ① 与 生殖器官的生理变化相同（ 处理），为胚胎移入受体提供相同的生理环境； ②早期胚胎在一定时间内处于 状态，为胚胎的收集提供可能； ③受体对移入子宫的外来胚胎基本上 免疫排斥反应，为胚胎在受体内的存活提供了可能； ④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受受体影响。 · 基本程序： ①对供、受体的选择和处理：选择遗传特性和生产性能优秀的供体，健康的受体；用激素进行同期发情处理，用 对供体母牛做超数排卵处理； ②配种或人工授精； ③胚胎的收集、检查、培养或保存：用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来；对胚胎进行质量检查（发育到桑椹胚或囊胚阶段），可直接向受体移植，或放入-196℃的液氮中保存； ④胚胎移植：手术法或非手术法将胚胎移入受体子宫； ⑤移植后的检查：对受体母牛进行是否妊娠的检查，妊娠后产下犊牛。 (5) 胚胎分割（教材P62） 1　 概念：采用 将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 2　 特点：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于 繁殖或克隆。 3　 材料：发育良好、形态正常的 。 4　 操作设备：实体显微镜和显微操作仪。 5　 注意事项：分割囊胚时，需将 均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育；分割的胚胎或细胞可以直接移植给受体，或在体外培养到囊胚阶段再移植。 6　 意义：加快繁殖速度，提高优良品种的利用率。 习题演练 (1)动物排出的卵子都是次级卵母细胞，需进一步成熟(　　) 原因：　 (2)当精子入卵后，透明带立即发生生理反应，阻止后来的精子进入(　　) 原因：　 (3)胚胎工程中常以观察到两个极体或雌、雄原核作为受精的标志(　　) (4)超数排卵是指应用外源性激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子(　　) 原因：　 (5)胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的囊胚或原肠胚(　　) 原因：　 (6)做DNA分析、鉴定性别要取内细胞团处的细胞(　　) 原因：　 第3章 基因工程 1. 重组DNA技术的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）— “分子手术刀”（教材P71） 1　 来源：主要从 生物中分离纯化得到。 2　 作用特点：能够识别双链DNA分子的 ，并且使每一条链中 部位的两个核苷酸之间的 键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少 数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组 成 。 3　 切割结果：产生 （两条链切口处的末端伸出互补的单链）或 （两条链切口处的末端是平整的）。 4　 作用意义：限制酶是基因工程的“手术刀”，为DNA的切割和重组提供了特异性的工具。 （2）DNA 连接酶— “分子缝合针”（教材P72） 1　 作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的 键，是基因工程的“缝合针”。 2　 种类及区别： · E.coli DNA连接酶：既可以连接 ，也可以连接 ，但连接平末端的效 率远低于T4 DNA连接酶。 · T4 DNA连接酶：既可以连接 ，也可以连接 ，但连接 的效率较低。 （3）基因进入受体细胞的载体 — — “分子运输车”（教材P72） 1　 作用：携带 进入受体细胞，使目的基因能够在受体细胞中复制、表达或稳定遗传。 2　 必备条件： · 能在受体细胞中 ，或整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 · 有一个或多个限制酶切割位点，以便 插入。 · 具有特殊的 ，便于 （如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等）。 · 对受体细胞 ，不会影响受体细胞的正常生命活动。 ③常用类型： · 质粒：一种 的、结构 、独立于 之外，并具有 能力的双链 状DNA分子，是最常用的载体。 · 噬菌体：经过改造的噬菌体载体，可将较大的DNA片段导入细菌细胞。 · 动植物病毒：经过改造的病毒载体，可将目的基因导入动植物细胞。 易错警示 1. 质粒是常用的载体，但是还有噬菌体、动植物病毒等也是载体，做选择题时需要注意，不要认为载体就是质粒。 2. 基因工程的工具有三种，但是工具酶只有两种，载体不是酶。 1. 基因工程的基本操作程序 （1）目的基因的获取（教材P76） 1　 目的基因定义：编码 的结构基因，也可以是一些具有 作用的因子。 2　 常用方法： · 从 中获取：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。包括基因组文库（包含一种生物的全部基因）和cDNA文库（包含一种生物的部分基因，由mRNA反转录而来）。 · 利用 技术扩增目的基因：PCR（ 链式反应）是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可在短时间内大量扩增目的基因。其过程包括 （90-95℃，双链DNA解旋为单链）、 （55-60℃， 互补结合）、延伸（72℃， 聚合酶催化合成新的DNA链）三个步骤，循环往复实现DNA片段的指数级扩增。 · 人工合成：如果目的基因比较 ，核苷酸序列 ，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成；如果基因序列未知，但已知其编码的蛋白质的氨基酸序列，可先推测出mRNA的核苷酸序列，再根据碱基互补配对原则推测出目的基因的核苷酸序列，进而人工合成。 （2） 基因表达载体的构建（核心步骤）（教材P80） 1　 构建目的：使目的基因在受体细胞中 存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 和发挥作用。 2　 组成结构： · 目的基因：编码所需蛋白质或调控因子的基因片段。 · 启动子：一段有特殊结构的 片段，位于基因的首端，是 酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 ，最终获得所需要的蛋白质。 · 终止子：位于基因的尾端，是转录终止的信号，使RNA聚合酶停止转录。 · 标记基因：便于 的筛选。用于鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。如抗生素抗性基因。 · 复制原点：载体自我复制的起点，保证载体在受体细胞中复制。 （3）将目的基因导入受体细胞（教材P81） · 转化的定义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 和 的过程。 · 常用导入方法： · 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，利用农杆菌 质粒上的 可转移到受体细胞并整合到受体细胞 上的特点）、花粉管通道法（我国独创，简便经济）。 · 动物细胞：显微注射技术（最常用，将重组DNA分子直接注入受精卵的细胞核内）。 · 微生物细胞：感受态细胞法（用 处理微生物细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 的生理状态，即感受态，然后将重组DNA分子与感受态细胞混合培养，使重组DNA分子进入受体细胞）。 （4）目的基因的检测与鉴定（教材P82） · 分子水平检测： · 检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上：采用 ，用 标记的目的基因作探针，与受体细胞的DNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已插入。 · 检测目的基因是否转录出mRNA：采用 ，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已转录。 · 检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用 杂交技术，用相应的抗体与受体细胞提取的蛋白质进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已翻译出蛋白质。 · 个体水平鉴定： · 植物：抗虫或抗病的接种实验，观察受体生物是否表现出相应的 特性；观察转基因植物的性状是否符合预期。 · 动物：观察转基因动物的性状是否符合预期，如转基因动物的生长速率、产奶量等。 习题演练 (1)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　　) 原因：　 (2)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　) 原因：　 (3)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　　) 原因：　 (4)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　　) 原因：　 (5)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　　) 原因：　 1. 基因工程的应用 （1）植物基因工程（教材P88） 主要用于提高农作物的 能力（如抗虫、抗病、抗除草剂、抗干旱、抗盐碱等），改良农作物的品质，以及利用植物生产药物等。 · 抗虫转基因植物：将Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因等导入植物，培育出抗虫棉、抗虫玉米等。 · 抗病转基因植物：将抗病毒基因（如病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因）、抗真菌基因（如几丁质酶基因、抗毒素合成基因）导入植物，培育出抗病毒烟草、抗真菌小麦等。 · 抗逆转基因植物：将调节细胞渗透压的基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因等导入植物，培育出抗盐碱、抗干旱的烟草，抗冻的番茄，抗除草剂的大豆等。 · 改良品质的转基因植物：将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，培育出延迟成熟的番茄；将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，培育出高赖氨酸玉米等。 （2） 动物基因工程（教材P89） · 提高动物的生长速率：将外源生长激素基因导入动物体内，使动物生长速率加快，如转基因鲤鱼。 · 改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使转基因奶牛分泌的乳汁中乳糖含量大大降低，适合乳糖不耐受人群饮用。 · 用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与 基因的启动子等调控组件重组在一起，导入哺乳动物的 中，培育出转基因动物，其进入泌乳期后，可通过分泌的乳汁生产所需要的药物，称为乳腺生物反应器（乳房生物反应器）。 · 用转基因动物作器官移植的供体：将抑制或除去 决定基因的导入猪的基因组，培育出没有 反应的转基因猪，其器官可用于人类器官移植。 （3）基因工程药物（教材P90） 利用基因工程技术生产的药物包括细胞因子（如干扰素、白细胞介素）、抗体、疫苗、激素（如胰岛素、生长激素）等。这些药物可用于治疗癌症、遗传病、传染病等多种疾病，且生产成本低、产量高、纯度高。例如，利用大肠杆菌生产重组人胰岛素，利用酵母菌生产乙肝疫苗等。 （4）基因治疗 1　 概念：把 基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。 2　 类型： · 体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转入正常基因。 · 体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，在体外完成基因转移后，再将成功转移的细胞回输到病人体内。 3　 实例：将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因导入患者的淋巴细胞，然后将这种淋巴细胞回输到患者体内，治疗重症联合免疫缺陷病（SCID）。 1. 蛋白质工程的原理和应用（教材P93） （1）定义：指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因 或基因 ，对现有蛋白质进行 ，或制造一种新的 ，以满足人类的生产和生活的需求。 （2）基本原理 中心法则的逆推：从预期的 出发→设计预期的蛋白质 →推测应有的氨基酸 →找到相对应的 （基因），然后通过基因工程技术改造或合成基因，最终表达出符合要求的蛋白质。 （3）蛋白质工程与基因工程的区别 1　 基因工程：只能生产自然界 的蛋白质。 2　 蛋白质工程：可以生产自然界 的新型蛋白质，是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 （4）蛋白质工程的应用前景 1　 改造酶的结构，提高酶的热稳定性、催化效率等，用于工业生产（如改进的TaqDNA聚合酶、洗衣粉中的蛋白酶等）。 2　 设计制造具有特定功能的蛋白质，如具有超强吸附能力的蛋白质用于污水处理，具有特定抗原性的蛋白质用于疫苗研发等。 3　 用于医学领域，设计制造新型抗体、蛋白质类药物，治疗各种疾病。 习题演练 (1)科学家利用转基因技术培育了抗玉米螟玉米，种植该玉米的农田就不需要进行防虫管理了(　　) 原因：　 (2)乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中(　　) 原因：　 (3)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列(　　) 原因：　 (4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改造分子的结构(　　) 原因：　 (5)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(　　) 原因：　 (6)DNA与蛋白质都溶于酒精(　　) 原因：　 (7)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换(　　) 原因：　 第4章 生物技术的安全性与伦理问题 1. 转基因产品的安全性 (1) 转基因成果（教材P101） 1　 微生物：减少啤酒酵母双乙酰生成以缩短发酵周期；构建基因工程菌生产氨基酸（工业化重要途径）；生产基因工程药物（涉及多种疾病治疗，2014年生物技术药物销售额1.2万亿元）。 2　 动物：转入 等基因培育生长快、营养优的家禽家畜；导入 基因培育抗病毒新品种；建立人类疾病转基因动物模型（如1型糖尿病、原发性高血压模型）。 3　 植物：培育出抗虫、抗病、抗除草剂、耐储藏等新性状作物（如耐储藏番茄）；2017年24国种植，前十国种植面积超1×10⁶hm²（美、巴等），主要作物为大豆、玉米、棉花、油菜；我国批准生产安全证书的有棉花、番木瓜等，仅棉花和番木瓜商业化种植，进口涉及多种作物的纤维及加工产品。 (2) 转基因技术的安全性（教材P102） 1　 食物安全：潜在风险（如产生过敏原、毒性物质、营养成分改变）； （评估转基因食品与传统食品的安全性是否实质等同）。 2　 生物安全：转基因生物可能成为 ，破坏生态 ；基因污染（转基因生物的外源基因通过 等途径扩散到其他物种）。 3　 环境安全：抗虫作物可能影响非靶生物（如益虫）；抗除草剂基因可能导致杂草获得抗性，形成“超级杂草”。 1. 关注生殖性克隆人 (1) 基因工程相关伦理（教材P106） 1　 基因歧视：基于基因信息的歧视（如就业、保险歧视）；基因检测的隐私保护（防止基因信息泄露）。 2　 基因治疗伦理：体细胞基因治疗（治疗患者本人，不影响后代）与生殖细胞基因治疗（可能改变后代基因，存在伦理争议）。 3　 设计试管婴儿：为治疗疾病（如造血干细胞移植）而设计胚胎的伦理争议（如胚胎的道德地位、性别选择）。 (2) 克隆技术伦理（教材P108） 1　 治疗性克隆：利用 技术获得早期胚胎，提取 用于疾病治疗（伦理争议较小，需关注胚胎的处理）。 2　 生殖性克隆：克隆人（违背人类伦理，破坏人类基因多样性，引发社会伦理问题）。 3　 我国对生殖性克隆的态度：我国政府一再重申四不原则： 、 、 、 任何生殖性克隆人实验。原因如下：①克隆人只是某些人出于某种目的制造出的“产品”,没有“父母”,这可能导致他们在心理上受到伤害；②由于技术问题，可能孕育出有严重生理缺陷的克隆人；③克隆人的家庭地位难以认定，这可能使以血缘为纽带的父子、兄弟和姐妹等人伦关系消亡；④生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念；⑤生殖性克隆人是对人类尊严的侵犯；⑥生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性，不利于人类的生存和进化。 (3) 胚胎工程伦理 1　 胚胎的道德地位：早期胚胎是否具有生命权（不同观点：从受精开始/着床后/胎儿阶段）。 2　 代孕问题：代孕母亲与胎儿的权利关系，商业化代孕的伦理争议。 1. 禁止生物武器（教材P111） (1) 生物武器种类与危害：包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类（如天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌等），致病能力 、攻击范围 ，可通过直接或食物、生活必需品、带菌昆虫等散布，经呼吸道、消化道、皮肤侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也损害植物。 (2) 生物武器的现实威胁：部分国家以科研为名研究储存生物武器（如炭疽杆菌、天花病毒毒株）；恐怖组织易获取利用生物武器；转基因技术可制造新型致病菌（如新型鼠痘病毒、改造蜡状杆菌、拼接生物毒素与流感病毒基因、改造流感病毒针对特定民族），可能导致无药可医、公众恐慌等严重后果。 (3) 国际社会对生物武器的禁止：1972年苏美英签署《禁止生物武器公约》，1975年生效；中国1984年加入；1998年中美联合声明重申不发展、不生产、不储存生物武器，反对扩散；2010年中国在联合国重申支持公约宗旨，主张全面禁止和彻底销毁生物武器等大规模杀伤性武器。 习题演练 (1)通过转基因技术生产药物只是转基因微生物方面的应用(　　) 原因：　 (2)若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题(　　) 原因：　 (3)生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题，是正常现象，不违反人类传统的伦理道德(　　) 原因：　 (4)生殖性克隆和治疗性克隆没有本质区别(　　) 原因：　 (5)生物武器可通过吸入、误食、接触带菌物品，被带菌昆虫叮咬等侵入人体(　　) (6)我们对待生物武器的态度是坚决禁止生物武器(　　) 1 学科网（北京）股份有限公司 $ 秘籍生物技术与工程（回归教材知识）  第1章发酵工程 1 1、 传统发酵技术的应用 1 2、 微生物的培养技术及应用 3 3、 发酵工程及其应用 6  第2章细胞工程 8 1、 植物细胞工程 8 ① 作物繁殖的新途径 9 ② 作物新品种的培育 9 ③ 细胞产物的工厂化生产（教材P41） 10 2、 动物细胞工程 10 3、 胚胎工程 14  第3章基因工程 17 1、 重组DNA技术的基本工具 17 2、 基因工程的基本操作程序 18 （1）目的基因的获取（教材P76） 18 （2）基因表达载体的构建（核心步骤）（教材P80） 18 3、 基因工程的应用 20 4、 蛋白质工程的原理和应用（教材P93） 21  第4章生物技术的安全性与伦理问题 22 1、 转基因产品的安全性 22 2、 关注生殖性克隆人 23 3、 禁止生物武器（教材P111） 24 第1章发酵工程 传统发酵技术的应用 (1) 传统发酵技术（教材P5） 定义：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保留下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术，一般称为传统发酵技术。 特点：传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。 常见食品种类：腐乳酱、酱油、酒醋、泡菜和豆豉。 (2) 发酵 指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 (3) 常见发酵菌种及相应发酵产品（教材P5） 1　 乳酸菌 乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸(反应简式①),可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。 · 泡菜的制作： a.制作原理 利用乳酸菌（原核生物）在无氧条件下进行乳酸发酵，将葡萄糖分解为乳酸，反应式：C₆H₁₂O₆→2C₃H₆O₃+少量能量，乳酸积累使泡菜具有酸味，且抑制其他杂菌的生长。 乳酸菌为异养厌氧型微生物。 b.实验材料与用具 材料：新鲜蔬菜（白菜、萝卜、黄瓜等）、食盐、清水、乳酸菌（或利用蔬菜表面的野生乳酸菌）。 用具：泡菜坛（带水槽的密封坛）、菜刀、砧板、天平、漏斗等。 c.制作流程 配制盐水：用清水和食盐配制质量分数为5%-20%的盐水，将盐水煮沸冷却（煮沸可杀死盐水中的杂菌，冷却防止杀死乳酸菌）。 装坛：将新鲜蔬菜洗净、切分，装入泡菜坛中，装至半坛时放入蒜瓣、生姜等香辛料，继续装至八成满→倒入冷却后的盐水，使盐水淹没全部蔬菜→盖好坛盖，向坛盖边缘的水槽中注满水，形成密封环境。 发酵：发酵过程注意经常向水槽中补充水，根据室内温度控制发酵时间。 d.注意事项 泡菜坛需选择无裂纹、无砂眼的，保证密封性能良好，避免氧气进入导致泡菜变质。 发酵过程中要保持坛盖水槽中的水始终充足，防止空气进入坛内。 泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量会先升高后降低，一般在发酵10天后亚硝酸盐含量降至安全水平，此时食用较为安全。 2　 酵母菌 酵母菌是一类单细胞真菌，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源，因此在一些含糖量较高的水果、蔬菜表面经常可以发现酵母菌的存在。 酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵(反应简式②),可用于酿酒、制作馒头和面包等。 温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适生长温度约为28℃ · 果酒的制作 a.制作原理 果酒制作：酵母菌（真核生物）在无氧条件下进行酒精发酵，反应式：C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH+2CO₂+少量能量，适宜温度为18-25℃，此温度下酵母菌繁殖速度快，发酵效率高。 b.实验材料与用具 材料：新鲜葡萄（或苹果）、洗洁精、体积分数为70%的酒精。 用具：榨汁机、发酵瓶（或泡菜坛）、玻璃棒、pH试纸、滤纸等。 c.制作流程 果酒制作：挑选新鲜葡萄→用清水冲洗1-2次（避免过度冲洗导致野生酵母菌流失）→去除枝梗→榨汁→将葡萄汁装入发酵瓶（留约1/3空间，防止发酵液溢出）→密封发酵（每隔12小时左右拧松瓶盖排气，防止瓶内压力过大）→10-12天后取样检测，可通过嗅味和品尝判断发酵是否完成。 d.注意事项 发酵器具需清洗干净并用70%酒精消毒，防止杂菌污染。 果酒发酵过程中，严格控制无氧环境，若有氧会导致酵母菌进行有氧呼吸，不产生酒精。 3　 醋酸菌 醋酸菌（原核生物）在有氧条件下，先将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转化为醋酸，反应式：C₂H₅OH+O₂→CH₃COOH+H₂O+少量能量，适宜温度为30-35℃，需要持续通入无菌空气。 · 果醋的制作 a.实验材料与用具 材料：发酵好的葡萄酒、体积分数为70%的酒精。 用具：榨汁机、发酵瓶（或泡菜坛）、玻璃棒、pH试纸、滤纸等。 b.制作流程 果醋制作：当果酒发酵完成后，打开瓶盖，通入无菌空气→接种醋酸菌→保持30-35℃温度发酵→7-8天后，若发酵液出现酸味，且pH值下降到3.0-3.5左右，说明果醋发酵完成。 c.注意事项 发酵器具需清洗干净并用70%酒精消毒，防止杂菌污染。 果醋发酵时需保证充足的氧气供应，可通过在发酵瓶上安装气泵持续通气。 4　 其他发酵菌种 毛霉：毛霉（真核生物）等微生物产生的蛋白酶和脂肪酶，将豆腐中的蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，将脂肪分解为甘油和脂肪酸，使腐乳具有独特的风味。 毛霉的生长适宜温度为15-18℃，需要保持一定的湿度。 产品：腐乳。 易错警示 果酒和果醋发酵过程的区别 1、 菌种不同； 2、 氧气条件不同：果酒发酵需无氧发酵，果醋发酵过程需充足的氧气； 3、 温度不同：果酒发酵温度为18-30℃，果醋为30-35℃。 故果酒转为果醋发酵需要提供氧气并适当提高温度。 (4) 传统发酵技术与工业发酵的区别（教材P8） 传统发酵技术：没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种。 菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一。 工业发酵：工业上大规模生产时，通常会先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵，可以缩短发酵时间，确保品质稳定。 微生物的培养技术及应用 (1) 培养基的配制（教材P9） ①培养基的分类 A. 按物理状态分： 液体培养基：不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态，适用于微生物的大量增殖、生理生化试验及代谢产物的动态监测。 固体培养基：呈固体状态的培养基。在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一。 半固体培养基：加入少量凝固剂，用于观察微生物的运动、鉴定菌种、测定噬菌体的效价。 B. 按用途分： 选择培养基：加入某种化学物质，抑制不需要的微生物生长，促进所需微生物生长，如以尿素为唯一氮源的培养基可筛选尿素分解菌。 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的微生物，如伊红美蓝培养基可鉴别大肠杆菌（形成黑色带有金属光泽的菌落）。 通用培养基：含有微生物生长所需的基本营养物质，用于培养多种微生物，如牛肉膏蛋白胨培养基。 要点总结 1． 固体培养基和液体培养基的主要区别：固体培养基加入了凝固剂琼脂。 2． 选择培养基：加入某种化学物质，抑制或阻止不需要的微生物生长，一般只有所需菌种可生长； 3． 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的微生物，培养基上可以有多种菌种生长，但是只有能发生特殊反应的菌落被鉴别出来。 （2）培养基配方（教材P10） 一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质。 1　 碳源：提供微生物生长所需碳元素的物质，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、石油等，是微生物合成细胞物质和代谢产物的主要原料。 2　 氮源：提供微生物生长所需氮元素的物质，如尿素、牛肉膏、蛋白胨、硝酸盐等，用于合成蛋白质、核酸等。 3　 水：微生物细胞的主要组成成分，参与代谢反应，运输营养物质和代谢产物。 4　 无机盐：如钾、钠、钙、镁、磷、硫等，作为酶的辅助因子，维持细胞的渗透压和pH值。 培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O₂的需求。 如:乳酸杆菌:添加维生素;霉菌:将pH调至酸性;细菌:将pH调至中性或弱碱性;厌氧微生物:提供无氧条件。 （3）无菌技术（教材P10） 1　 针对对象：消毒和灭菌工作主要包括两个方面：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 2　 分类 A. 消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 a. 煮沸消毒法：在100℃煮沸5～6min,可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。 b. 巴氏消毒法：针对于一些不耐高温的液体，如牛奶，即在62～65℃消毒30min或80～90℃处理30s～1min,可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。 c. 化学药物消毒：酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。 d. 紫外线进行消毒：接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min,以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 B. 灭菌：则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 a. 湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅以水蒸气为介质，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，维持15～30min来。 b. 干热灭菌：将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160～170℃的热空气中维持2～3h。针对耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等。 c. 灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。 要点总结 消毒和灭菌的区别 灭菌指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死部分微生物，条件温和。 (2) 微生物的纯培养（教材P11） ①常用纯培养方法 1）平板划线法：用接种环在固体培养基表面连续划线，将菌种逐步稀释，最终得到单个菌落，适用于微生物的分离和纯化。 · 基本过程：配制培养基—灭菌—倒平板—接种和分离酵母菌—培养酵母菌。 2） 稀释涂布平板法： 定义：将菌液进行一系列梯度稀释，然后取少量稀释液涂布在固体培养基表面，培养后得到单个菌落，适用于微生物的分离、纯化和计数。 过程： A、梯度稀释：将待测样品用无菌水或生理盐水进行系列梯度稀释（如10⁻¹、10⁻²…10⁻ⁿ），每级稀释需充分混匀。 B、涂布平板：取适宜稀释度的菌悬液（通常0.1-0.2mL）滴加到固体培养基平板表面，用无菌涂布器（经酒精灭菌冷却后）将菌液均匀涂布于整个平板表面。 C、培养：待菌液完全吸收后，将平板倒置（防止冷凝水污染菌落），置于适宜温度（如37℃）的恒温培养箱中培养一定时间（通常18-24h），使单个微生物细胞生长繁殖形成单菌落。 D、计数：选取菌落数在30-300之间的平板，统计菌落数量，按公式“菌落数=平板菌落数×稀释倍数/取样体积”计算样品中微生物浓度。 计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 计数原则：一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 计数结果偏小的原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 其他计数方法：显微镜直接计数。该方法利用特定的细菌计数板（细菌等较小的细胞）或血细胞计数板（酵母菌和霉菌孢子等），在显微镜下观察、计数；统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，故计数结果一般偏大。 易错警示 平板划线法只能用于纯化菌种，不能用于计数；稀释涂布平板既可以用于纯化菌种，又可以用来计数。 ②选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。如用尿素为唯一氮源的培养基分离能产生脲酶的微生物； ③鉴别培养基：在培养基中加入某种特定的指示剂或化学药品，使培养后不同种类的微生物能呈现出不同的特征（如颜色变化、菌落形态差异等），从而达到鉴别目的的培养基。 例子： · 伊红-亚甲蓝培养基：用于鉴别大肠杆菌，当大肠杆菌在该培养基上生长时，形成黑色带有金属光泽的菌落，而其他微生物则不会呈现这种特征； · 刚果红-纤维素培养基：用于鉴别分解纤维素的菌，在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，若微生物能分解纤维素，其菌落周围会出现透明圈，反之则无； · 在含尿素的培养基中加入酚红指示剂，尿素分解菌会将尿素分解产生氨，使培养基pH升高，酚红由黄色变为红色，以此可鉴别尿素分解菌。 发酵工程及其应用 (1) 发酵工程基本环节（教材P22） 1　 菌种的选育 方法：自然选育、诱变育种、基因工程育种等 2　 扩大培养：一般使用液体培养基 3　 配制培养基、灭菌、接种 4　 发酵罐内的发酵：发酵过程是发酵工程的核心环节，需要严格控制发酵条件，保证微生物的生长和代谢朝着预期的方向进行。 发酵条件的控制：温度、pH等 · pH：例如，谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 · 溶解氧：对于需氧微生物，发酵过程中需要保证充足的溶解氧供应，可通过搅拌、通气等方式增加溶解氧含量；对于厌氧微生物，需严格控制无氧环境，可通过密封发酵罐或通入氮气排除氧气。 · 搅拌速度：搅拌可使培养基中的营养物质分布均匀，提高溶解氧含量，促进微生物的生长，但搅拌速度过快会损伤微生物细胞，需根据微生物的种类和发酵阶段调整搅拌速度。 5　 产品的分离提纯 如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。 6　 获得产品 (2) 发酵工程的应用（教材P24） ①在食品工业中的应用 a. 生产传统发酵食品：利用发酵工程大规模生产啤酒、食醋、酱油、腐乳、泡菜等传统发酵食品，提高生产效率和产品质量的稳定性。 b. 生产食品添加剂：生产柠檬酸、味精（谷氨酸钠）、维生素、甜味剂等食品添加剂，如利用黑曲霉发酵生产柠檬酸，利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，再转化为味精。 c. 酶制剂：目前，已有50多种酶制剂成功用于食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等方面。这些酶制剂除少数由动植物生产外，绝大多数也是通过发酵工程生产的。 ②在医药工业中的应用 a. 生产抗生素； b. 生产激素：利用基因工程菌发酵生产胰岛素、生长激素、促红细胞生成素等激素，如利用大肠杆菌发酵生产人胰岛素，用于治疗糖尿病。 c. 生产疫苗：利用微生物发酵生产乙肝疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗等，如乙肝疫苗是利用酵母菌表达乙肝表面抗原制成的，用于预防乙肝病毒感染。 ③在农牧业中的应用 a. 微生物肥料：微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等(图1-12)。有的微生物肥料还可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。 b. 微生物农药：与传统的化学农药不同，微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。例如，苏云金杆菌可以用来防治80多种农林虫害；利用白僵菌可以防治玉米螟、松毛虫等虫害；一种放线菌产生的抗生素——井冈霉素可以用于防治水稻枯纹病。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。 c. 饲料添加剂：研究表明，微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%～80%,而且细菌生长繁殖速度很快。因此，许多国家以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。用酵母菌等生产的单细胞蛋白可以作为食品添加剂；用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提。另外，在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。 易错警示 单细胞蛋白指的是微生物菌体本身，不是蛋白质。 ④其他方面的应用 随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。像这样的发酵原料的改变推动着发酵工业迅速发展，对解决资源短缺与环境污染问题具有重要意义。 自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在各种极端恶劣的环境(如高温、高压、高盐和低温等环境)中正常生活，对它们的研究已成为国际热点，其中一些极端微生物已应用于生产实践。例如，嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。 发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。 习题演练 (1)豆腐中的蛋白质被蛋白酶全部分解成了氨基酸(　×　) 解析　毛霉分泌的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸。 (2)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件(　×　) 解析　参与泡菜制作的乳酸菌是厌氧菌，因此泡菜的制作全过程都要保持无氧条件。 (3)当缺乏糖源和氧气时，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，进而转化成乙酸(　×　) 解析　醋酸菌是好氧细菌，氧气缺乏时，会引起醋酸菌死亡，当氧气充足、缺少糖源时，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，进而转化成乙酸。 (4)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　×　) 解析　倒平板时，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基(10～20mL)倒入培养皿，立即盖上培养皿的皿盖，不能打开皿盖。 (5)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　×　) 解析　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，故稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。 (6)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计(　×　) 解析　统计菌落数目时为保证结果准确，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 (7)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数(　×　) 解析　利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离，但平板划线法不能用于微生物的计数。 第2章细胞工程 1. 植物细胞工程 (1) 植物组织培养技术（教材P34） 1　 定义：指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。 2　 原理：植物细胞的全能性：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。 3　 完整过程：外植体（离体的植物器官、组织或细胞）→脱分化→愈伤组织（未分化的、不定形的薄壁组织团块）→再分化→胚状体或丛芽→完整植株。 脱分化：已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块。需避光培养。 再分化：愈伤组织重新分化出根、芽等器官。需要光照培养，通过调整生长素和细胞分裂素的比例控制分化方向:生长素/细胞分裂素比例高促进根的分化，细胞分裂素/生长素比例高促进芽的分化，二者比例适中促进愈伤组织的形成。 4　 常用培养基：MS培养基。 5　 实验操作注意事项：全程无菌操作，外植体消毒（70%酒精消毒30s后用无菌水冲洗，再用质量分数为5%次氯酸钠溶液处理30min，最后无菌水冲洗干净），培养基需高压蒸汽灭菌。 6　 地位：是植物体细胞杂交、作物脱毒、单倍体育种等技术的基础。 易错警示 1、 脱分化过程不需要光照，因为光会诱导植物细胞分化，再分化过程需要； 2、 外植体不能灭菌，因为灭菌会导致植物细胞死亡。 (2) 植物体细胞杂交技术（教材P36） 1　 定义：指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。 2　 原理：细胞膜的流动性（原生质体融合阶段）、植物细胞的全能性（杂种细胞培育成植株阶段）。 3　 过程： a. 去壁：用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体。 b. 原生质体融合：采用物理法（离心、电融合法）或化学法（聚乙二醇PEG诱导剂、高Ca²—高pH融合法）诱导不同植物的原生质体融合。 c. 再生细胞壁：融合后的原生质体重新形成细胞壁，标志着杂种细胞形成。 d. 植物组织培养：将杂种细胞培养成完整的杂种植株。 4　 意义：在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。 易错警示 1、 植物体细胞杂交技术的终点是得到杂种植株，而不是得到杂种细胞就结束了； 2、 原生质体外没有细胞壁，不能放在清水中，会吸水涨破，需要放在等渗或略高渗溶液中。 (3) 植物细胞工程的应用（教材P39） 1　 作物繁殖的新途径 A、微型繁殖： · 概念：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 · 优点：保持优良品种的遗传特性；繁殖速度快，可在短时间内获得大量种苗；不受季节、气候和地域限制。 · 应用：花卉、果树、经济林木的大规模繁殖，如兰花、香蕉的工业化生产。 B、作物脱毒： · 原因：很多无性繁殖的植物感染的病毒很容易传给后代，病毒在作物体内逐年积累，导致作物产量降低，品质变差。 · 原理：植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少甚至无病毒，因为病毒在植物体内的运输速度慢于分生区细胞的分裂速度。 · 方法：切取植物分生区（如茎尖）进行组织培养，获得脱毒苗。 · 应用：马铃薯、草莓、甘蔗等作物的脱毒种植，大幅提高作物产量和品质。 2　 作物新品种的培育 A、单倍体育种： · 过程：取植物花药进行离体培养，获得单倍体植株；用秋水仙素处理单倍体幼苗，使染色体数目加倍，得到纯合二倍体植株；筛选符合要求的品种。 · 优点：明显缩短育种年限（一般2-3年）；能快速获得纯合子，排除杂种优势的干扰，便于性状稳定遗传。 · 应用：小麦、水稻、烟草等作物的新品种培育，如抗倒伏、抗病虫害的小麦品种。 B、突变体的利用： · 原理：植物组织培养过程中，培养细胞一直处于不断增殖的状态，容易受到培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突变。 · 方法：对愈伤组织进行诱变处理，然后筛选出具有优良性状的突变体，培育成新品种。 · 应用：培育抗盐碱、抗干旱、抗病虫害的作物品种，如抗除草剂的大豆品种；获得高产、优质的细胞产物突变体。 3　 细胞产物的工厂化生产（教材P41） · 定义：指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术； · 技术：植物细胞培养； · 原理：细胞增殖； · 产物类型：主要是职务的次生代谢产物，如人参皂甙、紫杉醇、香料（如薄荷油）、生物碱等。 · 优点：生产效率高，可大规模工业化生产；不受季节、气候和地域限制；减少对野生植物的依赖，保护生态环境。 · 实例：人参皂甙的工厂化生产，通过培养人参愈伤组织细胞，提取人参皂甙，产量远高于天然人参；紫杉醇的生产，从红豆杉细胞培养物中提取，用于治疗癌症。 易错警示 1、 作物脱毒，是使无性生殖的植物通过植物组织培养技术，后代不带或者少带病毒的技术，不是使后代抗病毒； 2、 单倍体育种过程，最终得到的是二倍体纯合子，而不是只得到单倍体； 3、 细胞产物的工厂化生产，使用的是植物细胞培养技术，原理是细胞增殖，没有体现细胞的全能性。 习题演练 (1)实验中除外植体需要灭菌外，使用的培养基和所有的器械也都要灭菌(　×　) 解析　外植体需要消毒处理，不能灭菌处理。 (2)愈伤组织是外植体经脱分化和再分化后形成的(　×　) 解析　愈伤组织是外植体经脱分化过程形成的。 (3)无论脱分化还是再分化，过程中均需提供光照(　×　) 解析　在脱分化阶段一般需要避光处理，再分化阶段需要光照处理。 (4)植物组织培养过程中生长素和细胞分裂素的比例始终不变(　×　) 解析　植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向，植物组织培养过程中应根据需要调整生长素和细胞分裂素的比例。 (5)同一株绿色开花植物不同部位的细胞经组织培养获得的植株基因型都是相同的(　×　) 解析　同一株绿色开花植物体细胞和生殖细胞(花粉)经组织培养获得的植株基因型不同。 (6)植物组织培养中，培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压(　√　) 1. 动物细胞工程 (1) 动物细胞培养技术（教材P43） 1　 定义：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 2　 原理：细胞增殖（有丝分裂）。 3　 完整过程： A. 取材：取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（细胞分裂能力强），如小鼠胚胎、幼鼠的肝脏。 B. 分散处理：对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞（避免胰蛋白酶处理时间过长，损伤细胞膜）。 C. 体外培养的动物细胞分类：a、悬浮培养的细胞；b、贴壁细胞，有细胞贴壁（需要贴附于某些基质表面才能生长增殖）、接触抑制（当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖）现象。 D. 原代培养：将分散的细胞制成细胞悬液，转移到培养瓶中培养。人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。 E. 传代培养：将分瓶后的细胞培养称为传代培养。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。 4　 培养条件： A. 无菌、无毒环境：在体外培养细胞时，需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 B. 营养条件：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。 C. 温度、pH和渗透压：哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。 D. 气体环境：O₂是细胞代谢所必需的，CO₂的主要作用是维持培养液的pH。将细胞放在含有95%空气和5%CO₂的混合气体的CO₂培养箱中进行培养。 (2) 干细胞培养及其应用（教材P46） 1　 干细胞分布：存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 2　 干细胞分类： · 胚胎干细胞(简称ES细胞)存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能(图2-13)。 · 成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。 一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。 ③特点：有着自我更新能力及分化潜能、与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。 ④医学上的应用： 造血干细胞：治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病； 神经干细胞：治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等) 诱导多能干细胞(简称iPS细胞)：通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞。已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。 iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞的原因：诱导过程无须破坏胚胎，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。 (3) 动物细胞融合技术（教材P48） 1　 定义：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术； 2　 起点：两个或多个动物细胞； 3　 终点：一个细胞； 4　 促进细胞融合的方法：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等； 5　 原理：细胞膜具有一定的流动性； 6　 动物细胞融合和植物体细胞杂交技术的区别： 终点 原理 细胞融合方法 动物细胞融合 细胞 细胞膜具有一定的流动性 PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法（特有） 植物体细胞杂交 杂种植株 细胞膜具有一定的流动性、植物细胞具有全能性 PEG融合法、电融合法、离心法、高Ca²—高pH融合法 7　 主要应用：杂交瘤技术，用于生产单克隆抗体。 (4) 单克隆抗体及应用（教材P48-49） 1　 传统抗体的缺点：由动物免疫后血清提取得到，为多克隆抗体，产量低、纯度低、特异性差，且易发生交叉反应。 2　 单克隆抗体的优点：特异性强（只针对一种抗原表位）、灵敏度高、可大量制备。 3　 制备原理：B淋巴细胞能产生特异性抗体，但不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖，但不能产生抗体。通过细胞融合获得的杂交瘤细胞，兼具B淋巴细胞的特异性抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。 4　 完整制备过程： A. 免疫小鼠：向小鼠体内注射特定抗原（如乙肝病毒表面抗原），使小鼠产生相应的B淋巴细胞。 B. 细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞（含B淋巴细胞）与骨髓瘤细胞混合，用PEG或灭活病毒诱导融合，得到融合细胞（包括B淋巴细胞自身融合、骨髓瘤细胞自身融合、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞）。 C. 第一次筛选：用特定的选择培养基（HAT培养基）培养融合细胞，只有杂交瘤细胞能存活，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长（HAT培养基抑制骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合体的增殖，B淋巴细胞自身融合体不能无限增殖，最终死亡）。 D. 第二次筛选：克隆化培养和抗体检测：对筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆培养，并通过抗原-抗体杂交技术检测，筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。 E. 单克隆抗体的提取：将阳性杂交瘤细胞在体外大规模培养，从细胞培养液中提取抗体；或注射到小鼠腹腔内，从小鼠腹水中提取抗体（产量更高、纯度更高）。 ⑤单克隆抗体的应用： · 诊断疾病：制备诊断试剂，如乙肝病毒诊断试剂盒、艾滋病病毒诊断试剂盒，快速、准确检测病原体；检测肿瘤标志物（如癌胚抗原CEA），用于癌症早期诊断。 · 治疗疾病： 生物导弹：将抗癌药物与单克隆抗体结合，利用单克隆抗体的特异性识别癌细胞表面的抗原，定向将药物输送到癌细胞，减少对正常细胞的损伤。 易错警示 生物导弹中，一般抗体只起导向作用，不治疗疾病，药物只起治疗作用，不能确定起作用的位置，两者各有其功能 免疫治疗：如用单克隆抗体治疗自身免疫病（如类风湿性关节炎）、癌症（如利妥昔单抗治疗淋巴瘤）。 · 科研应用：作为探针研究细胞表面抗原的分布和功能；用于蛋白质的定位、纯化和检测。 (5) 动物体细胞核移植技术（教材P52） 1　 定义：将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 2　 类型：胚胎细胞核移植（供体细胞为胚胎细胞，分化程度低，克隆成功率高）；体细胞核移植（供体细胞为体细胞，分化程度高，克隆成功率低）。 3　 体细胞核移植的完整过程（以克隆羊多莉为例）： A. 供体细胞准备：从供体高产奶牛身体的某一部位(如耳)上取体细胞，进行培养。 B. 受体细胞准备：从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞,在体外培养到MⅡ期中期，通过显微操作去除细胞核和第一极体，获得去核卵母细胞。 C. 细胞核移植：将供体细胞注入去核卵母细胞的细胞质中，通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。 D. 用物理或化学方法(如电刺激、Ca²载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程。 E. 胚胎培养：将重组细胞在体外培养，发育至桑椹胚或囊胚阶段。 F. 胚胎移植：将胚胎移入受体(代孕)母牛体内。 G. 分娩：代孕母牛分娩，获得克隆牛。 ④原理：动物细胞核的全能性（已分化的动物体细胞的细胞核仍含有本物种全套遗传信息，在适宜条件下可发育成完整个体）。 ⑤应用： · 畜牧生产：加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。 · 医药卫生： · 生产珍贵的医用蛋白； · 在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体。以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。 · 研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程； · 克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因； · 克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。 · 保护濒危物种：有望增加濒危物种的存活数量。 ⑥存在问题：克隆动物成功率低（一般不足10%）；克隆动物存在健康问题（如体型过大、免疫缺陷、早衰等）；伦理争议（如人类克隆的伦理问题）。 习题演练 (1)将动物细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养(　×　) 解析　将动物细胞置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 (2)动物细胞在培养过程中都具有细胞贴壁的现象(　×　) 解析　体外培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖，不具有细胞贴壁的现象；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型。 (3)动物体细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　×　) 解析　两个二倍体动物细胞融合形成的杂交细胞具有四个染色体组，是四倍体细胞。 (4)将抗原注入小鼠体内，是为了获得能产生相应抗体的B淋巴细胞(　√　) (5)将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行诱导融合，培养液中融合后的细胞即杂交瘤细胞(　×　) 解析　将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等，需要进行筛选。 1. 胚胎工程 (1) 受精（教材P56） 1　 准备阶段1——精子获能 定义：刚刚排出的精子必须在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力的生理现象。 精子获能方法：直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；将精子培养在人工配制的获能液（肝素、Ca²+载体等）中使其获能等。 2　 准备阶段2——卵子的准备 卵子在输卵管内发育到减数第二次分裂中期时，才具备受精能力。 ③受精阶段 · 概念：精子和卵子结合形成合子（受精卵）的过程。 · 场所：雌性动物的输卵管内。 · 过程： a、获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出多种酶，以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。 b、穿越透明带：在精子触及卵细胞膜的瞬间，卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进人透明带。然后，精子入卵。 c、卵细胞膜反应：精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。 ④原核形成与融合：精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ,排出第二极体后，形成雌原核。雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。 易错警示 1. 需要明确精子获能的原因和卵细胞需要发育到减数第二次分裂中期时，才具备受精能力； 2. 需要明确防止多精入卵三道防线的具体时间，避免混淆： 3. 精子释放出多种酶以溶解卵细胞膜外的一些结构：获能后的精子与卵子相遇时； 4. 卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进人透明带，时间：在精子触及卵细胞膜的瞬间； 5. 卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，时间：精子入卵后。 6. 受精的标志：观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志。 7. 受精完成的标志：雌雄原核融合形成合子。 (2) 胚胎早期发育（教材P58） 发育场所：输卵管和子宫。 发育阶段： ①卵裂期：在透明带内进行分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加； ②桑椹胚：受精卵经有丝分裂形成的细胞团，细胞数为32个左右，每个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能（全能性）； ③囊胚：细胞出现分化，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；囊胚腔逐渐扩大，胚胎从透明带中伸展出来的过程称为孵化； ④原肠胚：内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔，此时胚胎已具有三个胚层，进一步分化形成各种组织、器官和系统。 (3) 体外受精（教材P60） 概念：模拟体内受精，使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。 主要步骤： ①卵母细胞的采集和培养： ②精子的采集和获能： ③受精：获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。 (4) 胚胎移植（教材P61） · 概念：将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。 · 意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，大大缩短供体本身的繁殖周期，提高繁殖效率。 · 生理学基础： ①供体与受体生殖器官的生理变化相同（同期发情处理），为胚胎移入受体提供相同的生理环境； ②早期胚胎在一定时间内处于游离状态，为胚胎的收集提供可能； ③受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体内的存活提供了可能； ④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受受体影响。 · 基本程序： ①对供、受体的选择和处理：选择遗传特性和生产性能优秀的供体，健康的受体；用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理； ②配种或人工授精； ③胚胎的收集、检查、培养或保存：用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来；对胚胎进行质量检查（发育到桑椹胚或囊胚阶段），可直接向受体移植，或放入-196℃的液氮中保存； ④胚胎移植：手术法或非手术法将胚胎移入受体子宫； ⑤移植后的检查：对受体母牛进行是否妊娠的检查，妊娠后产下犊牛。 (5) 胚胎分割（教材P62） 1　 概念：采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 2　 特点：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖或克隆。 3　 材料：发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。 4　 操作设备：实体显微镜和显微操作仪。 5　 注意事项：分割囊胚时，需将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育；分割的胚胎或细胞可以直接移植给受体，或在体外培养到囊胚阶段再移植。 6　 意义：加快繁殖速度，提高优良品种的利用率。 习题演练 (1)动物排出的卵子都是次级卵母细胞，需进一步成熟(　×　) 解析　动物排出的卵子可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞，都需在输卵管中进一步成熟。 (2)当精子入卵后，透明带立即发生生理反应，阻止后来的精子进入(　×　) 解析　在精子触及卵细胞膜的瞬间，卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带，然后精子入卵。精子入卵后，卵细胞膜会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。 (3)胚胎工程中常以观察到两个极体或雌、雄原核作为受精的标志(　√　) (4)超数排卵是指应用外源性激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子(　×　) 解析　超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。 (5)胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的囊胚或原肠胚(　×　) 解析　胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚。 (6)做DNA分析、鉴定性别要取内细胞团处的细胞(　×　) 解析　进行胚胎性别鉴定时应取滋养层的细胞。 第3章基因工程 1. 重组DNA技术的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）—“分子手术刀”（教材P71） 1　 来源：主要从原核生物中分离纯化得到。 2　 作用特点：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 3　 切割结果：产生黏性末端（两条链切口处的末端伸出互补的单链）或平末端（两条链切口处的末端是平整的）。 4　 作用意义：限制酶是基因工程的“手术刀”，为DNA的切割和重组提供了特异性的工具。 （2）DNA连接酶—“分子缝合针”（教材P72） 1　 作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，是基因工程的“缝合针”。 2　 种类及区别： · E.coliDNA连接酶：既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率远低于T4DNA连接酶。 · T4DNA连接酶：既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率较低。 （3）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（教材P72） 1　 作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因能够在受体细胞中复制、表达或稳定遗传。 2　 必备条件： · 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 · 有一个或多个限制酶切割位点，以便外源DNA片段插入。 · 具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选（如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等）。 · 对受体细胞无害，不会影响受体细胞的正常生命活动。 ③常用类型： · 质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，是最常用的载体。 · 噬菌体：经过改造的噬菌体载体，可将较大的DNA片段导入细菌细胞。 · 动植物病毒：经过改造的病毒载体，可将目的基因导入动植物细胞。 易错警示 1. 质粒是常用的载体，但是还有噬菌体、动植物病毒等也是载体，做选择题时需要注意，不要认为载体就是质粒。 2. 基因工程的工具有三种，但是工具酶只有两种，载体不是酶。 1. 基因工程的基本操作程序 （1）目的基因的获取（教材P76） 1　 目的基因定义：编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2　 常用方法： · 从基因文库中获取：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。包括基因组文库（包含一种生物的全部基因）和cDNA文库（包含一种生物的部分基因，由mRNA反转录而来）。 · 利用PCR技术扩增目的基因：PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可在短时间内大量扩增目的基因。其过程包括变性（90-95℃，双链DNA解旋为单链）、复性（55-60℃，引物与单链DNA互补结合）、延伸（72℃，TaqDNA聚合酶催化合成新的DNA链）三个步骤，循环往复实现DNA片段的指数级扩增。 · 人工合成：如果目的基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成；如果基因序列未知，但已知其编码的蛋白质的氨基酸序列，可先推测出mRNA的核苷酸序列，再根据碱基互补配对原则推测出目的基因的核苷酸序列，进而人工合成。 （2）基因表达载体的构建（核心步骤）（教材P80） 1　 构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2　 组成结构： · 目的基因：编码所需蛋白质或调控因子的基因片段。 · 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 · 终止子：位于基因的尾端，是转录终止的信号，使RNA聚合酶停止转录。 · 标记基因：便于重组DNA分子的筛选。用于鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。如抗生素抗性基因。 · 复制原点：载体自我复制的起点，保证载体在受体细胞中复制。 （3）将目的基因导入受体细胞（教材P81） · 转化的定义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 · 常用导入方法： · 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上的特点）、花粉管通道法（我国独创，简便经济）。 · 动物细胞：显微注射技术（最常用，将重组DNA分子直接注入受精卵的细胞核内）。 · 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理微生物细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态，然后将重组DNA分子与感受态细胞混合培养，使重组DNA分子进入受体细胞）。 （4）目的基因的检测与鉴定（教材P82） · 分子水平检测： · 检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上：采用DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的目的基因作探针，与受体细胞的DNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已插入。 · 检测目的基因是否转录出mRNA：采用分子杂交技术，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已转录。 · 检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用抗原-抗体杂交技术，用相应的抗体与受体细胞提取的蛋白质进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已翻译出蛋白质。 · 个体水平鉴定： · 植物：抗虫或抗病的接种实验，观察受体生物是否表现出相应的抗虫或抗病特性；观察转基因植物的性状是否符合预期。 · 动物：观察转基因动物的性状是否符合预期，如转基因动物的生长速率、产奶量等。 习题演练 (1)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　×　) 解析　DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 (2)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　×　) 解析　限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。 (3)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　×　) 解析　质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 (4)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　×　) 解析　为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。 (5)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　×　) 解析　检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。 1. 基因工程的应用 （1）植物基因工程（教材P88） 主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗虫、抗病、抗除草剂、抗干旱、抗盐碱等），改良农作物的品质，以及利用植物生产药物等。 · 抗虫转基因植物：将Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因等导入植物，培育出抗虫棉、抗虫玉米等。 · 抗病转基因植物：将抗病毒基因（如病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因）、抗真菌基因（如几丁质酶基因、抗毒素合成基因）导入植物，培育出抗病毒烟草、抗真菌小麦等。 · 抗逆转基因植物：将调节细胞渗透压的基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因等导入植物，培育出抗盐碱、抗干旱的烟草，抗冻的番茄，抗除草剂的大豆等。 · 改良品质的转基因植物：将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，培育出延迟成熟的番茄；将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，培育出高赖氨酸玉米等。 （2）动物基因工程（教材P89） · 提高动物的生长速率：将外源生长激素基因导入动物体内，使动物生长速率加快，如转基因鲤鱼。 · 改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使转基因奶牛分泌的乳汁中乳糖含量大大降低，适合乳糖不耐受人群饮用。 · 用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，导入哺乳动物的受精卵中，培育出转基因动物，其进入泌乳期后，可通过分泌的乳汁生产所需要的药物，称为乳腺生物反应器（乳房生物反应器）。 · 用转基因动物作器官移植的供体：将抑制或除去抗原决定基因的导入猪的基因组，培育出没有免疫排斥反应的转基因猪，其器官可用于人类器官移植。 （3）基因工程药物（教材P90） 利用基因工程技术生产的药物包括细胞因子（如干扰素、白细胞介素）、抗体、疫苗、激素（如胰岛素、生长激素）等。这些药物可用于治疗癌症、遗传病、传染病等多种疾病，且生产成本低、产量高、纯度高。例如，利用大肠杆菌生产重组人胰岛素，利用酵母菌生产乙肝疫苗等。 （4）基因治疗 1　 概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。 2　 类型： · 体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转入正常基因。 · 体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，在体外完成基因转移后，再将成功转移的细胞回输到病人体内。 3　 实例：将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因导入患者的淋巴细胞，然后将这种淋巴细胞回输到患者体内，治疗重症联合免疫缺陷病（SCID）。 1. 蛋白质工程的原理和应用（教材P93） （1）定义：指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 （2）基本原理 中心法则的逆推：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），然后通过基因工程技术改造或合成基因，最终表达出符合要求的蛋白质。 （3）蛋白质工程与基因工程的区别 1　 基因工程：只能生产自然界已存在的蛋白质。 2　 蛋白质工程：可以生产自然界不存在的新型蛋白质，是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 （4）蛋白质工程的应用前景 1　 改造酶的结构，提高酶的热稳定性、催化效率等，用于工业生产（如改进的TaqDNA聚合酶、洗衣粉中的蛋白酶等）。 2　 设计制造具有特定功能的蛋白质，如具有超强吸附能力的蛋白质用于污水处理，具有特定抗原性的蛋白质用于疫苗研发等。 3　 用于医学领域，设计制造新型抗体、蛋白质类药物，治疗各种疾病。 习题演练 (1)科学家利用转基因技术培育了抗玉米螟玉米，种植该玉米的农田就不需要进行防虫管理了(　×　) 解析　转基因抗玉米螟玉米能够抵抗玉米螟，但不一定能抵抗其他害虫。 (2)乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中(　×　) 解析　乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入哺乳动物的受精卵中，但该基因在乳腺细胞中表达。 (3)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列(　×　) 解析　蛋白质工程改变的是蛋白质分子的少数氨基酸。 (4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改造分子的结构(　×　) 解析　蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (5)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(　×　) 解析　猪为哺乳动物，其成熟红细胞中没有细胞核。 (6)DNA与蛋白质都溶于酒精(　×　) 解析　DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精。 (7)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换(　×　) 解析　为避免外源DNA等因素的污染，在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 第4章生物技术的安全性与伦理问题 1. 转基因产品的安全性 (1) 转基因成果（教材P101） 1　 微生物：减少啤酒酵母双乙酰生成以缩短发酵周期；构建基因工程菌生产氨基酸（工业化重要途径）；生产基因工程药物（涉及多种疾病治疗，2014年生物技术药物销售额1.2万亿元）。 2　 动物：转入生长激素等基因培育生长快、营养优的家禽家畜；导入抗病毒基因培育抗病毒新品种；建立人类疾病转基因动物模型（如1型糖尿病、原发性高血压模型）。 3　 植物：培育出抗虫、抗病、抗除草剂、耐储藏等新性状作物（如耐储藏番茄）；2017年24国种植，前十国种植面积超1×10⁶hm²（美、巴等），主要作物为大豆、玉米、棉花、油菜；我国批准生产安全证书的有棉花、番木瓜等，仅棉花和番木瓜商业化种植，进口涉及多种作物的纤维及加工产品。 (2) 转基因技术的安全性（教材P102） 1　 食物安全：潜在风险（如产生过敏原、毒性物质、营养成分改变）；实质等同原则（评估转基因食品与传统食品的安全性是否实质等同）。 2　 生物安全：转基因生物可能成为入侵物种，破坏生态平衡；基因污染（转基因生物的外源基因通过花粉等途径扩散到其他物种）。 3　 环境安全：抗虫作物可能影响非靶生物（如益虫）；抗除草剂基因可能导致杂草获得抗性，形成“超级杂草”。 1. 关注生殖性克隆人 (1) 基因工程相关伦理（教材P106） 1　 基因歧视：基于基因信息的歧视（如就业、保险歧视）；基因检测的隐私保护（防止基因信息泄露）。 2　 基因治疗伦理：体细胞基因治疗（治疗患者本人，不影响后代）与生殖细胞基因治疗（可能改变后代基因，存在伦理争议）。 3　 设计试管婴儿：为治疗疾病（如造血干细胞移植）而设计胚胎的伦理争议（如胚胎的道德地位、性别选择）。 (2) 克隆技术伦理（教材P108） 1　 治疗性克隆：利用克隆技术获得早期胚胎，提取干细胞用于疾病治疗（伦理争议较小，需关注胚胎的处理）。 2　 生殖性克隆：克隆人（违背人类伦理，破坏人类基因多样性，引发社会伦理问题）。 3　 我国对生殖性克隆的态度：我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。原因如下：①克隆人只是某些人出于某种目的制造出的“产品”,没有“父母”,这可能导致他们在心理上受到伤害；②由于技术问题，可能孕育出有严重生理缺陷的克隆人；③克隆人的家庭地位难以认定，这可能使以血缘为纽带的父子、兄弟和姐妹等人伦关系消亡；④生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念；⑤生殖性克隆人是对人类尊严的侵犯；⑥生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性，不利于人类的生存和进化。 (3) 胚胎工程伦理 1　 胚胎的道德地位：早期胚胎是否具有生命权（不同观点：从受精开始/着床后/胎儿阶段）。 2　 代孕问题：代孕母亲与胎儿的权利关系，商业化代孕的伦理争议。 1. 禁止生物武器（教材P111） (1) 生物武器种类与危害：包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类（如天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌等），致病能力强、攻击范围广，可通过直接或食物、生活必需品、带菌昆虫等散布，经呼吸道、消化道、皮肤侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也损害植物。 (2) 生物武器的现实威胁：部分国家以科研为名研究储存生物武器（如炭疽杆菌、天花病毒毒株）；恐怖组织易获取利用生物武器；转基因技术可制造新型致病菌（如新型鼠痘病毒、改造蜡状杆菌、拼接生物毒素与流感病毒基因、改造流感病毒针对特定民族），可能导致无药可医、公众恐慌等严重后果。 (3) 国际社会对生物武器的禁止：1972年苏美英签署《禁止生物武器公约》，1975年生效；中国1984年加入；1998年中美联合声明重申不发展、不生产、不储存生物武器，反对扩散；2010年中国在联合国重申支持公约宗旨，主张全面禁止和彻底销毁生物武器等大规模杀伤性武器。 习题演练 (1)通过转基因技术生产药物只是转基因微生物方面的应用(　×　) 解析　可通过转基因微生物和转基因动物生产药物。 (2)若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题(　×　) 解析　转基因技术的安全性问题需要验证才能得到证实，若转基因植物的外源基因来源于自然界，也有可能存在安全性问题。 (3)生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题，是正常现象，不违反人类传统的伦理道德(　×　) 解析　生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题，与人类传统的伦理道德是背道而驰的。 (4)生殖性克隆和治疗性克隆没有本质区别(　×　) 解析　生殖性克隆是为了获得新个体，治疗性克隆只是为了获得用于治疗疾病的组织或器官，两者之间有着本质区别。 (5)生物武器可通过吸入、误食、接触带菌物品，被带菌昆虫叮咬等侵入人体(　√　) (6)我们对待生物武器的态度是坚决禁止生物武器(　√　) 1 学科网（北京）股份有限公司 $