3.2基因工程的基本操作程序(第6课时） 课件-2025-2026学年高二下学期人教版生物选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序(第6课时) 基因工程的第四步： 目的基因的检测与鉴定 导入水平：转基因生物的DNA上是否插入了目的基因 转录水平：目的基因是否转录出mRNA 翻译水平：目的基因是否翻译成蛋白质 个体水平：转基因个体是否具有抗性以及抗性程度等 个体水平 分子水平 基因工程的第四步： 目的基因的检测与鉴定 将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？ 已知目的基因的序列 3 基因表达载体中具备标记基因(如XX抗性基因)，可以对受体细胞（不含抗性基因)进行初次筛选 若只用单标记基因，在含抗生素的选择培养基上能生长的可能是导入了基因表达载体或未插入目的基因的空载体 双标记基因筛选法（破坏其中一个标记基因) 更有利于选择出导入了基因表达载体的受体细胞 氨苄青霉素 抗性基因 双标记基因筛选法 实例1：将此质粒导入大肠杆菌并进行筛选，已知LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 目的基因插入位点 方法：将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选白色 ①导入重组质粒 ②导入普通质粒 ③只导入目的基因片段 ④未导入成功 白色活菌 蓝色活菌 死亡 死亡 白色 小蓝8.将人生长素基因和pBR322结合，构建重组质粒，并导入受体菌进行筛选。 注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因， TetR为四环素抗性基因。 下列有关叙述正确的是B A.可选择的限制酶组合是酶E和酶G B.所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因 C.用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌 D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带 不能同时破坏两个标记基因 4 实例2：将此质粒导入大肠杆菌并进行筛选， ①导入重组质粒 ②导入普通质粒 ③只导入目的基因 ④未导入成功 氨苄青霉素培养基 四环素培养基 × × × × √ √ √ × 双标记基因筛选法 影印接种 氨苄青霉素 培养基 四环素培养基 回到原来的培养基中，挑选此培养基中没有的菌落 单标记基因无法确定导入了基因表达载体或未插入目的基因的空载体 双标记基因能筛选出导入了基因表达载体的受体细胞 但严格来讲，该方法只能说明有基因插入，最好是目的基因插入，但也没法排除有可能是其他基因混入 就算插入的是目的基因，也不能明确目的基因的方向等是否正确，进而无法确定目的基因是否正确表达 可用PCR+电泳、分子杂交技术 等检测目的基因（更精准） 还需在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 A（未插入） B（成功插入） 提取DNA 提取DNA 根据目的基因 设计引物 可扩增出目的基因片段 M：marker； 1：阳性对照 2：生物A 3：生物B 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 方法1：PCR+电泳 转基因生物 PCR操作 电泳检测是否 扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 方法1：PCR+电泳 检测目的基因是否转录（mRNA） 基本思路： 1.制作基因探针，并用PCR扩增 2.提取受体细胞全部mRNA，使基因探针和转基因生 物的mRNA杂交，若出现 杂交带，表明转录出了mRNA。 10 1 2 5’ 3’ 核酸探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。 检测目的基因是否插入和转录，还可以用分子杂交技术 3’ 5’ 3’ 5’ 以2链为模板转录出的mRNA： 5’-UACGGUCAUGUCGCAUGCUAG-3’ 基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与____________________碱基互补配对，并带有________________标记或荧光标记。 例如，胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的________形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有_____________，也可以检测胰岛素基因是否______。 人体的细胞中，胰岛B细胞的______________（DNA/RNA/DNA和RNA）能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有______（DNA/RNA）能与之形成杂交分子。 目的基因的一条链 放射性同位素 mRNA 胰岛素基因 转录 DNA和RNA DNA 检测目的基因是否插入和转录，还可以用分子杂交技术 四 第四步：目的基因的检测与鉴定 方法2： DNA分子杂交技术 提取DNA 样本 基因组DNA 酶切 DNA片段 电泳 转膜 硝酸纤维素膜 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 方法2： RNA分子杂交技术 检测目的基因是否转录（mRNA） 转膜 注射小鼠体内 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） 方法： 抗原—抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 原理： （提示：免疫学方法） 检测目的基因是否翻译（蛋白质） 15 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物（如胰岛素） 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 功能、活性正常 个体水平的检测 目的基因是否表现出相应的性状 16 1.目的基因的筛选和获取-前提 利用PCR获取和扩增 化学方法人工合成 2.构建基因表达载体-核心 启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点 3.将目的基因导入受体细胞-关键 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物); 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 小结 基因工程的基本操作程序 4．图甲为某DNA分子及其中的限制酶酶切位点，图乙为用A和B两种限制酶同时或分别处理该DNA分子后，对产物电泳分离的结果。错误的是A A．图甲X、Y分别为限制酶A、B的酶切位点 B．图甲中的DNA分子全长为10000个碱基对 C．图乙中②为限制酶B切割后的电泳结果 D．图乙中产物电泳时加样孔在图乙的上端 4500 B A 11．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物。PCR反应的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。正确的是C A．该不对称PCR过程中需要a·26个限制性引物 B．该方法扩增目的基因时需知道基因的全部序列 C．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 D．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 引物总数 =2n+1-2 =总单链数-2 含黑色引物的 DNA分子数 =DNA数-2 =2n-1 同时含2种引物的 DNA分子数 =2n-2 =DNA数-1 经过n轮复制之后 第n轮内，单独消耗新添加的引物总数？ 引物添加给了每一轮新合成的单链 =第n轮的单链数-第n-1轮的单链数 =2n+1-2n =2n $