3.2基因工程的基本操作程序(第1课时） 课件-2025-2026学年高二下学期人教版生物选择性必修3

复习：DNA粗提取与鉴定的步骤 为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因： 操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入 2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质 降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 DNA的粗提取与鉴定 2mol/L的NaCl溶液:溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。 加蒸馏水的目的:降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 2 第3章 第2节 人教版 选择性必修3 3 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 苏云金杆菌 Bt蛋白基因 棉花细胞 （核心） 抗虫棉 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？ 情境导入 载体载着什么呢？目的基因。 载着目的基因区干嘛？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 4 目的基因的概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状 或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因，还有一些是调控因子。 抗逆性 毒物降解 生产药物 工业用酶 5 较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。 目的基因的筛选 在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。人们通过研究已经发现苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关，并且对其结构和功能有所了解。 P77苏云金杆菌抗虫的原理 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性。而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。 我现在想要棉花具有抗虫的特性，我得先找到这种基因，那么为啥我偏偏就把Bt基因给选到了呢？那你就上网去搜，看看现在对哪种抗虫的基因了解的最透彻 那么科学家就发现这个基因是最合适的基因，那么科学家发现的Bt基因在抗虫的时候有啥用呢 6 DNA测序仪 序列数据库 （如GenBank） 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 序列比对工具 （如BLAST） 认识基因结构和功能的方法： 利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等 目的基因的筛选 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 1从生物材料中分离 2人工合成 DNA cDNA 1.1通过PCR获得大量目的基因 mRNA 1.2从基因文库中获取 逆转录 前提：基因比较小，核苷酸序列又已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 获取目的基因的两大途径 扩增 扩增 以前常用 现在常用 (基因组文库、cDNA文库) 目的基因的获取 建立基因组文库，并从中获取目的基因 基因组 文库 导入受体细胞保存 筛选目的基因 如果是从苏云金杆菌体内去获取这一段基因的话，纯度太低了，因为站在现在的角度，我们已经可以通过很多方法，获得了目的基因的序列了，只要我能创造出很多的目的基因就好了 某生物所有DNA 特定的限制酶 基因组所有基因 每个基因和载体结合重组DNA分子 导入受体菌 基因组文库 基因组文库：将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA 片段克隆到某种载体上而形成的集合 目的基因的获取 建立基因组文库，并从中获取目的基因 某种生物的成熟mRNA 单链DNA 双链DNA片段（cDNA） 导入受体菌中储存 cDNA文库 逆转录酶 DNA聚合酶 与载体连接 cDNA文库:指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合 （部分基因文库） 目的基因的获取 建立cDNA文库，并从中获取目的基因 11 1从生物材料中分离 2人工合成 DNA cDNA 1.1通过PCR获得大量目的基因 mRNA 1.2从基因文库中获取 逆转录 前提：基因比较小，核苷酸序列又已知 获取目的基因的两大途径 扩增 扩增 以前常用 现在常用 (基因组文库、cDNA文库) 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 （polymerase chain reaction） 聚合酶 链式 反应 一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR扩增仪 PCR 目的基因的获取 回顾：DNA的复制 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 过程： 解旋 → 合成引物 → 延伸子链 → 恢复螺旋 （需要解旋酶解开氢键） DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物，其作用是给DNA聚合酶提供3’端。 相关信息： 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。 （需要DNA聚合酶 延伸方向：子链的5’→3’） 引物过短：可能会出现其他非目的基因，降低特异性 引物过长：容易出现二级结构，降低扩增效率 DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 氢键的形成是自发的，不需要能量和酶 DNA聚合酶无法与单链DNA结合，需使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 RNA引物：在细胞内DNA复制时，RNA引物由引发酶（primase）以DNA模板链为模板合成。引发酶是一种特殊的RNA聚合酶，能够识别DNA复制起始位点并合成短链RNA引物。 14 在DNA复制中的作用 体内DNA复制参与的组分 PCR中参与的组分 用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 比较DNA在体内和体外的复制 15 在DNA复制中的作用 体内DNA复制参与的组分 PCR中参与的组分 用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常为与两条模板链结合的2种短的单链DNA，数量很多） 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 比较DNA在体内和体外的复制 2种引物的原因： DNA的两条链是反向平行的（序列不同） 提供能量和原料 17 微量离心管 还要加缓冲液 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg 2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg 2+ 。 DNA模板 四种脱氧核苷酸(dNTP) 引物 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） 通过控制什么条件，才能让这些分子按步骤进行DNA的扩增？ 温度 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 变性 延伸 复性 PCR的过程 Taq酶结合在引物的3’端 G和C含量越多，引物长度越长，温度越高 Taq酶的最适温度 PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板。 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 PCR的结果 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n PCR技术能够实现在体外短时间内对DNA片段以指数形式大量扩增 一般循环30次，一次2-3分钟 1.图1是PCR扩增技术相关过程， PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？ 不是完整的模板DNA分子； PCR扩增的仅仅是两种引物之间 所对应的特定DNA片段。 思考 · 讨论 2.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物 思考 · 讨论 5’ -ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA- -TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT- 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ 3.根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。 4.下图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请说明理由。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效 非目的基因 非目的基因 非目的基因 非目的基因 5’ 5’ 3’ 3’ 5.利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？ 思考 · 讨论 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 第三次循环结束， 出现了目的基因 23 2 2 2 2 2 0 2 4 6 2(n-1) 0 0 2 8 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 思考 · 讨论 2n 2 4 8 2 4 8 2n 1 3 7 2n-1 0 2 6 2n-2 1 3 7 2n-1 思考 · 讨论 ①DNA分子有_____个 ②总链数_____条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ⑦仅含引物2的DNA数：______ ⑧引物1、2均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 ★ 思考 · 讨论 26 27 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 思考 · 讨论 6.如何对产物进行鉴定？（p79） 7.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列，使得最后获得的目的基因两端有限制酶的识别位点。 不是在引物的3′端加识别序列，要保证子链能正常延延伸。 思考 · 讨论 ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 8.用PCR可以扩增mRNA吗？（p79） 不能！ 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 9.如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ 思考 · 讨论 mRNA是单链RNA分子，无法直接作为PCR的模板。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；核酸酶H（RNase H）是一类能够特异性识别并切割RNA-DNA杂交体中RNA链的核酸内切酶。 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 29 $