抢分11 基因编辑与现代生物技术应用（热点抢分必刷）（北京专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 聚焦基因编辑技术与育种创新，构建"原理-技术-应用"三维体系，通过对比分析与情境化命题培养科学思维与探究实践能力。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |基因编辑技术|3技术+8例题|Cre/LoxP位点特异性重组、CRISPR/Cas9靶向切割、In-Fusion无缝克隆|从分子剪刀机制到动植物定向改良，构建"识别-切割-修复"技术链| |育种方法比较|5方法+6例题|传统育种与基因工程技术对比分析，结合启动子调控与标记基因筛选|以变异原理为核心，形成"杂交-诱变-基因编辑"技术演进脉络|

抢热点 基因编辑与现代生物技术应用 基因编辑与现代生物技术应用，是当下生物科技领域极具前沿性、精准性，可依托基因定点修饰实现生物性状定向改良的技术体系与应用过程。传统生物技术育种多依靠自然变异、杂交选育，周期漫长且变异方向不可控，只能被动筛选优良性状，而融合了基因编辑的现代生物技术，能够直接对动植物基因组目标位点进行精准修饰，实现定向、高效、可控的种质创新。 基因编辑依托人工改造的核酸酶“分子剪刀”，在基因组特定位点精准制造双链断裂，借助生物体非同源末端连接与同源重组机制完成自我修复，进而产生定向基因突变与基因改良。将基因编辑融入育种创新全过程，突破了传统杂交育种的物种生殖隔离与选育周期瓶颈，可快速培育出抗病抗逆、高产优质、营养升级的农作物与畜禽新品种。同时在生命基础研究、人类遗传病干预、生物制品研发等领域协同发力，让现代生物技术从基础研究走向产业落地，为种业振兴、生物医疗与现代农业发展提供了核心技术支撑，展现出不可替代的应用价值与发展潜力。 猜押1 基因编辑 1.Cre/LoxP重组酶系统 （1）Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 （2）LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 （3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 2.CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。 其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 3.In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 1．（25-26高三上·北京通州·期末）经典的孟德尔遗传规律和自然选择限制了对野生植物种群进行基因改造，因为某些对人类有利的性状对植物自身是不利的，研究者开发了CAIN技术解决这一难题。 (1)Cas9-gRNA系统是基因编辑的重要工具，如图1所示，gRNA通过______原则识别并结合DNA上靶序列，同时招募Cas9蛋白对该靶序列进行切割，造成DNA损伤。 (2)基于Cas9-gRNA系统，研究者构建了CAIN技术，其载体结构如图2所示。DMC1启动子可以驱动Cas9基因和gRNA序列的转录，进而特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1；同时需要引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”（简称NPG1-ty基因），NPG1-ty基因的具体功能是______。为了将NPG1-ty基因重组到C载体中，需要用到的限制酶是_______，重组后的载体称为CAIN载体。 注：同义密码子是指同一氨基酸被多个不同密码子编码。DMC1是雄蕊花粉母细胞特异启动子。TPD1是花粉细胞特异启动子。 (3)科学家用______方法，将1个CAIN载体导入到植物拟南芥染色体中，且转入的CAIN载体稳定存在并表达。以该转基因植株作为父本，以野生型为母本进行人工授粉，F1中携带CAIN载体的比例为________。 (4)结合所学知识，有关本研究的表述中正确的是_______。 A．Cas9-gRNA功能类似“解药”，NPG1-ty功能类似“毒药” B．通过特异性抗体，能够区分NPG1和NPGI-ty基因表达的蛋白质 C．CAIN技术可用于破坏外来入侵植物的育性相关基因，控制入侵植物数量 D．CAIN技术被不当使用会影响生物安全，因此需要进行严格的监管和论证 【答案】(1)碱基互补配对 (2)恢复花粉萌发正常所需的NPGI基因功能，避免NPGI基因被Cas9-gRNA切割 KpnI和SalI (3)农杆菌转化 100% (4)CD 【分析】基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。 【详解】（1）结合图1分析，gRNA通过碱基互补配对原则识别并结合DNA上靶序列，同时招募Cas9蛋白对该靶序列进行切割，造成DNA损伤。 （2）特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1；同时需要引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”（简称NPG1-ty基因），说明NPG1-ty基因的具体功能是恢复花粉萌发正常所需的NPGI基因功能，避免NPGI基因被Cas9-gRNA切割。在构建重组DNA分子时需要保证NPG1-ty基因转录的方向和质粒上基因的转录方向是一致的，目的基因的左侧有两种限制酶识别序列，分别是KpnI和SpeI，左侧是转录的终点，而在质粒上SpeI最靠近TPD1启动子，因此选择KpnI，目的基因的右侧有三种限制酶识别序列，右侧是转录的起点，所选择的限制酶应该在质粒上KpnI的左侧，可以选择BamHI或SalI，但BamHI会破坏卡那霉素抗性基因，因此选择SalI。综合分析，为了将NPG1-ty基因重组到C载体中，需要用到限制酶是KpnI和SalI。 （3）将目的基因导入植物细胞的方法通常是农杆菌转化法，因此科学家会用农杆菌转化方法，将1个CAIN载体导入到植物拟南芥染色体中，且转入的CAIN载体稳定存在并表达。父本含有一个CAIN载体，母本不含CAIN载体，DMC1启动子可以驱动Cas9基因和gRNA序列的转录，进而特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1，即不含CAIN的花粉不能萌发，以该转基因植株作为父本，以野生型为母本进行人工授粉，F1中携带CAIN载体的比例为100%。 （4）A、Cas9-gRNA功能是特异性切割DNA片段，类似“毒药”，NPG1-ty功能是替换原有的基因，类似“解药”，A错误； B、引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”，说明NPG1和NPG1-ty基因表达的蛋白质相同，因此无法通过特异性抗体区分，B错误； C、结合题干信息可知，CAIN技术可用于破坏外来入侵植物的育性相关基因，从而减少出生率，进而控制入侵植物数量，C正确； D、CAIN技术被不当使用会影响生物安全，因此需要进行严格的监管和论证，尽可能减少对生物环境的影响，D正确。 故选CD。 2．（24-25高二下·北京昌平·期末）水稻的胚乳是主要可食用部分，其他部分在加工过程中被去除。害虫二化螟和田间杂草极大地影响水稻的产量，科研人员利用基因工程技术培育抗虫、抗除草剂（草甘膦）水稻，操作步骤如图1。 注：PgluC、PrbcS和P355分别为胚乳组织特异性启动子、绿色组织特异性启动子和持续激活启动子；Tnos为终止子，cry1C为抗虫基因，EPSPS为抗草甘膦基因，loxP为Cre重组酶特异性识别序列；SalI、KpnI、SphI、SacI和PstI均为限制酶，标线指向酶切位点 (1)构建重组质粒时需删除原质粒上的无关基因，目的是_______。 (2)获得目的基因Cre、cry1C和EPSPS后，常利用________技术将其大量扩增，连接为多基因串联体，并在两端分别添加_______酶切位点，以保证与质粒的正确连接。 (3)下列关于转基因抗虫、抗除草剂水稻培育过程的叙述，不合理的是________（多选）。 A．野生农杆菌需在含卡那霉素的培养基中培养 B．导入受体细胞前需用纤维素酶处理愈伤组织细胞 C．可在转基因水稻胚乳细胞中扩增出目的基因 D．可在转基因水稻根成熟区细胞检测到cry1C蛋白 E．施加适宜浓度的草甘膦以筛选抗草甘膦的植株 (4)Cre基因编码的酶能够切除两个loxP之间的序列，使其被降解。 ①Cre酶的识别序列及切割位点如图2，其作用与_________酶相似。 ②本研究转入Cre基因的意义是________。 【答案】(1)减少无关基因干扰，确保目的基因正确表达 (2)PCR SacI和PstI (3)ABD (4)限制酶 去除选择标记基因（如卡那霉素抗性基因），避免基因污染 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）重组质粒中无关基因可能影响目的基因的转录或翻译，删除后可减少无关基因的干扰，以确保目的基因的正确表达。 （2）PCR 技术是体外快速扩增目的基因的常用手段实现目的基因的大量复制，因此利用PCR用于扩增目的基因；为保证多基因串联体能与质粒正确连接，需在串联体两端添加与质粒相同的限制酶切位点，由图可知多基因串联体内部已有SalI、KpnI、SphI三个酶切位点，为保证在构建重组质粒添加限制酶时不破坏多基因串联体，应在多基因串联体两端添加除SalI、KpnI、SphI以外的限制酶切位点，即SacI和PstI。 （3）A、野生农杆菌不含卡那霉素抗性基因，无法在含卡那霉素培养基生长，A错误； B、培育转基因植物时不需要制备原生质体，可以用农杆菌转化法把目的基因导入受体细胞，B错误； C、转基因水稻是由导入重组质粒的水稻愈伤组织发育形成的完整个体，因此转基因水稻胚乳细胞中也含有目的基因，C正确； D、cry1C由绿色组织特异性启动子（PrbcS）驱动，根成熟区细胞无绿色组织特征，该基因不表达，不能检测到cry1C蛋白，D错误； E、草甘膦可杀死非抗性植株，保留含 EPSPS 基因的抗性植株，E正确。 故选ABD。 （4）①Cre酶识别特定序列并切割DNA，功能类似限制酶。 ②Cre酶切除loxP之间的序列，可在转基因后去除标记基因，提高安全性。 3．（22-23高三上·北京·开学考试）抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。 (1)构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过____________酶与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列____________（填“能”或“不能”）出现在目的基因内部，可通过____________技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。 (2)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆In-Fusion技术（图2），其中In-Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。 ①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In-Fusion反应。 如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段______________。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过______________处理的农杆菌中。 ②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物______________扩增目的基因并电泳检测。请在图4中画出阳性菌落的电泳结果。______________ (3)农杆菌转化愈伤组织时，用含______________的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，请叙述排除假阳性的原理________。 【答案】(1)限制酶和DNA连接酶 不能 PCR (2)a、d或d、a Ca2+ 1和4 (3)除草剂 由于成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因，也有GUS基因，而报告基因GUS在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达，且表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的实现成功转化愈伤组织和无蓝色的是假阳性的农杆菌。 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）构建含除草剂抗性基因的表达载体，需要用限制酶切割目的基因和运载体，而后通过DNA连接酶将目的基因和载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列不能出现在目的基因内部，否则会导致目的基因被破坏，为了构建目的基因两端的限制酶识别序列，可通过PCR技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列来实现。 （2）①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In-Fusion反应。如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，说明A基因合GUS基因通过e片段实现连接，则引物1和4将产生与载体相连接的片段，因此，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段a、d或d、a。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过Ca2+处理的农杆菌中，因为此时的农杆菌处于感受态，转化的成功率较高。 ②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物1和4扩增目的基因并电泳检测，若成功导入目的基因，则会存在基因合A和GUS发生融合的基因，若检测阳性，则说明转基因成功。则图4中画出的阳性菌落的电泳结果，由于阳性菌中含有融合基因，结合图示可知，其长度应该大于或等于600+800=1400，如图所示 。 （3）农杆菌转化愈伤组织时，需要用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织，能在该培养基上正常生长的愈伤组织为具有对除草剂的抗性；愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。由于成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因，也有GUS基因，而报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K分别处理上述的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的转化愈伤组织和无蓝色的是假阳性的农杆菌，这里依据的原理是GUS基因在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达。 1．2020年10月7日，瑞典皇家科学院已决定将2020年诺贝尔化学奖授予德国马克斯·普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A． Doudna博士，以表彰她们在基因组编辑领域的贡献。在人工设计的条件下，通过sgRNA与基因组靶序列的特异性结合，引导Cas9蛋白“切割”基因组DNA (如下图所示)。请回答下列问题。 (1)sgRNA与基因组靶序列可以特异性结合的原因是___________，Cas9核酸酶可以在sgRNA的引导下打开目标基因中的_______键，使得基因组DNA断裂。在_____酶的作用下，断裂的DNA可重新拼接。 (2)有研究者利用该技术，敲除了大鼠胰岛素受体底物1 (Irsl)基因，获得了糖尿病模型动物。流程如下： 根据已知Irs1基因的______， 设计两种sgRNA；构建含有两种sgRNA基因和______基因的表达载体；利用__________法，将上述基因的体外表达产物RNA，导入大鼠的_____(细胞)。 (3)提取转基因大鼠DNA，用PCR的方法检测Irs1编辑情况，结果如下图。其中WT为_____大鼠，由图可知2号大鼠比野生型大鼠的PCR产物短95bp，研究者据此确定其为阳性结果，即Irsl 被敲除失活，因为____________对应序列在Irsl基因上的位置相距95bp。 （4）2号大鼠P与野生型WT大鼠杂交，提取后代DNA，用相同引物进行PCR，结果如上图。_________________属于杂交后代， 说明基因编辑结果______稳定遗传。 【答案】(1)二者的碱基互补配对 磷酸二酯 DNA连接 (2)碱基序列 Irs1 显微注射 受精卵 (3)野生型 sgRNA基因 (4)2、3、7、9 可以 【分析】根据题意分析可知，CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导sgRNA识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列编辑。 【详解】（1）由于人工设计条件下，使sgRNA与基因组靶序列二者的碱基互补配对，因此sgRNA与基因组靶序列可以特异性结合。Cas9核酸酶可以在sgRNA的引导下打开目标基因中的磷酸二酯键，使得基因组DNA断裂。在DNA连接酶的作用下，断裂的DNA可重新拼接。 （2）利用“CRISPR/Cas9基因编辑技术”，敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irsl）基因，获得糖尿病模型动物的流程如下：据已知Irs1基因的碱基序列，设计两种sgRNA；构建含有两种sgRNA基因和Irs1基因的表达载体；通过显微注射法，将上述基因的体外表达产物RNA，导入大鼠的受精卵细胞。 （3）WT为野生型大鼠，据图分析可知，2号大鼠比野生型大鼠的PCR产物短95bp，据此确定其为阳性结果，即Irsl被敲除失活，因为sgRNA基因对应序列在Irsl基因上的位置相距95bp。 （4）2号大鼠P与野生型WT大鼠杂交，根据图分析，同时含有2 号大鼠P与野生型WT大鼠的两种条带的为杂交后代，因此2、3、7、9属于杂交后代，由此说明基因编辑结果可以稳定遗传。 2．为治疗镰状细胞贫血症，研究人员尝试将特定的mRNA递送至患者造血干细胞，通过基因编辑实现对该病的治疗。 (1)体外获得的mRNA递送到人体细胞后，经______过程合成蛋白质。 (2)利用纳米脂质体（LNP）作为基础材料，将特定蛋白与LNP偶联，构建可靶向造血干细胞递送mRNA的系统。 ①已知Cre酶可识别DNA分子中特定的loxP序列，当DNA分子上存在两个同向loxP序列时，Cre酶可将两个loxP序列之间的DNA序列切除（图1）。将Cre酶的mRNA包裹进该递送系统后送入小鼠细胞。若______，说明递送系统有效。 ②选择不同的蛋白质与LNP偶联后进行递送，根据图2判断，递送至造血干细胞效果最佳的蛋白质为______。 (3)利用上述mRNA递送系统可将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）递送至患者造血干细胞进行基因编辑。ABE是一类新兴基因编辑技术，由融合蛋白与sgRNA构成，可实现对A/T碱基对的精准转换，修复致病血红蛋白，原理如图3。请完善修复过程________。 (4)修复后的干细胞回输之前需要清除患者原造血干细胞，为骨髓微环境腾出空间，传统放化疗处理存在不孕不育风险和损伤正常细胞等缺陷。已知PUMA蛋白是一种促凋亡因子，请利用上述mRNA递送系统提出研究思路________。 【答案】(1)翻译 (2)细胞出现荧光 CD117蛋白 (3)融合蛋白将A转化为次黄嘌呤（I），DNA复制时I与C配对，经复制后A/T碱基对变为G/C碱基对，实现基因修复 (4)利用递送系统（CD117-LNP）包裹PUMA的mRNA，进入造血干细胞后翻译出PUMA，促进细胞凋亡。 【分析】1、基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR技术扩增目的基因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。 2、细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 【详解】（1）mRNA 是翻译的模板，体外获得的 mRNA 递送到人体细胞后，经翻译过程合成蛋白质。 （2）①递送系统包裹Cre酶的mRNA进入小鼠细胞，若Cre酶发挥作用，会识别DNA中loxP序列，切除两个同向loxP间含stop的序列，使荧光蛋白基因正常转录，小鼠细胞表达荧光蛋白（或检测到荧光蛋白 ），即细胞出现荧光 ，说明递送系统有效（能让mRNA进入细胞并翻译出有功能的Cre酶 ）。 ②图 2 中，对比不同蛋白质 - LNP 偶联物递送后，表达荧光蛋白的细胞占比，CD117蛋白-LNP 组在各mRNA剂量下，表达荧光蛋白的细胞占比均最高，说明递送效果最佳，故递送效果最佳的蛋白质为CD117蛋白。 （3）已知ABE可实现A/T碱基对精准转换，修复致病血红蛋白。结合图3及过程：融合蛋白将A转变为次黄嘌呤（被识别为 G ），DNA 复制时，依据碱基互补配对，与G配对的是C，后续再经DNA复制等，最终实现A-T碱基对向G-C碱基对的转换，修复致病基因。所以修复过程为：融合蛋白催化A脱氨生成次黄嘌呤（I），DNA 复制时I与C配对，经DNA复制后，原来的A/T碱基对转换为G/C碱基对，完成基因修复（或A在融合蛋白的作用下变为次黄嘌呤（被识别为G），然后DNA复制，以含G的链为模板合成子链时，对应位置引入C，从而将A-T对精准转换为G-C对）。 （4）要利用mRNA递送系统清除患者原造血干细胞，已知PUMA蛋白是促凋亡因子。思路是借助该系统将编码PUMA蛋白的mRNA递送至患者原造血干细胞，使细胞表达 PUMA 蛋白，诱导其凋亡，为修复后的干细胞回输腾出骨髓空间，同时避免传统放化疗弊端。即：利用上述mRNA递送系统（CD117-LNP），将编码PUMA蛋白的mRNA递送至患者原造血干细胞，使原造血干细胞表达PUMA蛋白，诱导其凋亡，为修复后的干细胞回输创造条件。 3．水稻条纹叶枯病是以灰飞虱为媒介传播的病毒病，俗称水稻上的癌症。病株常枯孕穗或穗小畸形不实。拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，各类型稻均不枯心，但抽穗畸形，结实很少。为提高水稻对条纹叶枯病的抗性，科学家通过基因工程将抗病毒基因cry1Ab13转入水稻，过程如图所示。回答下列问题： (1)为了减少限制酶识别序列的影响，研究人员采用了新型的无缝克隆In-Fusion技术实现重组载体的构建。该技术首先要将表达载体线性化，需使用限制酶____，其次要保证在目的基因两端构建出与线性化载体末端相同的DNA序列（即同源序列，通常15～20bp）。因此引物1和引物2要依据____序列设计。 (2)将线性化的表达载体和基因crylAb13混合进行In-Fusion反应，In-Fusion酶能够识别线性化DNA片段（末端任意16个碱基，使其形成黏性末端，依靠同源序列碱基间的配对获得重组表达载体，其中同源序列1、2中碱基序列不同，这样设计的好处除了防止线性化载体自身环化自连外，还能___________（答两点）。 (3)科学家通过实验探究水稻抗条纹叶枯病病毒（RSV）的调控机制。 ①茉莉酸（JA）参与调节水稻抗RSV。实验显示转录因子Y的表达水平在水稻感染RSV后显著上调。用外源JA处理接种RSV的水稻幼苗，一段时间后检测植株中的病毒蛋白积累量，结果如下图。实验结果表明JA____（选填“提高”或“降低”）水稻对RSV的抗性，转录因子Y____（选填“提高”或“降低”）水稻对RSV的抗性。 ②S是JA信号通路中的关键转录因子。荧光素酶（LUC）可分为无活性的N端和C端两段蛋白，两者在空间上靠近时可恢复酶活性。研究者将表达N端的基因（nLUC）与S基因融合，将表达C端的基因（cLUC）与Y基因融合，构建表达载体导入烟草叶片，48小时后加入底物检测荧光信号，结果如下表： 组别 导入基因 荧光信号（“+”表示有、“-”表示无） 甲 cLUC-Y融合基因+nLUC基因 一 乙 cLUC基因—nLUC基因 一 丙 ? + 丁 cLUC基因+nLUC-S融合基因 一 表中“?”处导入的基因为_________________。实验结果说明Y可与S结合，理由是_______________。 【答案】(1)BamHⅠ 目的基因和（表达）载体 (2)防止目的基因自身环化自连，防止目的基因与载体的反向连接（或保证目的基因与载体的正向连接） (3)提高 降低 cLUC-Y融合基因＋nLUC-S融合基因 与其他组相比，仅丙组检测到荧光，说明LUC的N端和C端在空间上靠近，恢复了酶活性，两者靠近是由Y与S结合导致的 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）目的基因需要插在表达载体启动子和终止子之间，故选择BamH Ⅰ，目的基因经引物1和引物2扩增后需要与线性化表达载体连接，故引物1和引物2要依据目的基因和表达载体序列进行设计。 （2）表达载体的构建过程中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是防止目的基因与表达载体的反向连接，防止线性化载体或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。 （3）①转录因子Y的表达水平在水稻感染RSV后显著上调，由图可知，Y过表达植株病毒蛋白积累更多，用外源JA处理后的植株病毒蛋白积累量比不用JA处理的减少，表明转录因子Y降低水稻对RSV的抗性，JA提高水稻对RSV的抗性。 ②据表分析，只有丙组出现荧光信号，说明Y可与S结合，且说明丙组导入的是nLUC-S融合基因和cLUC-Y融合基因，才能使无活性的N端和C端两段蛋白在空间上靠近从而恢复酶活性。 见下图： 猜押2 育种创新 杂交育种 诱变育种 单倍体育种 多倍体育种 基因工程育种 方法 （1）杂交→自交→选优（2）杂交 物理因素、化学因素、生物因素 花药离体培养、秋水仙素诱导加倍 秋水仙素处理萌发的种子或幼苗 将一种生物的特定基因转移到另一种生物细胞中 原理 基因重组 基因突变 染色体数目变异 染色体数目变异 基因重组 优点 不同个体的优良性状可集中于同一个体上 提高变异频率，出现新性状，大幅度改良某些性状，加速育种进程 明显缩短育种年限 营养器官增大、提高产量与营养成分 打破物种界限，定向改造生物的遗传性状 缺点 时间长，需要及时发现优良性状 有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性 技术复杂，成本高 技术复杂，且需要与杂交育种配合；在动物中难以实现 技术复杂，生态安全问题较多 适用对象 同一物种的多个品种的优良基因的组合 已知的优良基因资源 快速获得纯合稳定遗传品系 获得高产新物种 不同物种优良基因的组合 举例 高杆抗病与矮杆不抗病小麦杂产生矮杆抗病品种 高产量青霉素菌株的育成 抗病植株的育成 三倍体西瓜、八倍体小黑麦 转基因抗虫棉的培育 1．（2026·北京丰台·一模）在作物育种中，培育不育系可简化制种流程、节约人工时间。 (1)科研人员培育出了具备优良性状的甘蓝油菜雄性不育系CMS，为获得雄性育性恢复的该品系，计划引入油菜R中的育性恢复基因，部分流程如图1，其中①是________。以________性状作为筛选依据，从而获得BC1到BC5。 (2)在上述BC5中发现一株雌性不育突变体（G）。为判断雌性不育性状的遗传方式，应从BC5中选择正常植株（H）与G杂交，结果发现子代性状及比例为________，推测雌性不育性状由显性单基因控制。 (3)检测发现G中Bol基因的转录量显著低于H．对两者进行基因组测序，若结果为________，则支持假说“Bol基因是导致雌性不育的基因”。后续实验证明了该假说。 (4)进一步研究发现在20±2℃稳定低温或32±2℃稳定高温时，G可恢复育性。且G中突变的Bol基因可使叶片呈锯齿状。基于以上信息，请利用G植株、CMS植株、N品系（可育、具备优良性状），在图2中完善育种流程，构建田间收获均为目标杂交种的育种体系。 【答案】(1)CMS 雄性可育/育性恢复 (2)雌性可育:雌性不育= 1:1 (3)仅Bol基因序列存在差异 (4) 【详解】（1）CMS（♀，雄性不育） × 油菜R（♂，可育），核基因杂合，细胞质来自CMS，表型可育。作为母本，提供细胞质和部分核基因，F₁作为父本，提供含育性恢复基因的花粉。回交后代BC₁至BC₅中，核基因组逐步向CMS背景趋近，同时保留育性恢复基因。在每代回交后代中，仅选择雄性可育个体进行后续回交，淘汰雄性不育个体。该表型直接反映育性恢复基因的存在。 （2）若雌性不育性状由显性单基因控制，设该显性基因为A，隐性正常基因为a。突变体G为雌性不育，其基因型应为AA或Aa，正常植株H基因型为aa。当G与H杂交时：若G为AA，子代全为Aa，全部表现为雌性不育；若G为Aa，子代中Aa（雌性不育）:aa（正常）=1:1。突变体为杂合子，因此子代性状及比例应为雌性不育:雌性可育 = 1:1。 （3）要支持“Bol基因是导致雌性不育的基因”这一假说，基因组测序结果应显示G与H仅Bol基因序列存在差异，具体表现可能为：G中Bol基因存在功能丧失性突变，而H中该基因序列完整且保守。G中Bol基因的启动子或增强子区域发生插入/缺失等结构变异，导致转录量显著降低，而H中相应区域正常。G中Bol基因拷贝数减少或完全缺失，而H中为正常拷贝数。若测序结果显示上述任一情况，即可从遗传层面支持假说“Bol基因是导致雌性不育的基因”。后续实验证明了该假说。 （4）根据题意，构建田间收获均为目标杂交种的育种体系需遵循以下步骤：将G植株（基因型为Bb，锯齿叶、温度敏感型雌性不育）与N品系（基因型为bb，正常叶、可育）杂交，获得F₁代（Bb，锯齿叶、雌性不育）。F₁与N品系回交，在田间早期选择锯齿叶性状个体与连续多代与N品系回交，获得与N品系相似的雌性不育系，在20±2℃稳定低温或32±2℃稳定高温条件下，使Bb植株恢复育性，通过自交大量繁殖该纯合雌性不育植株。与CMS在23-29℃低温条件下杂交，获得大量目标杂交种。 2．（25-26高三上·北京顺义·期中）蔬菜甘蓝具有杂种优势现象，花为两性花，开花后一株可结5000多粒种子。育种专家对甘蓝雄性不育性状进行研究。 (1)从甘蓝纯种优良品系1中获得一株雄性不育突变株（甲），雄性不育性状与雄性可育性状称之为_____；将甲与品系1杂交，子代中可育株约占1/2，推测甲的_____性状为显性。后续研究证实了该推测，将可育基因与雄性不育基因分别记为A和A′。利用雄性不育株获得杂种避免了杂交过程中的_____和套袋等繁琐操作。 (2)通过甲获得两株基因型为A'A'的甘蓝（乙），利用品系1、乙及另一优良可育品系2，生产出兼具品系1和2优良性状的杂交种子（YF1），用于大田种植。请补充答题卡上的图解，用以表示经两代杂交生产大量YF1的过程_____。 (3)与A相比，A'启动子缺失1个碱基对。编辑A基因，获得编码区突变的隐性基因a，三者结构如图1所示。检测发现，突变株aa（丙）、兼具A′和a基因突变位点的纯合突变株（丁）均表现为雄性不育。 ①为检测突变启动子的活性，将A和A'基因启动子与报告基因连接后导入烟草细胞。图2结果说明突变后的启动子转录活性提高，依据是_____。 ②研究发现，A蛋白可抑制A和A'基因的转录，调控相关蛋白含量。为此，研究人员检测不同株系甘蓝育性基因（A及其等位基因）相对转录量请在图3中补充丁组实验结果_____。 (4)绝大多数植物都有A基因，利用其特点推广到其他作物育种时发现，若将（2）中产生的YF1用于某些自花传粉为主的作物时会造成严重减产，请分析原因_____。 【答案】(1)相对性状 雄性不育 去除雄蕊 (2) (3)A'组报告基因表达量高于A组 (4)YF1中有1/2是雄性不育杂合子，若自花传粉作物收获的是果实或种子，不育株自然 状态下无法授粉结实，严重减产 【分析】雄性不育系花粉败育，在杂交中只能作为母本，省去了人工去雄的麻烦；杂交育种是通过杂交的方法使不同品系的优良性状集中在一起。 【详解】（1）雄性不育性状与雄性可育性状是同一性状的不同表现，称之为相对性状。品系1是可育的纯种，与甲雄性不育株进行杂交，后代中可育株占1/2，说明甲是显性杂合子，即雄性不育性状为显性性状。雄性不育株在杂交中只能作母本，可以省去去除雄蕊、套袋等操作。 （2）甲的基因型为A′A，品系1和2的基因型为AA，乙的基因型为A'A'，设品系1其他优良性状的基因为BB，品系2其他优良性状的基因为CC，乙与品系1杂交，F1的基因型为A′AB-，再将F1与品系2杂交，可以获得兼具品系1和2优良性状的杂交种子（YF1）A′AB-C-，。 （3）①启动子的作用是启动转录过程。若突变后的启动子转录活性提高，那么与报告基因连接后，在相同的条件下，报告基因的转录量应该更高。观察图2，A'组报告基因相对表达量明显高于A组 ，所以可以说明突变后的启动子转录活性提高。 ②已知A蛋白可抑制A和A'基因的转录，突变株aa（丙）表现为雄性不育，兼具A'和a基因突变位点的纯合突变株（丁）也表现为雄性不育。因为丁兼具A'和a的突变位点，A'启动子转录活性提高，且a为隐性突变，在纯合状态下发挥作用，同时又没有A蛋白的抑制（因为A基因突变了），所以丁组中基因相对转录量应该高于丙组。参考丙组的转录量位置，丁组应在丙组之上。 如图所示：。 （4）由于YF1中有1/2是雄性不育杂合子，若自花传粉作物收获的是果实或种子，不育株自然状态下无法授粉结实，严重减产。 1．玉米为二倍体，是我国的主要农作物。糯玉米口感好，广受喜爱。为加快育种进程，我国科研人员利用吉诱101玉米品系对糯玉米品系进行诱导，过程如下图。 回答问题： (1)糯玉米和吉诱101玉米的体细胞中有____个染色体组。 (2)单倍体糯玉米体细胞中____（填“有”或“无”）同源染色体，减数分裂过程中染色体无法____，因此高度不育。 (3)用秋水仙素处理单倍体幼苗后，产生二倍体糯玉米，这种变异属于____。理论上，加倍后得到的二倍体糯玉米为纯合子。采用上述方法可____，提高育种效率。 (4)科研人员对单倍体进行了不同处理，种植后统计散粉植株数并计算散粉率（散粉代表可育），结果如下表。 组别 处理方法 平均散粉率（%） 1 0.6mg/mL秋水仙素 浸芽 10.66 2 浸根 6.20 3 浸种 4.34 4 不做处理 1.05 注：溶解秋水仙素的溶剂对植株散粉无显著影响 据表可知，第1组单倍体糯玉米的染色体加倍效果最佳。第4组在本实验中作为____组。 【答案】(1)2 /两     (2)无 正常联会 (3)染色体数目变异 明显缩短育种年限 (4)对照 【分析】二倍体中含有2个染色体组，由二倍体产生的配子中只有一个染色体组，该配子中无同源染色体。用秋水仙素处理，可使染色体加倍，其变异方式为染色体数目变异。 【详解】（1）玉米为二倍体，体细胞含有2个染色体组，糯玉米和吉诱101为玉米的两个品种，其体细胞中含有2个染色体组。 （2）单倍体玉米体细胞中只有一个染色体组，无同源染色体，减数分裂过程中染色体不能正常联会，导致其高度不育。 （3）用秋水仙素处理，使染色体加倍，该变异方式为染色体数目变异，理论上，加倍得到的两个染色体组完全相同，所以加倍后得到的二倍体糯玉米为纯合子。上述育种为单倍体育种，能明显缩短育种年限，提高育种效率。 （4）据表可知，第1组中散粉率最高，说明其可育性最高，则其单倍体糯玉米的染色体加倍效果最佳。第4组不做处理，则在实验中作为对照组。 2．小麦作为雌雄同花、自花传粉的作物，培育出雄性不育株，是实现杂交育种的关键。目前已探索获得不同的杂交小麦生产体系。请回答下列问题。 (1)XYZ杂交小麦生产体系中，雄性不育突变基因（m）位于小麦5号染色体上，雄性育性基因（M）和标记基因（H）位于黑麦5R号染色体上。X系和Y系分别导入了2条和1条黑麦5R染色体，如下图所示。标记基因H在开花时会表现为穗下节多毛性状，可用以区分X系、Y系和乙系。 ①在野生小麦的染色体中___（填“有”或“无”）5R的同源染色体，在X系中M与m的遗传遵循___定律。 ②利用Z系进行水稻育种的优点是___。X系与Z系杂交可获得___系，Y系与Z系杂交可获得___系。 (2)通过转基因技术将雄性育性基因M与雄配子致死基因P、蓝色素生成基因R一起导入基因型为mm的Z系个体（雄性不育）中，并使其插入到一条不含m基因的染色体上如下图所示。基因R的表达可使种子呈现蓝色，无基因R的种子呈现白色。 ①转基因个体（PRMmm）自交后得F1，F1个体之间随机授粉，得到的种子中雄性不育种子所占比例为___。 ②将转基因个体（PRMmm）自交并收获水稻种子，请写出快速辨别雄性不育种子和转基因雄性可育种子的方法：___。 ③若某转基因个体（PRMmm）中的基因R由于发生突变而不能表达，又该如何快速挑选出雄性不育种子？请以该突变转基因个体和Z系个体为材料，设计一个可快速挑选出雄性不育种子的实验方案（写出杂交组合并说明挑选方法）：___。 【答案】(1)无 自由组合 无需去雄，操作简便 Y Y、Z (2)3/4 （观察种子颜色）蓝色为转基因雄性可育，白色为雄性不育 杂交组合：突变转基因植株×Z系植株（雄性不育） 挑选方法：雄性不育植株上所结的种子即为雄性不育种子 【分析】根据题干信息分析，水稻的育性由一对等位基因M、m控制，基因型为MM和Mm的个体可产生正常的雌、雄配子，而基因型为mm的个体雄性不育，只能产生正常的雌配子。 【详解】（1）①由题意可知，雄性育性基因（M）和标记基因（H）位于黑麦5R号染色体上，因此在野生小麦的染色体中　　　无5R的同源染色体，在X系中M与m位于来自不同品种的非同源染色体上，其遗传遵循自由组合定律。 ②Z系不含M基因，为雄性不育系，只能做母本，因此杂交时无需去雄，操作简便。X减数分裂产生配子时，同源染色体彼此分离，因此可形成MmH的配子，Z系形成的配子为m，因此X系与Z系杂交可获得MmmH，即获得Y系。Y系减数分裂产生两种配子，即MmH、m，Z系产生的配子为m，因此Y系与Z系杂交可获得Y系MmmH和Z系mm。 （2）①由图可知，转基因PRMmm个体产生的雄配子为m、PRMm（含P的雄配子死亡）。雌配子为m、PRMm，二者比例为1∶1，则转基因个体自交，F1的基因型及比例为mm∶PRMmm＝1∶1，其中PRMmm为雄性可育，mm为雄性不育；F1中PRMmm和mm个体都能产生雌配子，且雌配子的种类及比例为m∶PRMm＝（1/2×1/2+1/2）∶（1/2×1/2）=3∶1，F1中只有PRMmm个体能产生雄配子，其配子只有m（含P的雄配子死亡），故F1个体之间随机授粉，得到的种子中的基因型及比例为mm∶PRMmm＝3∶1，其中mm为雄性不育，所占比例为3/4。 ②转基因个体（PRMmm）可产生两种雌配子，即m∶PRMm＝1∶1，由于含有P的雄配子致死，因此该转基因个体只能产生一种雄配子m，故自交后代收获的水稻种子基因型为mm∶PRMmm＝1∶1，由于基因R的表达可使种子呈现蓝色，即PRMm转基因雄性可育种子呈现蓝色，无基因R的种子呈现白色，即mm雄性不育种子呈现白色，所以快速辨别雄性不育种子和转基因雄性可育种子的方法是（观察种子颜色），蓝色为转基因雄性可育，白色为雄性不育。 ③某转基因个体（PRMmm）中的基因R由于发生突变而不能表达，则不能通过颜色进行筛选，为了快速挑选出雄性不育种子，需要的杂交组合是：转基因植株（PRMmm）（父本）×雄性不育植株（mm）即Z品系（母本），转基因植株（PRMmm）（父本）产生的雄配子只有m（含P的雄配子死亡），雄性不育植株（mm）（母本）只产生配子m，故种子的基因型为mm，表现为雄性不育，因此挑选出雄性不育植株上所结的种子即为雄性不育种子。 1．（2026·北京丰台·一模）水稻His基因控制合成的酶参与除草剂的代谢解毒过程。科研人员利用基因编辑工具Cre-LoxP系统和CRISPR/Cas9系统提高His基因表达水平。 (1)Cre-LoxP系统包含三种载体，载体1、载体2携带Lox序列，载体3携带Cre酶基因。 三种载体通过________法导入水稻细胞后，载体1、2的Lox序列会分别插入目的基因左侧、右侧，载体3表达的Cre酶可特异性识别Lox序列，催化如图1所示的剪切过程，实现一对lox序列间的基因敲除。 (2)His基因所在的染色体部分片段如图2，其附近的RPL基因带有强启动子。RPL基因表达水平变化不会对水稻植株的生命活动造成影响。 科研人员优化了Cre-LoxP系统，使其能引起315kb片段位置颠倒，导致________，提高His基因的表达。请根据图3中Cre酶切割位点，在下表中选出可行的Lox序列组合________，使该系统在Cre酶切割及细胞内DNA连接酶修复后，能实现上述实验目的。 组合 左侧Lox 5'——3' 右侧Lox 5'——3' 一 AGCATA TATGCT 二 AGCATA AGCATA 三 TATGCT TATGCT 四 TATGCT AGCATA (3)科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术去除Cre-LoxP操作后残留的Lox序列（“痕迹”）。为了检验CRISPR/Cas9去除痕迹的情况，建立荧光报告系统：将载体A、载体B和CRISPR/Cas9共同导入水稻原生质体中。若Lox序列被去除，则原生质体可检测到绿色荧光。 无绿色荧光 无绿色荧光 注：GFP-1、GFP-2和GFP-3片段可以通过同源重组的方式拼接成完整的GFP（绿色荧光蛋白基因） 有绿色荧光 请根据表中信息解释此系统的检验原理：________。 (4)通过上述技术的优化，科研人员成功制备出抗除草剂的水稻。请分析此工程的优势。 【答案】(1)农杆菌转化 (2)RPL基因的强启动子与His基因的弱启动子交换 一、四 (3)若成功删除Lox序列，则载体A与载体B发生同源重组，GFP基因能拼接 完整并表达，可检测到绿色荧光:若未成功删除，GFP基因无法拼接完整，检测 不到绿色荧光。 (4)能提高His基因表达水平:同时，因强启动子来自水稻自身基因且去除残 留Lox，避免引入外源基因的干扰，提高了产品安全性。 【详解】（1）植物基因工程常用的导入法是农杆菌转化法，因此三种载体通过农杆菌转化法导入水稻细胞。 （2）RPL基因带有强启动子，启动子是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录。原本His基因远离强启动子，表达水平低。315kb片段颠倒后，His基因所带的弱启动子与RPL强启动子互换，His基因受RPL强启动子驱动，转录大幅增强，His基因的表达提高。 Cre酶切割后要实现片段颠倒，必须两侧 Lox 方向相反；若两侧 Lox同向 → Cre 酶切割后会删除片段；若两侧 Lox反向 → Cre 酶切割后片段会颠倒（倒位），因此必须让左侧 Lox 与右侧 Lox方向相反。结合图 3 中 Cre 酶切割位点的方向与基因排列（RPL 强启动子位置），组合一和组合四在切割重接后，能让His基因正好被颠倒到强启动子下游，实现表达增强，因此选组合一和四。 （3）根据图示，若成功删除Lox序列，则载体A与载体B发生同源重组，形成完整绿色荧光蛋白基因，GFP基因能拼接完整并表达，可检测到绿色荧光；若未成功删除，GFP-1与GFP-2被隔开，GFP基因无法拼接完整，检测 不到绿色荧光。 （4）根据题意，能提高His基因表达水平；同时，因强启动子来自水稻自身基因且去除残留Lox，避免引入外源基因的干扰，提高了产品安全性。 2．（25-26高二下·北京丰台·期中）学习以下材料，回答下列小题。 基因魔剪：CRISPR/Cas系统 CRISPR/Cas基因编辑系统可对真核细胞的基因组进行特异编辑。CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断（通过设计gRNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割）。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因插入指定位点（图1）。 科学家通过在Cas9基因中引入突变，获得了只切割DNA一条链的nCas9，并将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，开发出了单碱基编辑技术（图2），能够对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C→T（G→A）或A→G（T→C）的碱基替换。对CRISPR/Cas系统改造后，还可用于激活或者抑制基因的转录等。 目前CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，gRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。 尽管如此，CRISPR/Cas系统作为一种革命性的技术，其成本低、制作简便、快捷高效等优点让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。 (1)利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，其中Cas9蛋白与限制酶的功能相似，可使________键断裂。gRNA依据________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割。 (2)有些遗传病是由于基因中一个碱基对改变引起的，若要修正此基因突变，文中图示的3种途径中，________（填“①”“②”或“③”）最为合适。 (3)研究者通过一些技术让Cas9基因发生突变，使Cas9蛋白失去切割活性，可将CRISPR/Cas9用于抑制基因转录，实施的过程为：在gRNA的引导下，Cas9蛋白与靶基因的________结合，使________酶失去结合位点从而抑制靶基因的转录。 (4)请结合文章，提出降低CRISPR/Cas9系统脱靶效应的思路________。 【答案】(1)磷酸二酯 碱基互补配对 (2)③ (3)启动子 RNA聚合酶 (4)设计gRNA的长度为17个碱基，避免第18~20个碱基不匹配时，导致错误位点的切割（或设计出特异性较强的gRNA，增强gRNA的特异性；通过设计Cas9，让其手指状结构远离DNA序列，从而在gRNA与DNA错配时，不会稳定错配结构，避免在错误位点切割等） 【详解】（1）如图1所示，Cas9蛋白类似于限制酶的作用，切割DNA断开磷酸二酯键。gRNA是一段RNA序列，和DNA序列的结合是依据碱基互补配对原则进行的。 （2）图中第①条途径将基因剪切后，可能造成突变，第②条途径是剪切后插入了新的基因，第③条途径是实现碱基对的替换，所以如果要修复由基因中一个碱基对的改变而引起的遗传病，需要替换该基因，第③种途径更合适。 （3）CRISPR/Cas9技术利用的是gRNA与DNA互补，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。所以可以通过一些技术让Cas9蛋白的基因发生突变，使其失去切割活性，并在gRNA的引导下与基因启动子结合，从而使RNA聚合酶失去结合位点，抑制靶基因的转录。 （4） 通过题干可知，正常情况下，gRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况，因此在设计gRNA时，gRNA的长度为17个碱基，避免第18~20个碱基不匹配时，导致错误位点的切割。 3．（24-25高二下·北京丰台·期中）科研人员开发出了能编辑叶绿体基因组的基因编辑系统CyDENT。 (1)这套系统的核心是FokI-TALE融合蛋白，FokI是一种低特异性的内切核酸酶，TALE是一种能识别特异性序列的DNA结合蛋白，形成的基因编辑复合物如图1。使用CyDENT系统进行基因编辑属于________水平的研究。研究团队在CyDENT系统中设计的TALE-FokI蛋白在功能上类似于常用基因工程工具中的________。 (2)研究团队利用叶绿体定位序列（CTP）构建了如图2所示的基因表达载体，请结合图3阐述CyDENT系统编辑叶绿体基因组的机制：________。 (3)研究团队决定进一步挖掘CyDENT编辑系统的潜力，根据不同的编辑需求选择不同载体模块组合成系统：例如换用不同类型的启动子。假设需要仅在人类大肠组织中编辑名为BST114的细胞核基因，请参照图2，选择合适的模块设计CyDENT系统的表达载体： ①________ ②________  ③________终止子 (4)CyTENT系统编辑核基因的效率尚不如成熟的CRISPR基因编辑系统。请提出CyDENT编辑技术在人类健康领域内的应用方向：________。 【答案】(1)分子 限制性内切核酸酶（限制酶） (2)核糖体合成的TALE-FokI蛋白带有CTP，CTP可以引导蛋白质向叶绿体内进行转运，将TALE-FokI蛋白带入到叶绿体中完成基因编辑 (3)大肠特异性启动子 核定位序列 BST114序列特异性TALE—FokI融合基因 (4)可用于线粒体疾病的基因治疗 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定。 【详解】（1）使用CyDENT系统进行基因编辑属于分子水平的研究。FokI是一种低特异性的内切核酸酶，TALE是一种能识别特异性序列的DNA结合蛋白，CyDENT系统中设计的TALE-FokI蛋白在功能上类似于常用基因工程工具中的限制性内切核酸酶。 （2）CyDENT系统编辑叶绿体基因组的机制：核糖体合成的TALE-FokI蛋白带有CTP，CTP可以引导蛋白质向叶绿体内进行转运，将TALE-FokI蛋白带入到叶绿体中完成基因编辑。 （3）基因表达载体应具备：限制酶酶切位点，启动子，终止子，复制原点，标记基因等。假设需要仅在人类大肠组织中编辑名为BST114的细胞核基因，设计CyDENT系统的表达载体：大肠特异性启动子、核定位序列、BST114序列特异性TALE—FokI融合基因和终止子。 （4）科研人员开发出了能编辑叶绿体基因组的基因编辑系统CyDENT，CyDENT编辑技术在人类健康领域内的应用方向：可用于线粒体疾病的基因治疗。 4．（23-24高三上·北京大兴·期末）影响小鼠内耳形态的基因A突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试进行基因治疗。 (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统由sgRNA及Cas9蛋白组成。图1所示，sgRNA与目标DNA结合，引导Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致________键断裂。 (2)同源重组是指在DNA断裂的情况下，含有同源区段的DNA之间发生的重组。科研人员尝试利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗。                              ①利用________技术扩增野生型小鼠的基因A，再用图2中的限制酶________切割基因A与腺病毒载体形成黏性末端，最后利用________酶进行拼接，构建腺病毒表达载体。科研人员尝试利用该载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳。   ②在上述基础上，科研人员又将sgRNA基因、Cas9基因接入了腺病毒表达载体（见图3），同时引入sgRNA的识别序列，目的是________。图3所示的腺病毒表达载体还需要哪些必要的结构或基因_____（多选）。 A．启动子和终止子 B．RNA聚合酶基因 C．标记基因 D．起始密码子和终止密码子             E．反密码子             F．复制原点 (3)将腺病毒表达载体注入耳聋小鼠的单侧耳组织细胞。为评估该治疗方案的效果，研究人员使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除________对实验结果的影响。 (4)进一步研究结果表明该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。人体内基因A突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注________。 【答案】(1)磷酸二酯键 (2)PCR SpeI和Sal DNA连接酶 通过CRISPR/Cas9基因编辑系统切割腺病毒表达载体DNA和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA发生断裂，启动同源重组 ACF (3)小鼠的个体差异 (4)该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑 【分析】1、实现基因工程的操作至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的 “分子手术刀”——限制酶、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”——DNA连接酶和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”——载体。 2、基因工程技术的基本步骤： 目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）DNA分子的单体间通过磷酸二酯键相连接，Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致靶序列磷酸二酯键断裂。 （2）①PCR为体外扩增DNA分子的一项技术，若要扩增野生型小鼠的基因A，则要用到PCR技术。如图2所示，若要利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗，则构建的基因表达载体中应包含同源区a、b，所用的限制酶要能同时把基因A中的同源区a、b切割下来。因此，所用的限制酶是SpeI和Sal，即能把基因A中的同源区a、b切割下来，也在腺病毒载体上有相应切口。利用限制酶所获取的目的片段和腺病毒载体片段，还要用DNA连接酶进行连接，形成重组的基因表达载体。 ②利用图2所示的载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳，有可能是未启动重组。将sgRNA基因、Cas9基因接入了腺病毒表达载体，同时引入sgRNA的识别序列，目的是通过CRISPR/Cas9基因编辑系统切割腺病毒表达载体DNA和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA发生断裂，启动同源重组。一个能正常表达的重组基因表达载体应包含有目的基因、标记基因、启动子和终止子、复制原点，因此图3所示的腺病毒表达载体还需要标记基因、启动子和终止子、复制原点，故选ACF。 （3）实验过程要遵循单一变量原则，研究人员使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除小鼠的个体差异对实验结果的影响。 （4）欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑。 5．（2026·北京顺义·一模）小胶质细胞与脑发育和神经退行性疾病有重要关联，科研人员对小胶质细胞的起源和功能转化机制展开研究。 (1)新生小鼠大脑白质中存在的小胶质细胞(P细胞)通过高表达C基因实现吞噬功能，维持神经系统稳态。为证明P细胞与其他脑区的小胶质细胞均来源于早期胚胎的Y细胞，科研人员利用基因工程改造小鼠并进行杂交，其体细胞内相关基因及调控元件如下图。 注：①R基因在Y细胞中特异性高表达 ②I序列：使相邻基因表达的蛋白不融合 ③Cre-Er：Cre酶进入细胞核后切除X之间的DNA序列；Er蛋白位于细胞质中 ④Stop：阻止下游基因转录 药物T可诱导Er入核，据图可知，药物T可使子代小鼠的小胶质细胞表达红色荧光蛋白。应在______(胚胎发育早期/胚胎发育晚期)施加药物T，标记小鼠脑区的小胶质细胞。出生后7天，用绿色荧光蛋白标记的C蛋白抗体处理小鼠脑区，支持P细胞起源于Y细胞的检测结果是________。 (2)通过设计只让P细胞表达红色荧光蛋白，小鼠出生后30天，用绿色荧光蛋白标记的C蛋白抗体处理小鼠脑区并检测，结果显示红色荧光分布于各脑区，但未检测到绿色荧光，说明P细胞_______，称为稳态小胶质细胞(eP细胞)。 (3)组蛋白乙酰化使染色质结构变得松散，为相关蛋白与基因调控序列结合并调控基因的转录提供空间。衰老或患神经退行性疾病时，eP细胞恢复至出生后7天的状态。推测P细胞功能状态的转变与组蛋白乙酰化和基因差异化表达有关。支持的证据有_______(多选) A．小鼠出生7-30天内P细胞的C基因转录量和组蛋白乙酰化水平逐渐降低 B．小鼠出生30天后eP细胞所有基因的组蛋白乙酰化水平均升高 C．衰老小鼠eP细胞C基因转录量和组蛋白乙酰化水平与P细胞相似 D．与正常鼠相比，阿尔茨海默病模型鼠eP细胞C基因转录量和组蛋白乙酰化水平高 (4)A蛋白能特异性结合C基因的调控序列。为验证A蛋白参与调控C基因的转录，在出生后30天的脑组织中分离eP细胞，特异性敲除A基因，检测敲除后eP细胞的吞噬能力。请评价实验设计并完善_________________________。 【答案】(1)胚胎发育早期 大脑白质的细胞红、绿荧光重合，其他脑区的小胶质细胞显红色标记 (2)不再表达C基因，失去吞噬功能，部分转移到各脑区 (3)ACD (4)选材不合理，应选取出生后7天的小胶质细胞开展实验；缺乏对照，应补充未敲除A基因组，检测C基因表达量和吞噬能力；检测指标不完整，应补充检测C基因的转录量 【分析】表观遗传学则研究不涉及 DNA 序列改变的基因表达变化，主要通过 DNA 甲基化、组蛋白修饰等机制实现。这些表观遗传修饰可以稳定地遗传给后代，影响基因的表达和功能，从而导致生物体的表型变化。 【详解】（1）小鼠脑区小胶质细胞来源于胚胎发育早期的Y细胞，即由Y细胞分化而来，所以要标记小鼠脑区的小胶质细胞，所以应在胚胎发育早期对Y细胞施加药物T，使子代小鼠的小胶质细胞表达红色荧光蛋白，从而得到被标记的小胶质细胞。所有小胶质细胞（包括P细胞）均表达红色荧光，表明来源于Y细胞；出生后7天，用绿色荧光蛋白标记的C蛋白抗体处理小鼠脑区，由于P细胞高度表达C基因，P细胞含有大量C蛋白， P细胞同时被绿色荧光标记，所以支持P细胞起源于Y细胞的检测结果是大脑白质的细胞红、绿荧光重合，其他脑区的小胶质细胞显红色标记。 （2）出生30天时，P细胞已迁移至各脑区并表达红色荧光，但未法检测到绿色荧光，说明P细胞不再高表达C基因； 功能上从“稳态前体”（P细胞）转变为“稳态”（eP细胞），失去吞噬功能，部分转移到各脑区。 （3）A、出生7–30天内，P细胞逐渐转变为eP细胞，吞噬功能消失，C基因转录量降低，而组蛋白乙酰化促进转录，因此组蛋白乙酰化水平也逐渐降低，支持功能转变与表观遗传调控相关，A正确； B、“所有基因组蛋白乙酰化水平均升高”不符合“基因差异化表达”的题干前提，只有相关功能基因的乙酰化水平变化，并非全部，B错误； C、衰老小鼠eP细胞中C基因转录量和组蛋白乙酰化水平与P细胞相似 ，可以表明衰老时eP细胞“去分化”回P细胞状态，C正确； D、阿尔茨海默病模型鼠eP细胞中C基因转录量和组蛋白乙酰化水平升高，表明疾病状态下eP细胞也恢复P细胞特征，D正确。 故选ACD。 （4）选材不合理，应选取出生后7天的小胶质细胞开展实验；缺乏对照，应补充未敲除A基因组，检测C基因表达量和吞噬能力；检测指标不完整，应补充检测C基因的转录量。 6．（23-24高三上·北京朝阳·期中）水稻雄性不育系在育种中具有重要的应用价值。研究者试图寻找更多的雄性不育基因。 (1)研究者获得一株雄性不育突变株 S221，与纯合可育植株杂交，后代表型及分离比为不育株：可育株=1∶1，表明S221不育性为_________性状且受核内_________对等位基因控制。 (2)对S221的不育基因进行精细定位，发现不育单株8号染色体的S基因上游插入一段DNA片段（简称M 片段）。 ①研究者利用_________技术扩增得到M片段和S基因，M片段、S基因分别用限制酶_________处理，在_________的作用下形成融合片段，构建表达载体（如图1），最终获得转基因株系1．相同方法获得只插入S基因的转基因株系2． ②观察并比较水稻花穗、花药和花粉粒的发育情况，发现与野生型植株相比，株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒，株系2无明显差异。本实验的目的是_________ 。 (3)为了研究 M片段的功能，研究者将一系列片段分别与Luc基因融合构建表达载体导入水稻原生质体，检测 Luc基因的表达水平，操作及结果见图2． 图 2结果表明_________。 (4)进一步研究发现，不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控。结合本研究，推测突变株S221雄性不育的机理。_________ 【答案】(1)显性 1 (2)PCR BamHI、Bgl II DNA 连接酶 水稻雄性不育是否由 M 片段插入S基因上游导致 (3)M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进 Luc基因表达 (4)在雄性不育突变株中，M片段插入到S基因的上游，启动并增强S基因表达，从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调，凋亡细胞数量增加，花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒，进而导致雄性不育 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 (4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）雄性不育突变株 S221，与纯合可育植株杂交，后代表型及分离比为不育株：可育株=1∶1，表明S221不育性为显性性状且受核内1对等位基因控制。 （2）①研究者利用PCR技术扩增得到M片段和S基因，据图1分析，M片段、S基因分别用BamHI、Bgl II限制酶处理，在DNA 连接酶的作用下形成融合片段，构建表达载体。 ②野生型植株相比，株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒，株系2无明显差异，可判断本实验的目的是水稻雄性不育是否由 M 片段插入S基因上游导致。 （3）据图2分析，第3组Luc基因表达水平最高，说明M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进 Luc基因表达。 （4）由于不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控，推测突变株S221雄性不育的机理为：在雄性不育突变株中，M片段插入到S基因的上游，启动并增强S基因表达，从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调，凋亡细胞数量增加，花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒，进而导致雄性不育。 7．（22-23高三上·北京丰台·期末）“中国小麦远缘杂交之父”李振声院士及其团队首创全新育种方法，为小麦染色体工程育种开辟了新途径。 (1)单体小麦和缺体小麦是小麦育种和遗传分析的基础材料。单体比正常个体少一条染色体，缺体比正常个体少一对同源染色体。普通小麦含有42条染色体，也可被视为二倍体（用2N=42W表示），在培育过程中可发生______________，从而出现单体和缺体。若不考虑同源染色体之间的差异，普通小麦共有____________种缺体。 (2)研究团队利用带有蓝粒性状标记的单体小麦（图1），选育出能稳定遗传的可育缺体小麦。 蓝粒单体小麦（E代表携带蓝粒基因的染色体）自交以后，产生三种染色体组成的后代，即：40W+E、_________。由于蓝粒性状具剂量效应，会出现三种表现型，即白粒、蓝粒和深蓝粒，其中________粒小麦为缺体小麦。自交后，筛选得到了育性高的株系4D缺体（缺少4号染色体）。 (3)二倍体黑麦（2N=14R）是小麦的近缘物种，耐旱耐寒和抗病能力都很强。为引入黑麦优良性状培育异种染色体代换的小麦新品种，研究人员进行了杂交实验，如图2。 以4D缺体小麦为母本，经过人工__________后授以黑麦花粉，所得F1代体细胞含有_______条染色体。由于F1雌雄都不育，用图中①__________处理F1幼苗使其染色体加倍。经过细胞学观察，选择_______条染色体的F1植株进行回交。在F2代中选择小于47条染色体的植株继续回交，所得F3植株染色体数以40条、41条、42条居多。其中可选择_______条染色体的个体进行自交，即可得到染色体数恢复的小黑麦异种染色体代换系小麦，经筛选鉴定后可用于生产。该方法可大大缩短育种年限，有计划引入异源染色体。 (4)育种专家在小麦培育过程中偶然发现一株隐性纯合突变体，为判断此隐性突变基因的位置（在几号染色体上），利用正常小麦植株和各种单体小麦植株，结合上述方法，提出你的实验思路___________。 【答案】(1)染色体变异 21 (2)40W、40W+2E 白 (3)去雄 27 秋水仙素 54 41 (4)利用各种单体小麦作为母本分别与该隐性突变个体杂交，若某种单体的子代中出现隐性突变类型，则此基因在相应的染色体上 【分析】染色体数目的变异可以分为两类：一类是细胞内个别染色体的增加或减少，另一类是细胞内染色体数目以一套完整的非同源染色体为基数成倍地增加或成套地减少。单体是比正常个体少一条染色体，缺体比正常个体少一对同源染色体，单倍体是体细胞和本物种配子中染色体组一样多，三体是多一条染色体，三倍体是多一个染色体组。 【详解】（1）单体比正常个体少一条染色体，缺体比正常个体少一对同源染色体，都属于染色体数目变异，故在培育过程中可发生染色体变异导致单体和缺体的出现。缺体比正常个体少一对同源染色体，普通小麦含有42条染色体，即有21对同源染色体，共有21种缺体。 （2）蓝粒单体小麦缺少一条染色体，染色体组成可表示为40W+E，由于E染色体不能配对，只考虑该染色体，可产生E和0型（不含E）两种配子，故后代包括40W+E、40W+EE，40W三种后代。缺体小麦缺少一对染色体，40W的小麦为缺体，表现为白色。 （3）杂交实验中应对母本进行人工去雄后授以父本花粉；4D缺体小麦含有40条染色体，黑麦含有14条染色体，F1含有27条染色体。秋水仙素可以抑制纺锤体的形成，达到染色体加倍的目的。用秋水仙素加倍处理后，原来27条染色体的F1正常应加倍成含54条染色体的植株，选择含54条染色体的植株与4D缺体进行回交。加倍后含有54条染色体的植株减数分裂形成的配子有27条染色体，其中20条来自普通小麦，7条来自黑麦，4D缺体配子有20条染色体，在F2代中选择小于47条染色体的植株继续回交，所得F3植株染色体数以40条、41条、42条居多，40和42的染色体成对存在，41条染色体的个体中不成对的染色体来自黑麦，自交后可得到染色体数恢复的小黑麦异种染色体代换系小麦，经筛选鉴定后可用于生产。该方法可大大缩短育种年限，有计划地引入异源染色体。 （4）小麦培育过程中偶然发现一株隐性纯合突变体，为判断此隐性突变基因位置可利用各种单体小麦作为母本分别与该隐性突变个体杂交，若某种单体的子代中出现隐性突变类型，则此基因在相应染色体上。 8．（2026·北京昌平·一模）棉花是我国重要的经济作物，其种皮表面的棉花纤维分为长绒和短绒，长绒具经济价值，短绒无纺织价值且增加种子处理成本。依据种皮表面是否具有短绒可将棉花种子分为毛籽和光籽。科研人员以亚洲棉为材料，探究光籽性状的遗传规律和分子机制。 (1)下表为不同品种亚洲棉的杂交实验及结果 组别 P父本  ×  母本 F2光籽:毛籽 1 GA0149（光籽）  ×  GA0146（毛籽） 918:318 2 常紫1号（光籽）  ×  石系亚1号（毛籽） 64:176 3 江苏红茎鸡脚（光籽）  ×  石系亚1号（毛籽） 136:100 ①推测第1组与第2组F2分离比不同的原因是_________。 ②第3组F2分离比符合9:7，表型为光籽的基因型需满足_________。 (2)为揭示GA0149品种光籽的分子成因，科研人员以GA0149和GA0146为材料开展研究。统计两种材料的叶茸毛数目，发现GA0149的叶茸毛数量明显少于野生型GA0146，由此可推测_____________，为后续基因筛选提供了表型关联依据。 (3)科研人员筛选出与光籽性状相关的8个候选基因，与GA0146相比仅GaFZ基因在GA0149中出现特异高表达。检测GA0149和GA0146的短绒发育关键期及花、叶和根等组织中的GaFZ基因表达量。结果显示，_________，表明GaFZ基因是控制光籽性状的关键基因，同时验证了（2）的推测。 (4)科研人员扩大研究样本，进一步验证了GaFZ基因的表达调控元件（larINDELFZ）和GaFZ基因表达与光籽表型的关系，结果如下图。请构建GA0149光籽表型产生的分子机制：_________。 (5)已知棉花长绒的发育依赖于经典的MBW-GL2通路，研究发现GaFZ基因独立于该通路，这一研究成果在育种中的价值是 _______。 【答案】(1)不同品种中控制光籽的基因可能不完全相同 两对等位基因的显性基因同时存在 (2)控制短绒发育的基因可能同时调控叶茸毛发育 (3)在短绒发育关键期和叶组织中，GA0149的GaFZ基因表达量显著高于GA0146，在其他器官中的表达量无明显差异 (4)larINDELFZGaFZ基因表达→抑制短绒发育→光籽表型 (5)可通过调控GaFZ基因的表达培育“光籽但长绒高产”的棉花品种，降低种子脱绒成本 【详解】（1）①第1组F₂光籽:毛籽≈3:1，说明光籽/毛籽由1对等位基因控制，光籽为显性性状； 第2组F₂光籽:毛籽≈1:3，说明光籽/毛籽由2对等位基因控制，且只有双隐性个体表现为光籽（或显性纯合/双显性为毛籽），即符合9:3:3:1的变式（1:3=3:9）。 因此原因是：不同品种中控制光籽的基因可能不完全相同。 ②9:7是9:3:3:1的变式，说明由2对等位基因（设为A/a、B/b）控制，只有同时含有2个显性基因（即双显性A_B_）时表现为光籽。 （2）GA0149为光籽、GA0146为毛籽，且GA0149叶茸毛数量明显少于GA0146，说明控制短绒发育的基因可能同时调控叶茸毛发育。 （3）要证明GaFZ是控制光籽的关键基因，需满足：在短绒发育关键期和叶组织中，GA0149的GaFZ基因表达量显著高于GA0146，在其他器官中的表达量无明显差异。 （4）结合表达调控元件（larINDELFZ）和GaFZ基因表达与光籽表型的关系，机制为：GA0149中存在larINDELFZ调控元件，该元件增强了GaFZ基因的表达，GaFZ高表达抑制了短绒的发育，最终表现为光籽性状。 （5）已知棉花长绒的发育依赖于经典的MBW-GL2通路，研究发现GaFZ基因独立于该通路，这一研究成果在育种中的价值是可通过调控GaFZ基因的表达培育“光籽但长绒高产”的棉花品种，降低种子脱绒成本。 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 抢热点 基因编辑与现代生物技术应用 基因编辑与现代生物技术应用，是当下生物科技领域极具前沿性、精准性，可依托基因定点修饰实现生物性状定向改良的技术体系与应用过程。传统生物技术育种多依靠自然变异、杂交选育，周期漫长且变异方向不可控，只能被动筛选优良性状，而融合了基因编辑的现代生物技术，能够直接对动植物基因组目标位点进行精准修饰，实现定向、高效、可控的种质创新。 基因编辑依托人工改造的核酸酶“分子剪刀”，在基因组特定位点精准制造双链断裂，借助生物体非同源末端连接与同源重组机制完成自我修复，进而产生定向基因突变与基因改良。将基因编辑融入育种创新全过程，突破了传统杂交育种的物种生殖隔离与选育周期瓶颈，可快速培育出抗病抗逆、高产优质、营养升级的农作物与畜禽新品种。同时在生命基础研究、人类遗传病干预、生物制品研发等领域协同发力，让现代生物技术从基础研究走向产业落地，为种业振兴、生物医疗与现代农业发展提供了核心技术支撑，展现出不可替代的应用价值与发展潜力。 猜押1 基因编辑 1.Cre/LoxP重组酶系统 （1）Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 （2）LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 （3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 2.CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。 其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 3.In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 1．（25-26高三上·北京通州·期末）经典的孟德尔遗传规律和自然选择限制了对野生植物种群进行基因改造，因为某些对人类有利的性状对植物自身是不利的，研究者开发了CAIN技术解决这一难题。 (1)Cas9-gRNA系统是基因编辑的重要工具，如图1所示，gRNA通过______原则识别并结合DNA上靶序列，同时招募Cas9蛋白对该靶序列进行切割，造成DNA损伤。 (2)基于Cas9-gRNA系统，研究者构建了CAIN技术，其载体结构如图2所示。DMC1启动子可以驱动Cas9基因和gRNA序列的转录，进而特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1；同时需要引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”（简称NPG1-ty基因），NPG1-ty基因的具体功能是______。为了将NPG1-ty基因重组到C载体中，需要用到的限制酶是_______，重组后的载体称为CAIN载体。 注：同义密码子是指同一氨基酸被多个不同密码子编码。DMC1是雄蕊花粉母细胞特异启动子。TPD1是花粉细胞特异启动子。 (3)科学家用______方法，将1个CAIN载体导入到植物拟南芥染色体中，且转入的CAIN载体稳定存在并表达。以该转基因植株作为父本，以野生型为母本进行人工授粉，F1中携带CAIN载体的比例为________。 (4)结合所学知识，有关本研究的表述中正确的是_______。 A．Cas9-gRNA功能类似“解药”，NPG1-ty功能类似“毒药” B．通过特异性抗体，能够区分NPG1和NPGI-ty基因表达的蛋白质 C．CAIN技术可用于破坏外来入侵植物的育性相关基因，控制入侵植物数量 D．CAIN技术被不当使用会影响生物安全，因此需要进行严格的监管和论证 2．（24-25高二下·北京昌平·期末）水稻的胚乳是主要可食用部分，其他部分在加工过程中被去除。害虫二化螟和田间杂草极大地影响水稻的产量，科研人员利用基因工程技术培育抗虫、抗除草剂（草甘膦）水稻，操作步骤如图1。 注：PgluC、PrbcS和P355分别为胚乳组织特异性启动子、绿色组织特异性启动子和持续激活启动子；Tnos为终止子，cry1C为抗虫基因，EPSPS为抗草甘膦基因，loxP为Cre重组酶特异性识别序列；SalI、KpnI、SphI、SacI和PstI均为限制酶，标线指向酶切位点 (1)构建重组质粒时需删除原质粒上的无关基因，目的是_______。 (2)获得目的基因Cre、cry1C和EPSPS后，常利用________技术将其大量扩增，连接为多基因串联体，并在两端分别添加_______酶切位点，以保证与质粒的正确连接。 (3)下列关于转基因抗虫、抗除草剂水稻培育过程的叙述，不合理的是________（多选）。 A．野生农杆菌需在含卡那霉素的培养基中培养 B．导入受体细胞前需用纤维素酶处理愈伤组织细胞 C．可在转基因水稻胚乳细胞中扩增出目的基因 D．可在转基因水稻根成熟区细胞检测到cry1C蛋白 E．施加适宜浓度的草甘膦以筛选抗草甘膦的植株 (4)Cre基因编码的酶能够切除两个loxP之间的序列，使其被降解。 ①Cre酶的识别序列及切割位点如图2，其作用与_________酶相似。 ②本研究转入Cre基因的意义是________。 3．（22-23高三上·北京·开学考试）抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。 (1)构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过____________酶与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列____________（填“能”或“不能”）出现在目的基因内部，可通过____________技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。 (2)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆In-Fusion技术（图2），其中In-Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。 ①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In-Fusion反应。 如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段______________。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过______________处理的农杆菌中。 ②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物______________扩增目的基因并电泳检测。请在图4中画出阳性菌落的电泳结果。______________ (3)农杆菌转化愈伤组织时，用含______________的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，请叙述排除假阳性的原理________。 1．2020年10月7日，瑞典皇家科学院已决定将2020年诺贝尔化学奖授予德国马克斯·普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A． Doudna博士，以表彰她们在基因组编辑领域的贡献。在人工设计的条件下，通过sgRNA与基因组靶序列的特异性结合，引导Cas9蛋白“切割”基因组DNA (如下图所示)。请回答下列问题。 (1)sgRNA与基因组靶序列可以特异性结合的原因是___________，Cas9核酸酶可以在sgRNA的引导下打开目标基因中的_______键，使得基因组DNA断裂。在_____酶的作用下，断裂的DNA可重新拼接。 (2)有研究者利用该技术，敲除了大鼠胰岛素受体底物1 (Irsl)基因，获得了糖尿病模型动物。流程如下： 根据已知Irs1基因的______， 设计两种sgRNA；构建含有两种sgRNA基因和______基因的表达载体；利用__________法，将上述基因的体外表达产物RNA，导入大鼠的_____(细胞)。 (3)提取转基因大鼠DNA，用PCR的方法检测Irs1编辑情况，结果如下图。其中WT为_____大鼠，由图可知2号大鼠比野生型大鼠的PCR产物短95bp，研究者据此确定其为阳性结果，即Irsl 被敲除失活，因为____________对应序列在Irsl基因上的位置相距95bp。 （4）2号大鼠P与野生型WT大鼠杂交，提取后代DNA，用相同引物进行PCR，结果如上图。_________________属于杂交后代， 说明基因编辑结果______稳定遗传。 2．为治疗镰状细胞贫血症，研究人员尝试将特定的mRNA递送至患者造血干细胞，通过基因编辑实现对该病的治疗。 (1)体外获得的mRNA递送到人体细胞后，经______过程合成蛋白质。 (2)利用纳米脂质体（LNP）作为基础材料，将特定蛋白与LNP偶联，构建可靶向造血干细胞递送mRNA的系统。 ①已知Cre酶可识别DNA分子中特定的loxP序列，当DNA分子上存在两个同向loxP序列时，Cre酶可将两个loxP序列之间的DNA序列切除（图1）。将Cre酶的mRNA包裹进该递送系统后送入小鼠细胞。若______，说明递送系统有效。 ②选择不同的蛋白质与LNP偶联后进行递送，根据图2判断，递送至造血干细胞效果最佳的蛋白质为______。 (3)利用上述mRNA递送系统可将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）递送至患者造血干细胞进行基因编辑。ABE是一类新兴基因编辑技术，由融合蛋白与sgRNA构成，可实现对A/T碱基对的精准转换，修复致病血红蛋白，原理如图3。请完善修复过程________。 (4)修复后的干细胞回输之前需要清除患者原造血干细胞，为骨髓微环境腾出空间，传统放化疗处理存在不孕不育风险和损伤正常细胞等缺陷。已知PUMA蛋白是一种促凋亡因子，请利用上述mRNA递送系统提出研究思路________。 3．水稻条纹叶枯病是以灰飞虱为媒介传播的病毒病，俗称水稻上的癌症。病株常枯孕穗或穗小畸形不实。拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，各类型稻均不枯心，但抽穗畸形，结实很少。为提高水稻对条纹叶枯病的抗性，科学家通过基因工程将抗病毒基因cry1Ab13转入水稻，过程如图所示。回答下列问题： (1)为了减少限制酶识别序列的影响，研究人员采用了新型的无缝克隆In-Fusion技术实现重组载体的构建。该技术首先要将表达载体线性化，需使用限制酶____，其次要保证在目的基因两端构建出与线性化载体末端相同的DNA序列（即同源序列，通常15～20bp）。因此引物1和引物2要依据____序列设计。 (2)将线性化的表达载体和基因crylAb13混合进行In-Fusion反应，In-Fusion酶能够识别线性化DNA片段（末端任意16个碱基，使其形成黏性末端，依靠同源序列碱基间的配对获得重组表达载体，其中同源序列1、2中碱基序列不同，这样设计的好处除了防止线性化载体自身环化自连外，还能___________（答两点）。 (3)科学家通过实验探究水稻抗条纹叶枯病病毒（RSV）的调控机制。 ①茉莉酸（JA）参与调节水稻抗RSV。实验显示转录因子Y的表达水平在水稻感染RSV后显著上调。用外源JA处理接种RSV的水稻幼苗，一段时间后检测植株中的病毒蛋白积累量，结果如下图。实验结果表明JA____（选填“提高”或“降低”）水稻对RSV的抗性，转录因子Y____（选填“提高”或“降低”）水稻对RSV的抗性。 ②S是JA信号通路中的关键转录因子。荧光素酶（LUC）可分为无活性的N端和C端两段蛋白，两者在空间上靠近时可恢复酶活性。研究者将表达N端的基因（nLUC）与S基因融合，将表达C端的基因（cLUC）与Y基因融合，构建表达载体导入烟草叶片，48小时后加入底物检测荧光信号，结果如下表： 组别 导入基因 荧光信号（“+”表示有、“-”表示无） 甲 cLUC-Y融合基因+nLUC基因 一 乙 cLUC基因—nLUC基因 一 丙 ? + 丁 cLUC基因+nLUC-S融合基因 一 表中“?”处导入的基因为_________________。实验结果说明Y可与S结合，理由是_______________。 猜押2 育种创新 杂交育种 诱变育种 单倍体育种 多倍体育种 基因工程育种 方法 （1）杂交→自交→选优（2）杂交 物理因素、化学因素、生物因素 花药离体培养、秋水仙素诱导加倍 秋水仙素处理萌发的种子或幼苗 将一种生物的特定基因转移到另一种生物细胞中 原理 基因重组 基因突变 染色体数目变异 染色体数目变异 基因重组 优点 不同个体的优良性状可集中于同一个体上 提高变异频率，出现新性状，大幅度改良某些性状，加速育种进程 明显缩短育种年限 营养器官增大、提高产量与营养成分 打破物种界限，定向改造生物的遗传性状 缺点 时间长，需要及时发现优良性状 有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性 技术复杂，成本高 技术复杂，且需要与杂交育种配合；在动物中难以实现 技术复杂，生态安全问题较多 适用对象 同一物种的多个品种的优良基因的组合 已知的优良基因资源 快速获得纯合稳定遗传品系 获得高产新物种 不同物种优良基因的组合 举例 高杆抗病与矮杆不抗病小麦杂产生矮杆抗病品种 高产量青霉素菌株的育成 抗病植株的育成 三倍体西瓜、八倍体小黑麦 转基因抗虫棉的培育 1．（2026·北京丰台·一模）在作物育种中，培育不育系可简化制种流程、节约人工时间。 (1)科研人员培育出了具备优良性状的甘蓝油菜雄性不育系CMS，为获得雄性育性恢复的该品系，计划引入油菜R中的育性恢复基因，部分流程如图1，其中①是________。以________性状作为筛选依据，从而获得BC1到BC5。 (2)在上述BC5中发现一株雌性不育突变体（G）。为判断雌性不育性状的遗传方式，应从BC5中选择正常植株（H）与G杂交，结果发现子代性状及比例为________，推测雌性不育性状由显性单基因控制。 (3)检测发现G中Bol基因的转录量显著低于H．对两者进行基因组测序，若结果为________，则支持假说“Bol基因是导致雌性不育的基因”。后续实验证明了该假说。 (4)进一步研究发现在20±2℃稳定低温或32±2℃稳定高温时，G可恢复育性。且G中突变的Bol基因可使叶片呈锯齿状。基于以上信息，请利用G植株、CMS植株、N品系（可育、具备优良性状），在图2中完善育种流程，构建田间收获均为目标杂交种的育种体系。 2．（25-26高三上·北京顺义·期中）蔬菜甘蓝具有杂种优势现象，花为两性花，开花后一株可结5000多粒种子。育种专家对甘蓝雄性不育性状进行研究。 (1)从甘蓝纯种优良品系1中获得一株雄性不育突变株（甲），雄性不育性状与雄性可育性状称之为_____；将甲与品系1杂交，子代中可育株约占1/2，推测甲的_____性状为显性。后续研究证实了该推测，将可育基因与雄性不育基因分别记为A和A′。利用雄性不育株获得杂种避免了杂交过程中的_____和套袋等繁琐操作。 (2)通过甲获得两株基因型为A'A'的甘蓝（乙），利用品系1、乙及另一优良可育品系2，生产出兼具品系1和2优良性状的杂交种子（YF1），用于大田种植。请补充答题卡上的图解，用以表示经两代杂交生产大量YF1的过程_____。 (3)与A相比，A'启动子缺失1个碱基对。编辑A基因，获得编码区突变的隐性基因a，三者结构如图1所示。检测发现，突变株aa（丙）、兼具A′和a基因突变位点的纯合突变株（丁）均表现为雄性不育。 ①为检测突变启动子的活性，将A和A'基因启动子与报告基因连接后导入烟草细胞。图2结果说明突变后的启动子转录活性提高，依据是_____。 ②研究发现，A蛋白可抑制A和A'基因的转录，调控相关蛋白含量。为此，研究人员检测不同株系甘蓝育性基因（A及其等位基因）相对转录量请在图3中补充丁组实验结果_____。 (4)绝大多数植物都有A基因，利用其特点推广到其他作物育种时发现，若将（2）中产生的YF1用于某些自花传粉为主的作物时会造成严重减产，请分析原因_____。 1．玉米为二倍体，是我国的主要农作物。糯玉米口感好，广受喜爱。为加快育种进程，我国科研人员利用吉诱101玉米品系对糯玉米品系进行诱导，过程如下图。 回答问题： (1)糯玉米和吉诱101玉米的体细胞中有____个染色体组。 (2)单倍体糯玉米体细胞中____（填“有”或“无”）同源染色体，减数分裂过程中染色体无法____，因此高度不育。 (3)用秋水仙素处理单倍体幼苗后，产生二倍体糯玉米，这种变异属于____。理论上，加倍后得到的二倍体糯玉米为纯合子。采用上述方法可____，提高育种效率。 (4)科研人员对单倍体进行了不同处理，种植后统计散粉植株数并计算散粉率（散粉代表可育），结果如下表。 组别 处理方法 平均散粉率（%） 1 0.6mg/mL秋水仙素 浸芽 10.66 2 浸根 6.20 3 浸种 4.34 4 不做处理 1.05 注：溶解秋水仙素的溶剂对植株散粉无显著影响 据表可知，第1组单倍体糯玉米的染色体加倍效果最佳。第4组在本实验中作为____组。 2．小麦作为雌雄同花、自花传粉的作物，培育出雄性不育株，是实现杂交育种的关键。目前已探索获得不同的杂交小麦生产体系。请回答下列问题。 (1)XYZ杂交小麦生产体系中，雄性不育突变基因（m）位于小麦5号染色体上，雄性育性基因（M）和标记基因（H）位于黑麦5R号染色体上。X系和Y系分别导入了2条和1条黑麦5R染色体，如下图所示。标记基因H在开花时会表现为穗下节多毛性状，可用以区分X系、Y系和乙系。 ①在野生小麦的染色体中___（填“有”或“无”）5R的同源染色体，在X系中M与m的遗传遵循___定律。 ②利用Z系进行水稻育种的优点是___。X系与Z系杂交可获得___系，Y系与Z系杂交可获得___系。 (2)通过转基因技术将雄性育性基因M与雄配子致死基因P、蓝色素生成基因R一起导入基因型为mm的Z系个体（雄性不育）中，并使其插入到一条不含m基因的染色体上如下图所示。基因R的表达可使种子呈现蓝色，无基因R的种子呈现白色。 ①转基因个体（PRMmm）自交后得F1，F1个体之间随机授粉，得到的种子中雄性不育种子所占比例为___。 ②将转基因个体（PRMmm）自交并收获水稻种子，请写出快速辨别雄性不育种子和转基因雄性可育种子的方法：___。 ③若某转基因个体（PRMmm）中的基因R由于发生突变而不能表达，又该如何快速挑选出雄性不育种子？请以该突变转基因个体和Z系个体为材料，设计一个可快速挑选出雄性不育种子的实验方案（写出杂交组合并说明挑选方法）：___。 1．（2026·北京丰台·一模）水稻His基因控制合成的酶参与除草剂的代谢解毒过程。科研人员利用基因编辑工具Cre-LoxP系统和CRISPR/Cas9系统提高His基因表达水平。 (1)Cre-LoxP系统包含三种载体，载体1、载体2携带Lox序列，载体3携带Cre酶基因。 三种载体通过________法导入水稻细胞后，载体1、2的Lox序列会分别插入目的基因左侧、右侧，载体3表达的Cre酶可特异性识别Lox序列，催化如图1所示的剪切过程，实现一对lox序列间的基因敲除。 (2)His基因所在的染色体部分片段如图2，其附近的RPL基因带有强启动子。RPL基因表达水平变化不会对水稻植株的生命活动造成影响。 科研人员优化了Cre-LoxP系统，使其能引起315kb片段位置颠倒，导致________，提高His基因的表达。请根据图3中Cre酶切割位点，在下表中选出可行的Lox序列组合________，使该系统在Cre酶切割及细胞内DNA连接酶修复后，能实现上述实验目的。 组合 左侧Lox 5'——3' 右侧Lox 5'——3' 一 AGCATA TATGCT 二 AGCATA AGCATA 三 TATGCT TATGCT 四 TATGCT AGCATA (3)科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术去除Cre-LoxP操作后残留的Lox序列（“痕迹”）。为了检验CRISPR/Cas9去除痕迹的情况，建立荧光报告系统：将载体A、载体B和CRISPR/Cas9共同导入水稻原生质体中。若Lox序列被去除，则原生质体可检测到绿色荧光。 无绿色荧光 无绿色荧光 注：GFP-1、GFP-2和GFP-3片段可以通过同源重组的方式拼接成完整的GFP（绿色荧光蛋白基因） 有绿色荧光 请根据表中信息解释此系统的检验原理：________。 (4)通过上述技术的优化，科研人员成功制备出抗除草剂的水稻。请分析此工程的优势。 2．（25-26高二下·北京丰台·期中）学习以下材料，回答下列小题。 基因魔剪：CRISPR/Cas系统 CRISPR/Cas基因编辑系统可对真核细胞的基因组进行特异编辑。CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断（通过设计gRNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割）。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因插入指定位点（图1）。 科学家通过在Cas9基因中引入突变，获得了只切割DNA一条链的nCas9，并将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，开发出了单碱基编辑技术（图2），能够对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C→T（G→A）或A→G（T→C）的碱基替换。对CRISPR/Cas系统改造后，还可用于激活或者抑制基因的转录等。 目前CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，gRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。 尽管如此，CRISPR/Cas系统作为一种革命性的技术，其成本低、制作简便、快捷高效等优点让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。 (1)利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，其中Cas9蛋白与限制酶的功能相似，可使________键断裂。gRNA依据________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割。 (2)有些遗传病是由于基因中一个碱基对改变引起的，若要修正此基因突变，文中图示的3种途径中，________（填“①”“②”或“③”）最为合适。 (3)研究者通过一些技术让Cas9基因发生突变，使Cas9蛋白失去切割活性，可将CRISPR/Cas9用于抑制基因转录，实施的过程为：在gRNA的引导下，Cas9蛋白与靶基因的________结合，使________酶失去结合位点从而抑制靶基因的转录。 (4)请结合文章，提出降低CRISPR/Cas9系统脱靶效应的思路________。 3．（24-25高二下·北京丰台·期中）科研人员开发出了能编辑叶绿体基因组的基因编辑系统CyDENT。 (1)这套系统的核心是FokI-TALE融合蛋白，FokI是一种低特异性的内切核酸酶，TALE是一种能识别特异性序列的DNA结合蛋白，形成的基因编辑复合物如图1。使用CyDENT系统进行基因编辑属于________水平的研究。研究团队在CyDENT系统中设计的TALE-FokI蛋白在功能上类似于常用基因工程工具中的________。 (2)研究团队利用叶绿体定位序列（CTP）构建了如图2所示的基因表达载体，请结合图3阐述CyDENT系统编辑叶绿体基因组的机制：________。 (3)研究团队决定进一步挖掘CyDENT编辑系统的潜力，根据不同的编辑需求选择不同载体模块组合成系统：例如换用不同类型的启动子。假设需要仅在人类大肠组织中编辑名为BST114的细胞核基因，请参照图2，选择合适的模块设计CyDENT系统的表达载体： ①________ ②________  ③________终止子 (4)CyTENT系统编辑核基因的效率尚不如成熟的CRISPR基因编辑系统。请提出CyDENT编辑技术在人类健康领域内的应用方向：________。 4．（23-24高三上·北京大兴·期末）影响小鼠内耳形态的基因A突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试进行基因治疗。 (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统由sgRNA及Cas9蛋白组成。图1所示，sgRNA与目标DNA结合，引导Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致________键断裂。 (2)同源重组是指在DNA断裂的情况下，含有同源区段的DNA之间发生的重组。科研人员尝试利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗。                              ①利用________技术扩增野生型小鼠的基因A，再用图2中的限制酶________切割基因A与腺病毒载体形成黏性末端，最后利用________酶进行拼接，构建腺病毒表达载体。科研人员尝试利用该载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳。   ②在上述基础上，科研人员又将sgRNA基因、Cas9基因接入了腺病毒表达载体（见图3），同时引入sgRNA的识别序列，目的是________。图3所示的腺病毒表达载体还需要哪些必要的结构或基因_____（多选）。 A．启动子和终止子 B．RNA聚合酶基因 C．标记基因 D．起始密码子和终止密码子             E．反密码子             F．复制原点 (3)将腺病毒表达载体注入耳聋小鼠的单侧耳组织细胞。为评估该治疗方案的效果，研究人员使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除________对实验结果的影响。 (4)进一步研究结果表明该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。人体内基因A突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注________。 5．（2026·北京顺义·一模）小胶质细胞与脑发育和神经退行性疾病有重要关联，科研人员对小胶质细胞的起源和功能转化机制展开研究。 (1)新生小鼠大脑白质中存在的小胶质细胞(P细胞)通过高表达C基因实现吞噬功能，维持神经系统稳态。为证明P细胞与其他脑区的小胶质细胞均来源于早期胚胎的Y细胞，科研人员利用基因工程改造小鼠并进行杂交，其体细胞内相关基因及调控元件如下图。 注：①R基因在Y细胞中特异性高表达 ②I序列：使相邻基因表达的蛋白不融合 ③Cre-Er：Cre酶进入细胞核后切除X之间的DNA序列；Er蛋白位于细胞质中 ④Stop：阻止下游基因转录 药物T可诱导Er入核，据图可知，药物T可使子代小鼠的小胶质细胞表达红色荧光蛋白。应在______(胚胎发育早期/胚胎发育晚期)施加药物T，标记小鼠脑区的小胶质细胞。出生后7天，用绿色荧光蛋白标记的C蛋白抗体处理小鼠脑区，支持P细胞起源于Y细胞的检测结果是________。 (2)通过设计只让P细胞表达红色荧光蛋白，小鼠出生后30天，用绿色荧光蛋白标记的C蛋白抗体处理小鼠脑区并检测，结果显示红色荧光分布于各脑区，但未检测到绿色荧光，说明P细胞_______，称为稳态小胶质细胞(eP细胞)。 (3)组蛋白乙酰化使染色质结构变得松散，为相关蛋白与基因调控序列结合并调控基因的转录提供空间。衰老或患神经退行性疾病时，eP细胞恢复至出生后7天的状态。推测P细胞功能状态的转变与组蛋白乙酰化和基因差异化表达有关。支持的证据有_______(多选) A．小鼠出生7-30天内P细胞的C基因转录量和组蛋白乙酰化水平逐渐降低 B．小鼠出生30天后eP细胞所有基因的组蛋白乙酰化水平均升高 C．衰老小鼠eP细胞C基因转录量和组蛋白乙酰化水平与P细胞相似 D．与正常鼠相比，阿尔茨海默病模型鼠eP细胞C基因转录量和组蛋白乙酰化水平高 (4)A蛋白能特异性结合C基因的调控序列。为验证A蛋白参与调控C基因的转录，在出生后30天的脑组织中分离eP细胞，特异性敲除A基因，检测敲除后eP细胞的吞噬能力。请评价实验设计并完善_________________________。 6．（23-24高三上·北京朝阳·期中）水稻雄性不育系在育种中具有重要的应用价值。研究者试图寻找更多的雄性不育基因。 (1)研究者获得一株雄性不育突变株 S221，与纯合可育植株杂交，后代表型及分离比为不育株：可育株=1∶1，表明S221不育性为_________性状且受核内_________对等位基因控制。 (2)对S221的不育基因进行精细定位，发现不育单株8号染色体的S基因上游插入一段DNA片段（简称M 片段）。 ①研究者利用_________技术扩增得到M片段和S基因，M片段、S基因分别用限制酶_________处理，在_________的作用下形成融合片段，构建表达载体（如图1），最终获得转基因株系1．相同方法获得只插入S基因的转基因株系2． ②观察并比较水稻花穗、花药和花粉粒的发育情况，发现与野生型植株相比，株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒，株系2无明显差异。本实验的目的是_________ 。 (3)为了研究 M片段的功能，研究者将一系列片段分别与Luc基因融合构建表达载体导入水稻原生质体，检测 Luc基因的表达水平，操作及结果见图2． 图 2结果表明_________。 (4)进一步研究发现，不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控。结合本研究，推测突变株S221雄性不育的机理。_________ 7．（22-23高三上·北京丰台·期末）“中国小麦远缘杂交之父”李振声院士及其团队首创全新育种方法，为小麦染色体工程育种开辟了新途径。 (1)单体小麦和缺体小麦是小麦育种和遗传分析的基础材料。单体比正常个体少一条染色体，缺体比正常个体少一对同源染色体。普通小麦含有42条染色体，也可被视为二倍体（用2N=42W表示），在培育过程中可发生______________，从而出现单体和缺体。若不考虑同源染色体之间的差异，普通小麦共有____________种缺体。 (2)研究团队利用带有蓝粒性状标记的单体小麦（图1），选育出能稳定遗传的可育缺体小麦。 蓝粒单体小麦（E代表携带蓝粒基因的染色体）自交以后，产生三种染色体组成的后代，即：40W+E、_________。由于蓝粒性状具剂量效应，会出现三种表现型，即白粒、蓝粒和深蓝粒，其中________粒小麦为缺体小麦。自交后，筛选得到了育性高的株系4D缺体（缺少4号染色体）。 (3)二倍体黑麦（2N=14R）是小麦的近缘物种，耐旱耐寒和抗病能力都很强。为引入黑麦优良性状培育异种染色体代换的小麦新品种，研究人员进行了杂交实验，如图2。 以4D缺体小麦为母本，经过人工__________后授以黑麦花粉，所得F1代体细胞含有_______条染色体。由于F1雌雄都不育，用图中①__________处理F1幼苗使其染色体加倍。经过细胞学观察，选择_______条染色体的F1植株进行回交。在F2代中选择小于47条染色体的植株继续回交，所得F3植株染色体数以40条、41条、42条居多。其中可选择_______条染色体的个体进行自交，即可得到染色体数恢复的小黑麦异种染色体代换系小麦，经筛选鉴定后可用于生产。该方法可大大缩短育种年限，有计划引入异源染色体。 (4)育种专家在小麦培育过程中偶然发现一株隐性纯合突变体，为判断此隐性突变基因的位置（在几号染色体上），利用正常小麦植株和各种单体小麦植株，结合上述方法，提出你的实验思路___________。 8．（2026·北京昌平·一模）棉花是我国重要的经济作物，其种皮表面的棉花纤维分为长绒和短绒，长绒具经济价值，短绒无纺织价值且增加种子处理成本。依据种皮表面是否具有短绒可将棉花种子分为毛籽和光籽。科研人员以亚洲棉为材料，探究光籽性状的遗传规律和分子机制。 (1)下表为不同品种亚洲棉的杂交实验及结果 组别 P父本  ×  母本 F2光籽:毛籽 1 GA0149（光籽）  ×  GA0146（毛籽） 918:318 2 常紫1号（光籽）  ×  石系亚1号（毛籽） 64:176 3 江苏红茎鸡脚（光籽）  ×  石系亚1号（毛籽） 136:100 ①推测第1组与第2组F2分离比不同的原因是_________。 ②第3组F2分离比符合9:7，表型为光籽的基因型需满足_________。 (2)为揭示GA0149品种光籽的分子成因，科研人员以GA0149和GA0146为材料开展研究。统计两种材料的叶茸毛数目，发现GA0149的叶茸毛数量明显少于野生型GA0146，由此可推测_____________，为后续基因筛选提供了表型关联依据。 (3)科研人员筛选出与光籽性状相关的8个候选基因，与GA0146相比仅GaFZ基因在GA0149中出现特异高表达。检测GA0149和GA0146的短绒发育关键期及花、叶和根等组织中的GaFZ基因表达量。结果显示，_________，表明GaFZ基因是控制光籽性状的关键基因，同时验证了（2）的推测。 (4)科研人员扩大研究样本，进一步验证了GaFZ基因的表达调控元件（larINDELFZ）和GaFZ基因表达与光籽表型的关系，结果如下图。请构建GA0149光籽表型产生的分子机制：_________。 (5)已知棉花长绒的发育依赖于经典的MBW-GL2通路，研究发现GaFZ基因独立于该通路，这一研究成果在育种中的价值是 _______。 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 抢热点 基因编辑与现代生物技术应用 答案版 考点1 基因编辑 1． 【答案】(1)碱基互补配对 (2)恢复花粉萌发正常所需的NPGI基因功能，避免NPGI基因被Cas9-gRNA切割 KpnI和SalI (3)农杆菌转化 100% (4)CD 2． 【答案】(1)减少无关基因干扰，确保目的基因正确表达 (2)PCR SacI和PstI (3)ABD (4)限制酶 去除选择标记基因（如卡那霉素抗性基因），避免基因污染 3． 【答案】(1)限制酶和DNA连接酶 不能 PCR (2)a、d或d、a Ca2+ 1和4 (3)除草剂 由于成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因，也有GUS基因，而报告基因GUS在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达，且表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的实现成功转化愈伤组织和无蓝色的是假阳性的农杆菌。 1． 【答案】(1)二者的碱基互补配对 磷酸二酯 DNA连接 (2)碱基序列 Irs1 显微注射 受精卵 (3)野生型 sgRNA基因 (4)2、3、7、9 可以 2． 【答案】(1)翻译 (2)细胞出现荧光 CD117蛋白 (3)融合蛋白将A转化为次黄嘌呤（I），DNA复制时I与C配对，经复制后A/T碱基对变为G/C碱基对，实现基因修复 (4)利用递送系统（CD117-LNP）包裹PUMA的mRNA，进入造血干细胞后翻译出PUMA，促进细胞凋亡。 3． 【答案】(1)BamHⅠ 目的基因和（表达）载体 (2)防止目的基因自身环化自连，防止目的基因与载体的反向连接（或保证目的基因与载体的正向连接） (3)提高 降低 cLUC-Y融合基因＋nLUC-S融合基因 与其他组相比，仅丙组检测到荧光，说明LUC的N端和C端在空间上靠近，恢复了酶活性，两者靠近是由Y与S结合导致的 考点2 育种创新 1． 【答案】(1)CMS 雄性可育/育性恢复 (2)雌性可育:雌性不育= 1:1 (3)仅Bol基因序列存在差异 (4) 2． 【答案】(1)相对性状 雄性不育 去除雄蕊 (2) (3)A'组报告基因表达量高于A组 (4)YF1中有1/2是雄性不育杂合子，若自花传粉作物收获的是果实或种子，不育株自然 状态下无法授粉结实，严重减产 1． 【答案】(1)2 /两     (2)无 正常联会 (3)染色体数目变异 明显缩短育种年限 (4)对照 2． 【答案】(1)无 自由组合 无需去雄，操作简便 Y Y、Z (2)3/4 （观察种子颜色）蓝色为转基因雄性可育，白色为雄性不育 杂交组合：突变转基因植株×Z系植株（雄性不育） 挑选方法：雄性不育植株上所结的种子即为雄性不育种子 1． 【答案】(1)农杆菌转化 (2)RPL基因的强启动子与His基因的弱启动子交换 一、四 (3)若成功删除Lox序列，则载体A与载体B发生同源重组，GFP基因能拼接 完整并表达，可检测到绿色荧光:若未成功删除，GFP基因无法拼接完整，检测 不到绿色荧光。 (4)能提高His基因表达水平:同时，因强启动子来自水稻自身基因且去除残 留Lox，避免引入外源基因的干扰，提高了产品安全性。 2． 【答案】(1)磷酸二酯 碱基互补配对 (2)③ (3)启动子 RNA聚合酶 (4)设计gRNA的长度为17个碱基，避免第18~20个碱基不匹配时，导致错误位点的切割（或设计出特异性较强的gRNA，增强gRNA的特异性；通过设计Cas9，让其手指状结构远离DNA序列，从而在gRNA与DNA错配时，不会稳定错配结构，避免在错误位点切割等） 3． 【答案】(1)分子 限制性内切核酸酶（限制酶） (2)核糖体合成的TALE-FokI蛋白带有CTP，CTP可以引导蛋白质向叶绿体内进行转运，将TALE-FokI蛋白带入到叶绿体中完成基因编辑 (3)大肠特异性启动子 核定位序列 BST114序列特异性TALE—FokI融合基因 (4)可用于线粒体疾病的基因治疗 4． 【答案】(1)磷酸二酯键 (2)PCR SpeI和Sal DNA连接酶 通过CRISPR/Cas9基因编辑系统切割腺病毒表达载体DNA和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA发生断裂，启动同源重组 ACF (3)小鼠的个体差异 (4)该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑 5． 【答案】(1)胚胎发育早期 大脑白质的细胞红、绿荧光重合，其他脑区的小胶质细胞显红色标记 (2)不再表达C基因，失去吞噬功能，部分转移到各脑区 (3)ACD (4)选材不合理，应选取出生后7天的小胶质细胞开展实验；缺乏对照，应补充未敲除A基因组，检测C基因表达量和吞噬能力；检测指标不完整，应补充检测C基因的转录量 6． 【答案】(1)显性 1 (2)PCR BamHI、Bgl II DNA 连接酶 水稻雄性不育是否由 M 片段插入S基因上游导致 (3)M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进 Luc基因表达 (4)在雄性不育突变株中，M片段插入到S基因的上游，启动并增强S基因表达，从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调，凋亡细胞数量增加，花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒，进而导致雄性不育 7． 【答案】(1)染色体变异 21 (2)40W、40W+2E 白 (3)去雄 27 秋水仙素 54 41 (4)利用各种单体小麦作为母本分别与该隐性突变个体杂交，若某种单体的子代中出现隐性突变类型，则此基因在相应的染色体上 8． 【答案】(1)不同品种中控制光籽的基因可能不完全相同 两对等位基因的显性基因同时存在 (2)控制短绒发育的基因可能同时调控叶茸毛发育 (3)在短绒发育关键期和叶组织中，GA0149的GaFZ基因表达量显著高于GA0146，在其他器官中的表达量无明显差异 (4)larINDELFZGaFZ基因表达→抑制短绒发育→光籽表型 (5)可通过调控GaFZ基因的表达培育“光籽但长绒高产”的棉花品种，降低种子脱绒成本 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $