3.1 重组DNA技术的基本工具（第2课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 （第2课时） 例：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图 所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 ①不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏 和 。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 一、限制酶的选择技巧 技巧1：选择不会破坏目的基因和抗性基因的限制酶 例：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 ②不宜只选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后， , 。 目的基因只有 一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 技巧2：目的基因的两侧都要使用限制酶切割 一、限制酶的选择技巧 例： ③由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入Pst I 一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成 连接的环状产物以及 连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是 ，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 一、限制酶的选择技巧 活动2：探究单酶切与双酶切 第1步：分别将质粒1、质粒2、目的基因1和目的基因2裁开成4个条状 第2步：分别将质粒1和质粒2首尾相连制作成环状DNA分子，即质粒 第3步：分别找到质粒1、质粒2、目的基因1和目的基因2的限制酶识别序列、写出限制酶名称，并标记切割位点 EcoR Ⅰ Hind Ⅲ 一、限制酶的选择技巧 活动2：探究单酶切与双酶切 EcoR Ⅰ Hind Ⅲ 第4步：比较质粒1和质粒2的限制酶差别 第5步：比较目的基因1和目的基因2的限制酶差别 单酶切：一种限制酶切割目的基因和质粒 缺点：①质粒、目的基因会自身环化；②目的基因会反向插入质粒，导致目的基因无法正常表达。 一、限制酶的选择技巧 活动2：探究单酶切与双酶切 EcoR Ⅰ Hind Ⅲ 第4步：比较质粒1和质粒2的限制酶差别 第5步：比较目的基因1和目的基因2的限制酶差别 双酶切：两种限制酶切割目的基因和质粒 第6步：观察质粒2能否与目的基因1相连接 一、限制酶的选择技巧 例： ③由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入Pst I 一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成 连接的环状产物以及 连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是 ，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 反向连接 目的基因与目的基因 质粒片段与质粒片段 一、限制酶的选择技巧 例：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 ④为避免目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，例如可选择用 和 这两种限制酶。 Pst I EcoR I 技巧3：目的基因和质粒最好使用双酶切法，且不为同尾酶 一、限制酶的选择技巧 思考：使用Spe Ⅰ 和Xba Ⅰ 两种限制酶可以防止自身环化吗？ 课堂小测 1、某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为 工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点) 和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割 位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的（ ） A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 课堂小测 2、图1为某种质粒简图，图2表示某外源 DNA 上的目的基因，小箭头所指分别为 限制性内切核酸酶EcoR I、BamH I、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是（ ） A. 在基因工程中若只用一种限 制酶完成对质粒和外源DNA的 切割，则可选 EcoR Ⅰ B. 如果将一个外源 DNA分子和一个质粒分别用 EcoR I 酶切后，再用 DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoR I 酶切割位点有1个 C. 为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH I 和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理 D. 图1所示的一个质粒分子经 EcoR I 切割后，含有2个游离的磷酸基团 B 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 1. 实验原理 (1)提取DNA的原理： DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl 溶液 (2)鉴定DNA的原理： 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 2. 材料用具 (1)选材： 草莓 香蕉 菠菜 菜花 猪肝 ①选什么样的材料实验更易成功？ 思考 选取DNA含量相对较高的生物组织 ②猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 猪血中的红细胞（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和细胞器，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中的红细胞有细胞核，且核DNA的量较多，适合。 加入柠檬酸钠，可防止血液凝固 洋葱 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 2. 材料用具 破坏细胞，释放出细胞内的物质 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 稀释 NaCl溶液 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L的NaCl溶液 二苯胺试剂 蒸馏水 (2)试剂： 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 研磨 如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ 思考1 研磨不充分，会使DNA分子从细胞核中不能完全被释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA含量。 研磨液成分 作用 SDS EDTA Tris缓冲液 使蛋白质变性 抑制DNA酶的活性 维持pH的稳定，保证DNA结构正常 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 研磨 生活小实验中：植物材料在切碎后、研磨前需要加入一定的洗涤剂和食盐 如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ 思考1 研磨不充分，会使DNA分子从细胞核中不能完全被释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA含量。 溶解细胞膜 溶解DNA 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 方法1：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 过滤 过滤的纱布能用滤纸代替吗？ 思考2 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失 方法2：直接将研磨液倒入塑料离心管，1500r/min转速离心5min，取上清液放入烧杯。 上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 思考3 可能含有核蛋白、多糖等杂质 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 用冷却的酒精析出DNA 加体积分数为95%的酒精的目的是什么？ 思考4 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出 酒精预冷的作用是什么？ 思考5 ①抑制 DNA 水解酶活性，防止 DNA 降解 ②低温有利于增加 DNA 分子柔韧性，减少断裂 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 用冷却的酒精析出DNA 如何将析出的DNA展示并保存？ 思考6 方法1：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分 方法2：将溶液倒入塑料离心管中，10000r/min转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。 减少DNA断裂 应尽量不使用或少使用玻璃器皿（玻璃表面易吸附DNA） 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 实验组 对照组 加入2mol/L的NaCl溶液 加入2mol/L的NaCl溶液 不加入丝状物或沉淀物 加入丝状物或沉淀物 加入4ml的二苯胺试剂 加入4ml的二苯胺试剂 (蓝色) 二、【探究·实践】DNA 的粗提取与鉴定 4. 结果分析 (1)如果提取出丝状物或沉淀物不是白色的，说明了什么？ 说明 DNA中的杂质较多 (2)如果用二苯胺试剂鉴定的结果呈现较浅的蓝色，可能的原因是什么？ ①材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分 ④加入酒精后搅拌时过猛或不同方向搅拌，DNA被破坏 ⑤二苯胺试剂没有现配现用 ③加入的酒精没有经过充分预冷 ②使用滤纸进行过滤 课堂小测 3、下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ） A. 将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液 B. 采用体积分数为95%的酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质 C. 用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损 D. 将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化 B 在家如何实现 DNA的粗提取实验 Lavf59.27.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $