3.1重组DNA技术的基本工具(第2课时) 课件-2025-2026学年高二下学期人教版生物选择性必修3

3.1重组DNA技术的基本工具(第2课时) 课前热身 限制性内切核酸酶的来源、作用特点、作用结果分别是什么？ 来源： 主要来自原核生物 作用特点： 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 作用结果： 产生黏性末端或平末端 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 重组DNA技术的基本工具——分子手术刀 限制酶识别的特定序列有何特点？ 限制酶识别的特定序列有何特点？ ①大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6个核苷酸 ②都可以找到一条中心轴线； ③一般中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。 重组DNA技术的基本工具——分子手术刀 能被限制酶所识别的序列一般都有回文序列 4 P75 1.同种限制酶切割形成的黏性末端相同吗？ 2.不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 3.哪种限制酶切割产生的片段能与SpeⅠ切割产生的片段相连接？为什么？ 相同 XbaⅠ 两者切割产生了相同的黏性末端 可能 相同 同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的游离的黏性末端相同 P75 3.哪种限制酶切割产生的片段能与SpeⅠ切割产生的片段相连接？为什么？ XbaⅠ 两者切割产生了相同的黏性末端 4.追问：连接完成后，该重组DNA分子的新连接处 (填“能”或“不能”)再被原来的这两种限制酶切割？ 原来的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。 不能 苏-Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 如何将目的基因切割下来？ 重组DNA技术的基本工具——分子手术刀 用EcoRⅠ限制酶将Bt基因从DNA片段中切割下来！ 如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶来获取目的基因 苏-Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 如何将目的基因切割下来？ 重组DNA技术的基本工具——分子手术刀 获得某个目的基因需要用限制酶切几个切口？ 产生几个黏性(平)末端？ 切2个切口， 产生4个黏性(平)末端。 多了的无所谓 二 苏-Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？ 某DNA片段 5’ 3’ 3’ 5’ 某DNA片段 …… TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG …… …… AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC …… 5’ 3’ 3’ 5’ 如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段，使其具有相同的粘性末端 重组DNA技术的基本工具——分子缝合针 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 某DNA片段 5’ 3’ 3’ 5’ 你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 使其具有相同的粘性末端 5’ 3’ 3’ 5’ 重组DNA技术的基本工具——分子缝合针 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 使其具有相同的粘性末端 如何将他们连接起来呢？ DNA连接酶 — “分子缝合针” 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 黏性末端能通过自发形成氢键暂时连接在一起 注意： ①DNA连接酶无识别的特异性，对于相同(或互补)的黏性末端以及平末端都能连接，DNA连接酶种类少。而限制酶有特异性，限制酶种类多。 ②DNA连接酶只能连接双链DNA的缺口，不能直接连接单链DNA。 重组DNA技术的基本工具——分子缝合针 仍然具有专一性 二 5’ 3’ 3’ 5’ 片段1 片段2 片段3 DNA连接酶 2. 作用： 3. 种类： ⑴ E·coli DNA连接酶 ⑵ T4 DNA连接酶 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 从大肠杆菌（Escherichia coli）中分离得到的 从T4噬菌体中分离得到的 区别： E·coli DNA连接酶连接平末端的效率远低于T4 DNA连接酶 重组DNA技术的基本工具——分子缝合针 1.概念：一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 12 二 DNA连接酶: 一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 DNA聚合酶: 将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上 14 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 比较与DNA相关的五种酶 练习1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② 磷酸二酯键 氢键 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 三 为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解， 就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 重组DNA技术的基本工具——分子运输车 若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。 将 送入 ，在受体细胞内对目的基因进行 。 外源基因 它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 1.作用： 2.种类： 受体细胞 大量复制 重组DNA技术的基本工具——分子运输车 质粒 动植物病毒 噬菌体 18 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 复制原点 重组DNA技术的基本工具——分子运输车 一段特殊的DNA序列， DNA聚合酶的识别和结合位点 拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。 拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。 3.运载体需具备的条件 条件①：具有一个或多个限制酶切割位点,供外源基因插入其中 条件②：能在受体细胞中进行自我复制， 或能整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 3.我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体具备什么条件？ 2.要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 1.载体要与目的基因连接，需要具备什么条件？ 重组DNA技术的基本工具——分子运输车 4.为了避免受体细胞受到损伤，载体具备什么条件？ 条件④：对受体细胞无害。 20 3.运载体需具备的条件 条件①：具有一个或多个限制酶切割位点,供外源基因插入其中 条件②：能在受体细胞中进行自我复制， 或能整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 重组DNA技术的基本工具——分子运输车 条件④：对受体细胞无害。 在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 21 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 氨苄青霉素 抗性基因 拓展：标记基因的筛选原理 标记基因： 四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因、抗生素的抗性基因等 1.筛选出含有质粒载体的受体细胞 在含有氨苄青霉素的培养基上能够生存的是被导入了质粒载体的受体细胞 培养基中有几种类型的大肠杆菌？什么样的大肠杆菌能够在该培养基上存活并繁殖？ 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 22 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 氨苄青霉素 抗性基因 拓展：标记基因的筛选原理 思考:存活的受体细胞一定是成功将目的基因导入的受体细胞吗？ 仅导入空载体的和导入含目的基因载体的受体细胞均能在该培养基中存活。 培养基中有几种类型的大肠杆菌？什么样的大肠杆菌能够在该培养基上存活并繁殖？ 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 23 无法存活 存活；白色 存活；蓝色 LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 拓展：标记基因的筛选原理 2.筛选出含有目的基因的质粒载体的受体细胞 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 24 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含有一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 拓展：标记基因的筛选原理 2.筛选出含有目的基因的质粒载体的受体细胞 E.coli DNA连接酶 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 作用部位： 种类 DNA连 接酶 切开DNA分子的磷酸二酯键 主要存在于原核生物中 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上。 ④ 常有特殊的标记基因 运载 工具 条件 种类： 磷酸二酯键 限制酶 作用部位： 来源： 特点： 作用结果： 产生黏性末端或平末端 重组DNA技术的基本工具 26 $