《畜禽疫病防治》新城疫的诊断与抗体检测（HA-HI）（课件）-山东省畜牧养殖类专业技能考试

新城疫的诊断与抗体检测 （HA-HI） 1 CONTENTS 01 一、概述 02 二、病原体 03 三、流行病学 04 四、临床症状 目录 05 五、病理变化 06 六、诊断 07 七、防 制 2 设备及用具 1 Part 3 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 普通托盘天平 4 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 普通离心机(最高转速: 4000rpm 容量: 12×15mL) 5 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 微型振荡器（MH-2） 6 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 0.005～0.05 mL、0.1～1 mL、2～10 mL微量移液器及吸头、微量移液器架 7 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 96孔V型血凝反应板 8 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 烧杯、具盖塑料离心管、指型离心管。 9 一、器材或设备的准备 1.器材或设备 禽用采血器、75%酒精棉球、干棉球、金属镊子（大）等。 10 二、试剂及辅料 2.试剂及辅料 生理盐水、3.8%柠檬酸钠溶液、新城疫标准抗原、被检血清样本、新城疫标准阳性血清、新城疫标准阴性血清 11 三、 实验动物 3. 实验动物 非免疫公鸡 12 配制1%鸡红细胞悬液 2 Part 13 二、配制1%鸡红细胞悬液 （1）采血： （2）洗涤： （3）配制1%红细胞悬液： 14 二、配制1%鸡红细胞悬液 （1）采血： 使用禽用采血器，于SPF公鸡、非免疫公鸡翅下静脉采抗凝血。 具体方法： 使用禽用采血器吸取3.8％枸橼酸钠溶液为抗凝血血量的5分之1，从鸡翅下静脉抽血用量。助手用左手抓住禽的两只脚，右手固定住两翅，暴露出翅内侧，放置在鸡笼上，采血者左手拨开翅内侧羽毛，在翅静脉处消毒后，右手持5号采血器与皮肤呈45度角方向顺血管进针，进针时手要稳，进针不宜过深，见血液回流，慢慢回抽针芯，采血完毕后，用干棉球按压5-10mins后放手，避免形成血肿。 15 二、配制1%鸡红细胞悬液 （2）洗涤： 首先调平天平：先将天平两侧托盘各放入50ml小烧杯， 调至平衡； 将抗凝血置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水（或PBS液）为抗凝血的3倍～4倍，再取配平用具盖离心管一支，内加入生理盐水约，作为配平试管。后将装有抗凝血离心管放入放于天平左侧托盘小烧杯中，将装有生理盐水的离心管，放入天平右侧小烧杯中，用生理盐水将两侧配平后，将配平后的离心管对称放入离心机中；以2000r/min离心5～10min，去掉血浆和白细胞层。再加生理盐水，轻轻均匀血球，同上法离心沉淀。重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞层； 16 二、配制1%鸡红细胞悬液 （3）配制1%红细胞悬液： 根据所需用量，吸取压积红细胞，用稀释液配置成体积分数为1%红细胞悬液（20ml，4℃）备用。注意不要离心过度，使红细胞损坏。混匀时，切不可用力振荡，以免红细胞破碎。用前需振荡均匀。 注意：采集配制的抗凝血保存时间不应超过24H，最好现用现配。 17 血凝试验（HA） 3 Part 18 三、血凝试验（HA） 试验原理： 有些病毒，如禽流感病毒、新城疫病毒、Eds76等，能凝集某种动物的红细胞，故可以来推测材料中有无该病毒的存在。 19 三、血凝试验（HA） 1在96孔V型微量血凝板1孔～12孔均加入25 μL生理盐水。 2在第1孔中加入25μL抗原或病毒悬液，吹打3次～5次，充分混匀。 3将抗原或病毒悬液在反应板上进行系列倍比稀释，即从第1孔中吸取25 μL悬液至第2孔，混匀后再吸取25μL悬液至第3孔，依次进行倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25 μL弃去，第12孔不加抗原或病毒悬液，作为生理盐水对照。 4由后向前，每孔加入25 μL生理盐水。 5由后向前，每孔加入25 μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。将微量反应板在微型振荡器振荡混匀，室温静置20 min～30 min或2℃～8℃静置60 min，当对照孔(第12孔)红细胞呈显著纽扣状时判定结果。 20 三、血凝试验（HA） 6结果判定： 加样完成后，将反应板置于室温下（20-25℃）静置20min-30min，将反应板平放于A4白纸上观察，第12孔红细胞呈显著纽扣样沉淀时，将反应板倾斜，由后向前观察实验结果。第12孔红细胞呈泪珠状流淌。能够使1%红细胞发生完全凝集的抗原最高稀释倍数，称为该抗原的血凝价或血凝滴度，为1个血凝单位（HAU）。 21 4HAU抗原的配制 4 Part 24 四、4HAU抗原的配制 4HUA抗原概念： 规定用于血凝抑制试验的病毒需含4个血凝单位，即将一个血凝单位的病毒稀释度增加4倍浓度，例如，一个血凝单位为6log2，4个血凝单位则为4log2。 25 四、临床症状 4HAU的配制方法如下： 假设抗原的血凝效价为8log2(1：256)，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64(256除以4)，稀释时，将1 mL抗原加入63 mL稀释液中即为4HAU抗原。 26 四、临床症状 4 HAU抗原的检测： 4HAU抗原应现用现配，在使用前进行标定。将配制的4HAU进行系列稀释，使最终稀释度分别为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7，然后按照7.3进行血凝试验。如果配制的抗原液为4 HAU，则1：4稀释度将给出凝集终点；如果4HAU高于4个单位，可能1：5或1：6为终点；如果较低，可能1：2或1：3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4 HAU。 27 血凝抑制试验（HI） 5 Part 28 五、血凝抑制试验（HI） 试验原理： 如有能凝集红细胞的病毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制还有特异性，故病毒的血凝抑制试验，可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体，也可用已知血清来鉴定未知病毒。 29 五、血凝抑制试验（HI） 1.取96孔V型微量血凝板，用移液器在第1孔~第11孔各加入25 μL 生理盐水，第12孔加入50 μL 生理盐水。 2.在第1孔加入25μL血清，充分混匀后移出25 μL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，并从第10孔弃除25μL。 3.由后至前，在第11孔～第1孔各加入25 μL 4 HAU抗原，振荡15 s，使液体混合均匀，室温静置至少20min或2℃~8℃至少60 min。 4.在第1孔~第12孔每孔加入25μL 1%的鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温静置20 min～40 min或2℃～8℃静置40 min～60 min，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。 5.第11孔为抗原对照，第12孔为生理盐水对照，每次测定还应设已知效价的标准阳性血清和阴性血清作对照。 30 五、血凝抑制试验（HI） 6结果判定： 置室温下20-40min，在红细胞对照孔红细胞呈显著纽扣状时，并且4HAU抗原对照孔红细胞完全凝集于孔壁时观察试验结果，将反应板倾斜，从背侧观察加样孔底部的红细胞是否呈泪痕状流淌。以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI抗体效价。只有当阴性血清对照孔血清效价≤2log2，阳性血清对照孔血清效价与标定效价相差≤1log2，并且红细胞对照无自凝现象的情况下，HI试验结果有效。HI效价≤3log2，判为HI试验阴性，HI效价≥4log2，判为HI试验阳性。 31 五、血凝抑制试验（HI） 结果判定： 只有当阴性血清对照孔血清效价≤2log2，阳性血清对照孔血清效价与标定效价相差≤1log2，并且红细胞对照无自凝现象的情况下，HI试验结果有效。HI效价≤3log2，判为HI试验阴性，HI效价≥4log2，判为HI试验阳性。 34 试验结果分析 6 Part 35 六、试验结果分析 1、新城疫实验室诊断 结合临床表现，病理变化和流行过程，比较感染前后的抗体滴度是否有明显上升，具有诊断意义，一般发病前后抗体滴度上升2Log2可判定为野毒感染。 结合鸡群临床表现，且鸡群出现抗体滴度异常高，且滴度水平离散度较大，也可以间接判断，鸡群为发病状态； 36 六、试验结果分析 2、新城疫抗体检测 定期进行抗体检测，可以帮助我们正确制定免疫程序，也可以进行疫苗免疫效果评价；一般在活疫苗免疫后14天，灭活疫苗免疫后21天应进行免疫效果评价。日常监测可根据鸡场情况，灵活制定。 37 六、防 制 免疫效果评估： 注意鸡群HI抗体的平均水平； 个体免疫合格的判定标准是抗体效价≥5 log2； 群体免疫合格率≥70% 注意鸡群HI抗体的均匀度； 由于在接种疫苗后，鸡体内形成对新城疫有抵抗力的相关因子很多，包括与体液免疫有关的HI抗体、中和抗体、沉淀抗体，与细胞免疫有关的各种因子，与非特异性免疫有关的干扰素、补体和非特异性免疫效应细胞等。因此，可以说目前仍未有一个行之有效的、能真正全面反映鸡群免疫力的评价体系。 38 Thank you 谢谢大家 39 $