2026届高三生物二轮复习课件专题8 生物技术与工程

专题8 生物技术与工程① 考点1 发酵工程 考点2 细胞工程 考点3 基因工程 考点4 蛋白质工程 网络构建：发酵工程【P121】 00 传统发酵技术 ①腐乳： ； ②泡菜： ； ③果酒： ； ④果醋： ； 主要是毛霉，产生蛋白酶，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸 发酵工程 乳酸菌，进行无氧呼吸产生乳酸(C3H6O3) 酵母菌，进行无氧呼吸产生酒精(C2H5OH) 醋酸菌，进行有氧呼吸产生醋酸(CH3COOH) 微生物的基本培养技术 ①培养基的配制： ； ②无菌技术： ； ③微生物的纯培养： ； ④微生物的数量测定： ； 碳源、氮源、水、无机盐 消毒、灭菌 注：特殊需求 平板划线法、稀释涂布平板法 显微镜直接计数法、稀释涂布平板法 关键：防止杂菌污染 ①基本环节： → →接 → →种 ②应用：食品工业、医药工业、农牧业、其他方面 发酵工程 → → →获得产品 选育菌株 扩大培养 配制培养基 灭菌 发酵罐内发酵 分离提纯产物 【必备知识】 1.什么是传统发酵技术？ 2.制作腐乳、泡菜、果酒和果醋的原理是什么？ 3.怎样制作腐乳、泡菜？怎样制作果酒和果醋？ 【易错点注意】 1.制作泡菜过程中，亚硝酸盐含量的变化。 2.果酒和果醋改进装置及其分析。 3.制作果醋： ①O2充足、糖源充足的反应式： ②O2充足、缺少糖源的反应式： 4.制作果醋和制作泡菜的坛内都会有白膜出现： 前者一般是 大量繁殖形成的，后者一般是 大量繁殖形成的。 传统发酵技术的应用 01 酶 C6H12O6 +2O2 2CH3COOH(乙酸)+2CO2+2H2O+能量 酶 C2H5OH + O2 CH3COOH(乙酸)+H2O+能量 醋酸菌 酵母菌 【必备知识】 1.什么是培养基？如何配制？ 2.什么是无菌技术？ 3.怎样进行酵母菌的纯培养？(重点：平板划线法) 4.怎样测定微生物的数量？ (重点：稀释涂布平板法) 【易错点注意】 1.培养基的分类：(注意具体实例) ①按物理性质分：固体培养基、液体培养基；②按用途分：选择培养基、鉴别培养基； 2.无菌技术：(注意具体条件) ①消毒：巴氏消毒法、煮沸消毒法、紫外线消毒、化学药物消毒； ②灭菌：灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌； 微生物的基本培养技术 02 【必备知识】 1.什么是发酵工程？ 2.发酵工程的一般流程是什么？ 3.发酵工程在生产上有哪些应用？ 【易错点注意】 ①发酵工程的基本环节中的具体要求。 ②青霉素具有杀菌作用，还需要对发酵罐严格灭菌吗？ ③谷氨酸在不同条件下的发酵产物分别是什么？ ④发酵产品是微生物细胞、代谢物时，分别用什么分离、提纯方法？ ⑤“精酿”啤酒和“工业”啤酒相比有什么特点？ ⑥单细胞蛋白是什么？ 发酵工程及其应用 03 网络构建：细胞工程【P121】 00 植物细胞工程 ①基本技术： ； 植物繁殖的新途径： ； ②应用 作物新品种的培育： ； 细胞产物的工厂化生产； 细胞工程 动物细胞工程 ①动物细胞培养技术： ； ②动物细胞融合技术： ； ③动物细胞核移植技术： ； 胚胎工程 ①理论基础： ； 体外受精； ②技术 胚胎移植； 胚胎分割； 植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术 快速繁殖技术、作物脱毒(脱毒苗≠抗毒苗) 单倍体育种、突变体的利用 利用了植物细胞培养(原理：细胞增殖) 应用：单克隆抗体 应用：干细胞的培养及其应用 应用：克隆动物(无性生殖) 受精、早期胚胎发育 优势：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力 应用：试管动物(有性生殖) 意义：促进优良动物品种的繁殖(无性生殖) 胚胎移植是胚胎工程的最终技术环节 【必备知识】 1.植物组织培养技术的原理及过程。 2.植物体细胞杂交技术的原理及过程。 3.怎样进行菊花的组织培养？(注意方法步骤) 4.植物细胞工程在生产实践中有哪些应用？ 5.植物细胞工程应用于生产实践的主要优势是什么？ 【易错点注意】 区分初生代谢、次生代谢、初生代谢物、次生代谢物。 植物细胞工程 01 【必备知识】 1.动物细胞培养： ①动物细胞培养的原理、基本条件及过程。 ②怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？(开放性题目) 2.动物细胞融合： ①动物细胞融合的原理及过程。 ②单克隆抗体是如何制备的？在临床上有哪些应用？(注意:抗体-药物偶联物) 3.动物细胞核移植 ①动物细胞核移植技术的原理及过程。 ②体细胞核移植技术的应用前景有哪些？(开放性题目) ③怎样理性看待体细胞核移植技术存在的问题？(开放性题目) 动物细胞工程 02 【必备知识】 1.胚胎工程的理论基础： ①胚胎形成经过了哪些过程？ ②受精和早期胚胎发育的基本过程是怎样的? 2.胚胎工程技术及其应用： ①体外受精的过程及意义。 ②胚胎移植的概念、实质及过程。 ③胚胎分割的概念、实质及过程。 胚胎工程 03 网络构建：基因工程【P121】 00 三种基本工具 ①分子手术刀： ； ②分子缝合针： ； ③分子运输车： ； 基因工程 基本操作程序 ① ； ② ；(核心) ③ ； ④ ； 限制性内切核酸酶(简称：限制酶) DNA连接酶(E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶) 载体(质粒、噬菌体、动物病毒、植物病毒) ①操作手段： ； ②结果：改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质。 ③设计流程： 蛋白质 工程 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 改造或合成基因 预期 蛋白质的功能 设计预期 的蛋白质 结构 找到并改变相对应的基因或合成新的基因 获得 所需要的 蛋白质 1.功能：能识别 的 特定核苷酸序列，并且 使每一条链中特定部位 的 断开。 2.切割结果： ①当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧 将DNA分子的两条链分别切开时， 产生的是 末端。 ②当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时， 产生的是 末端。 分子手术刀：限制性内切核酸酶（简称：限制酶） 01 双链DNA分子 磷酸二酯键 黏性 平 注：黏性末端指切口伸出的核苷酸， 它们之间正好互补配对。 注：平末端指平整的切口。 分子手术刀：限制性内切核酸酶（简称：限制酶） 01 3.特点： 限制酶有数千种，不是一种酶，而是一类酶。 一种限制酶一般只能识别一种特定的 ， ①大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成， 也有少数限制酶的识别序列由 个、 个或其他数量的核苷酸组成。 ②限制酶特异性识别和切割的部位基本都具有 (反向对称重复排列)。 即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。 6 4 8 脱氧核苷酸序列 限制酶 Bam H Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ TaqⅠ 识别序列及切割位点 GGATCC CCTAGG AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG TCGA AGCT 回文序列 分子手术刀：限制性内切核酸酶（简称：限制酶） 01 【思考】 1.由于限制酶只能识别 ， 每切割一次，断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团， 产生 个黏性末端(平末端)，消耗 分子水。 故：将一个基因从DNA分子上切割下来需要切 处， 同时产生 个黏性末端或平末端。 2.限制酶(主要存在原核生物)不切割自身DNA的原因是： ①原核生物DNA分子中 ； ②原核生物DNA分子中 。　　　 双链DNA分子的特定核苷酸序列 2 2 2 2 2 4 不存在该酶的识别序列 识别序列已经被修饰(表观遗传) 分子缝合针：DNA连接酶 02 1.功能：将双链DNA片段缝合起来，恢复被 切开 的两个脱氧核苷酸之间的 。 2.分类： 种类 来源 功能特性 既能连接 ， 又能连接 ； （但连接 的效率极低） 既能连接 ， 又能连接 ； （但连接 的效率较低） 相同点 恢复的都是 ； 大肠杆菌 T4 噬菌体 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 黏性末端 平末端 黏性末端 平末端 平末端 平末端 磷酸二酯键 注：DNA连接酶没有识别特异性； 限制酶 分子运输车：基因进入受体细胞的载体 03 1.功能：携带 进入受体细胞； 2.种类： 种类 用途 不同点 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 不同， 在 、 、 . 以及可以插入 的 大小也有很大差别。 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 噬菌体 植物病毒 动物病毒 来源 大小 结构 复制方式 外源DNA片段 注：最常用的载体是质粒 外源DNA片段 分子运输车：基因进入受体细胞的载体 03 最常用的载体——质粒 ①化学本质： 是一种 的、结构简单、 独立于 或 之外， 并具有 能力的 。 ②基因工程中使用质粒的特点： 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒， 都是天然质粒的基础上进行过 的。 真核细胞细胞核 环状双链DNA分子 原核细胞拟核DNA 裸露 人工改造 自我复制 分子运输车：基因进入受体细胞的载体 03 最常用的载体——质粒 常见的标记基因： ①抗性基因 ②荧光基因 ③营养物质合成基因 ③作为载体所具备的条件及原因： a.能在受体细胞中进行 ， 或整合到受体DNA上，随受体DNA , 使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制， 以扩增外源基因的数量。 b.具有一个至多个 ， 便于外源DNA片段(基因)插入其中。 c.具有特殊的 ，便于重组DNA分子的筛选。 d.对受体细胞无 作用，避免受体细胞受到损伤。 限制酶切割位点 自我复制 标记基因 同步复制 毒害 目的基因的筛选与获取 01 ①目的基因： 在基因工程的设计和操作中， 用于改变 或获得 等的基因。 主要是指 的基因。 ▲实例：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 ②筛选方法： 从相关的 和 的基因中进行筛选是较为有效的方法。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 不一定；也可以是一些具有调控作用的因子。 目的基因一定是指编码 蛋白质的基因吗？ 思考 已知结构 功能清晰 （一）如何筛选合适的目的基因？ 目的基因的筛选与获取 01 方法①： 目的基因； 方法②：从 中获取目的基因； 方法③：利用 获取和扩增目的基因。 人工合成 基因文库 PCR （二）如何获取目的基因？ 目的基因的筛选与获取·①人工合成目的基因 01 1.逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。 它以目的基因的 为模板，借助 酶合成双链DNA， 2.化学合成法：当基因较小且序列已知时，可采用 ， (工具：DNA合成仪) mRNA 逆转录 化学合成法进行人工合成 目的基因的筛选与获取·②从基因文库中获取目的基因 01 1.概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段, 导入到受体菌的群体中储存, 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 2.分类： 本质 将某种生物体内所有基因， 与载体连接后储存在 一个受体菌的群体中。 将生物的某个发育时期的mRNA逆转录产生的互补DNA(cDNA)片段，与载体连接后 储存在一个受体菌的群体中。 特点 包括包括编码区、非编码区、 启动子、终止子等结构。 由于基因的选择性表达，cDNA文库只有一部分基因，且只有编码区,没有其他结构。 基因组文库 cDNA文库 注：基因文库中的相应基因，是储存在受体菌中的。 1.概念：PCR是 (全称)的缩写。 它是一项根据 的原理， 在 (操作环境)提供参与DNA复制的 与 ， 对 进行大量复制的技术(目的/优点)。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 目的基因的核苷酸序列 PCR扩增仪(PCR仪) 比较体内DNA复制和PCR 有什么相同点和不同点？ 思考 各种组分 反应条件 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 比较项目 体内DNA复制 PCR 相同点 都利用 的原理，利用 原则， 合成具有相同遗传信息的子代DNA分子。 不同点 场所 细胞核.拟核.叶绿体.线粒体等 次数 细胞分裂一次，DNA复制一次 模板 基因组DNA 原料 4种游离的脱氧核苷酸 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 引物 引物酶合成的RNA引物(2种) DNA半保留复制 碱基互补配对 PCR扩增仪(PCR仪) 一次PCR一般要经历30次循环 目的基因 4种游离的脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Mg2+激活) 人工合成的DNA片段(2种) 注：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 ① ： 当温度 时， 双链DNA 为单链。 ② ： 当温度下降到 时， 通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合。 ③ ： 当温度上升到 时， 溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下， 根据 原则合成 新的DNA链。 变性 超过90℃ 解聚 复性 50℃左右 两种引物 延伸 72℃左右 耐高温的DNA聚合酶 碱基互补配对 2.过程： 注：不需要解旋酶，高温断开氢键。 注:子链延伸方向都是 5’端→3’端。 第二轮循环的产物 第一轮循环的 . 作为第二轮反应的 ， 经过 、 . 和 三步产生 第二轮循环的产物。 产物 模板 变性 复性 延伸 第三轮循环的产物 第二轮循环的 . 作为第三轮反应的 ， 经过 、 . 和 三步产生 第三轮循环的产物。 产物 模板 变性 复性 延伸 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 3.PCR的结果： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板， 因而每一次循环后目的基因的量可以增加 倍。即成 形式扩增。 （约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 4.PCR产物的鉴定:常采用 来鉴定PCR的产物。 一 指数 2n 琼脂糖凝胶电泳 提示：由于DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。 所以，复制的DNA片段，其长度是由 决定的。 引物的位置 复制的DNA片段，其长度是有什么决定的？ 思考 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 1.基因表达载体构建的目的： ①让目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代。 ②同时使目的基因能够 和 。 2.基因表达载体的组成： 稳定存在 表达 发挥作用 待得住 能表达：转录、翻译 :便于重组DNA分子的筛选； : 位置：位于基因的上游； 作用：RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录； : :主要是指编码特定蛋白质的基因； 位置：位于基因的下游； 作用：终止转录； 终止子 启动子 标记基因 目的基因 复制原点：能够完成自主复制； 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 目的基因插入位点是随意的吗？应注意什么？ 思考 提示： 随意的； 目的基因的表达需要 与 的调控， 所以目的基因应插入到启动子和终止子 的部位。 不是 启动子 终止子 之间 注：目的基因只有插入在启动子和终止子之间，才可以正常表达 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 3.基因表达载体的构建过程: ①用一定的 切割载体(质粒)，使它出现 个切口。 ②用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③利用 将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处， 这样就形成了 （即： ）。 限制酶 同种 相同 DNA连接酶 一 一个重组DNA分子 基因表达载体 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 将目的基因导入受体细胞 03 Ca2+处理法 农杆菌转化法 花粉管通道法 显微注射法 【方法一】用微量注射器将含目的基因的 DNA溶液直接注入 中。 【方法二】在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头， 将DNA溶液滴加在花柱切面上， 使目的基因借助 进入胚囊。 将目的基因导入受体细胞·①花粉管通道法 03 子房 花粉管通道 受体细胞： 受精卵 →我国科学家独创 将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法 03 【方法一】 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片 ， 然后 ，并 ； 【方法二】 可以将 直接浸没在 中一段时间， 然后培养植株并获得 ， 再进行 、 等； 受体细胞： 与农杆菌共培养 筛选转化细胞 再生成植株 体细胞 花序 含有农杆菌的溶液 种子 筛选 鉴定 受体细胞： 受精卵 →常用 对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法 03 1.农杆菌的特点： 农杆菌细胞内含有 质粒， 当它侵染植物细胞后， 能将Ti质粒上的 (可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞内， 并且将其整合到该细胞的 上。 注：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物， 而对大多数单子叶植物没有侵染能力； 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 Ti T-DNA 染色体DNA →常用 将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法 03 2.转化： 是指 ，并且 的过程。 3.利用农杆菌进行转化的思路： →常用 Ti质粒 目的基因 植物细胞 植物 细胞 染色体DNA 农杆菌 基因表达载体 导入 插入 表达 新 性状 植株 转入 构建 注：导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。 存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中， 造成“基因污染”。　　 目的基因进入受体细胞内 在受体细胞内维持稳定和表达 将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法 03 【深度思考】 1.农杆菌转化法中的两次拼接： ①第一次拼接： 将 拼接到 上； ②第二次拼接（非人工操作）： 将 拼接到 上。 2.农杆菌转化法中的两次导入： ①第一次导入： 将 导入到 中； ②第二次导入（非人工操作）： 将 导入到 中。 →常用 目的基因 Ti质粒的T-DNA 被插入目的基因的T-DNA 受体细胞染色体的DNA 含目的基因的重组Ti质粒 农杆菌 含目的基因的T-DNA 植物细胞 将目的基因导入受体细胞·③显微注射法 03 显微注射 受精卵 受体细胞： 受精卵 构建基因表达载体并提纯 利用 将基因表达载体注入动物的 中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 将目的基因导入受体细胞·④Ca2+处理法 03 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 基因表达载体 缓冲液 吸收DNA 完成转化 Ca2+的作用是什么？ 思考 增加细菌细胞膜的通透性。 感受态细胞有什么特点？ 思考 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 目的基因的检测和鉴定 04 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 受体细胞的染色体DNA上 是否插入了 . 目的基因是否转录出了 . 目的基因是否翻译成 . 个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应 . 目的基因(DNA) mRNA PCR等技术 蛋白质 抗原-抗体杂交技术 性状 抗虫接种实验、 抗病接种实验等 逆转录 目的基因的检测与鉴定·①PCR等技术 04 提取 待测DNA 转基因 生物 PCR 通过电泳检测是否扩增出目的基因 提取 待测mRNA 转基因 生物 PCR 利用目的基因的核苷酸序列设计引物。 PCR中的引物应该根据什么进行设计？ 思考 目的基因的检测与鉴定·②分子杂交技术 04 原理 探针 含有目的基因的DNA单链片段。 注：带有放射性同位素标记或荧光分子标记等。 结果 显示出 ，则检测出目的基因/mRNA。 图示 ①DNA分子杂交： ②DNA-RNA分子杂交: 碱基互补配对原则 杂交带 带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 目的基因的检测与鉴定·③抗原-抗体杂交技术 04 原理 探针 与抗原特异性结合的抗体。 注：带有放射性同位素标记或荧光分子标记等。 结果 显示出 ，则检测出目的蛋白。 图示 抗原与抗体的特异性结合 杂交带 →说明目的基因成功表达。 带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 目的基因的检测与鉴定·④个体生物学水平的鉴定实例 04 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫 害虫死亡 病毒（菌）感染 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行 功能活性比较 功能、活性正常 随堂小练【P133】 05 1.人类是乙肝病毒的最主要的宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。如图为乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程，质粒中LacZ基因可使细菌能够利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述正确的是(　　) D A．过程①最好的限制酶选择方案是BamHⅠ和EcoRⅤ B．质粒用限制酶BamHⅠ和EcoRⅤ切割后产生4个游离的磷酸基团 C．过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal以筛选蓝色的大肠杆菌菌落 D．基因工程疫苗不会出现病毒的增殖和感染，安全性高 双酶切法，最好的限制酶选择方案是BamHⅠ和EcoRⅠ，×； 切割后三段DNA，产生6个游离的磷酸基团，×； 重组质粒中LacZ基因被破坏，菌落呈白色，×； 基因工程疫苗仅含乙肝病毒外壳，无增殖和感染能力，√； 典题精研【P131】 2.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR) 作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达 载体，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） D 05 A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基 中能形成菌落 重组质粒和普通质粒中都有四环素抗性基因，故不一定，√； 单酶切法，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，√； 重组质粒和普通质粒的DNA长度不同，可用DNA凝胶电泳技术鉴定，√； SphⅠ酶切会破坏TetR，故不能在含Tet的培养基中形成菌落，×； 素养提升：限制酶的选择技巧 05 ①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时：至少保留一个完整的 ,便于筛选。 除此之外还需保留 、 、 。 ③确保目的基因和载体上有 黏性末端。 (补充说明：平末端也可以，但连接平末端效率低)。 能切下目的基因且不破坏目的基因 相同 标记基因 复制原点 启动子 终止子 注：用同种酶或同尾酶切割可产生相同的黏性末端。 提示： ； 弊端：① ； ② ； ③ ； 素养提升：限制酶的选择技巧 05 相同的黏性末端， 可以相互连接！ 1.只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？ 能 质粒、目的基因会发生自身环化连接 质粒与目的基因会发生反向连接 会发生两两自身连接 注：用同种限制酶或 同尾酶处理，产生的 都是相同的黏性末端，均会出现以上弊端。 单酶切法 质粒两两 自身连接 基因两两 自身连接 提示： ； 优点：① ； ② ； 素养提升：限制酶的选择技巧 05 3.使用Bam HⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA， 能否构建基因表达载体？ 可以防止质粒、目的基因的自身环化连接 还可以防止目的基因与载体的反向连接 注：不能防止 两两自身连接。 能 双酶切法 相同的黏性末端， 可以相互连接！ 质粒两两 自身连接 基因两两 自身连接 善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。 典题精研【P131】 1.(2025·安徽，15)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　) C 05 05 A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 白色菌落，可能导入了重组质粒，也可能是导入了普通质粒K，不可判定，√； Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，√； 导入的目的基因成功，也不一定能成功表达目标蛋白，还需进一步检测，×； 因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β-半乳糖苷酶， 分解X-gal进而形成蓝色菌落，可能，√； 素养提升：筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞 05 【问题1】质粒(普通质粒/重组质粒)一定能成功导入受体细胞吗？ 提示： ， 因为质粒携带目的基因导入受体细胞的 成功率 。 因此还需要进一步 出成功导入质粒 的受体细胞。 不一定 不高 筛选 素养提升：筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞 05 【方法1】利用标记基因筛选出含质粒(普通质粒/重组质粒)的受体细胞： ①原理：质粒上的标记基因一般是 。 而受体细胞本身 抵抗该抗生素的能力。 用含有 的培养基培养受体细胞， 能够生存的是 。 某种抗生素的抗性基因 没有 该抗生素 被导入了质粒的受体细胞 提示： ， 因为导入 的和导入 的受体细胞均能在该培养基中存活。 ①普通质粒 (含抗性基因的质粒) 氨苄青霉素抗性基因 ②重组质粒 (含抗性基因和 目的基因的质粒) 氨苄青霉素抗性基因 目的基因 素养提升：筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞 05 【问题2】根据标记基因的作用，在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的 受体细胞一定是导入目的基因(重组质粒/基因表达载体)的受体细胞吗？ 不一定 普通质粒 重组质粒 素养提升：筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞 05 【方法2】利用双标记技术筛选出含目的基因(重组质粒)的受体细胞： ①原理：在构建基因表达载体时，使用两个不同的标记基因(如抗性基因)， 将目的基因插入其中一个标记基因内，导致该标记基因 正常表达； 则普通质粒具有 种标记，重组质粒只有 种标记。 无法 重组 质粒 重组 质粒 普通 质粒 两 一 素养提升：筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞 05 ②筛选方法：影印培养法(以“将目的基因插入四环素抗性基因”为例) a.用 法将细菌接种在 含氨苄青霉素的培养基上培养， 再利用 影印到含有四环素的培养基上， b.对比含不同抗生素的平板， . 的菌落， 就是含目的基因(重组质粒)的目标菌落。 c.最后，可在含 的培养基上挑取 菌落(如图)进行培养。 稀释涂布平板 灭菌的绒布 在含氨苄青霉素培养 基上能生长，在四环素培养基上不能生长 氨苄青霉素 1、2、3、6、9 典题精研【P132】 05 3.(2025·山东)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构 。 选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切， 再选择SmaⅠ和 对Ti质粒进行完全酶切， 将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。 复制原点 注: LB/RB:T-DNA的边界序列; Kanr:卡那霉素抗性基因; bp:碱基对。 XbaⅠ DNA聚合酶 →选XbaⅠ形成的重组质粒最小。 T AGATC CTAG →必备知识 利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌； 经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并 电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带， 较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 注: LB/RB:T-DNA的边界序列; Kanr:卡那霉素抗性基因; bp:碱基对。 T AGATC CTAG 550 SpeⅠ、SmaⅠ mRNA延伸方向(5→3) GGG CCC CCC GGG GGG CCC (2)为证明这两个突变体是T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的， 提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。 在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA， 最好使用识别序列为 (填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶， 且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。 T AGATC CTAG mRNA延伸方向(5→3) GGG CCC CCC GGG GGG CCC 4 【解析】识别序列越短， 基因组DNA存在限制酶酶切位点越多， 越能获得较短的DNA片段， 更有利于后续PCR扩增。 需首先将图乙的片段 ， 才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。 PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 。 (填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 T AGATC CTAG mRNA延伸方向(5→3) GGG CCC CCC GGG GGG CCC 连接成环/环化 测序和序列比对 琼脂糖凝胶电泳只可判断2条片段未知序列的大小。 引物P1和P2方向相反， 故需先环化，再扩增。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株， 如果检测到野生型基因， (填“能/不能”)确定该植株的表型为野生型。 T AGATC CTAG mRNA延伸方向(5→3) GGG CCC CCC GGG GGG CCC 不能 通过农杆菌转化法将构建的含野生型基因的表达载体转入突变植株， 即使能在突变植株内检测到野生型基因， 但由于不知道突变基因是否为显性突变，故不能确定该植株的表型是否为野生型。 $