3.2.1基因工程及其技术（PCR）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章 基因工程 第一节 基因工程及其技术 ——聚合酶链式反应（PCR)技术 一、聚合酶链式反应（PCR）技术 1．概念 目的DNA片段（目的基因）的体外扩增技术。 DNA复制的过程 解旋酶 双链打开 DNA聚合酶 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 以母链为模板进行碱基互补配对 解旋 合成子链 复旋 游离的脱氧核苷酸 3 2．反应条件 条件 作用 一定量的模板DNA 引物对 4中脱氧核苷酸dNTP 缓冲液 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） Mg2+ 作为DNA复制的模板 使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 作为合成DNA子链的原料 提供相对稳定的pH环境 催化合成DNA子链 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活 （1）引物 引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的聚合酶链式反应（PCR），需要引物是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。 （2）dNTP（提供能量和原料） dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下： A T C G P ~ P ~ P 脱氧核糖 含氮碱基 磷酐键 脱氧核苷酸 There was a time when to amplify（扩增） DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro（体外） just as well. Just mix your template （模板）with a buffer（缓冲液） and some primers（引物） Nucleotides（核苷酸） and polymerases（聚合酶）, too. Denaturing（变性）, annealing（退火）, and extending（延伸）. Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do. PCR, when you need to detect mutations（基因突变）. PCR, when you need to recombine（基因重组）. PCR, when you need to find out who the daddy is. PCR, when you need to solve a crime. 中文歌词： 从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。 这时有个家伙叫Kary Mullis博士的，他钻出来说体外合成也一样OK！ 只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷和聚合酶。 变性，退火，和延伸。 加热~冷却~加热~太神奇了！ 当你想要检测突变，来啊做PCR吧！ 当你想要基因重组，来啊做PCR吧！   当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧! 当你想要侦破大案，来啊做PCR吧！ 3．反应过程 阅读教材78页的PCR反应过程，结合课件给出的模板和引物，自己画出第一次循环的过程。 学生活动 引物1对 3＇ 5＇ 3＇ 5＇ 3．反应过程 （1）变性 在约94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋（变性）为两条单链DNA。 （2）退火 反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 （3）延伸 反应体系的温度回升到约72℃（Taq酶催化作用的最适反应温度），4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。 3．反应过程 第3次循环；8个；2n。 仔细观察图3-1-8的聚合酶链式反应示意图，思考下列问题： （1）第几次循环后可以得到目的基因？（2）第3次循环后可以得到多少DNA片段？（3）第n次循环后可以得到多少DNA片段？ 学生活动 项目 DNA复制 PCR 不同点 场所 酶 特点 设备 引物 产物 相同点 原料 复制原理 模板 项目 DNA复制 PCR 不同点 场所 细胞内 试管中 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 TaqDNA聚合酶 特点 半保留半不连续全链复制 半保留全连续局部区域复制 设备 无 严格控制温度变化的温控设备 引物 RNA片段，不保留在复制的子链中 DNA片段，保留在复制的子链中 产物 核基因组 引物界定的片段 相同点 原料 四种脱氧核苷酸 复制原理 严格遵循碱基互补配对原则 模板 DNA为模板 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 第1次 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 第2次 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 第3次 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 第4次 1个 3个 4个 1个 3个 4个 思考讨论： 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物1（或2）的DNA分子数 同时含引物1和2的DNA分子数 消耗引物数量 两条链等长的DNA分子数 DNA分子种类 思考讨论： 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物1（或2）的DNA分子数 同时含引物1和2的DNA分子数 消耗引物数量 两条链等长的DNA分子数 DNA分子种类 2 4 8 2n 2 4 8 2n 1 3 7 2n-1 0 2 6 2n-2 2 6 14 2n+1-2 0 0 2 2n-2n 2 4 5 5 【例1】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　) A. 8个 B. 6个 C. 4个 D. 2个 A 二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 （1）尝试运用PCR仪扩增DNA片段。 （2）关注PCR技术的应用。 （3）学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。 实验目的 （2）器材 PCR仪、微量取液器、PCR管、枪头等。 PCR仪 PCR管 （3）试剂 DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液。 微量取液器的结构和使用方法 微量取液器是一类精确移取微量液体的器具。微量取液器一般可分为两种。一种是固定容量的，常用的有100 μL、200 μL等多种规格。另一种是可调 容量的取液器，常用的有5 μL、10 μL、20 μL、200 μL等几种。 使用微量取液器时，用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮， 使数字窗口出现所需要移取溶液的体积的数字。然后，按照微 量取液器的使用说明进行规范操作。 技能指导 （1）在0.2 mLPCR管内配置50 μL反应体系 实验步骤 所加试剂 体积 dNTP混合物（2.5 μmol·mL-1） 4 μL 10×PCR缓冲液 5 μL 正向引物（10 μmol·mL-1） 2 μL 反向引物（10 μmol·mL-1） 2 μL DNA模板 1 μL Taq酶 1 μL（1 U） 双蒸水 35 μL （2）设置程序进行扩增 步骤 温度 作用 时间 ① 94℃ 预变形 5 min ② 94℃ 变性 1 min ③ 55℃ 退火 1 min ④ 72℃ 延伸 2 min ⑤ 重复步骤②~④，30个循环 ⑥ 72℃ 延伸 7~10 min 预变性的目的： 以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢；反之，越快。 ③通过凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果。 电泳鉴定 实验原理 （2）器材 琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器（微量恒温仪）、微量取液器、PCR管、枪头等。 琼脂糖凝胶电泳系统 26 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 电泳 加样 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，（一般配制质量体积比0.8%～1.2%）。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂（蓝色））混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 实验步骤——琼脂糖凝胶电泳 27 2.条数 核心探讨 实验步骤 采用微量取液器配制PCR反应体系 设置程序进行扩增 配制琼脂糖凝胶液 制备凝胶加样缓冲液 加PCR产物 电泳 采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果 课堂小结 1．PCR技术 变性 退火 延伸 在约94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋（变性）为两条单链DNA。 反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 温度回升到约72℃，4种dNTP根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3'端，引物链延伸，形成互补的DNA双链。 非编码区 非编码区 编码区 （1）原核生物基因 非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号 终止子：终止RNA的合成 编码区：编码蛋白质的合成 一.目的基因的筛选与获取---基因的结构 信使RNA 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 终止子：终止转录 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列 编码序列=外显子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 一.目的基因的筛选与获取---基因的结构 （2）真核生物基因 转 录 【例2】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 (1）第1组：__________________________________________________________ 第2组：__________________________________________________________ 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 (2)两种引物与模板链如何配对？ 引物的5′端与模板链3′端互补配对 (3)延伸时需要加入两种引物，原因是 。 (4)两种引物的要求： 。 DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 ①引物自身不能环化 ②两种引物之间不能互补配对 ③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 【例3】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 一.目的基因的筛选与获取 Lavf57.58.101 $