抢分11 利用基因工程构建工程菌（高频热点抢分）（天津专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 聚焦基因工程构建工程菌的系统方法，整合工具酶应用、载体构建与筛选逻辑，通过典型案例实现原理到实践的迁移。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |热点狙击|2道综合题（大肠杆菌/酵母菌改造）|限制酶选择与引物设计技巧、工程菌筛选标准确定、启动子活性与表达量关系分析|从工具酶作用（结构与功能观）→载体构建流程（科学思维）→工程菌应用（探究实践）的递进链条| |抢分攻略|近5年真题考点+备考方向|基因工程原理与PCR技术结合、实验操作与结果分析方法|真题考点（2021-2025）→命题特点→备考策略的逻辑闭环|

抢分11 利用基因工程构建工程菌 热点抢分+押题预测 01热点狙击 1.（2026·部分区·一模）苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。 注：限制性内切核酸酶BsaⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点如图1所示。 （1）BsaⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsaⅠ酶切图1中载体产生的末端________（填“相同”或“不相同”或“不完全相同”）。 （2）为构建A基因—RFP（红色荧光蛋白）基因表达载体，需在图1中载体的BsaⅠ酶切点处插入基因A。为保证基因A对应的基因序列与载体正确连接，应在扩增该基因时通过引物添加相关序列，则引物2的序列为5′________________________3′（写出前12个碱基）。若要通过PCR检测A基因—RFP基因表达载体构建是否成功，应选择图1中的引物组合________。 （3）筛选导入A基因—RFP基因表达载体的大肠杆菌工程菌时，若选用缺少苏氨酸的完全培养基能否达到目的，请做出判断并说明原因_________________________________。 （4）为探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响，分别将利用三种具有持续表达活性的启动子的A基因—RFP基因表达载体导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图2。 ①图中菌株W-01、菌株W-02、菌株W-03三组实验的荧光强度相对值可反映__________________________。 ②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于菌株W的原因是________。 2．（2026·河西区·期末）虾青素是雨生红球藻产物，具有抗氧化和提高免疫力等特点，但并非其基本生命活动必需的产物。某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因工程改造酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素产业化生产。 回答下列问题： （1）目的基因的获取。提取雨生红球藻的总DNA作为_____，设计特异性引物扩增crtZ基因，此过程每次循环可以分为_____三个步骤。 （2）构建重组DNA分子。图中质粒还缺少的必备元件是_____。质粒中启动子是_____识别和结合的部位，驱动目的基因高效转录。为使基因crtZ片段能正确连接到图中质粒，应选用限制酶_____来处理质粒。 （3）目的基因导入受体细胞。将重组质粒导入大肠杆菌后，需在含_____的培养基上筛选，以排除未导入质粒的大肠杆菌；再从阳性大肠杆菌中提取重组质粒，导入URA3基因缺失的酿酒酵母，应在_____的培养基上筛选工程酵母。 （4）虾青素的部分代谢途径如图所示。 通过基因编辑技术将crtZ基因定向整合到酿酒酵母染色体上的ERG3基因中，该方法可避免因_____（生理过程）导致的目的基因丢失，提高遗传稳定性；同时能进一步提高虾青素产量，原因是_____。 1.【热点解读】改造大肠杆菌，获得常用的工业生产原料 （1）基因工程相关的题目中，大肠杆菌是常见的改造对象，一般会将所需要大量表达的基因转入大肠杆菌，再令其大量繁殖，从而实现相关物质的高产。 （2）题目常要求选出改造过程中所需要的限制酶和引物，或者写出引物的具体序列。 （3）在完成改造后，还应比较多种改造出的菌株，综合筛选出最优的目的菌。 2.【热点解读】改造酵母菌，通过发酵来实现某种物质的工业化生产 （1）一些特殊物质在细胞内初步合成后，需要通过发酵等过程，才能成为最终需要的产品，所以除了大肠杆菌外，还会采用酵母菌等可以进行发酵的菌种进行改造。 （2）此类题目除了要求分析具体如何对酵母菌进行改造外，还要求分析如何对其进行筛选，以及其产生目标物质的具体机制。 02 抢分攻略 1.掌握近五年真题考试特点 （1）近五年真题考点 年份 题号 考查内容 2025 16 将大肠杆菌导入酵母菌，构建共生体，验证学术假说 2024 16 通过改造金黄色葡萄球菌，验证其抗生素抗性的来源 2023 17 改造酿酒酵母，以实现利用纤维素产乙醇 2022 15 改造谷氨酸棒状杆菌，提高苯丙氨酸的产量 2021 16 改造酿酒酵母，获得具有产乳酸特性的酵母菌 （2）题目特点：利用基因工程，对日常生活中常见的微生物进行改造，综合分析基因工程与微生物筛选与培养的相关问题。 2.基于命题特点的备考方向 （1）熟悉基因工程的原理和PCR技术的相关过程，明确构建基因表达载体时的要点。 （2）根据题目中的具体信息，分析实验中需要进行的操作，确定对所得工程菌的筛选标准。 1．（1）磷酸二酯键　黏性　不相同 （2）GGTCTCNAAACC　引物2和引物3 （3）否，大肠杆菌自身能合成苏氨酸 （4）A基因的表达水平（三种启动子的活性不同）　W-01荧光最强，A基因表达最高，A蛋白产量高，苏氨酸运出速率高，（菌体中苏氨酸浓度低）对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱 【详解】（1）限制性内切核酸酶（限制酶）的作用是断裂DNA分子中特定位置相邻核苷酸之间的磷酸二酯键。观察图中载体的两个BsaⅠ切点：正向链（5′→3′）：识别序列（5’-GGTCTC-3’）后第1个N后切割，反向链（3′→5′）：识别序列（3′-CCAGAG-5′）后第5个N前切割，分别产生5’-GTTT-3’和5’-AAAC-3’的黏性末端，两者末端序列不同。 （2）为保证基因A对应的基因序列与载体正确连接，应在扩增该基因时通过引物添加相关序列：酶切位点序列+对应质粒黏性末端互补的片段，即5’-GGTCTCNAAAC...3’（N代表任意碱基），但题目只要求前12个，再加1个与3’第1个碱基G配对的C，所以引物2的序列为5’-GGTCTCNAAACC...3’。选择一个在载体上、一个在插入片段上的引物组合，这样只有插入成功时才能扩增出条带。图中引物2在基因A的下游，引物3在载体RFP基因上游的启动子区域，所以用引物2和引物3可以跨越插入位点，扩增出预期片段，验证是否成功插入。 （3）大肠杆菌作为原核生物，自身具备完整的苏氨酸合成代谢途径。在缺少外源苏氨酸的培养基中，大肠杆菌会启动自身合成途径产生苏氨酸。因此，无论是否导入A基因（A蛋白负责运出苏氨酸），大肠杆菌在缺苏氨酸培养基上均能生长，无法据此筛选出工程菌。 （4）RFP基因与A基因共享同一启动子（I-01/I-02/I-03），其表达量与荧光强度正相关，因此荧光强度相对值可反映A基因的表达水平（转录或翻译水平）；W-01荧光最强，A基因表达最高，A蛋白最多，苏氨酸运出速度最快，胞内苏氨酸浓度最低，解除对“苏氨酸合成酶基因”的转录抑制，合成酶持续表达，苏氨酸产量显著升高。 2．（1）模板　变性、复性、延伸 （2）复制原点　RNA聚合酶　BamHI和EcoRI （3）氨苄青霉素　不含尿嘧啶 （4）有丝分裂（细胞增殖）　ERG3基因被破坏，使更多前体物质用于虾青素合成途径 【详解】（1）目的基因扩增以雨生红球藻总DNA为模板，特异性引物可精准结合目的基因（crtZ基因）两端序列，启动扩增。PCR技术每次循环分为三步：变性（高温使DNA双链解旋）、复性（降温让引物与模板链结合）、延伸（Taq酶催化子链合成），通过多轮循环实现目的基因大量复制。 （2）重组质粒的必备元件包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点（保证质粒在受体细胞中自主复制），图中质粒缺失复制原点。启动子是RNA聚合酶的结合位点，RNA聚合酶结合后可启动目的基因转录为mRNA。目的基因的两端只有EcoRⅠ和BglⅡ识别序列，目的基因应该用这两种酶切割，为使基因crtZ片段能在受体细胞中表达，应将基因crtZ片段连在启动子和终止子之间，他们之间有BglⅡ、EcoRI、BamHI和HindⅢ识别序列，但BglⅡ有一个识别位点在启动子左边，如果使用此酶，有可能会将启动子切除，不能使用此酶，BglⅡ和BamHI切割后产生的黏性末端相同，为保证目的基因和质粒能正确连接在一起，应该用EcoRI和BamHI切割质粒。 （3）大肠杆菌的筛选标记基因为Ampr（氨苄青霉素抗性基因），故需在含氨苄青霉素的培养基上筛选，未导入质粒的大肠杆菌无抗性，会被淘汰。酿酒酵母缺失URA3基因，无法合成尿嘧啶，而重组质粒含URA3基因，故需在不含尿嘧啶的培养基上筛选。只有导入重组质粒的工程酵母，才能通过URA3基因合成尿嘧啶，在该培养基上存活，从而区分成功转化的酵母。 （4）若目的基因仅存在于质粒上，酵母有丝分裂（细胞增殖）过程中，质粒可能随机分配，导致部分子代细胞丢失目的基因；整合到染色体上可避免这一问题，提高遗传稳定性。据代谢途径可知，ERG3基因控制合成麦角固醇，crtZ基因整合到ERG3基因中会破坏其功能，使前体物质无法流向麦角固醇合成途径，转而更多用于虾青素合成，故产量提高。 1．腺相关病毒载体系统可用于基因治疗。用受体细胞生产病毒过程中，需要用下图所示两种质粒。下列叙述正确的是（　　） A．构建两种质粒需要限制酶和DNA聚合酶 B．仅导入质粒1即可生产含目的基因的病毒 C．生产出的病毒颗粒中不含有质粒2的基因 D．用病毒载体进行基因治疗没有安全性风险 【答案】C 【详解】A、构建重组质粒时，需要限制酶切割DNA片段，再用DNA连接酶连接片段，不需要DNA聚合酶，A错误；B、生产完整病毒需要复制酶（完成DNA复制）和衣壳蛋白（组装病毒外壳），这两种基因都位于质粒2上，仅导入质粒1无法合成必需的蛋白，不能生产出含目的基因的病毒，B错误；C、分析题意，仅两个ITR之间的DNA会被包装到病毒颗粒中，质粒2不含ITR序列，其基因不会被包装进病毒，因此生产出的病毒颗粒中不含有质粒2的基因，C正确；D、用病毒载体进行基因治疗存在安全性风险，如可能引发免疫排斥、病毒侵染机体导致患病等，D错误。 2．大肠杆菌的pBR322质粒常用于重组质粒的构建，该质粒上限制酶识别位点如图1所示。受体菌可能导入重组质粒或pBR322质粒，需要在培养基中添加抗生素进行初筛和复筛。将初筛培养基上的菌落原位影印（将菌落按原有位置影印到另一培养基上）到复筛培养上培养，1～6表示菌落，结果如图2所示。下列有关分析正确的是（　　） A．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则初筛培养基要添加四环素 B．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则复筛培养基要添加氨苄青霉素 C．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则菌落3、4、6导入的是重组质粒 D．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则菌落1、2、5导入的是pBR322质粒 【答案】B 【详解】A、用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，四环素抗性基因失去效应，初筛应添加氨苄青霉素，复筛应添加四环素，A错误；B、用BclⅠ、HindⅢ切割，氨苄青霉素抗性基因失去效应，四环素抗性基因正常，初筛应添加四环素，复筛应添加氨苄青霉素，B正确；C、用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，复筛时四环素培养基上死亡的是重组质粒菌落，即菌落3、4、6导入的是pBR322质粒，而非重组质粒，C错误；D、用BclⅠ、HindⅢ切割，复筛时氨苄青霉素培养基上存活的菌落3、4、6是导入pBR322质粒菌落，菌落1、2、5是导入重组质粒菌落，D错误。 3．科学家将大肠杆菌质粒和酵母菌质粒上的功能元件组装到同一质粒上，构建了如图1所示的穿梭质粒表达载体。用穿梭质粒与人干扰素基因重组并导入酵母菌细胞后，人胸腺素基因整合至酵母菌细胞核内的染色体DNA上。下列相关叙述正确的是（　　） A．人干扰素基因在酵母菌中表达时，转录和翻译过程均发生在细胞质中 B．可以利用该穿梭质粒表达载体在大肠杆菌实现目的基因的大量克隆 C．重组后的穿梭质粒在酵母菌和大肠杆菌细胞中表达出的干扰素结构相同 D．PCR技术检测酵母菌中是否导入人干扰素基因时，应选择图2中1和4作引物 【答案】B 【详解】A、酵母菌是真核生物，其转录过程发生在细胞核内（人干扰素基因整合在细胞核染色体DNA上），翻译过程发生在细胞质的核糖体上，A错误；B、该穿梭质粒含有大肠杆菌复制原点，因此它可以在大肠杆菌中自主复制，从而实现目的基因的大量克隆，B正确；C、大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对蛋白质进行加工修饰；酵母菌是真核生物，能对干扰素进行加工，C错误；D、PCR的引物需要分别与目的基因两条链的3'端互补配对，以确保扩增方向是从5'→3'，引物应选择与上方链3'端互补的3，和与下方链3'端互补的2，D错误。 4．研究人员从一片被石油污染的海域中分离出一株能产生石油降解酶（由pe基因编码）的海洋细菌，计划通过基因工程将该基因转入大肠杆菌，构建高效降解石油的工程菌。下列叙述正确的是（　　） A．筛选能产生石油降解酶的细菌时，培养基中应以石油作为唯一碳源 B．利用PCR扩增pe基因时，若扩增次，需要的引物数量至少是2n+1 C．构建表达载体时，必须用相同的限制酶同时切割pe基因和载体质粒 D．导入重组质粒前，应先用Mg2+处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态 【答案】A 【详解】A、筛选能产生石油降解酶的细菌时，选择培养基以石油为唯一碳源，只有能分解利用石油的细菌可以正常生长繁殖，其他微生物因缺乏可利用的碳源无法存活，可实现筛选目的，A正确；B、PCR扩增n次得到2n个DNA分子，除初始模板的2条母链外，其余所有子链合成都需要引物，因此所需引物数为2×2n-2=2n+1-2，B错误；C、构建表达载体时，无需必须使用相同限制酶，使用切割后能产生相同黏性末端的同尾酶，或用两种不同限制酶进行双酶切都可，双酶切还可避免目的基因、载体的自身环化和目的基因反向连接，C错误；D、导入重组质粒前，应用Ca2+处理大肠杆菌制备感受态细胞，使其易于吸收外源DNA，D错误。 5．研究人员将MP水解酶基因（mpd）和报告基因导入大肠杆菌构建了一种检测土壤农药甲基对硫磷（MP）的“细菌传感器”（部分结构如图）。MP被酶解为对硝基酚（PNP）后，可诱导报告基因表达并产生荧光信号。实验发现，在黑土中，携带rfp（红色荧光蛋白）报告基因的工程菌检测灵敏度明显低于携带amilCP（紫色荧光蛋白）报告基因的工程菌；而在含有MP的细菌液体培养基中，两者检测灵敏度相当。rfp工程菌在黑土检测中灵敏度低，最合理的解释是因为黑土（　　） A．某些成分抑制lacI启动子的活性，导致mpd基因表达量不足 B．改变了重组质粒的拷贝数，导致rfp工程菌中的质粒数量降低 C．某些物质在红光波段有自发荧光，干扰了信号的特异性检测 D．降低了MP水解酶的活性，导致MP无法被有效降解为PNP 【答案】C 【详解】A、液体培养基中两者灵敏度相当，说明mpd基因表达、MP水解产生PNP的过程完全正常。如果黑土抑制lacI启动子，液体培养基里两者灵敏度也会出现差异，A错误；B、质粒拷贝数是菌株自身遗传特性，液体培养基无菌土干扰时两者灵敏度一致，说明质粒拷贝数没有差异；黑土不会改变大肠杆菌胞内质粒拷贝数，B错误；C、黑土中含有腐殖质、矿物质等杂质，这些物质会在红光波段自发产生背景荧光；rfp菌检测的是红光信号，土壤自发荧光会和报告基因的特异性红光信号重叠，造成背景干扰、信噪比下降，检测灵敏度大幅降低；amilCP菌检测紫色荧光，土壤杂质在紫光波段几乎无自发荧光干扰，因此灵敏度更高，C正确；D、MP水解酶由mpd基因编码，两种工程菌的mpd基因完全一致。如果黑土抑制水解酶活性，液体培养基中两者灵敏度也会同步下降、出现差异，与题干“液体培养基灵敏度相当”矛盾，D错误。 6．如图，pBI121是人工构建的双元表达载体，由大肠杆菌质粒、农杆菌Ti质粒T-DNA转移元件及植物表达调控元件组合而成。我国科学家将Bt抗虫基因插入pBI121后，通过花粉管注射或农杆菌介导法转化，成功培育出可稳定遗传的抗虫棉。下列相关说法错误的是（　　） A．在植物细胞中含有抗虫基因的pBI121重组质粒能正常复制和增殖 B．抗虫基因需重组到棉花细胞的染色体上才能传代抗虫性状 C．通过GUS水解X-Gluc产生蓝色可以检测抗虫基因的表达 D．棉铃虫对抗虫棉产生的显性抗性比隐性抗性的基因频率增加更快 【答案】A 【详解】A、pBI121重组质粒中只有T-DNA片段才能转移并插入到受体细胞染色体中，才能随受体细胞染色体复制而复制，A错误；B、只有抗虫基因整合到棉花细胞的染色体DNA上，才能随染色体复制和细胞分裂稳定传递给子代，维持稳定的抗虫性状，B正确；C、GUS基因与抗虫基因受同一个真核启动子调控，若抗虫基因成功插入并表达，说明载体结构完整，GUS基因也可正常表达，其编码的GUS水解X-Gluc产生蓝色，可间接检测抗虫基因的表达，C正确；D、显性抗性基因只要存在就会表现出抗性，所有携带显性抗性基因的棉铃虫都能在抗虫棉上存活，因此基因频率增加更快，而隐性抗性只有纯合时才表现抗性，杂合子仍会被淘汰，基因频率增加更慢，D正确。 7．某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因工程改造，使用酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素工业化生产。下列相关叙述错误的是（　　） 注：URA3：酵母筛选标记基因，缺失该基因酵母无法合成尿嘧啶；Ampr：大肠杆菌的筛选标记基因，编码氨苄青霉素抗性基因 A．图示质粒在改造中还需要添加复制原点，且启动子具有物种特异性 B．为使基因crtZ片段正确连接到图中质粒，应选用限制酶BamHI和EcoRI来处理质粒 C．通过在含氨苄青霉素且缺乏尿嘧啶的培养基上培养可以筛选出能生产虾青素的工程菌 D．若将构建的基因表达载体导入URA3基因缺失的酿酒酵母，应用不含尿嘧啶的培养基来筛选 【答案】C 【详解】A、图示质粒没有复制原点，所以构建基因表达载体时，需要添加复制原点，该表达载体需要在酵母菌中表达，所以启动子具有物种特异性，A正确；B、crtZ只能用EcoRⅠ和BglⅡ切割，而质粒上含有两个BglⅡ的酶切位点，所以不能选择BglⅡ，由于BglⅡ和BamHⅠ形成的黏性末端相同，所以可以用限制酶BamHI和EcoRI来处理质粒，B正确；CD、URA3是酵母筛选标记基因，缺失该基因酵母无法合成尿嘧啶；Ampr是大肠杆菌的筛选标记基因，编码氨苄青霉素抗性基因，所以应该在含氨苄青霉素的培养基上培养筛选出能生产虾青素的工程菌以排除未导入质粒的大肠杆菌；再从阳性大肠杆菌中提取重组质粒，导入URA3基因缺失的酿酒酵母，在不含尿嘧啶的培养基上筛选工程酵母，C错误，D正确。 8．某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组先在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；最后将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ~Ⅳ）、引物（P1~P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．片段甲构建过程中需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶 B．构建片段甲时，可将M1片段插入质粒的Ⅰ和Ⅱ酶切位点之间 C．选用P1和P4引物对B2的DNA进行PCR和电泳检测N基因是否插入成功 D．利用菌株B2处理秸秆的优点包括减少环境污染、增加土壤养分等 【答案】C 【详解】A、构建重组DNA分子（片段甲）时，需要用限制酶切割含有N基因的质粒和含有M1、M2片段的DNA，以获得相同的末端，再用DNA连接酶将它们连接起来，所以需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶，A正确；B、Ⅰ和Ⅱ酶切位点位于启动子的上游，将M1片段插入Ⅰ和Ⅱ之间，不会破坏启动子、N基因等关键结构，是可行的，B正确；C、将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2时，不含引物P4片段，引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，所以应选用P1和P2引物对B2的DNA进行PCR和电泳检测N基因是否插入成功，C错误；D、菌株B2能高效降解纤维素（秸秆的主要成分），处理秸秆可以减少焚烧带来的环境污染，同时降解产物能增加土壤养分，D正确。 9．有机磷化合物在环境中过度积累或残留，会对生态系统和人类造成危害。为培育降解有机磷的工程菌，科研人员将有机磷降解酶基因mpd、ophc2导入假单胞菌体内，以获取目标菌株，培育过程如图1所示。回答下列问题： （1）PCR的每次循环分为三个步骤，其中温度最低的是________，该步骤的目的是________。实验室常利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA分子在凝胶中的迁移速率与________（答两点）等有关。 （2）科研人员利用PCR技术实现mpd基因的下游与ophc2基因的上游无缝衔接，从而获得融合基因，由图可知，引物1的5'端的12个碱基序列为5'-________-3'，如此设计引物1的目的是________。 （3）为保证融合基因能正确插入质粒，需要在引物2的________（填“3'”或“5'”）端加下表中限制酶________的识别和切割序列。 XhoI 5'-C↓TCGAG-3' MboI 5'-↓GATC-3' SalI 5'-G↓TCGAC-3' BamHI 5'-G↓GATCC-3' （4）经转化的假单胞菌，通过________（填方法）接种到培养基上，为筛选出分解能力强的目标菌，向培养基中加入黄色的有机磷农药，培养一段时间后结果如图2所示，应选取菌落________（填序号）进行培养。 【答案】（1）复性　使引物与两条单链DNA结合　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 （2）CCGTAGAGGTCA　使mpd基因的下游添加上与ophc2基因的上游相同的碱基序列 （3）5′　SalⅠ （4）稀释涂布平板法　5 【详解】（1）PCR的每次循环分为三个步骤，即变性、复性和延伸。其中温度最低的是复性，该步骤的目的是使引物与两条单链DNA结合。在凝胶中，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 （2）科研人员利用PCR技术实现mpd基因的下游与ophc2基因的上游无缝衔接获得融合基因，结合转录方向可推测，需要引物1和引物3有互补的碱基序列，根据图示可知，引物1的5'端的12个碱基序列为5′-CCGTAGAGGTCA-3'，这样才能使mpd基因的下游添加上与ophc2基因的上游相同的碱基序列，为获得融合基因做准备。 （3）根据质粒中的限制酶识别位点可知，融合基因下游含有XhoI识别切割序列，XhoI和SalI切割后可形成相同的黏性末端，因而需要选择SalⅠ和BamHⅠ切割质粒，进而可以保证融合基因能正确插入质粒，据此可推测需要在引物2的5′端添加限制酶SalⅠ的识别和切割序列。 （4）结合图中菌落的分布可以看出，经转化的假单胞菌是通过稀释涂布平板法接种到培养基上的，为筛选出分解能力强的目标菌，向培养基中加入黄色的有机磷农药，培养一段时间后结果如图2所示，3、5、6菌落有透明圈说明能分解有机磷，但是分解能力有强有弱。根据透明圈直径与菌落直径的比值大小来判断分解能力，比值越大，分解能力越强，应选取菌落5进行培养。 10．木质素是储量丰富的可再生碳源。科研人员利用基因编辑技术处理尖孢曲霉，构建出能高效降解木质素并转化成脂质的工程菌，进一步提升了利用木质素废料生产单细胞蛋白和微生物脂质的效率。回答下列问题。 （1）AID是一种单链DNA特异性胞苷脱氨酶，能够将脱氧胞苷（dC）转化为脱氧尿苷（dU）。MCM5可作为真核生物的解旋酶。科研人员利用_______的培养基筛选出能降解木质素的尖孢曲霉菌株M1，然后，将MCM5-AID融合基因导入M1细胞中，从而可能获得高效降解木质素并转化成油脂的工程菌株，用MCM5-AID融合基因制备工程菌的原理是_______。 （2）科研人员将M1菌株基因组中eGFP基因两端的上、下游序列插入图1质粒中，将改造后的质粒导入M1菌株，利用同源重组原理将eGFP基因替换为MCM5-AID融合基因，为不影响MCM5-AID融合基因表达，应将上、下游序列分别插入质粒的________（从①②③④中选择）位点。用图1中引物_______进行PCR扩增，可检测出存在MCM5-AID融合基因的M2菌株，进而使用________诱导M2菌株表达MCM5-AID蛋白，从而获得木质素分解活性差异化的众多突变菌株。 （3）科研人员将单一突变菌株包裹在含荧光FITC标记木质素的微量液滴中，利用菌株分解木质素释放FITC可产生荧光信号，且荧光强度与菌株木质素分解能力呈正相关的原理，从众多突变菌株中筛选出性能更优的降解菌株。相比传统分离纯化方法，这项创新技术的优点是_______（答出1点）。 （4）从众多M2突变菌株中筛选出了M6菌株，将野生型菌株WT与M6菌株的相关生理特性进行对比，如图2所示。科研人员认为，M6菌株可以作为优质工程菌，其主要依据是_______。 【答案】（1）以木质素为唯一碳源　使融合基因表达出MCM5-AID融合蛋白，在MCM5解旋DNA时，AID能直接接触并将单链DNA中暴露的碱基C转化为U，导致随机性基因突变 （2）①、④　P1和P4　Cu2+ （3）可显著提升筛选效率；可避免材料的浪费；可提高木质素分解活性菌株的分离精度 （4）突变菌株M6漆酶活性更强，能高效降解木质素且高效合成脂质，不影响单细胞蛋白的产量 【详解】（1）筛选能降解木质素的菌株，需使用以木质素为唯一碳源的选择培养基，只有能利用木质素的菌株可以存活。使融合基因表达出MCM5-AID融合蛋白，这种蛋白可作为解旋酶打开氢键，同时也能够将脱氧胞苷（dC）转化为脱氧尿苷（dU），首先在MCM5解旋DNA时，AID就能直接接触并将单链DNA中暴露的碱基C转化为U，导致随机性基因突变，提高菌株降解木质素并转化为脂质的能力。 （2）要通过同源重组将eGFP替换为MCM5-AID，且不影响融合基因表达，需要将eGFP的上游、下游序列分别插入融合基因的两侧外侧，即质粒的①（融合基因上游外侧）和④（融合基因下游外侧）位点；若同源重组成功，MCM5-AID替换了原基因组的eGFP，选择结合在同源序列外侧的引物P1（上游正向）和P4（下游反向）进行PCR，可扩增出目的片段，检测出阳性菌株；题干注释明确说明PcrpA是铜离子诱导型启动子，因此用铜离子（Cu2+）诱导融合基因表达。 （3）该技术将单菌株包裹在微量液滴中，通过荧光直接筛选，相比传统方法，优点是筛选效率高，可一次性高通量筛选大量突变株；经过精确的筛选可以避免材料的浪费；也可以做到对木质素分解活性菌株的精准分离。 （4）从图2可知，与野生型WT相比，改造后的M6菌株漆酶（降解木质素的关键酶）活性远高于野生型，说明木质素降解能力更强；脂质含量也显著高于野生型，符合生产微生物脂质的需求；粗蛋白含量和野生型接近，满足生产单细胞蛋白的要求，因此M6是优质工程菌。 11．人体肠道中寄生的艰难梭菌接触到肠道分泌的溶菌酶后，会产生大量肽聚糖脱乙酰酶（PGD）改变细胞壁结构，以避免被溶菌酶伤害。已知艰难梭菌感应溶菌酶与蛋白甲和乙有关，为探究艰难梭菌感应溶菌酶的机制，科研人员预利用反义基因对蛋白甲和乙的表达进行抑制。前期设计的相关DNA结构如图1，其中→代表启动子，代表终止子。 （1）肠道分泌的溶菌酶属于免疫系统的第___________道防线。终止子在基因表达中的作用是___________。 （2）为将图1中的DNA片段拼合为质粒以导入艰难梭菌，可利用核酸酶特异性切除DNA5＇端单链，使各DNA片段两端的同源序列末端产生互补单链，混合后形成如图2的结构，然后用___________酶处理，将DNA双链补齐并实现多片段拼接与环化。上述过程中充当引物的单链是___________（填图2中编号）。若要将图1中的片段一次性拼合形成质粒，为避免错误连接共需要在图1的DNA片段的两端设计___________种DNA同源序列。 （3）添加不同诱导物对转基因艰难梭菌处理后，获得结果如图3。PGD相对值是指PGD与腺苷酸激酶的含量比值，利用该比值作为实验结果可有效排除艰难梭菌死亡等因素引起的实验误差。腺苷酸激酶作为参考蛋白需要具有在艰难梭菌中___________，受外界环境和实验处理的影响较小的特点。据实验结果分析，艰难梭菌感应溶菌酶调控PGD表达的机制是___________。 【答案】（1）一　终止转录 （2）DNA聚合酶、DNA连接酶　②、③　3 （3）含量稳定　甲蛋白促进PGD合成，乙蛋白抑制甲蛋白的功能，溶菌酶解除乙蛋白的抑制作用 【详解】（1）人体免疫系统的第一道防线由皮肤和黏膜组成，肠道不属于体液且分泌的溶菌酶有杀菌作用，溶菌酶属于黏膜分泌物，所以这属于免疫系统的第一道防线。终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，其在基因表达中的作用是终止转录过程。 （2）将DNA双链补平并实现多片段拼接与环化，需要DNA聚合酶补平末端，再用DNA连接酶连接片段、完成环化。引物需要与模板链3'端互补，结合图2的结构，②、③链可作为引物启动DNA合成。 若要将图1中的片段一次性拼合形成质粒，为避免错误连接共需要在图1的DNA片段的两端设计3种DNA同源序列（复制原点、木糖诱导型启动子＋反义基因甲、乳糖诱导型启动子＋反义基因乙，共3个不同的同源末端，保证定向拼接）。 （3）腺苷酸激酶作为参考蛋白需要具有在艰难梭菌中表达量稳定（含量稳定），受外界环境和实验处理的影响较小的特点。分析实验结果可知，无溶菌酶时，添加乳糖（诱导反义基因乙表达）会显著升高PGD相对值，说明蛋白乙会抑制PGD合成，添加木糖（抑制蛋白甲）PGD维持低水平，说明蛋白甲会促进PGD的合成，同时加乳糖＋木糖，PGD相对值较低，说明乙蛋白抑制甲蛋白的功能；有溶菌酶时，未添加诱导物（蛋白甲、乙正常表达）组PGD相对值较高，说明溶菌酶解除了乙蛋白的抑制作用，故艰难梭菌感应溶菌酶调控PGD表达的机制是:甲蛋白促进PGD合成，乙蛋白抑制甲蛋白的功能，溶菌酶解除乙蛋白的抑制作用。 12．沙门氏菌是一种常见的兼性厌氧的肠道致病菌，会引起人体腹泻等症状，其毒力与sseK1基因有关。研究人员利用在受体菌内不能复制的“自杀性质粒”，通过同源序列的配对和交换达到敲除该基因的目的如下图，以获得减毒处理的沙门氏菌。 （1）研究人员将“自杀性质粒”与经______处理的沙门氏菌在低温下混合，经短暂的______处理后，将菌体接种到加入______的培养基中进行一段时间的培养和初步筛选。 （2）上述过程最后筛选得到的是______（填“含”与“不含”）“自杀性质粒”的沙门氏菌，此目标菌种没有图示中的______基因，理由是______。 （3）为进一步验证目标菌种是否已成功构建，科研人员应选用图中所示①-④引物中的______，对改造菌DNA进行PCR。PCR体系中必需加入dNTP，其作用是______。再对产物进行凝胶电泳，若图中自杀性质粒全长为abp，CmR长度为xbp，sseK1长度为ybp，两个同源序列总长度为zbp，若结果为______（①有长度为x+z的片段②有长度为a-x的片段③有长度为x的片段④无长度为y+z的片段⑤无长度为a的片段⑥无长度为y的片段），则表明sseK1基因已切除。 （4）结合题意分析，研究者敲除sseK1基因所涉及的变异类型属于______。 【答案】（1）（低浓度）氯化钙溶液　热刺激　氯霉素 （2）不含　sseK1、SacB　“自杀性质粒”在受体菌内不能复制 （3）②③　提供原料和能量　①④ （4）基因重组 【详解】（1）据图，为了让“自杀性质粒”与受体菌（沙门氏菌）基因组DNA通过同源序列的配对和交换达到敲除该基因的目的，需先将“自杀性质粒”导入受体菌，因此，要用氯化钙溶液处理受体菌让它成为感受态的细胞，便于导入，而热刺激能加快导入；由于沙门氏菌种有CmR（氯霉素抗性基因），能抗氯霉素，故能在加氯霉素的培养基上筛选。 （2）研究人员利用的是在受体菌内不能复制的“自杀性质粒”，通过同源序列的配对和交换达到敲除该基因的目的（如图），以获得减毒处理的沙门氏菌；分析题意可知，“自杀性质粒”在受体菌内不能复制，且结合图示可知，沙门氏菌基因组DNA的前后变化可知，改造后的沙门氏菌种有CmR，无sseK1和SacB。 （3）PCR扩增时，DNA从子链的5'→3'，引物也是连接在子链上，引物的5'段对应于模板链的3'段，所以应选择引物②③；dNTP是PCR体系中必需加入的原料，水解过程中除了可以产生四种脱氧核糖核苷酸，还可提供能量；结合图示信息可知，“自杀性质粒”主要完成的是基因的敲入（敲入CmR）和基因的替换（CmR替代了sseK1），改造后的沙门氏菌基因组DNA的变化是CmR替代了sseK1，故应有长度x+z片段，而无y+z的片段，①④正确。 （4）依据题干信息，敲除sseK1基因是通过同源序列的配对和交换达到的，所以涉及的变异类型为基因重组。 13．高尿酸血症是以尿酸（UA）水平升高为特征的一种常见代谢病。临床药物（比如别嘌醇）存在调控滞后、副作用明显等问题。科学家利用基因工程技术，将重组质粒导入大肠杆菌，设计了一种可口服、定植于动物肠道的工程菌，该菌可根据尿酸浓度按需释放尿酸氧化酶（UOX）分解尿酸，实现对尿酸水平的动态调控。回答下列问题： （1）基因工程中常用人工改造后的质粒作为基因表达载体，该质粒除含有启动子、终止子外，还应包括_______等元件；其中启动子的作用是_______。 （2）为实现对尿酸的动态调控，研究人员构建质粒1、2（如图1）。已知阻遏蛋白HucR可与诱导型启动子结合并抑制基因转录，当诱导物_______存在时，阻遏蛋白HucR与诱导物结合，随后二者从诱导型启动子上脱离，激活目的基因的表达。结合以上内容，在图1的质粒2处标注恰当的基因表达元件、目的基因的名称，并画出诱导物存在时的调控过程_______。 （3）将改造后的工程菌定植于高尿酸血症大鼠的肠道，8小时后检测血清中尿酸水平（如图2），可初步得出结论“工程菌可降低高尿酸血症大鼠血清中的尿酸水平”，判断依据是_______。 （4）为评估定植工程菌对实验动物大鼠的影响，从安全性角度出发，还需进一步检查_______。 【答案】（1）目的基因、标记基因、复制原点、限制酶切割位点（任意答出2点）　RNA聚合酶识别、结合部位，驱动基因转录 （2）尿酸分子 （3）与对照组相比，8小时后定植工程菌组大鼠中血清尿酸水平明显下降，且效果与别嘌醇相同 （4）有无不良反应、有无破坏肠道菌群平衡、有无器官损伤 【详解】（1）基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，所以该质粒除含有启动子、终止子外，还应包括目的基因、标记基因、复制原点、限制酶切割位点。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 （2）已知阻遏蛋白HucR可与诱导型启动子结合并抑制基因转录，当诱导物尿酸分子存在时，阻遏蛋白HucR与诱导物结合，随后二者从诱导型启动子上脱离，激活目的基因的表达。质粒2处应标注诱导型启动子、终止子、目的基因（尿酸氧化酶基因/UOX基因）、标记基因。诱导物存在时的调控过程为：诱导物尿酸分子与阻遏蛋白HucR结合，阻遏蛋白HucR与诱导型启动子脱离，RNA聚合酶与诱导型启动子结合，启动目的基因（尿酸氧化酶基因/UOX基因）的转录，进而翻译出尿酸氧化酶（UOX），如图所示：。 （3）分析图2，工程菌处理组8小时后血清中尿酸水平明显低于PBS处理组和别嘌醇处理组，所以可初步得出结论“工程菌可降低高尿酸血症大鼠血清中的尿酸水平”，判断依据是与对照组相比，8小时后定植工程菌组大鼠中血清尿酸水平明显下降，且效果与别嘌醇相同。 （4）为评估定植工程菌对实验动物大鼠的影响，从安全性角度出发，还需进一步检查有无不良反应、有无破坏肠道菌群平衡、有无器官损伤。 14．甘油三酯脂肪酶（LIP）在高温条件下易失活，限制了其工业应用。研究人员从嗜热菌中分离得到一种热稳定蛋白HEAT，该蛋白具有耐高温特性。欲将HEAT蛋白与LIP融合，获得耐高温的重组脂肪酶，部分实验流程如图所示。 （注：AUG是起始密码子，UGA是终止密码子。HindⅢ、BamHⅠ和EcoRⅠ均表示限制酶） （1）图中所示过程需将HEAT基因和LIP基因用_______（填工具酶）连接成融合基因，并成功表达出融合蛋白。在连接前必须对HEAT基因的_______处（填序号）序列进行改造，其目的是_______________。 （2）构建重组质粒时，应选用图中________限制酶对融合基因和质粒进行双酶切。 （3）获得HEAT-LIP融合蛋白后，为检测其酶活性及热稳定性，设计了如下实验： 组别 处理条件 相对酶活性（%） 甲组 天然LIP，37℃处理30min 100 乙组 天然LIP，70℃处理30min 15 丙组 HEAT-LIP融合蛋白，70℃处理30min 82 分析实验结果，得出的结论是___________________________。 （4）研究人员希望将LIP基因改造为LIP-M基因，使LIP第三位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为天冬氨酸（Asp），以进一步提高其催化效率。 脂肪酶 部分氨基酸序列 LIP ……Val-Glu-Leu-Gly-Phe-Arg…… LIP-M ……Val-Asp-Leu-Gly-Phe-Arg 通过设计引物并利用PCR扩增技术将LIP基因改造成LIP-M基因，请写出基因的改造思路：________________________。 【答案】（1）DNA连接酶　②　防止翻译在HEAT蛋白合成后提前终止，导致无法继续翻译LIP蛋白（或防止翻译会在②处序列对应mRNA上的终止密码子处停止，不会得到融合蛋白） （2）HindⅢ和BamHⅠ （3）说明HEAT蛋白能提高LIP的热稳定性 （4）根据LIP—M第三位氨基酸的差异，设计一条含有突变碱基的引物。用该突变引物和另一端的普通引物，以LIP基因为模板进行PCR扩增，即可获得LIP—M基因 【详解】（1）DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，形成磷酸二酯键，故HEAT基因和LIP基因可通过DNA连接酶连接起来。基因②处序列对应mRNA上的终止密码子，为防止翻译在HEAT蛋白合成后提前终止，导致无法继续翻译LIP蛋白，故需要对HEAT基因②处的序列进行改造。 （2）目的基因需要插在启动子和终止子之间，同时为确保目的基因与载体定向拼接，需要用HindⅢ和BamHI处理目的基因和质粒。 （3）对比甲组（天然LIP在37℃处理，相对酶活性100%）和乙组（天然LIP在70℃处理，相对酶活性仅15%）的结果，可以看出天然LIP在高温（70℃）条件下酶活性显著下降，热稳定性较差。而丙组中，HEAT-LIP融合蛋白在70℃处理30分钟后，相对酶活性仍能达到82%，远高于相同高温条件下天然LIP的15%，这表明融合了HEAT蛋白后，重组脂肪酶在高温环境下仍能保持较高的酶活性，即HEAT蛋白的融合有效提高了LIP的热稳定性。 （4）要实现LIP基因第三位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为天冬氨酸（Asp），首先需要明确两种氨基酸对应的密码子，然后可根据LIP—M第三位氨基酸的差异，设计一条含有突变碱基的引物，使用该突变引物和另一端的普通引物，以LIP基因为模板进行PCR扩增，即可获得LIP—M基因。 15．聚乙烯型塑料应用广泛，但其难降解的特性带来了诸多环境问题。聚酯酰胺（PEAs）的可水降解性使其有望成为聚乙烯的替代品。某科研团队利用大肠杆菌构建能合成PEAs的工程菌，如图1表示合成PEAs相关基因连接形成的DNA片段，其中①②③④为引物，图2为载体质粒结构示意图。回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增PEAs合成串联基因时，为保证PEAs基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的________端与引物__________（①-④编号选填）连接，另一个用于扩增的引物是______。在PCR反应体系中，一般要添加，目的是_______。 （2）基因工程中构建基因表达载体的目的是______。 （3）研究人员将强启动子修饰后的PEAs合成串联基因插入图2载体质粒的位点1和位点2之间。图中的LacZ基因编码产生的酶可以分解X-gal,产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。为了筛选出含有PEAs合成串联基因的大肠杆菌，应在培养基中加入_____并选择___________的菌落。 （4）为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9系统为工程菌增加了自毁保护体系，机理如图2所示。研究结束后，在培养液中加入B物质，B物质通过_______,使gRNA基因和Cas9基因表达，gRNA和Cas9蛋白形成复合物后，gRNA通过______________识别目标DNA,Cas9蛋白对目标DNA进行剪切，最终使大肠杆菌死亡。gRNA基因可设置为_____________（填“毒蛋白基因”或“生长必需基因”）的特异性序列。 【答案】（1）3'　③　②　激活DNA聚合酶 （2）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传，同时使目的基因能够表达和发挥作用 （3）X-gal和四环素　白色 （4）解除A蛋白对P2启动子的抑制作用　碱基互补配对　生长必需基因 【详解】（1）转录过程中子链沿着5'→3'的方向进行，启动子是RNA聚合酶结合的位点，可驱动下游基因的转录，因此强启动子的3′端需要连接引物才能保证基因正常转录；根据PCR扩增的原理，引物需要与模板的3'端结合，要完整扩增PEAs合成串联基因，需要选择位于两端、方向相反的引物②和③；Mg2+的作用是激活DNA聚合酶，提高酶活性。 （2）构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，同时保证目的基因能够表达和发挥功能。 （3）目的基因插入LacZ基因内部，会破坏LacZ基因，未插入目的基因的质粒LacZ完整，可表达酶分解X-gal使菌落变蓝；插入目的基因的质粒LacZ失活，菌落为白色，同时质粒携带四环素抗性基因，因此培养基需要加入X-gal和四环素，筛选出白色菌落即为含有目的基因的大肠杆菌。 （4）根据图示，原本A蛋白基因的表达被抑制，加入B物质后，B抑制了该抑制作用，即可以解除A蛋白对P2启动子的抑制作用，A蛋白激活启动子P2，使gRNA基因和Cas9基因表达；gRNA通过碱基互补配对特异性识别目标DNA序列；要使工程菌自毁，需要Cas9剪切大肠杆菌生存必需的基因，使工程菌死亡，因此gRNA的识别序列对应大肠杆菌的生长必需基因。 1 / 17 学科网（北京）股份有限公司 $ 抢分11 利用基因工程构建工程菌 答案版 1．（1）磷酸二酯键　黏性　不相同 （2）GGTCTCNAAACC　引物2和引物3 （3）否，大肠杆菌自身能合成苏氨酸 （4）A基因的表达水平（三种启动子的活性不同）　W-01荧光最强，A基因表达最高，A蛋白产量高，苏氨酸运出速率高，（菌体中苏氨酸浓度低）对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱 2．（1）模板　变性、复性、延伸 （2）复制原点　RNA聚合酶　BamHI和EcoRI （3）氨苄青霉素　不含尿嘧啶 （4）有丝分裂（细胞增殖）　ERG3基因被破坏，使更多前体物质用于虾青素合成途径 1.C 2.B 3.B 4.A 5.C 6.A 7.C 8.C 9.（1）复性　使引物与两条单链DNA结合　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 （2）CCGTAGAGGTCA　使mpd基因的下游添加上与ophc2基因的上游相同的碱基序列 （3）5′　SalⅠ （4）稀释涂布平板法　5 10.（1）以木质素为唯一碳源　使融合基因表达出MCM5-AID融合蛋白，在MCM5解旋DNA时，AID能直接接触并将单链DNA中暴露的碱基C转化为U，导致随机性基因突变 （2）①、④　P1和P4　Cu2+ （3）可显著提升筛选效率；可避免材料的浪费；可提高木质素分解活性菌株的分离精度 （4）突变菌株M6漆酶活性更强，能高效降解木质素且高效合成脂质，不影响单细胞蛋白的产量 11.（1）一　终止转录 （2）DNA聚合酶、DNA连接酶　②、③　3 （3）含量稳定　甲蛋白促进PGD合成，乙蛋白抑制甲蛋白的功能，溶菌酶解除乙蛋白的抑制作用 12.（1）（低浓度）氯化钙溶液　热刺激　氯霉素 （2）不含　sseK1、SacB　“自杀性质粒”在受体菌内不能复制 （3）②③　提供原料和能量　①④ （4）基因重组 13.（1）目的基因、标记基因、复制原点、限制酶切割位点（任意答出2点）　RNA聚合酶识别、结合部位，驱动基因转录 （2）尿酸分子 （3）与对照组相比，8小时后定植工程菌组大鼠中血清尿酸水平明显下降，且效果与别嘌醇相同 （4）有无不良反应、有无破坏肠道菌群平衡、有无器官损伤 14.（1）DNA连接酶　②　防止翻译在HEAT蛋白合成后提前终止，导致无法继续翻译LIP蛋白（或防止翻译会在②处序列对应mRNA上的终止密码子处停止，不会得到融合蛋白） （2）HindⅢ和BamHⅠ （3）说明HEAT蛋白能提高LIP的热稳定性 （4）根据LIP—M第三位氨基酸的差异，设计一条含有突变碱基的引物。用该突变引物和另一端的普通引物，以LIP基因为模板进行PCR扩增，即可获得LIP—M基因 15.（1）3'　③　②　激活DNA聚合酶 （2）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传，同时使目的基因能够表达和发挥作用 （3）X-gal和四环素　白色 （4）解除A蛋白对P2启动子的抑制作用　碱基互补配对　生长必需基因 1 / 17 学科网（北京）股份有限公司 $ 抢分11 利用基因工程构建工程菌 热点抢分+押题预测 01热点狙击 1.（2026·部分区·一模）苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。 注：限制性内切核酸酶BsaⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点如图1所示。 （1）BsaⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsaⅠ酶切图1中载体产生的末端________（填“相同”或“不相同”或“不完全相同”）。 （2）为构建A基因—RFP（红色荧光蛋白）基因表达载体，需在图1中载体的BsaⅠ酶切点处插入基因A。为保证基因A对应的基因序列与载体正确连接，应在扩增该基因时通过引物添加相关序列，则引物2的序列为5′________________________3′（写出前12个碱基）。若要通过PCR检测A基因—RFP基因表达载体构建是否成功，应选择图1中的引物组合________。 （3）筛选导入A基因—RFP基因表达载体的大肠杆菌工程菌时，若选用缺少苏氨酸的完全培养基能否达到目的，请做出判断并说明原因_________________________________。 （4）为探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响，分别将利用三种具有持续表达活性的启动子的A基因—RFP基因表达载体导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图2。 ①图中菌株W-01、菌株W-02、菌株W-03三组实验的荧光强度相对值可反映__________________________。 ②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于菌株W的原因是________。 2．（2026·河西区·期末）虾青素是雨生红球藻产物，具有抗氧化和提高免疫力等特点，但并非其基本生命活动必需的产物。某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因工程改造酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素产业化生产。 回答下列问题： （1）目的基因的获取。提取雨生红球藻的总DNA作为_____，设计特异性引物扩增crtZ基因，此过程每次循环可以分为_____三个步骤。 （2）构建重组DNA分子。图中质粒还缺少的必备元件是_____。质粒中启动子是_____识别和结合的部位，驱动目的基因高效转录。为使基因crtZ片段能正确连接到图中质粒，应选用限制酶_____来处理质粒。 （3）目的基因导入受体细胞。将重组质粒导入大肠杆菌后，需在含_____的培养基上筛选，以排除未导入质粒的大肠杆菌；再从阳性大肠杆菌中提取重组质粒，导入URA3基因缺失的酿酒酵母，应在_____的培养基上筛选工程酵母。 （4）虾青素的部分代谢途径如图所示。 通过基因编辑技术将crtZ基因定向整合到酿酒酵母染色体上的ERG3基因中，该方法可避免因_____（生理过程）导致的目的基因丢失，提高遗传稳定性；同时能进一步提高虾青素产量，原因是_____。 1.【热点解读】改造大肠杆菌，获得常用的工业生产原料 （1）基因工程相关的题目中，大肠杆菌是常见的改造对象，一般会将所需要大量表达的基因转入大肠杆菌，再令其大量繁殖，从而实现相关物质的高产。 （2）题目常要求选出改造过程中所需要的限制酶和引物，或者写出引物的具体序列。 （3）在完成改造后，还应比较多种改造出的菌株，综合筛选出最优的目的菌。 2.【热点解读】改造酵母菌，通过发酵来实现某种物质的工业化生产 （1）一些特殊物质在细胞内初步合成后，需要通过发酵等过程，才能成为最终需要的产品，所以除了大肠杆菌外，还会采用酵母菌等可以进行发酵的菌种进行改造。 （2）此类题目除了要求分析具体如何对酵母菌进行改造外，还要求分析如何对其进行筛选，以及其产生目标物质的具体机制。 02 抢分攻略 1.掌握近五年真题考试特点 （1）近五年真题考点 年份 题号 考查内容 2025 16 将大肠杆菌导入酵母菌，构建共生体，验证学术假说 2024 16 通过改造金黄色葡萄球菌，验证其抗生素抗性的来源 2023 17 改造酿酒酵母，以实现利用纤维素产乙醇 2022 15 改造谷氨酸棒状杆菌，提高苯丙氨酸的产量 2021 16 改造酿酒酵母，获得具有产乳酸特性的酵母菌 （2）题目特点：利用基因工程，对日常生活中常见的微生物进行改造，综合分析基因工程与微生物筛选与培养的相关问题。 2.基于命题特点的备考方向 （1）熟悉基因工程的原理和PCR技术的相关过程，明确构建基因表达载体时的要点。 （2）根据题目中的具体信息，分析实验中需要进行的操作，确定对所得工程菌的筛选标准。 1．腺相关病毒载体系统可用于基因治疗。用受体细胞生产病毒过程中，需要用下图所示两种质粒。下列叙述正确的是（　　） A．构建两种质粒需要限制酶和DNA聚合酶 B．仅导入质粒1即可生产含目的基因的病毒 C．生产出的病毒颗粒中不含有质粒2的基因 D．用病毒载体进行基因治疗没有安全性风险 2．大肠杆菌的pBR322质粒常用于重组质粒的构建，该质粒上限制酶识别位点如图1所示。受体菌可能导入重组质粒或pBR322质粒，需要在培养基中添加抗生素进行初筛和复筛。将初筛培养基上的菌落原位影印（将菌落按原有位置影印到另一培养基上）到复筛培养上培养，1～6表示菌落，结果如图2所示。下列有关分析正确的是（　　） A．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则初筛培养基要添加四环素 B．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则复筛培养基要添加氨苄青霉素 C．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则菌落3、4、6导入的是重组质粒 D．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则菌落1、2、5导入的是pBR322质粒 3．科学家将大肠杆菌质粒和酵母菌质粒上的功能元件组装到同一质粒上，构建了如图1所示的穿梭质粒表达载体。用穿梭质粒与人干扰素基因重组并导入酵母菌细胞后，人胸腺素基因整合至酵母菌细胞核内的染色体DNA上。下列相关叙述正确的是（　　） A．人干扰素基因在酵母菌中表达时，转录和翻译过程均发生在细胞质中 B．可以利用该穿梭质粒表达载体在大肠杆菌实现目的基因的大量克隆 C．重组后的穿梭质粒在酵母菌和大肠杆菌细胞中表达出的干扰素结构相同 D．PCR技术检测酵母菌中是否导入人干扰素基因时，应选择图2中1和4作引物 4．研究人员从一片被石油污染的海域中分离出一株能产生石油降解酶（由pe基因编码）的海洋细菌，计划通过基因工程将该基因转入大肠杆菌，构建高效降解石油的工程菌。下列叙述正确的是（　　） A．筛选能产生石油降解酶的细菌时，培养基中应以石油作为唯一碳源 B．利用PCR扩增pe基因时，若扩增次，需要的引物数量至少是2n+1 C．构建表达载体时，必须用相同的限制酶同时切割pe基因和载体质粒 D．导入重组质粒前，应先用Mg2+处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态 5．研究人员将MP水解酶基因（mpd）和报告基因导入大肠杆菌构建了一种检测土壤农药甲基对硫磷（MP）的“细菌传感器”（部分结构如图）。MP被酶解为对硝基酚（PNP）后，可诱导报告基因表达并产生荧光信号。实验发现，在黑土中，携带rfp（红色荧光蛋白）报告基因的工程菌检测灵敏度明显低于携带amilCP（紫色荧光蛋白）报告基因的工程菌；而在含有MP的细菌液体培养基中，两者检测灵敏度相当。rfp工程菌在黑土检测中灵敏度低，最合理的解释是因为黑土（　　） A．某些成分抑制lacI启动子的活性，导致mpd基因表达量不足 B．改变了重组质粒的拷贝数，导致rfp工程菌中的质粒数量降低 C．某些物质在红光波段有自发荧光，干扰了信号的特异性检测 D．降低了MP水解酶的活性，导致MP无法被有效降解为PNP 6．如图，pBI121是人工构建的双元表达载体，由大肠杆菌质粒、农杆菌Ti质粒T-DNA转移元件及植物表达调控元件组合而成。我国科学家将Bt抗虫基因插入pBI121后，通过花粉管注射或农杆菌介导法转化，成功培育出可稳定遗传的抗虫棉。下列相关说法错误的是（　　） A．在植物细胞中含有抗虫基因的pBI121重组质粒能正常复制和增殖 B．抗虫基因需重组到棉花细胞的染色体上才能传代抗虫性状 C．通过GUS水解X-Gluc产生蓝色可以检测抗虫基因的表达 D．棉铃虫对抗虫棉产生的显性抗性比隐性抗性的基因频率增加更快 7．某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因工程改造，使用酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素工业化生产。下列相关叙述错误的是（　　） 注：URA3：酵母筛选标记基因，缺失该基因酵母无法合成尿嘧啶；Ampr：大肠杆菌的筛选标记基因，编码氨苄青霉素抗性基因 A．图示质粒在改造中还需要添加复制原点，且启动子具有物种特异性 B．为使基因crtZ片段正确连接到图中质粒，应选用限制酶BamHI和EcoRI来处理质粒 C．通过在含氨苄青霉素且缺乏尿嘧啶的培养基上培养可以筛选出能生产虾青素的工程菌 D．若将构建的基因表达载体导入URA3基因缺失的酿酒酵母，应用不含尿嘧啶的培养基来筛选 8．某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组先在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；最后将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ~Ⅳ）、引物（P1~P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．片段甲构建过程中需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶 B．构建片段甲时，可将M1片段插入质粒的Ⅰ和Ⅱ酶切位点之间 C．选用P1和P4引物对B2的DNA进行PCR和电泳检测N基因是否插入成功 D．利用菌株B2处理秸秆的优点包括减少环境污染、增加土壤养分等 9．有机磷化合物在环境中过度积累或残留，会对生态系统和人类造成危害。为培育降解有机磷的工程菌，科研人员将有机磷降解酶基因mpd、ophc2导入假单胞菌体内，以获取目标菌株，培育过程如图1所示。回答下列问题： （1）PCR的每次循环分为三个步骤，其中温度最低的是________，该步骤的目的是________。实验室常利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA分子在凝胶中的迁移速率与________（答两点）等有关。 （2）科研人员利用PCR技术实现mpd基因的下游与ophc2基因的上游无缝衔接，从而获得融合基因，由图可知，引物1的5'端的12个碱基序列为5'-________-3'，如此设计引物1的目的是________。 （3）为保证融合基因能正确插入质粒，需要在引物2的________（填“3'”或“5'”）端加下表中限制酶________的识别和切割序列。 XhoI 5'-C↓TCGAG-3' MboI 5'-↓GATC-3' SalI 5'-G↓TCGAC-3' BamHI 5'-G↓GATCC-3' （4）经转化的假单胞菌，通过________（填方法）接种到培养基上，为筛选出分解能力强的目标菌，向培养基中加入黄色的有机磷农药，培养一段时间后结果如图2所示，应选取菌落________（填序号）进行培养。 10．木质素是储量丰富的可再生碳源。科研人员利用基因编辑技术处理尖孢曲霉，构建出能高效降解木质素并转化成脂质的工程菌，进一步提升了利用木质素废料生产单细胞蛋白和微生物脂质的效率。回答下列问题。 （1）AID是一种单链DNA特异性胞苷脱氨酶，能够将脱氧胞苷（dC）转化为脱氧尿苷（dU）。MCM5可作为真核生物的解旋酶。科研人员利用_______的培养基筛选出能降解木质素的尖孢曲霉菌株M1，然后，将MCM5-AID融合基因导入M1细胞中，从而可能获得高效降解木质素并转化成油脂的工程菌株，用MCM5-AID融合基因制备工程菌的原理是_______。 （2）科研人员将M1菌株基因组中eGFP基因两端的上、下游序列插入图1质粒中，将改造后的质粒导入M1菌株，利用同源重组原理将eGFP基因替换为MCM5-AID融合基因，为不影响MCM5-AID融合基因表达，应将上、下游序列分别插入质粒的________（从①②③④中选择）位点。用图1中引物_______进行PCR扩增，可检测出存在MCM5-AID融合基因的M2菌株，进而使用________诱导M2菌株表达MCM5-AID蛋白，从而获得木质素分解活性差异化的众多突变菌株。 （3）科研人员将单一突变菌株包裹在含荧光FITC标记木质素的微量液滴中，利用菌株分解木质素释放FITC可产生荧光信号，且荧光强度与菌株木质素分解能力呈正相关的原理，从众多突变菌株中筛选出性能更优的降解菌株。相比传统分离纯化方法，这项创新技术的优点是_______（答出1点）。 （4）从众多M2突变菌株中筛选出了M6菌株，将野生型菌株WT与M6菌株的相关生理特性进行对比，如图2所示。科研人员认为，M6菌株可以作为优质工程菌，其主要依据是_______。 11．人体肠道中寄生的艰难梭菌接触到肠道分泌的溶菌酶后，会产生大量肽聚糖脱乙酰酶（PGD）改变细胞壁结构，以避免被溶菌酶伤害。已知艰难梭菌感应溶菌酶与蛋白甲和乙有关，为探究艰难梭菌感应溶菌酶的机制，科研人员预利用反义基因对蛋白甲和乙的表达进行抑制。前期设计的相关DNA结构如图1，其中→代表启动子，代表终止子。 （1）肠道分泌的溶菌酶属于免疫系统的第___________道防线。终止子在基因表达中的作用是___________。 （2）为将图1中的DNA片段拼合为质粒以导入艰难梭菌，可利用核酸酶特异性切除DNA5＇端单链，使各DNA片段两端的同源序列末端产生互补单链，混合后形成如图2的结构，然后用___________酶处理，将DNA双链补齐并实现多片段拼接与环化。上述过程中充当引物的单链是___________（填图2中编号）。若要将图1中的片段一次性拼合形成质粒，为避免错误连接共需要在图1的DNA片段的两端设计___________种DNA同源序列。 （3）添加不同诱导物对转基因艰难梭菌处理后，获得结果如图3。PGD相对值是指PGD与腺苷酸激酶的含量比值，利用该比值作为实验结果可有效排除艰难梭菌死亡等因素引起的实验误差。腺苷酸激酶作为参考蛋白需要具有在艰难梭菌中___________，受外界环境和实验处理的影响较小的特点。据实验结果分析，艰难梭菌感应溶菌酶调控PGD表达的机制是___________。 12．沙门氏菌是一种常见的兼性厌氧的肠道致病菌，会引起人体腹泻等症状，其毒力与sseK1基因有关。研究人员利用在受体菌内不能复制的“自杀性质粒”，通过同源序列的配对和交换达到敲除该基因的目的如下图，以获得减毒处理的沙门氏菌。 （1）研究人员将“自杀性质粒”与经______处理的沙门氏菌在低温下混合，经短暂的______处理后，将菌体接种到加入______的培养基中进行一段时间的培养和初步筛选。 （2）上述过程最后筛选得到的是______（填“含”与“不含”）“自杀性质粒”的沙门氏菌，此目标菌种没有图示中的______基因，理由是______。 （3）为进一步验证目标菌种是否已成功构建，科研人员应选用图中所示①-④引物中的______，对改造菌DNA进行PCR。PCR体系中必需加入dNTP，其作用是______。再对产物进行凝胶电泳，若图中自杀性质粒全长为abp，CmR长度为xbp，sseK1长度为ybp，两个同源序列总长度为zbp，若结果为______（①有长度为x+z的片段②有长度为a-x的片段③有长度为x的片段④无长度为y+z的片段⑤无长度为a的片段⑥无长度为y的片段），则表明sseK1基因已切除。 （4）结合题意分析，研究者敲除sseK1基因所涉及的变异类型属于______。 13．高尿酸血症是以尿酸（UA）水平升高为特征的一种常见代谢病。临床药物（比如别嘌醇）存在调控滞后、副作用明显等问题。科学家利用基因工程技术，将重组质粒导入大肠杆菌，设计了一种可口服、定植于动物肠道的工程菌，该菌可根据尿酸浓度按需释放尿酸氧化酶（UOX）分解尿酸，实现对尿酸水平的动态调控。回答下列问题： （1）基因工程中常用人工改造后的质粒作为基因表达载体，该质粒除含有启动子、终止子外，还应包括_______等元件；其中启动子的作用是_______。 （2）为实现对尿酸的动态调控，研究人员构建质粒1、2（如图1）。已知阻遏蛋白HucR可与诱导型启动子结合并抑制基因转录，当诱导物_______存在时，阻遏蛋白HucR与诱导物结合，随后二者从诱导型启动子上脱离，激活目的基因的表达。结合以上内容，在图1的质粒2处标注恰当的基因表达元件、目的基因的名称，并画出诱导物存在时的调控过程_______。 （3）将改造后的工程菌定植于高尿酸血症大鼠的肠道，8小时后检测血清中尿酸水平（如图2），可初步得出结论“工程菌可降低高尿酸血症大鼠血清中的尿酸水平”，判断依据是_______。 （4）为评估定植工程菌对实验动物大鼠的影响，从安全性角度出发，还需进一步检查_______。 14．甘油三酯脂肪酶（LIP）在高温条件下易失活，限制了其工业应用。研究人员从嗜热菌中分离得到一种热稳定蛋白HEAT，该蛋白具有耐高温特性。欲将HEAT蛋白与LIP融合，获得耐高温的重组脂肪酶，部分实验流程如图所示。 （注：AUG是起始密码子，UGA是终止密码子。HindⅢ、BamHⅠ和EcoRⅠ均表示限制酶） （1）图中所示过程需将HEAT基因和LIP基因用_______（填工具酶）连接成融合基因，并成功表达出融合蛋白。在连接前必须对HEAT基因的_______处（填序号）序列进行改造，其目的是_______________。 （2）构建重组质粒时，应选用图中________限制酶对融合基因和质粒进行双酶切。 （3）获得HEAT-LIP融合蛋白后，为检测其酶活性及热稳定性，设计了如下实验： 组别 处理条件 相对酶活性（%） 甲组 天然LIP，37℃处理30min 100 乙组 天然LIP，70℃处理30min 15 丙组 HEAT-LIP融合蛋白，70℃处理30min 82 分析实验结果，得出的结论是___________________________。 （4）研究人员希望将LIP基因改造为LIP-M基因，使LIP第三位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为天冬氨酸（Asp），以进一步提高其催化效率。 脂肪酶 部分氨基酸序列 LIP ……Val-Glu-Leu-Gly-Phe-Arg…… LIP-M ……Val-Asp-Leu-Gly-Phe-Arg 通过设计引物并利用PCR扩增技术将LIP基因改造成LIP-M基因，请写出基因的改造思路：________________________。 15．聚乙烯型塑料应用广泛，但其难降解的特性带来了诸多环境问题。聚酯酰胺（PEAs）的可水降解性使其有望成为聚乙烯的替代品。某科研团队利用大肠杆菌构建能合成PEAs的工程菌，如图1表示合成PEAs相关基因连接形成的DNA片段，其中①②③④为引物，图2为载体质粒结构示意图。回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增PEAs合成串联基因时，为保证PEAs基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的________端与引物__________（①-④编号选填）连接，另一个用于扩增的引物是______。在PCR反应体系中，一般要添加，目的是_______。 （2）基因工程中构建基因表达载体的目的是______。 （3）研究人员将强启动子修饰后的PEAs合成串联基因插入图2载体质粒的位点1和位点2之间。图中的LacZ基因编码产生的酶可以分解X-gal,产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。为了筛选出含有PEAs合成串联基因的大肠杆菌，应在培养基中加入_____并选择___________的菌落。 （4）为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9系统为工程菌增加了自毁保护体系，机理如图2所示。研究结束后，在培养液中加入B物质，B物质通过_______,使gRNA基因和Cas9基因表达，gRNA和Cas9蛋白形成复合物后，gRNA通过______________识别目标DNA,Cas9蛋白对目标DNA进行剪切，最终使大肠杆菌死亡。gRNA基因可设置为_____________（填“毒蛋白基因”或“生长必需基因”）的特异性序列。 1 / 17 学科网（北京）股份有限公司 $