3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 （1）仪器 （2）材料 PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等） 4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 3、材料用具 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 3、材料用具 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul 20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul 20umol/l 的引物I 2.5ul 20umol/l 的引物II 2.5ul H2O 28-33ul 1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U 模板DNA 5-10ul 总体积 50ul 注：模板DNA的用量为1pg-1ug 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 4、实验步骤（PCR） 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 移液 离心 扩增 提高反应速率 预变性的目的： 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 4、实验步骤（电泳鉴定） 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 加样 电泳、观察 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 4、实验步骤（电泳鉴定） 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 11 探讨点1.未出现扩增条带的主要原因有哪些？ 探讨点2.出现非特异性扩增条带的主要原因有哪些？ 探讨点3. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 探讨点4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 (1)TaqDNA聚合酶失活或浓度过低。 (2)引物出现质量问题。 (3)Mg2＋浓度过低。 (4)变性时的温度低，变性时间短。 (1)模板DNA出现污染。 (2)引物特异性不强、引物设计不合理、引物过短。 (3)Mg2＋浓度过高。 (4)复性时的温度过低等。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 (1)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。( ) (2)PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。( ) 解析：PCR中离心的目的是让反应组分集中分布在离心管的底部。 (3)电泳鉴定PCR产物时，应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。( ) 解析：电泳鉴定PCR产物时，应在一个加样孔中加入指示分子大小的标准参照物，其他加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。 √ × × 【基础过关】 【典例】下列关于PCR的说法，错误的是(　　) A.PCR是体外复制DNA的技术 B.PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料 C.TaqDNA聚合酶要具有耐高温的特点 D.PCR利用了DNA的热变性原理 解析：PCR是体外复制DNA的技术，A正确；PCR过程中需要一种模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料，还需要扩增缓冲液、TaqDNA聚合酶等，B错误；TaqDNA聚合酶具有耐高温的特点，C正确；PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，D正确。 B 【变式训练】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 4-9号是转基因植株的DNA，理论上应包含目的基因。 解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。 14 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) $