3.2基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 第4章　基因工程 基因工程的基本操作程序 苏云金杆菌 普通棉花(无抗虫特性) 抗虫基因 转入植物细胞 提取 2.基因表达载体 的构建（核心） 1.目的基因的 筛选与获取 3.将目的基因 导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 Bt基因 Ti质粒 重组DNA分子 将目的基因插入染色体DNA中 结合转基因抗虫棉案例回答以下问题： （1）转基因抗虫棉的目的基因是： （2）转基因抗虫棉的受体细胞是： 抗虫基因—苏云金杆菌的Bt 基因 棉花植株细胞 目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。（P76第2段） 主要指的是编码蛋白质的基因。 第一步：目的基因的筛选与获取 1、目的基因的筛选： 思考1： 自然界中抗虫基因种类多如：Bt基因、蛋白酶抑制基因、凝集素基因等，如何选择合适的基因？ （1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 掌握了Bt基因的序列信息 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。 Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白破坏鳞翅目昆虫的消化系统。 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 DNA测序仪 明确了目的基因后，该怎么获得它? 序列数据库 （如GenBank） 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 序列比对工具（如BLAST） (2)认识基因结构和功能的技术方法： 1、目的基因的筛选： 第一步：目的基因的筛选与获取 测序技术 2、目的基因的获取： （1）人工合成： 前提： 方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 DNA合成仪 第一步：目的基因的筛选与获取 （2）从基因文库中获取目的基因 将某种生物的基因片段,导入到受体菌中,各受体菌分别含不同基因,这些受体菌称为基因文库。 种类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 基因组文库： 含有一种生物的全部基因 缺点：工作量大，盲目性强 基因组文库 cDNA文库 没有启动子、终止子和内含子等非编码序列 PCR——聚合酶链式反应 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 第一步：目的基因的筛选与获取 耐高温的 缓冲溶液 （含Mg2+) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 （体内）DNA复制的条件 模板 原料 酶 能量 DNA解旋后的两条单链 游离的4种脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶等 主要由ATP提供 第一步：目的基因的筛选与获取 A T C G A A T C G G T T T A C C T T A G C C A A DNA 聚合酶 引物 3′ 3′ 5′ 5′ 2.DNA复制过程需要引物的原因： 引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）。 母链DNA 子链DNA ·细胞内通常以RNA单链为引物 ·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物 DNA聚合酶不能从头合成子链 DNA复制时，子链延伸的方向是从5’→3’端。 P77“相关信息栏” （3）利用PCR获取和扩增目的基因 利用PCR获取和扩增目的基因——PCR过程（书p78-79） 待扩增的DNA片段 引物 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 变性 温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链 复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 缓冲溶液 （含Mg2+) 利用PCR获取和扩增目的基因——PCR过程（书p78-79） 循环N次：2n个DNA分子 当DNA中GC含量高时，变性温度需适当提高 破坏氢键 引物结合在DNA模板链的3'端 复性温度与引物长度和引物GC比例呈正相关 引物是子链的一部分 利用PCR获取和扩增目的基因 DNA体外扩增的原理p84 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 1、PCR技术获取目的基因时要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 至少3次 第一次 第二次 5' 3' 5' 3' 3' 5' 思考讨论 第三次 1、两个引物要分别与目的基因两条链的3’端互补配对 引物设计的原则： 2、引物自身、不同引物之间尽量不要互补配对 3、引物长度通常为20-30个核苷酸，太短特异性差，太长扩增效率低 利用PCR获取和扩增目的基因——PCR过程（书p78-79） 4、引物的5’端有时要加上酶切位点 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳； ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 ③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 利用PCR获取和扩增目的基因——PCR产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳（书p84） 探究·实践 六、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 注意 利用PCR获取和扩增目的基因——PCR产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳（书p74） 利用PCR获取和扩增目的基因——提取DNA模板 DNA的粗提取与鉴定（书p74） 1.实验思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 2.实验原理： DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 现配现用 利用PCR获取和扩增目的基因——提取DNA模板 DNA的粗提取与鉴定（书p74） 利用PCR获取和扩增目的基因——提取DNA模板 DNA的粗提取与鉴定（书p74） 选DNA含量相对较高的组织： ·不选哺乳动物成熟红细胞（无细胞核） ·能选鸡血（要加柠檬酸，防止血液凝固） ·取动物细胞做材料时，可加蒸馏水使细胞吸水涨破 利用PCR获取和扩增目的基因——提取DNA模板 DNA的粗提取与鉴定（书p74） 裂解细胞，释放DNA 不能用滤纸，滤纸会吸附DNA ①抑制微生物的核酸水解酶活性，防止DNA降解 ②低温能增加DNA的柔韧性，减少断裂 避免破坏DNA 第一步：目的基因的筛选与获取 原理: 反应体系（条件） 过程: 1、筛选： 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 2、获取： 人工合成、从基因文库中获取、利用PCR获取和扩增目的基因 利用PCR获取和扩增目的基因 DNA半保留复制 DNA模板（目的基因） 4种脱氧核苷酸 引物 耐高温的DNA聚合酶 Mg2+ 高温条件等 变性、复性、延伸 提取DNA并鉴定（p74） 琼脂糖凝胶电泳（p84） （一）目的： ①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代; （二）组成： ②使目的基因能够表达和发挥作用 目的基因该插入什么位置？ 第二步：基因表达载体的构建 基因工程的核心 是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA 是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游，使转录在所需要的地方停下来 重组DNA分子 DNA 连接酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 限制酶 （1）用一定的限制酶切割质粒，使 其出现一个切口，露出黏性末端。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 限制酶 (3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 基因表达载体构建模式图 第二步：基因表达载体的构建 基因工程的核心 目的基因 第二步：基因表达载体的构建 基因工程的核心 问题1: 使用一种限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？怎么改进？ 自连 片段间的连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接（正连、反连） 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 ①单酶切法得到的重组DNA结果 目的基因 第二步：基因表达载体的构建 基因工程的核心 问题2：如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 a b a b ②双酶切法 目的基因与质粒连接（正连） 图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和_____________。 目的基因 抗性基因 限制酶的选择原则： （1）不破坏目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因 （2）构建表达质粒时，要选择启动子和终止子之间的酶切位点 （3）确保质粒和目的基因出现相同黏性末端（即目的基因用什么酶去切，质粒也要用同种酶或同尾酶去切） （4）最好采用双酶切法（保证质粒/目的基因两端是不同的末端，防止它们的自身环化，防止目的基因反接等） 第二步：基因表达载体的构建 基因工程的核心 1、构建基因表达载体时为了防止目的基因和质粒的自身环化，可以选用BamHⅠ和HindⅢ剪切 2、表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞——植物细胞 （1）花粉管通道法 (我国独创) ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 子房 花粉 柱头 花粉管 精子 卵细胞 胚囊 适用植物：开花植物 第三步：将目的基因导入受体细——植物细胞 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，它能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。 （2）农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 第三步：将目的基因导入受体细——植物细胞 构建表 达载体 含目的基因的重组Ti质粒 表现出新性状的植株 导入植物 细胞 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 目的基因 Ti质粒 T-DNA 含重组Ti质粒的农杆菌 转入农杆菌 过程： 农杆菌转化法示意图 （2）农杆菌转化法 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。 第一次基因拼接（人为操作） 第一次导入（人为操作） 第二次导入（利用农杆菌实现） 第二次基因拼接（利用农杆菌实现） 第三步：将目的基因导入受体细——微生物细胞 Ca2+处理目的 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 受体细胞 （1）原核细胞（常选择大肠杆菌） （2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 Ca2+处理法 Ca2+ 感受态细胞 吸收 第三步：将目的基因导入受体细——动物细胞 （1）常用方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 ①体积大，易操作。②易表现出全能性。 （3) 过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 种类项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸DNA分子 《金牌》p82 第四步：目的基因的检测与鉴定 《金牌》p83 第四步：目的基因的检测与鉴定 方法1：PCR扩增 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 DNA半保留复制 原理： 1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 第四步：目的基因的检测与鉴定 一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。 基因探针： 原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 方法2：分子杂交技术 碱基互补配对 原理： 第四步：目的基因的检测与鉴定 RT-PCR RNA分子杂交(Northern Blot)流程图 过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 第四步：目的基因的检测与鉴定 方法：抗原-抗体杂交技术 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 杂交 转基因生物 抗体 抗原 抗原-抗体杂交带 抗原抗体特异性结合 原理： 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 第四步：目的基因的检测与鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 4、个体水平鉴定 概念检测 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 √ × × D 课堂小结 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.11 Lavf59.14.100 $