3.2.2基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章：基因工程 3.2基因工程的基本 操作程序（二） 目录 TABLE OF CONTENTS 01 目的基因的筛选与获取 02 基因表达载体的构建 03 将目的基因导入受体细胞 04 目的基因的检测与鉴定 基因表达载体的构建 02 获得目的基因后，能直接导入受体细胞吗？ 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 4 一 基因表达载体的构建 二 基因工程的核心工作 1.构建基因表达载体的目的 1 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代。 2 使目的基因能够表达和发挥作用 2.基因表达载体的组成 载体≠基因表达载体 各个元件有什么作用？ 基因表达载体与载体相比增加了________ 。 目的基因 启动子 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA 启动子类型： 组成型启动子(一直启动) 组织特异性启动子(特定组织中启动) 诱导型启动子(特定诱导物下启动) 终止子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 下游 转录 复制原点： DNA复制的起始位点（DNA聚合酶结合位点） 标记基因：便于重组DNA分子的筛选 如抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等 限制酶切割位点：供外源DNA片段插入其中。 目的基因： 改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的 基因。必须插到 和 之间 启动子 终止子 6 复习 区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子 名称 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束 一 基因表达载体的构建 二 3.基因表达载体构建的流程 1 用限制酶切割载体，使它出现一个缺口 2 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因 用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。 3 一 基因表达载体的构建 二 cDNA文库 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ Bt基因 （目的基因） PCR（设计引物） Bt基因 EcoRⅠ酶切位点 EcoRⅠ酶切位点 质粒 EcoRⅠ酶切位点 一 基因表达载体的构建 二 cDNA文库 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ Bt基因 （目的基因） PCR（设计引物） Bt基因！ EcoRⅠ酶切位点 EcoRⅠ酶切位点 质粒 EcoRⅠ酶切位点 （目的基因） Bt基因 一 基因表达载体的构建 二 Bt基因！ EcoRⅠ酶切位点 EcoRⅠ酶切位点 质粒 EcoRⅠ酶切位点 （目的基因） Bt基因 一 基因表达载体的构建 二 Bt基因！ EcoRⅠ酶切位点 EcoRⅠ酶切位点 质粒 EcoRⅠ酶切位点 Bt基因 （目的基因） 重组DNA分子 一 基因表达载体的构建 二 思 维 提 升 （1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。 例：请结合下图，回答问题： 质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 一 基因表达载体的构建 二 思 维 提 升 （2）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、 哪种选择更具优势？为什么 例.请结合下图，回答问题： 左 右 右 左 目的基因自身环化 质粒自连 单个片段 两个片段之间会出现什么问题？ 正向连接 正向连接 正向连接 正向连接 正向连接 反向连接 正向连接 反向连接 转录方向 转录方向 模板链 模板链 正向连接 反向连接 正向连接 反向连接 转录方向 转录方向 模板链 模板链 转录 CCA……UCCCUAA mRNA1 转录 UUAGGGA……UGG mRNA2 反向连接将导致最终表达产物不相同！ 一 基因表达载体的构建 二 思 维 提 升 （2）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、 外源DNA的优点是什么？ 例.请结合下图，回答问题： ①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接； ②还可以防止目的基因与载体的反向连接。 核心归纳 1．限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 核心归纳 1．限制酶的选择 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 核心归纳 1．限制酶的选择 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 核心归纳 1．限制酶的选择 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 1．下列与基因表达载体有关的说法错误的是( ) A．一个表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等 B．基因表达载体的构建是基因工程核心工作 C．有了启动子才能驱动基因转录出mRNA，终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 D．启动子就是起始密码子，终止子就是终止密码子 2/2 完成 D 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 27 2．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( ) ①一个表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子　②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA　③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止　④所有基因表达载体的构建是完全相同的　⑤构建过程应该在体外进行　⑥选择同种限制酶和DNA连接酶构建可以提高定向连接效率 A．②③⑤ B．①④⑥ C．①②⑤ D．③④⑥ 2/2 完成 B 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 28 3．如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( ) 注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。 A．NdeⅠ和BamHⅠ B．NdeⅠ和XbaⅠ C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ 2/2 完成 A 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 29 将目的基因导入受体细胞 03 一 将目的基因导入受体细胞 三 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 我国科学家独创 常用 显微注射法 Ca2+处理法 受体细胞类型 农杆菌转化法 花粉管通道法 一 将目的基因导入受体细胞 三 1.花粉管通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 1 我国科学家独创的一种方法 在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 2 适用生物：开花植物 1.导入植物细胞 一 将目的基因导入受体细胞 三 “转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。 1.导入植物细胞 ①农杆菌特点： a. 能在自然条件下侵染___________和___________， 而对大多数单子叶植物没有侵染能力； b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________。 双子叶植物 裸子植物 Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 该细胞的染色体DNA上 2.农杆菌转化法 一 将目的基因导入受体细胞 三 1.导入植物细胞 ②、过程： 新性状植株 第一次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上 第二次拼接 含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上(非人工操作) 第一次导入 第二次导入 含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞(非人工操作) 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 该过程经过____次拼接、____次导入 两 两 一 将目的基因导入受体细胞 三 1.导入植物细胞 猜测单子叶植物细胞为什么不适用农杆菌转化法？ 可能损伤时无法分泌酚类物质。 为什么农杆菌容易感染双子叶植物和裸子植物？ 双子叶、裸子植物 受损 伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物 吸引农杆菌向受伤组织集中 将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。 【特点】易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 一 将目的基因导入受体细胞 三 1.导入植物细胞 将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株 将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等 导入体细胞 导入受精卵 一 将目的基因导入受体细胞 三 2.导入动物细胞 受精卵全能性高，高度分化的体细胞全能性受到抑制 显微注射法 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 受体细胞: 受精卵 ① 体积大，易操作； ② 全能性高，易培养成完整个体。 一 将目的基因导入受体细胞 三 3.导入微生物细胞 Ca2+处理法 重组 Ti质粒 吸收 感受态细胞 原因：生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。 受体细胞： 常用原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛） 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 Ca2+处理细胞 将重组的基因表达载体导入其中 这种细胞称为感受态细胞 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法 受体细胞 体细胞、受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T-­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞 吸收DNA分子 核心归纳 受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是( ) A．羊受精卵——显微注射法 B．棉花细胞——花粉管通道法 C．大肠杆菌——农杆菌转化法 D．番茄细胞——农杆菌转化法 2/2 完成 C 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 41 2．用农杆菌转化法培育转基因植物，下列叙述错误的是( ) A．目的基因插入 Ti 质粒的位点是某种限制性内切核酸酶的识别位点 B．若目的基因的序列未知，可以通过构建基因文库的方法从中获取 C．采用抗原—抗体杂交技术可检测目的基因在受体细胞中是否表达 D．植物受体细胞必须是受精卵细胞，因其全能性最高 2/2 完成 D 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 42 目的基因的检测与鉴定 04 一 目的基因的检测与鉴定 四 1.目的 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 2.检测内容及方法 类型 检测内容 方法 分子水平 的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 个体是否具有相应性状 PCR等技术 抗原-抗体杂交技术 病原体接种实验等 一 目的基因的检测与鉴定 四 1.分子水平的检测 方法： PCR扩增或DNA分子杂交技术 （1)检测目的基因是否导入 方法①：PCR扩增 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 M：marker；1: 阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 一 目的基因的检测与鉴定 四 1.分子水平的检测 方法： PCR扩增或DNA分子杂交技术 过程： ① 首先取出转基因生物的基因组DNA。 ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。 DNA分子杂交结果图 （1)检测目的基因是否导入 方法②：DNA分子杂交技术 一 目的基因的检测与鉴定 四 方法： PCR或RNA分子杂交技术 1.分子水平的检测 2.检测目的基因是否转录 RNA分子杂交(Northern Blot)流程图 洗去未结合的探针 放射自显影 放射自显影 杂交 RNA提取 电泳分离 不同大小的RNA被分离 样本 标记的RNA/DNA探针 提取 逆转录 转膜 一 目的基因的检测与鉴定 四 苏云金杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 注射小鼠体内 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 | 电泳分离 抗体 抗原 杂交 Bt抗虫蛋白 方法：抗原-抗体杂交技术 1.分子水平的检测 3.检测目的基因是否翻译成蛋白质 如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译 一 目的基因的检测与鉴定 四 方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 正常棉叶子 抗虫棉叶子 接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。 抗虫或抗病接种实验 与天然产品的功能进行活性比较 2.个体水平的检测 一 目的基因的检测与鉴定 四 2.个体水平的检测 抗性以及抗性程度 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 本节课小结 1．在检测抗虫棉培育是否成功的方法中，不属于分子水平检测的是( ) A．观察害虫吃棉叶后是否死亡 B．用PCR技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因 C．用PCR技术检测目的基因是否转录形成mRNA D．用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质 2/2 完成 A 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 52 2．（不定项）为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI 121)结合，然后导入棉花细胞(如图所示)。下列操作与实验目的相符的是( ) A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA­ACA融合基因 B．用KpnⅠ和XhoⅠ两种酶处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 2/2 完成 ABD 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 53 DNA片段的扩增及电泳鉴定 05 实验原理 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有__________________，在一定的________下，这些基团可以带上__________________。在______的作用下，这些___________会向着_____________________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 带电分子 与它所带电荷相反 电场 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极移动。 实验原理 2.DNA片段电泳鉴定的原理 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 以右图中展示的核酸电泳结果为例，最左侧一列“M”（Marker）所在加样孔，添加的是已知分子量大小不同的DNA片段混合物，其作为“标尺”在电泳检测中必不可少，一是检测琼脂糖凝胶是否有问题，二是可以用来粗略估算样品DNA分子量的大小。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 琼脂糖凝胶具有类似孔板的网状结构，当DNA在网状结构中移动时，大的DNA片段受到的阻力大，移动速度慢；小的DNA片段受到的阻力小，移动速度快，故可以根据长度差异分离不同的DNA。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 材料用具 PCR仪 自动控温，实现DNA的扩增 微量离心管 实际上是进行PCR反应的场所 微量移液器 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 一次性吸液枪头 微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头 电泳装置 包括电泳仪、电泳槽等 1 2 3 4 5 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 6 4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管) 7 电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 8 PCR反应体系的配方 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液(含Mg2+) 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液(实为dNTP) 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶(即为耐高温的DNA聚合酶) 1～2 U 模板DNA(1pg～1μg) 5～10 μL 总体积 50 μL 方法步骤 （1）DNA片段的扩增 → PCR技术 移液 离心 扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 [思考]为什么最后1次变性时间延长？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。 （2）DNA片段的电泳鉴定 配制 琼脂糖溶液 制备 琼脂糖凝胶 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ① 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 ②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 加样 电泳 观察 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 （2）DNA片段的电泳鉴定 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA 电泳鉴定中的“两液”（P117) （1）电泳缓冲液：维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质，影响物质的电泳迁移率，整个电泳过程中都需要。 （2）凝胶载样缓冲液：主要用于样品的稀释和保护，在样品加样前与样品混合使用。（内含指示剂） 凝胶载样缓冲液中指示剂通常是一种颜色较深的染料（如溴酚蓝)，可以作为电泳进度的指示分子，但其迁移速率与DNA分子不同，不能指示DNA分子的具体位置。 特别注意 1 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 *将 PCR 所用的缓冲液和酶从冰箱拿出后放在冰块上缓慢融化，主要有以下原因： - 保护酶的活性：PCR 所用的酶，如 Taq DNA 聚合酶等，对温度较为敏感。较高温度可能会使酶的空间结构发生改变，导致酶活性降低甚至失活。在冰块上缓慢融化，可以使酶在低温环境下逐渐恢复到适宜的使用状态，最大程度减少因温度变化对酶活性的影响，保证其在后续 PCR 反应中能正常发挥催化作用。 - 维持缓冲液的稳定性：PCR 缓冲液中含有多种成分，如镁离子、缓冲物质等，这些成分在合适的温度下才能保持稳定的化学性质和浓度。如果缓冲液快速升温，可能会引起某些成分的化学反应或沉淀，影响缓冲液的 pH 值和离子强度等。而在冰块上缓慢融化，能让缓冲液在相对稳定的低温环境中恢复到室温，维持其成分和性质的稳定，为 PCR 反应提供适宜的反应环境。 - 防止污染：在低温环境下，微生物的生长和代谢受到抑制。将缓冲液和酶放在冰块上，可减少在融化过程中微生物污染的风险，保证试剂的纯净度，避免因污染而影响 PCR 反应的结果。 结果分析与评价 1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 结果分析与评价 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 探究 · 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．使用PCR仪进行DNA片段的扩增及电泳鉴定的具体实验操作顺序应为( ) ①设计好PCR仪的循环程序　②按配方准备好各组分　③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分　④进行PCR　⑤离心使反应液集中在离心管底部　⑥配制琼脂糖溶液　⑦电泳缓冲液加入电泳槽　⑧取出凝胶置于紫外灯下观察和照相　⑨将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合注入加样孔内，进行电泳 A．②③⑤④①⑦⑥⑨⑧ B．①⑤③②④⑥⑦⑨⑧ C．②③⑤①④⑥⑦⑨⑧ D．④②⑤③①⑧⑨⑥⑦ 2/2 完成 C 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 71 2．(不定项）下列关于PCR操作过程的叙述，正确的是( ) A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存 C．将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化 D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 2/2 完成 ABD 趁热打铁 【解析】A、培养液中的营养物质通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等，A正确； B、培养液需要定期更换，以清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，B正确； C、培养液需要适宜的温度、pH和渗透压，维持细胞生存，C正确； D、动物细胞培养的环境中需要95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），D错误。 72 感谢观看 It could be the part of the presentation where you can introduce your company or agency. 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