基因工程题型拓展导学案-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程题型拓展（PCR专题）

题型一：PCR的数量关系

思考1： 图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？

思考2：完成下表

例：某研究小组利用PCR技术扩增一段目的基因，已知该目的基因片段长度为500bp，初始模板DNA分子数量为2个。若PCR反应共进行10个循环，且所有循环均高效完成、无扩增损耗。下列相关叙述正确的是（     ）

A. 理论上可获得该目的基因片段总数为1024个

B. 理论上可获得只含目的基因片段的DNA分子数为1004个

C. 第10次循环结束时，新合成的DNA链数为1024条

D. 整个PCR过程共消耗引物分子总数为2048个

题型二：引物的选择和设计

引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的原则主要包括：

(1)引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。

(2)引物G+C含量以40%-60%为宜，4种碱基最好随机分布。

G+C太少：与模板DNA链结合的氢键少，结合力小，扩增效果不佳；

G+C过多：可导致引物自身之间形成二聚体或多聚体，会降低扩增效率，同时需要更高的退火温度，进而增加实验成本。

思考与讨论：复性时，为何两条模板链能与引物结合而不是模板链之间结合呢？

 

 

(3)引物自身、引物之间不能有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影响引物与模板的复性结合。在3′端不应有任何互补的碱基。

 

 

 

 

 

 

例1：土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为（      ）

A.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′

B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′

C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′

D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′

例2：（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题∶设计引物是PCR技术关键步骤之一。某

同学设计的2组引物如图，都不合理，请分别说明理由。

①第1组：__________________________________________________;

②第2组：__________________________________________________。

例3：（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（     ）

A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇

B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI

C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段

D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶

例4：(2021 .湖北)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（     ）

A.增加模板DNA的量 B. 延长热变性的时间

C.延长延伸的时间  D.提高复性的温度

题型三：PCR的应用（利用引物添加酶切位点）

 

 

 

 

 

 

例1：引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的(　　)

例2：基于嗜热厌氧杆菌的特殊代谢能力（图a），研究人员构建了双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）的过量表达载体，图b为构建表达载体时所需的关键条件。

①为保证双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2，其中引物1的序列为5`—                                                     —3`。

题型四：PCR的应用（重叠延伸PCR（融合PCR））

(1）原理：拼接两个或多个 DNA 序列，可以使用末端可以连接的特殊引物。设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。

(2)用途：可以将几段较小的 DNA 按照顺序连接形成较大的DNA，且不需要限制酶。

(3)特点：不需要限制性内切核酸酶和连接酶的处理，用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，操作非常简便，利用这一技术很快获得利用限制性内切核酸酶消化的方法难以达到的产物，可用于大片段基因的人工合成，且成功率非常高。

例1：某科研小组采用 PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因 (dsred2) 和 α- 淀粉酶基因 (amy) 的 dsred2-amy 融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列 (黑色区域) 可互补配对。下列说法错误的是（     ）

A. 利用 PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链

B. 不能在同一反应体系中进行 dsred2 基因和 amy 基因的扩增

C. dsred2 基因和 amy 基因混合后只能得到一种类型的杂交链

D. 杂交链延伸得到 dsred2-amy 融合基因的过程不需要加引物

 

例2： 重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。过程如下图，下列叙述不正确的是（      ）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多

B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中

C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行一次PCR，共产生4种DNA

D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制

题型五：PCR的应用（定点突变）

（1）概念：将某基因中的一个或几个特定的碱基对替换、增加或删除，导致基因中

 的部分碱基序列发生改变，实现基因的定点突变。

（2）两种方法： ①重叠延伸PCR 技术：该技术要使用四条引物。 ②大引物PCR技术：需要用到三种引物进行两次PCR ，这三种引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。

①重叠延伸PCR 技术：该技术要使用四条引物。该技术要使用四条引物。引物1和引物3的突起处