重难01 吃透基因工程：PCR、酶切、载体构建等重难核心（重难点突破讲义）高二生物下学期人教版

重难01 吃透基因工程：PCR、酶切、载体构建等重难核心 1．掌握 PCR 核心：熟练掌握 PCR 的原理、三步循环（变性 复性 延伸）、反应条件，精准区分 PCR 与体内 DNA 复制的关键差异。 2.突破酶的应用：明确限制酶的识别与切割特点，掌握双酶切设计原则，能解决载体构建中酶的选择问题。 3.贯通工程流程：吃透基因表达载体构建的核心要素，熟练掌握目的基因检测与鉴定的层级方法与适用场景。 一、PCR技术（聚合酶链式反应） （1）定义 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2）反应过程 变性阶段 复性阶段 延伸阶段 当温度超过 90℃时，双链 DNA 解聚为单链（体外用高温代替解旋酶） 当温度下降到 50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合 当温度上升到 72℃左右时，耐高温的 DNA 聚合酶发挥作用，以 4 种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成新的 DNA 链 （3）反应条件 PCR反应需要在一定的缓冲液中进行，需提供： 1　 DNA模板：待扩增的目的基因DNA 2　 2种引物：分别与两条模板链结合的、人工合成的短单链DNA（长度通常为20~30个核苷酸） 3　 4种脱氧核苷酸（dNTP）：合成DNA子链的原料 4　 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）：催化子链合成，耐受PCR的高温循环 5　 Mg²⁺：激活DNA聚合酶活性，缓冲液中需添加 6　 温度循环控制：变性→复性→延伸，循环n次后目的基因数量约为2ⁿ，产物常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 （4）PCR与体内DNA复制的关键差异 对比项目 PCR（体外扩增） 体内DNA复制 解旋方式 高温（90℃以上）解旋，无需解旋酶 解旋酶催化打开双链 所用酶 耐高温的Taq DNA聚合酶 普通DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等多种酶 引物类型 人工合成的DNA单链 细胞内合成的RNA引物 反应场所 体外PCR仪中 细胞内（细胞核、线粒体、叶绿体） 温度条件 周期性变温（变性/复性/延伸） 恒温（细胞生理温度） 二、基因工程核心酶的应用 （1）限制酶（限制性核酸内切酶） ① 定义 限制酶是能够识别特定的核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子的酶，作用于DNA分子中的磷酸二酯键。 ② 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 ③ 双酶切设计原则 选用两种不同的限制酶，分别切割载体和含目的基因的DNA片段 核心目的：防止载体自身环化、目的基因自身环化与反向连接，大幅提高重组载体的构建效率 关键要求：两种酶切割后，载体与目的基因能产生互补的黏性末端，保证目的基因正确、定向连接 （2）DNA连接酶 ① 定义 DNA连接酶是能够恢复磷酸二酯键，将两个DNA片段（目的基因与载体）拼接形成重组DNA分子的酶。 ② 与DNA聚合酶的核心差异 酶的种类 作用对象 核心功能 应用场景 DNA连接酶 两个完整的DNA片段 恢复磷酸二酯键，连接片段 基因表达载体的构建 DNA聚合酶 单个脱氧核苷酸 连接脱氧核苷酸形成子链 体内DNA复制、PCR延伸阶段 三、基因工程高频操作流程 （1）基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） ① 定义 获取足量目的基因后，为使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，需要构建基因表达载体。 ② 核心要素 组成元件 定义 核心功能 启动子 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 终止子 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游 使转录在所需要的地方停下来，终止转录过程 目的基因 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物的基因，主要是编码蛋白质的基因 编码目标性状的外源基因（如Bt抗虫蛋白基因、抗冻蛋白基因afp） 标记基因 载体上用于筛选的基因（如抗生素抗性基因） 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 复制原点 载体上控制复制的序列 控制载体在受体细胞内的复制起点，保证载体随细胞分裂稳定遗传 （2）目的基因的检测与鉴定 ① 定义 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能确定，是检查转基因生物是否培育成功的关键步骤。 ② 分子水平检测 检测层级 检测内容 方法 适用场景 DNA水平 目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA PCR技术、DNA分子杂交技术 初步验证目的基因是否成功导入受体细胞 转录水平 目的基因是否转录出mRNA 分子杂交技术（用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交） 验证目的基因是否启动转录，完成基因表达的第一步 翻译水平 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术 验证目的基因是否完成翻译，合成目标蛋白质 ③ 个体生物学水平鉴定 定义：在个体水平对转基因生物的性状进行直接鉴定，验证目的基因的功能 适用场景：最终验证转基因生物的性状表达，如： a.转基因抗虫棉：采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，确定Bt基因是否赋予棉花抗虫特性及抗性程度 b.抗病转基因植物：接种病原体，鉴定抗病性 c.抗逆转基因作物：进行干旱、盐碱等胁迫处理，鉴定抗逆性 判定标准：只有个体水平表现出预期性状，才代表转基因生物培育成功 题型01 PCR技术原理与过程综合分析 【方法与技巧】 核心突破：牢牢紧扣 PCR 最新定义（体外依据 DNA 半保留复制，大量复制目的基因），牢记 “变性→复性→延伸” 三步循环的温度、核心反应及特点，不混淆细节。 易错点秒杀 ① 解旋方式：PCR 靠高温（90℃以上）解旋，无需解旋酶；② 酶的选择：必须用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，普通 DNA 聚合酶不耐高温；③ 引物要求：2 种引物，分别与两条模板链 3' 端互补，为 DNA 单链；④ 计算规律：循环 n 次，目的基因数量约为2n，第 3 次循环才出现完整目的基因片段；⑤ 原料与条件：原料是 4 种脱氧核苷酸（dNTP），需含Mg2+的缓冲液。 解题步骤 先判断题干考查 PCR 的核心知识点（原理 / 过程 / 条件 / 与体内复制差异）→ 定位对应细节，排除易错选项→ 结合题干信息验证答案（计算题需注意循环次数与完整片段的关系）。 【典例解析】 【典例1】生长素参与植物生长发育的调节，生长素运输蛋白（PINI）对IAA的极性运输具有重要作用。为研究35S启动子（一种来自病毒的强启动子）能否引起下游基因的过量表达，研究人员将35S启动子与PINI基因转入拟南芥，观察PINI过量表达对植物的影响。 （1）获取PINI基因的mRNA后，通过RT-PCR扩增获取PINI基因（DNA）时所需要的酶是 　 　 。每次PCR循环分为3步，其中所需温度最低的一步称为 　 　 。 （2）PINI基因不能直接导入受体细胞，需要构建PINI表达载体。构建PINI表达载体的目的是 　 　 。 （3）为将PINI基因以正确方向插入质粒需要双酶切。在设计引物时，需在引物的5'端加入相应的酶切位点。据图1分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是 　 　 。 （4）提取转基因拟南芥的DNA，用相应引物扩增出35S启动子和PINI基因，为检测目的基因是否导入拟南芥，应电泳检测扩增产物中的 　 　 ，不检测另一种的原因是 　 　 。据图2可知，也可在个体水平上进行检测，方法是 　 　 。 【典例2】柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5′﹣A↓AGCTT﹣3′、5′﹣G↓GATCC﹣3′、5′﹣G↓TCGAC﹣3′。请回答下列问题： （1）构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有　 　 （回答2点）等。据图分析，在基因表达载体构建过程中，应使用　 　 对M基因和质粒进行切割。 （2）利用PCR技术克隆M基因时，应选择如图中的引物　 　 （填序号），引物的作用是　 　 。 （3）将图中农杆菌先后置于含　 　 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是　 　 。 （4）图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了　 　 技术，该技术的原理是　 　 。 题型02 限制酶与双酶切设计综合题 【方法与技巧】 核心突破：明确限制酶的识别与切割特点（识别特定回文序列、切割磷酸二酯键、产生黏性/平末端），掌握双酶切设计原则，核心解决载体构建中酶的选择问题。 双酶切设计关键 ① 选用两种不同限制酶，分别切割载体和目的基因；② 目的是防止载体自身环化、目的基因自身环化和反向连接；③ 关键要求：两种酶切割后，载体与目的基因产生互补黏性末端，保证定向连接；④ 避免用同一种限制酶，否则易出现连接错误。 解题步骤 先分析题干中载体和目的基因的酶切位点→ 结合双酶切原则判断酶的选择是否合理→ 排除“自身环化、反向连接”相关错误选项→ 验证酶切后末端是否互补。 【典例剖析】 【典例1】稻米的直链淀粉是由蜡质基因（waxy）控制合成的淀粉合成酶（GBSS）催化形成，直链淀粉含量高的米饭质地和适口性不高。将waxy反义基因片段导入水稻细胞抑制内源基因表达，可降低直链淀粉含量。请据图回答下列问题。 （1）分析图1和图2可知，waxy基因表达时的模板链为　 　 （填“1”或“2”）链。 （2）据图1可知，为构建waxy反义基因表达载体，在利用PCR技术获取waxy基因过程中，需要在设计的两种引物5’端分别添加限制酶　 　 的识别序列。将目的基因与载体连接，可获得　 　 种重组DNA分子。 （3）结合图2已知信息，构建基因表达载体后若要筛选得到构建正确的waxy反义基因表达载体，可选择引物　 　 进行PCR技术检测，PCR技术的原理是　 　 。 （4）反义基因技术能降低稻米中直链淀粉含量的机制是：　 　 。 【典例2】如图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X﹣gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题： （1）可使用 　 　 技术扩增目的基因。 （2）过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是 　 　 。 A．只有BamHⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．EcoRⅤ和BamHⅠ D．EcoRⅤ和EcoRⅠ （3）基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、　 　 和目的基因的检测与鉴定。其中在构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还可以选择噬菌体和 　 　 。 （4）过程②常用 　 　 处理大肠杆菌，使其处于容易吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （5）为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入 　 　 ，培养一段时间后挑选出 　 　 （填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 题型03基因表达载体构建分析题 【方法与技巧】 核心突破：吃透基因表达载体的 5 大核心要素（启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点），牢记各要素的定义和功能，明确载体构建的完整流程。 易错点秒杀 ① 启动子≠起始密码子，启动子是 RNA 聚合酶结合位点（DNA 片段），起始密码子位于 mRNA 上；② 终止子≠终止密码子，终止子终止转录，终止密码子终止翻译；③ 标记基因的作用是 “筛选含重组载体的受体细胞”，而非鉴定目的基因是否表达；④ 载体构建必须用限制酶和 DNA 连接酶，缺一不可。 解题步骤 先明确题干考查载体要素 / 构建流程 / 酶的选择→ 逐一分析选项，结合要素功能和流程细节排除错误→ 验证选项是否符合教材表述。 【典例剖析】 【典例1】水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，可实现对水体中水杨酸含量的动态检测，为环境污染治理提供新方法。其过程如图1所示，向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器。请回答下列问题： （1）基因工程操作的核心工作是基因表达载体的构建，其组成包括启动子、终止子、目的基因和　 　 。启动子是　 　 识别和结合的部位，其功能是　 　 。 （2）分析图1可知，当环境中存在水杨酸时，　 　 可激活Ps，使mrfp基因表达，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。Ps从类型上属于　 　 型启动子，Pc和Ps　 　 （填“是”或“不是”）同一类型的启动子。 （3）基因工程中启动子与增强子都与基因转录有关，增强子可增强转录效率。研究人员欲通过改造重组质粒，实现在相同浓度的水杨酸条件下，使荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度。方法一是选择激活能力更强的调控蛋白基因nahR1替代nahR；方法二是在mrfp基因前插入　 　 。 （4）水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是　 　 。 【典例2】利用Golden Gate构建基因表达载体的原理是利用TypeⅡs型限制酶（如BsaⅠ）的酶切位点在识别序列之外的特性，使重组DNA分子上不会留下使用的酶切位点，这样就可以在同一反应体系中进行酶切和片段连接，且可以通过设计自定义序列（NNNNN）同时进行多片段的有序连接。镉是水体污染中常见的重金属元素，为治理水体中的镉污染，研究人员将镉离子结合蛋白基因CADR、黄色荧光蛋白基因YFP利用Golden Gate法融合并接入质粒，转入莱茵衣藻细胞后利用含镉培养液进行培养。质粒构建过程如图所示（RFP表示红色荧光蛋白基因），请回答下列问题。 （1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有　 　 （写出一项）。利用BsaⅠ切割时DNA分子的　 　 键发生断裂，形成黏性末端；理论上利用BsaⅠ切割后最多可以产生　 　 种黏性末端。若要在同一反应体系中完成载体构建，除BsaⅠ酶外，还需要在反应体系中加入　 　 。 （2）为保证目的基因与载体正确连接且重组质粒上不保留酶切位点，研究人员需要设计不同的BsaⅠ切割位点，若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'﹣CCATGGAGACC﹣3'，则CADR基因左侧切割后形成的黏性末端序列为5'﹣　 　 ﹣3'（写出同一单链碱基）。 （3）构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶作用底物的是　 　 。 （4）为筛选构建成功的重组载体，用酶切并连接处理后的DNA分子转化靶细胞，培养一段时间后在荧光显微镜下观察，观察到部分发红色荧光的细胞，原因是　 　 。若通过培养，观察到某细胞株系发出黄色荧光，　 　 （填“能”或“不能”）确定该株系适合用于镉污染治理。 题型04目的基因检测与鉴定层级分析题 【方法与技巧】 核心突破：熟练掌握 “分子水平（DNA→转录→翻译）+ 个体水平” 的层级检测方法，明确每种方法的检测内容、适用场景，牢记转基因成功的判定标准。 层级记忆 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 易错点秒杀 ① 仅检测到目的基因插入（DNA 水平），不代表转基因成功；② 分子杂交（转录水平）检测 mRNA，抗原 — 抗体杂交检测蛋白质，不可混淆；③ 个体水平鉴定是转基因成功的最终标准。 解题步骤 先明确题干考查的检测层级→对应匹配检测方法与适用场景→排除 “层级颠倒、方法混淆” 的错误选项→验证转基因成功的判定逻辑。 【典例剖析】 【典例1】 为提高棉花植株的抗虫特性，研究小组将抗虫基因Cry1A基因导入棉花细胞中以得到转基因抗虫棉，过程如图1。该过程涉及的各种限制酶及酶切位点如表。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ SmaⅠ XmaⅠ HindⅢ 识别序列 G↓GATCC G↓AATTC CCC↓GGG C↓CCGGG A↓AGCTT （1）目的基因的筛选与获取：研究人员将苏云金杆菌中获取的Cry1A基因成功导入棉花细胞并表达，但产物表达量较低，需要将其中多个密码子替换为植物偏爱密码子。在已知Cry1A基因序列的前提下，可采用 　 　 方法获取新的目的基因。 （2）基因表达载体的构建：目的基因需要连接在启动子和终止子之间，为实现该操作，需要在目的基因两端添加HindⅢ限制酶识别序列，该方法的不足是 　 　 。研究人员为改善该问题，在目的基因两侧增加了其他限制酶识别序列如图2，则可选择的限制酶组合有 　 　 种（不考虑连接效率）。 （3）将目的基因导入受体细胞：除图示外的方法，将抗虫基因导入棉花细胞的方法还有 　 　 ，该方法相比于图示方法的优点是 　 　 （说出2点）。 （4）目的基因的检测与鉴定：除了利用PCR技术检测目的基因是否插入成功并转录外，还需在个体水平进行鉴定，为判断转基因抗虫棉是否培育成功，需要对其进行的操作是 　 　 。 【典例2】果胶甲酯酶具有催化水解果胶的作用，为获得高产、高纯度的胞外果胶甲酯酶，图1表示某科研小组设计的黑曲霉工程菌的构建和发酵流程图。回答下列问题： （1）科研小组从基因数据库中获得果胶甲酯酶基因序列后，通过设计引物扩增出大量果胶甲酯酶基因片段，在扩增过程中提供4种dNTP的作用 　 　 ，在构建重组表达载体过程中，果胶甲酯酶基因应插入到质粒的 　 　 间才能进行表达，此过程缓冲液中加入Mg2+的目的是 　 　 。 （2）可提取农杆菌的DNA进行PCR后再通过 　 　 判断重组表达载体是否导入到农杆菌。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原﹣抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉 　 　 判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶甲酯酶相似，造成提取产物纯度不高，所以科研小组通过一定的方法将这种蛋白质的基因 　 　 ，实现获得高纯度的果胶甲酯酶。 （3）目的基因的检测与鉴定。可采用PCR技术检测果胶甲酯酶基因是否成功导入黑曲霉菌。已知目的基因一条链的部分序列为5'﹣TACAGGT……GGTTCAC﹣3'，则检测目的基因时特异性引物对应选择 　 　 。 A.5'﹣TACAGGT﹣3' B.5'﹣GGTTCAC﹣3' C.5'﹣ATGTCCA﹣3' D.5'﹣GTGAACC﹣3' 再将扩增得到的DNA片段进行检测结果如图2，据图未成功导入目的基因的是 　 　 （填写数字）。 题型05 三大重难点综合应用题 【方法与技巧】 核心突破：串联 PCR 技术、酶的应用、载体构建、目的基因检测四大核心知识点，以转基因生物（如抗虫棉、抗冻番茄）为案例，综合考查知识应用能力，贴合期中大题命题趋势。 解题模板 ① 目的基因获取：PCR 技术（原理、条件、过程）；② 载体构建：限制酶（双酶切）+ DNA 连接酶，载体五要素；③ 检测与鉴定：分子水平三步检测 + 个体水平鉴定；④ 答题规范：使用教材标准术语，避免口语化（如 “启动子”“抗原 — 抗体杂交” 不可简写）。 易错点提醒 综合题中，常结合 PCR 计算、双酶切设计、检测方法辨析，需逐一突破，避免遗漏细节。 【典例剖析】 【典例1】人体内的t﹣PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物t﹣PA。 （1）研究人员采用PCR技术可以获得大量t﹣PA基因，PCR的原理是 　 　 。此外，大量获得t﹣PA基因的方法还有 　 　 （答出两种）。 （2）高质量的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除蛋白质，原因是 　 　 。 （3）研究表明，为心梗患者注射大量t﹣PA会诱发颅内出血，其原因在于t﹣PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t﹣PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。（注：如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题： ①改造t﹣PA蛋白你认为应该直接对蛋白质进行改造，还是对天然的t﹣PA基因进行序列改造，原因是？　 　 。 ②如图所示，需选用限制酶XmaⅠ和 　 　 切开质粒pCLY11，才能与t﹣PA改良基因高效连接。在基因工程的基本操作过程中，最核心的步骤是基因表达载体的构建，其目的是 　 　 。 ③应该选择不含 　 　 的大肠杆菌作为受体细胞，以便在加入新霉素的选择培养基中筛选出导入质粒的大肠杆菌。筛选出的大肠杆菌菌落并非都是目的菌株，这时选择 　 　 色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t﹣PA蛋白的工程菌株。 【典例2】在传统领域，乳酸广泛应用于食品、化妆品、饲料、农药、医药、化工等行业；同时，乳酸是合成新兴材料聚乳酸的主要原料。得益于下游市场的发展，我国乳酸需求量持续增长。乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。研究者将人工合成的、来源于牛的乳酸脱氢酶A基因（LDHA）插入酿酒酵母表达载体pAUR123中，经过转化、筛选、鉴定和培养，获得了产乳酸的商用酿酒酵母菌。 （1）LDHA的获取：研究者从基因数据库检索获得牛LDHA编码序列，并将其编码起始密码子序列中的原核生物偏好的GTG替换为酿酒酵母偏好的密码子ATG，替换的目的是 　 　 。再通过 　 　 法将核苷酸按照顺序一个一个连接起来，由此合成少量LDHA。为了获得大量的LDHA，可采用PCR技术对LDHA基因进行扩增。为了保证扩增过程的特异性，根据LDHA的两端序列设计相关引物。为了方便目的基因与质粒的正确连接，通常在引物1的5′端加上 　 　 （选填编号）识别序列，引物2的5′端加上 　 　 （选填编号）识别序列。 ①XbaⅠ ②BamHⅠ ③EcoRⅠ （2）pAUR123重组表达载体的构建过程中，下列实验步骤错误的为 　 　 。（多选） A.将LDHA和酿酒酵母表达载体pAUR123同时进行酶切，然后用DNA连接酶连接，得到重组的pAUR123表达载体 B.将上一步得到的pAUR123表达载体，转化到感受态酵母菌中，扩大培养 C.扩大培养时要将将转化后的菌株接种在固体培养基上 D.pAUR123重组表达载体上的乳酸脱氢酶编码序列能在大肠杆菌中高效表达。 （3）制备转LDHA基因酿酒酵母细胞时，将扩增的pAUR123重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，水浴一段时间，转化后的细胞接种于 　 　 的固体培养基表面，接种方法为 　 　 。倒置培养，筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 （4）如图2，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后，若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是 　 　 。（单选） A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种 为实现对菌体代谢的动态调控，研究人员设计了光感应系统，并导入绿色荧光蛋白（GFP）基因以检测光感应系统的调控能力。如图3，系统1在酵母中表达由V、L和H组成的融合蛋白。 （5）分别检测黑暗和光照下系统1的荧光强度，结果如图4。对照组能持续激活GFP表达。实验结果显示 　 　 ，可知系统1实现了光调控基因表达，但表达量较低。推测可能由于菌体密度高导致透光性差，不利于V﹣L﹣H对光照的响应。 （6）利用分级调节的放大效应，进一步优化设计出系统2（如图3），同等光照强度下，系统2荧光强度显著高于系统1，但是发现黑暗条件下系统2的GFP基因也有明显表达。为解决此问题，对系统2增加如图5所示组分，i、ii、iii依次为 　 　 （单选）。（注：G80蛋白可结合并抑制GAL4；含有PSD的融合蛋白在光下降解） A.持续表达型启动子、GAL4基因、PSD基因 B.Pc120、G80基因、PSD基因 C.PGAL、GAL4基因、PSD基因 D.持续表达型启动子、G80基因、PSD基因 （7）将优化后的系统2中GFP基因替换为乳酸脱氢酶基因，应用于酵母菌合成乳酸的发酵生产。发现在“先黑暗—后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，请推测“先黑暗—后光照”模式下乳酸产量高的原因 　 　 。 1. 利用 PCR 扩增目的基因时，循环 4 次后，只含目的基因片段的 DNA 分子数为（） A．8 B．16 C．6 D．12 2. 构建重组质粒时，选用两种不同限制酶切割目的基因和载体的主要目的是（） A． 提高酶切效率 B．防止载体自身环化和目的基因反向连接 C．使切割位点更精准 D．避免破坏目的基因的编码序列 3.下列关于 PCR 技术与体内 DNA 复制的比较，正确的是（） A． 两者都需要解旋酶破坏氢键 B． 两者所用引物均为 RNA 引物 C．PCR 延伸阶段由 Taq 酶催化，不需要 ATP 供能 D．体内 DNA 复制与 PCR 均在细胞核内完成 4.已知某质粒的标记基因上有 BamHⅠ 酶切位点，启动子旁有 EcoRⅠ 和 HindⅢ 位点。若要保证标记基因完整且能正确表达目的基因，应选择的酶切组合是（） A．仅用 BamHⅠ B．EcoRⅠ＋BamHⅠ C．EcoRⅠ＋HindⅢ D．仅用 EcoRⅠ 5.角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶类，在饲料工业中具有较大的应用前景，但天然菌株产酶量低。为了获得高效表达的KerA工程菌，研究者分别构建了大肠杆菌和毕赤酵母工程菌，并实现了异源表达。下图1为含KerA基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoR1、BamH1、Sall、Xhol均为限制酶，Kanr、Tcr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。请回答下列相关问题： (1)为了获取KerA基因，从天然菌株中提取相应的DNA片段，再通过PCR技术大量扩增，PCR技术的原理是_____。 (2)在构建基因表达载体的过程中，应该选用图1中的_____限制酶切割外源DNA和质粒DNA。 (3)将目的基因导入大肠杆菌时，常出现三种情况：未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。下图是KerA大肠杆菌工程菌的筛选示意图，结合图1所获得的重组质粒分析，下图2中的_____（选用“A／B／C／D／E”字母作答）菌落为含有目的基因的“工程菌”。 (4)KerA基因在大肠杆菌和毕赤酵母工程菌是否实现异源表达，需要用_____技术检测，但经研究发现，只有毕赤酵母工程菌表达合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是_____。 (5)KerA在60℃以上时热稳定性差，限制了该酶的应用范围，研究人员在KerA的末端插入半胱氨酸，这不仅对酶活性影响小，且大大提高了其热稳定性。其运用到的这种现代生物技术为_____。 6.水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶_________切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′_________3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含_________的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是_________。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用______。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的_______，待发育成熟后，往水体中添加________进行检测。 7.抗除草剂转基因作物可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。 注：内含子是真核生物基因的非编码序列，可被转录，在mRNA加工中被剪切掉，内含子被剪切后，报告基因GUS才能正常表达。 （1）构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过限制酶与　 　 酶与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列　 　 （“能”或“不能”）出现在目的基因内部，否则会导致目的基因被破坏。若目的基因两端缺少所需的限制酶识别序列，可通过PCR技术在引物的　 　 （“3’端”或“5’端”）添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。 （2）为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆In﹣Fusion技术（图2），其中In﹣Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。 ①关于图2所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有　 　 （可多选）。 A．免去传统方法双酶切的繁杂操作 B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确 C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性 ②科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In﹣Fusion反应。如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中片段　 　 。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过　 　 处理的农杆菌中。 ③为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物　 　 扩增目的基因并电泳检测。 （3）农杆菌转化愈伤组织时，用含　 　 的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基因GUS在　 　 细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，假阳性的农杆菌　 　 （出现/不出现）蓝色。 8.广东顺德桑蚕养殖历史悠久，蚕丝主要由丝素重链（FibH）等蚕丝蛋白聚合而成，韧性不足。蜘蛛丝被称为“生物钢”，由蛛丝蛋白（MiSp）聚合而成，有着超强韧性。科研人员利用人工改造后的piggyBac质粒（如图）作为载体，构建能表达MiSp的转基因家蚕，以期改良蚕丝的品质。 （1）经改造的蛛丝可作为手术缝合线，术后无需拆线，推测其原因是　 　 。 （2）下表为构建转基因家蚕的过程，请完成表格内容。 基本步骤 操作要点 第一步：获取目的基因 运用PCR技术扩增MiSp基因时需要的条件有：　 　 （至少写出两点） 第二步：构建重组质粒 为保证MiSp基因能与质粒正确连接并准确表达，MiSp基因必须插入到piggyBac质粒的启动子和终止子之间，进行基因扩增时，需选择的引物是　 ，且在其5′端分别加上　 　 限制酶的识别序列。 第三步：将目的基因导入受体细胞 利用　 　 方法将重组质粒导入家蚕的受精卵细胞。 第四步：目的基因的检测和鉴定 若观察到家蚕　 　 ，则说明目的基因导入受体细胞。可采用⑥　 　 技术，检测家蚕是否能产生蛛丝蛋白。 （3）研究者提出可应用现代发酵工程技术生产蛛丝蛋白的思路：筛选出高产蛛丝蛋白的菌种经　 　 ，再接种到　 　 中大规模生产。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 重难01 吃透基因工程：PCR、酶切、载体构建等重难核心 1．掌握 PCR 核心：熟练掌握 PCR 的原理、三步循环（变性 复性 延伸）、反应条件，精准区分 PCR 与体内 DNA 复制的关键差异。 2.突破酶的应用：明确限制酶的识别与切割特点，掌握双酶切设计原则，能解决载体构建中酶的选择问题。 3.贯通工程流程：吃透基因表达载体构建的核心要素，熟练掌握目的基因检测与鉴定的层级方法与适用场景。 一、PCR技术（聚合酶链式反应） （1）定义 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2）反应过程 变性阶段 复性阶段 延伸阶段 当温度超过 90℃时，双链 DNA 解聚为单链（体外用高温代替解旋酶） 当温度下降到 50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合 当温度上升到 72℃左右时，耐高温的 DNA 聚合酶发挥作用，以 4 种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成新的 DNA 链 （3）反应条件 PCR反应需要在一定的缓冲液中进行，需提供： 1　 DNA模板：待扩增的目的基因DNA 2　 2种引物：分别与两条模板链结合的、人工合成的短单链DNA（长度通常为20~30个核苷酸） 3　 4种脱氧核苷酸（dNTP）：合成DNA子链的原料 4　 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）：催化子链合成，耐受PCR的高温循环 5　 Mg²⁺：激活DNA聚合酶活性，缓冲液中需添加 6　 温度循环控制：变性→复性→延伸，循环n次后目的基因数量约为2ⁿ，产物常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 （4）PCR与体内DNA复制的关键差异 对比项目 PCR（体外扩增） 体内DNA复制 解旋方式 高温（90℃以上）解旋，无需解旋酶 解旋酶催化打开双链 所用酶 耐高温的Taq DNA聚合酶 普通DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等多种酶 引物类型 人工合成的DNA单链 细胞内合成的RNA引物 反应场所 体外PCR仪中 细胞内（细胞核、线粒体、叶绿体） 温度条件 周期性变温（变性/复性/延伸） 恒温（细胞生理温度） 二、基因工程核心酶的应用 （1）限制酶（限制性核酸内切酶） ① 定义 限制酶是能够识别特定的核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子的酶，作用于DNA分子中的磷酸二酯键。 ② 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 ③ 双酶切设计原则 选用两种不同的限制酶，分别切割载体和含目的基因的DNA片段 核心目的：防止载体自身环化、目的基因自身环化与反向连接，大幅提高重组载体的构建效率 关键要求：两种酶切割后，载体与目的基因能产生互补的黏性末端，保证目的基因正确、定向连接 （2）DNA连接酶 ① 定义 DNA连接酶是能够恢复磷酸二酯键，将两个DNA片段（目的基因与载体）拼接形成重组DNA分子的酶。 ② 与DNA聚合酶的核心差异 酶的种类 作用对象 核心功能 应用场景 DNA连接酶 两个完整的DNA片段 恢复磷酸二酯键，连接片段 基因表达载体的构建 DNA聚合酶 单个脱氧核苷酸 连接脱氧核苷酸形成子链 体内DNA复制、PCR延伸阶段 三、基因工程高频操作流程 （1）基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） ① 定义 获取足量目的基因后，为使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，需要构建基因表达载体。 ② 核心要素 组成元件 定义 核心功能 启动子 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 终止子 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游 使转录在所需要的地方停下来，终止转录过程 目的基因 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物的基因，主要是编码蛋白质的基因 编码目标性状的外源基因（如Bt抗虫蛋白基因、抗冻蛋白基因afp） 标记基因 载体上用于筛选的基因（如抗生素抗性基因） 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 复制原点 载体上控制复制的序列 控制载体在受体细胞内的复制起点，保证载体随细胞分裂稳定遗传 （2）目的基因的检测与鉴定 ① 定义 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能确定，是检查转基因生物是否培育成功的关键步骤。 ② 分子水平检测 检测层级 检测内容 方法 适用场景 DNA水平 目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA PCR技术、DNA分子杂交技术 初步验证目的基因是否成功导入受体细胞 转录水平 目的基因是否转录出mRNA 分子杂交技术（用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交） 验证目的基因是否启动转录，完成基因表达的第一步 翻译水平 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术 验证目的基因是否完成翻译，合成目标蛋白质 ③ 个体生物学水平鉴定 定义：在个体水平对转基因生物的性状进行直接鉴定，验证目的基因的功能 适用场景：最终验证转基因生物的性状表达，如： a.转基因抗虫棉：采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，确定Bt基因是否赋予棉花抗虫特性及抗性程度 b.抗病转基因植物：接种病原体，鉴定抗病性 c.抗逆转基因作物：进行干旱、盐碱等胁迫处理，鉴定抗逆性 判定标准：只有个体水平表现出预期性状，才代表转基因生物培育成功 题型01 PCR技术原理与过程综合分析 【方法与技巧】 核心突破：牢牢紧扣 PCR 最新定义（体外依据 DNA 半保留复制，大量复制目的基因），牢记 “变性→复性→延伸” 三步循环的温度、核心反应及特点，不混淆细节。 易错点秒杀 ① 解旋方式：PCR 靠高温（90℃以上）解旋，无需解旋酶；② 酶的选择：必须用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，普通 DNA 聚合酶不耐高温；③ 引物要求：2 种引物，分别与两条模板链 3' 端互补，为 DNA 单链；④ 计算规律：循环 n 次，目的基因数量约为2n，第 3 次循环才出现完整目的基因片段；⑤ 原料与条件：原料是 4 种脱氧核苷酸（dNTP），需含Mg2+的缓冲液。 解题步骤 先判断题干考查 PCR 的核心知识点（原理 / 过程 / 条件 / 与体内复制差异）→ 定位对应细节，排除易错选项→ 结合题干信息验证答案（计算题需注意循环次数与完整片段的关系）。 【典例解析】 【典例1】生长素参与植物生长发育的调节，生长素运输蛋白（PINI）对IAA的极性运输具有重要作用。为研究35S启动子（一种来自病毒的强启动子）能否引起下游基因的过量表达，研究人员将35S启动子与PINI基因转入拟南芥，观察PINI过量表达对植物的影响。 （1）获取PINI基因的mRNA后，通过RT-PCR扩增获取PINI基因（DNA）时所需要的酶是 　 　 。每次PCR循环分为3步，其中所需温度最低的一步称为 　 　 。 （2）PINI基因不能直接导入受体细胞，需要构建PINI表达载体。构建PINI表达载体的目的是 　 　 。 （3）为将PINI基因以正确方向插入质粒需要双酶切。在设计引物时，需在引物的5'端加入相应的酶切位点。据图1分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是 　 　 。 （4）提取转基因拟南芥的DNA，用相应引物扩增出35S启动子和PINI基因，为检测目的基因是否导入拟南芥，应电泳检测扩增产物中的 　 　 ，不检测另一种的原因是 　 　 。据图2可知，也可在个体水平上进行检测，方法是 　 　 。 【答案】（1）逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 复性 （2）保证PINI在受体细胞中稳定存在和表达 （3）EcoRⅠ和PstⅠ （4）35S 启动子 本实验的目的是要探究PINI过量表达对植物的影响，因此需要首先确定35S是否存在 使用除草剂来检测转基因植物对除草剂的抗性 【解析】（1）获取PINI基因的mRNA后，需要经过逆转录过程获得DNA，而后通过PCR技术扩增该DNA，PCR过程中需要耐高温的DNA聚合酶，因此，用mRNA通过RT﹣PCR扩增获取PINI基因（DNA）时所需要的酶是逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶）。每次PCR循环分为3步，分别是高温变性、低温复性和中温延伸，可见所需温度最低的一步称为复性。 （2）PINI基因不能直接导入受体细胞，否则会被限制酶切割，因此，为了保证目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，因而需要构建PINI表达载体。 （3）为将PINI基因以正确方向插入质粒需要双酶切。在设计引物时，需在引物的5'端加入相应的酶切位点。由于目的基因中存在XhoⅠ限制酶，为了达到双酶切的目的，在构建基因表达载体时，应选用的限制酶是EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列。 （4）提取转基因拟南芥的DNA，用相应引物扩增出35S启动子和PINI基因，为检测目的基因是否导入拟南芥，应电泳检测扩增产物中的35S，不检测PINI基因的原因是本实验的目的是要探究PINI过量表达对植物的影响，因此需要首先确定35S是否存在。图2中显示目的基因表达载体中的标记基因是抗除草剂基因，因此也可通过使用除草剂来检测对除草剂的抗性实现在个体水平上进行的检测。 【典例2】柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5′﹣A↓AGCTT﹣3′、5′﹣G↓GATCC﹣3′、5′﹣G↓TCGAC﹣3′。请回答下列问题： （1）构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有　 　 （回答2点）等。据图分析，在基因表达载体构建过程中，应使用　 　 对M基因和质粒进行切割。 （2）利用PCR技术克隆M基因时，应选择如图中的引物　 　 （填序号），引物的作用是　 　 。 （3）将图中农杆菌先后置于含　 　 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是　 　 。 （4）图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了　 　 技术，该技术的原理是　 　 。 【答案】（1）标记基因、启动子、终止子、复制原点 SalⅠ和HindⅢ （2）2和3 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 （3）氨苄青霉素、四环素 对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况 （4）植物组织培养 植物细胞全能性 【解析】（1）基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等；据图分析，用限制酶BamHⅠ会破坏M基因，且为了防止目的基因和载体自身环化以及反向连接，应使用SalⅠ和HindⅢ对M基因和质粒进行切割。 （2）根据子链延伸方向为5'→3'，引物需要与模板的3'端结合，可判断出扩增M基因应选择引物2和引物3；引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （3）用限制酶SalⅠ和HindⅢ对质粒进行切割时，破坏了抗四环素基因，在重组质粒上只有抗氨苄青霉素基因，因此应先将农杆菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，此时导入空质粒和重组质粒的农杆菌均可存活，再将存活的农杆菌接种于含四环素的培养基中，此时导入重组质粒的农杆菌由于没有四环素抗性而死亡，从原来含氨苄青霉素的培养基中原位置可筛选出含重组质粒的农杆菌；在个体生物学水平上，通过对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况，可以检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染。 （4）由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性。 题型02 限制酶与双酶切设计综合题 【方法与技巧】 核心突破：明确限制酶的识别与切割特点（识别特定回文序列、切割磷酸二酯键、产生黏性/平末端），掌握双酶切设计原则，核心解决载体构建中酶的选择问题。 双酶切设计关键 ① 选用两种不同限制酶，分别切割载体和目的基因；② 目的是防止载体自身环化、目的基因自身环化和反向连接；③ 关键要求：两种酶切割后，载体与目的基因产生互补黏性末端，保证定向连接；④ 避免用同一种限制酶，否则易出现连接错误。 解题步骤 先分析题干中载体和目的基因的酶切位点→ 结合双酶切原则判断酶的选择是否合理→ 排除“自身环化、反向连接”相关错误选项→ 验证酶切后末端是否互补。 【典例剖析】 【典例1】稻米的直链淀粉是由蜡质基因（waxy）控制合成的淀粉合成酶（GBSS）催化形成，直链淀粉含量高的米饭质地和适口性不高。将waxy反义基因片段导入水稻细胞抑制内源基因表达，可降低直链淀粉含量。请据图回答下列问题。 （1）分析图1和图2可知，waxy基因表达时的模板链为　 　 （填“1”或“2”）链。 （2）据图1可知，为构建waxy反义基因表达载体，在利用PCR技术获取waxy基因过程中，需要在设计的两种引物5’端分别添加限制酶　 　 的识别序列。将目的基因与载体连接，可获得　 　 种重组DNA分子。 （3）结合图2已知信息，构建基因表达载体后若要筛选得到构建正确的waxy反义基因表达载体，可选择引物　 　 进行PCR技术检测，PCR技术的原理是　 　 。 （4）反义基因技术能降低稻米中直链淀粉含量的机制是：　 　 。 【答案】（1）2 （2）SmaⅠ、SmaⅠ2 （3）B和G（或C和F） DNA的半保留复制 （4）反义基因表达载体中waxy基因转录出的mRNA与稻米自身所含waxy基因转录出的mRNA碱基互补配对结合成双链，阻止了稻米中waxy基因的翻译 【解析】（1）基因转录时，模板链的方向是3'→5'，转录方向与模板链反向。图1中waxy基因的转录方向为M→N，图2中1链的方向是5'→3'，2链的方向是3'→5'，且转录方向与2链反向，因此模板链为2链。 （2）插入的目的基因需要在LB和RB之间，且要在启动子的下游，同时选择的限制酶不能破坏目的基因，这样能选取的限制酶只有SmaⅠ，因此为构建waxy反义基因表达载体，在利用PCR技术获取waxy基因过程中，需要在设计的两种引物5'端分别添加限制酶SmaⅠ的识别序列。由于使用同种限制酶切割，则存在正向和反向连接，因此可获得2种重组DNA分子。 （3）反义基因的转录方向与waxy基因相反，因此需要选择能扩增反义基因与载体连接区域的引物。结合图2，引物C（以waxy基因 1 链为模板）和引物F（以α链为模板）可以特异性扩增正确的反义基因表达载体片段，同理，也可用引物B和引物G。 （4）waxy反义基因转录产生的mRNA与waxy基因的mRNA碱基互补配对，形成双链RNA，阻止waxy基因的mRNA翻译出淀粉合成酶（GBSS），从而抑制直链淀粉的合成，降低稻米中直链淀粉含量。 【典例2】如图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X﹣gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题： （1）可使用 　 　 技术扩增目的基因。 （2）过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是 　 　 。 A．只有BamHⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．EcoRⅤ和BamHⅠ D．EcoRⅤ和EcoRⅠ （3）基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、　 　 和目的基因的检测与鉴定。其中在构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还可以选择噬菌体和 　 　 。 （4）过程②常用 　 　 处理大肠杆菌，使其处于容易吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （5）为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入 　 　 ，培养一段时间后挑选出 　 　 （填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 【答案】（1）PCR （2）B （3）将目的基因导入受体细胞 动植物病毒 （4）Ca2+ （5）X﹣gal 白色 【解析】（1）可使用PCR技术扩增目的基因。 （2）构建基因表达载体最佳方法是使用双酶切法处理目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端，进而通过DNA连接酶构建基因表达载体，这样能防止目的基因和质粒的自身环化。选择限制酶的要求是不能破坏目的基因，故不选择EcoRⅤ，可以选择BamHⅠ和EcoRⅠ处理目的基因和质粒。 故选：B。 （3）基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入到受体细胞和目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，所用载体除了质粒以外，还有噬菌体和动植物病毒。 （4）过程②常用Ca2+处理大肠杆菌，目的是使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （5）LacZ基因编码的酶可使X﹣gal分解，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。构建基因表达载体时，目的基因的插入使LacZ基因破坏，不能表达出相应的酶，进而不能使培养基中X﹣gal分解，因此菌落呈现白色。即在筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入X﹣gal，培养一段时间后挑选出“白色”的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 题型03基因表达载体构建分析题 【方法与技巧】 核心突破：吃透基因表达载体的 5 大核心要素（启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点），牢记各要素的定义和功能，明确载体构建的完整流程。 易错点秒杀 ① 启动子≠起始密码子，启动子是 RNA 聚合酶结合位点（DNA 片段），起始密码子位于 mRNA 上；② 终止子≠终止密码子，终止子终止转录，终止密码子终止翻译；③ 标记基因的作用是 “筛选含重组载体的受体细胞”，而非鉴定目的基因是否表达；④ 载体构建必须用限制酶和 DNA 连接酶，缺一不可。 解题步骤 先明确题干考查载体要素 / 构建流程 / 酶的选择→ 逐一分析选项，结合要素功能和流程细节排除错误→ 验证选项是否符合教材表述。 【典例剖析】 【典例1】水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，可实现对水体中水杨酸含量的动态检测，为环境污染治理提供新方法。其过程如图1所示，向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器。请回答下列问题： （1）基因工程操作的核心工作是基因表达载体的构建，其组成包括启动子、终止子、目的基因和　 　 。启动子是　 　 识别和结合的部位，其功能是　 　 。 （2）分析图1可知，当环境中存在水杨酸时，　 　 可激活Ps，使mrfp基因表达，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。Ps从类型上属于　 　 型启动子，Pc和Ps　 　 （填“是”或“不是”）同一类型的启动子。 （3）基因工程中启动子与增强子都与基因转录有关，增强子可增强转录效率。研究人员欲通过改造重组质粒，实现在相同浓度的水杨酸条件下，使荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度。方法一是选择激活能力更强的调控蛋白基因nahR1替代nahR；方法二是在mrfp基因前插入　 　 。 （4）水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是　 　 。 【答案】（1）标记基因 RNA聚合酶 驱动基因转录出mRNA （2）水杨酸﹣调控蛋白复合物 诱导 不是 （3）增强子 （4）引物1和引物3 【解析】（1）基因表达载体的结构包括启动子、终止子、目的基因和标记基因；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点；功能是驱动基因转录出mRNA。 （2）据图1可知，水杨酸进入细胞后和调控蛋白结合形成水杨酸—调控蛋白复合物，该复合物激活启动子Ps，进而启动红色荧光蛋白基因表达；Ps需要水杨酸诱导才能激活，属于诱导型启动子；Pc持续驱动调控蛋白基因表达，不需要诱导，与Ps不是同一类型启动子。 （3）据题干信息可知，增强子可以增强基因转录效率，因此要提高荧光强度，可在mrfp基因前插入增强子，增强转录效率提高表达量。 （4）水杨酸羟化酶基因a链为模板链，根据模板链3'→5'的方向，可知引物1位于该基因的上游、引物2位于下游；mrfp基因b链为模板链，同理可知，引物3位于该基因的下游、引物4位于上游。根据融合基因的连接顺序，选用融合基因上、下游的引物1和3进行扩增可用于鉴定。 【典例2】利用Golden Gate构建基因表达载体的原理是利用TypeⅡs型限制酶（如BsaⅠ）的酶切位点在识别序列之外的特性，使重组DNA分子上不会留下使用的酶切位点，这样就可以在同一反应体系中进行酶切和片段连接，且可以通过设计自定义序列（NNNNN）同时进行多片段的有序连接。镉是水体污染中常见的重金属元素，为治理水体中的镉污染，研究人员将镉离子结合蛋白基因CADR、黄色荧光蛋白基因YFP利用Golden Gate法融合并接入质粒，转入莱茵衣藻细胞后利用含镉培养液进行培养。质粒构建过程如图所示（RFP表示红色荧光蛋白基因），请回答下列问题。 （1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有　 　 （写出一项）。利用BsaⅠ切割时DNA分子的　 　 键发生断裂，形成黏性末端；理论上利用BsaⅠ切割后最多可以产生　 　 种黏性末端。若要在同一反应体系中完成载体构建，除BsaⅠ酶外，还需要在反应体系中加入　 　 。 （2）为保证目的基因与载体正确连接且重组质粒上不保留酶切位点，研究人员需要设计不同的BsaⅠ切割位点，若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'﹣CCATGGAGACC﹣3'，则CADR基因左侧切割后形成的黏性末端序列为5'﹣　 　 ﹣3'（写出同一单链碱基）。 （3）构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶作用底物的是　 　 。 （4）为筛选构建成功的重组载体，用酶切并连接处理后的DNA分子转化靶细胞，培养一段时间后在荧光显微镜下观察，观察到部分发红色荧光的细胞，原因是　 　 。若通过培养，观察到某细胞株系发出黄色荧光，　 　 （填“能”或“不能”）确定该株系适合用于镉污染治理。 【答案】（1）标记基因 磷酸二酯 256 DNA连接酶 （2）5'﹣CCAT﹣3' （3）D （4）未插入CADR/YFP的目的基因的空载体，RFP基因正常表达 能 【解析】（1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有标记基因、复制原点。BsaⅠ属于限制酶切割DNA分子，断裂DNA分子磷酸二酯键。由于BsaⅠ黏性末端含有4个随机碱基（NNNN），每种位置有4种可能，故最多能产生44＝256种黏性末端。表达载体的构建需要使用DNA连接酶、限制酶等工具酶。 （2）若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'﹣CCATGGAGACC﹣3'，BsaⅠ切割产生的黏性末端是3'﹣GGTA﹣5'，则CADR基因左侧切割后形成的黏性末端序列为5'﹣CCAT﹣3'。 （3）脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，﹣OH位于3'端，ABC脱氧核苷酸两端的基团有误，DNA连接酶是连接两个相同的DNA片段，即催化一条脱氧核苷酸链的3'端的﹣OH与另一脱氧核苷酸链的5'端的磷酸基团形成磷酸二酯键，故选D。 （4）部分细胞仅导入未插入CADR/YFP的目的基因的空载体，RFP基因正常表达，但CADR和YFP未插入，故仅发红色荧光。若观察到黄色荧光，即CADR与YFP均正确插入并转录翻译，说明该体系具备镉抗性及报告功能，能用于镉污染治理。 题型04目的基因检测与鉴定层级分析题 【方法与技巧】 核心突破：熟练掌握 “分子水平（DNA→转录→翻译）+ 个体水平” 的层级检测方法，明确每种方法的检测内容、适用场景，牢记转基因成功的判定标准。 层级记忆 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 易错点秒杀 ① 仅检测到目的基因插入（DNA 水平），不代表转基因成功；② 分子杂交（转录水平）检测 mRNA，抗原 — 抗体杂交检测蛋白质，不可混淆；③ 个体水平鉴定是转基因成功的最终标准。 解题步骤 先明确题干考查的检测层级→对应匹配检测方法与适用场景→排除 “层级颠倒、方法混淆” 的错误选项→验证转基因成功的判定逻辑。 【典例剖析】 【典例1】 为提高棉花植株的抗虫特性，研究小组将抗虫基因Cry1A基因导入棉花细胞中以得到转基因抗虫棉，过程如图1。该过程涉及的各种限制酶及酶切位点如表。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ SmaⅠ XmaⅠ HindⅢ 识别序列 G↓GATCC G↓AATTC CCC↓GGG C↓CCGGG A↓AGCTT （1）目的基因的筛选与获取：研究人员将苏云金杆菌中获取的Cry1A基因成功导入棉花细胞并表达，但产物表达量较低，需要将其中多个密码子替换为植物偏爱密码子。在已知Cry1A基因序列的前提下，可采用 　 　 方法获取新的目的基因。 （2）基因表达载体的构建：目的基因需要连接在启动子和终止子之间，为实现该操作，需要在目的基因两端添加HindⅢ限制酶识别序列，该方法的不足是 　 　 。研究人员为改善该问题，在目的基因两侧增加了其他限制酶识别序列如图2，则可选择的限制酶组合有 　 　 种（不考虑连接效率）。 （3）将目的基因导入受体细胞：除图示外的方法，将抗虫基因导入棉花细胞的方法还有 　 　 ，该方法相比于图示方法的优点是 　 　 （说出2点）。 （4）目的基因的检测与鉴定：除了利用PCR技术检测目的基因是否插入成功并转录外，还需在个体水平进行鉴定，为判断转基因抗虫棉是否培育成功，需要对其进行的操作是 　 　 。 【答案】（1）人工合成 （2）易出现目的基因和质粒的自身环化，及目的基因与质粒的错误连接 5 （3）花粉管通道法 无需进行组织培养，缩短培育周期；成本低，操作简单（言之有理即可） （4）在转基因抗虫棉生长期喷洒一定浓度的除草剂并投放棉铃虫幼虫进行取食，观察抗虫棉的生长情况（合理即可） 【解析】（1）在已知Cry1A基因序列的前提下，可采用人工合成方法获取新的目的基因。 （2）基因工程中，目的基因和质粒都需要经过酶切，如果处理不当，容易出现目的基因和质粒的自身环化，及目的基因与质粒的错误连接，影响后续的转化效率。若在两侧都添加了SmaⅠ/EcoRⅠ/HindⅢ和 BamHⅠ/EcoRⅠ/HindⅢ等位点，则可供选择的限制酶配对共有5 种，即EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ、HindⅢ和BamHⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ、HindⅢ和HindⅢ。 （3）花粉管通道法是一种简便的转基因方法，可以直接将外源DNA导入植物的生殖细胞，无需进行组织培养，缩短培育周期；成本低，操作简单。 （4）在个体水平上鉴定转基因抗虫棉是否真正抗虫，在转基因抗虫棉生长期喷洒一定浓度的除草剂并投放棉铃虫幼虫进行取食，观察抗虫棉的生长情况。 故答案为： （1）人工合成 （2）易出现目的基因和质粒的自身环化，及目的基因与质粒的错误连接 5 （3）花粉管通道法 无需进行组织培养，缩短培育周期；成本低，操作简单（言之有理即可） （4）在转基因抗虫棉生长期喷洒一定浓度的除草剂并投放棉铃虫幼虫进行取食，观察抗虫棉的生长情况（合理即可） 【典例2】果胶甲酯酶具有催化水解果胶的作用，为获得高产、高纯度的胞外果胶甲酯酶，图1表示某科研小组设计的黑曲霉工程菌的构建和发酵流程图。回答下列问题： （1）科研小组从基因数据库中获得果胶甲酯酶基因序列后，通过设计引物扩增出大量果胶甲酯酶基因片段，在扩增过程中提供4种dNTP的作用 　 　 ，在构建重组表达载体过程中，果胶甲酯酶基因应插入到质粒的 　 　 间才能进行表达，此过程缓冲液中加入Mg2+的目的是 　 　 。 （2）可提取农杆菌的DNA进行PCR后再通过 　 　 判断重组表达载体是否导入到农杆菌。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原﹣抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉 　 　 判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶甲酯酶相似，造成提取产物纯度不高，所以科研小组通过一定的方法将这种蛋白质的基因 　 　 ，实现获得高纯度的果胶甲酯酶。 （3）目的基因的检测与鉴定。可采用PCR技术检测果胶甲酯酶基因是否成功导入黑曲霉菌。已知目的基因一条链的部分序列为5'﹣TACAGGT……GGTTCAC﹣3'，则检测目的基因时特异性引物对应选择 　 　 。 A.5'﹣TACAGGT﹣3' B.5'﹣GGTTCAC﹣3' C.5'﹣ATGTCCA﹣3' D.5'﹣GTGAACC﹣3' 再将扩增得到的DNA片段进行检测结果如图2，据图未成功导入目的基因的是 　 　 （填写数字）。 【答案】（1）在PCR扩增过程中提供原料和能量 启动子和终止子 作为相关酶的激活剂 （2）琼脂糖凝胶电泳（凝胶电泳） 单位时间催化水解的果胶量 敲除 （3）AD 2、7 【解析】（1）dNTP代表脱氧核糖核苷酸三磷酸，4种dNTP由磷酸基团，脱氧核糖和含氮碱基组成，可以为PCR（体外扩增DNA技术）提供原料和能量，质粒常作为运载体帮助目的基因复制及表达，基因表达必须有启动子和终止子，因此须插在启动子和终止子之间，缓冲液中加入Mg2+的目的是作为相关酶的激活剂。 （2）琼脂糖凝胶电泳可以检测DNA，通过与标准DNA对照，判断是否存在对应的DNA。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原﹣抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉单位时间催化水解的果胶量判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶酶相似，造成提取产物纯度不高，可以将该蛋白对应的基因敲除，使得该蛋白无法合成，排除对果胶甲酯酶的干扰。 （3）已知目的基因一条链的部分序列为5'﹣TACAGGT……GGTTCAC﹣3'，引物是与模板链互补配对的一段短单链DNA，引物与模板链的3'端结合后才能进行DNA的扩增，根据碱基互补配对原则（A﹣T，C﹣G）进行选择，所以检测目的基因时特异性引物对应选择5'﹣GTGAACC﹣3'和5'﹣TACAGGT﹣3'，AD正确，BC错误。 故选：AD。 观察图2，M为Marker（标准分子量），P为阳性对照（含有目的基因的对照），目的基因长度为457kb，在1﹣10号黑曲霉菌中，2和7号没有出现与阳性对照相同位置（457kb左右）的条带，说明2和7号未成功导入目的基因。 题型05 三大重难点综合应用题 【方法与技巧】 核心突破：串联 PCR 技术、酶的应用、载体构建、目的基因检测四大核心知识点，以转基因生物（如抗虫棉、抗冻番茄）为案例，综合考查知识应用能力，贴合期中大题命题趋势。 解题模板 ① 目的基因获取：PCR 技术（原理、条件、过程）；② 载体构建：限制酶（双酶切）+ DNA 连接酶，载体五要素；③ 检测与鉴定：分子水平三步检测 + 个体水平鉴定；④ 答题规范：使用教材标准术语，避免口语化（如 “启动子”“抗原 — 抗体杂交” 不可简写）。 易错点提醒 综合题中，常结合 PCR 计算、双酶切设计、检测方法辨析，需逐一突破，避免遗漏细节。 【典例剖析】 【典例1】人体内的t﹣PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物t﹣PA。 （1）研究人员采用PCR技术可以获得大量t﹣PA基因，PCR的原理是 　 　 。此外，大量获得t﹣PA基因的方法还有 　 　 （答出两种）。 （2）高质量的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除蛋白质，原因是 　 　 。 （3）研究表明，为心梗患者注射大量t﹣PA会诱发颅内出血，其原因在于t﹣PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t﹣PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。（注：如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题： ①改造t﹣PA蛋白你认为应该直接对蛋白质进行改造，还是对天然的t﹣PA基因进行序列改造，原因是？　 　 。 ②如图所示，需选用限制酶XmaⅠ和 　 　 切开质粒pCLY11，才能与t﹣PA改良基因高效连接。在基因工程的基本操作过程中，最核心的步骤是基因表达载体的构建，其目的是 　 　 。 ③应该选择不含 　 　 的大肠杆菌作为受体细胞，以便在加入新霉素的选择培养基中筛选出导入质粒的大肠杆菌。筛选出的大肠杆菌菌落并非都是目的菌株，这时选择 　 　 色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t﹣PA蛋白的工程菌株。 【答案】（1）DNA半保留复制 人工合成、从基因文库中获取 （2）蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性。 （3）应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。BgLⅡ让目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用 neo'（新霉素抗性基因） 白 【解析】（1）PCR技术是体外DNA复制的一﹣种技术，其原理是DNA半保留复制，此外，大量获得t﹣PA基因（目的基因）的方法还有人工合成、从基因文库中获取。 （2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一，在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同，蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性，因此能用高温处理的方法去除蛋白质。 （3）①蛋白质结构比较复杂，天然的t﹣PA基因控制t﹣PA蛋白的合成，改造t﹣PA蛋白应该对天然的t﹣PA基因进行序列改造，其主要原因有：蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。 ②目的基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶XmaI和BglI切割产生的粘性末端能与目的基因的黏性末端碱基互补，要想把目的基因与质粒pCLY11 （运载体） 拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶Xma和BglI切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建，期的是让目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 ③限制酶XmaI和BglI会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏neo'（新霉素抗性基因），质粒pCLY11能产生新霉素抗性物质，选择不含neo'（新霉素抗性基因）的大肠杆菌作为受体细胞，这些细胞没有新霉素的抗性，当其导入重组质粒后，质粒上的neo'（新霉素抗性基因）使得大肠杆菌具有新霉素抗性，这样可以选择导入质粒pCLY11的大肠杆菌，因此应该选择不含neo'（新霉素抗性基因）的大肠杆菌作为受体细胞，以便在加入新霉素的选择培养基中筛选出导入质粒的大肠杆菌。 由于neof （新霉素抗性基因）存在于原有质粒上，若未连目的基因的质粒导入到大肠杆菌中，这些大肠杆菌也可以获得新霉素的抗性；而区分重组质粒和原有质粒的一个标志可以观察mlacZ基因的表达情况，由于重组质粒拼接了目的基因，破坏了mlacZ基因，因此在重组质粒中该基因不表达，菌落呈现白色，而原有基因由于该基因保存完整，可以表达，所以菌落呈现蓝色，因此筛选出的大肠杆菌菌落并非都是目的菌株，这时选择白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t﹣PA蛋白的工程菌株。 【典例2】在传统领域，乳酸广泛应用于食品、化妆品、饲料、农药、医药、化工等行业；同时，乳酸是合成新兴材料聚乳酸的主要原料。得益于下游市场的发展，我国乳酸需求量持续增长。乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。研究者将人工合成的、来源于牛的乳酸脱氢酶A基因（LDHA）插入酿酒酵母表达载体pAUR123中，经过转化、筛选、鉴定和培养，获得了产乳酸的商用酿酒酵母菌。 （1）LDHA的获取：研究者从基因数据库检索获得牛LDHA编码序列，并将其编码起始密码子序列中的原核生物偏好的GTG替换为酿酒酵母偏好的密码子ATG，替换的目的是 　 　 。再通过 　 　 法将核苷酸按照顺序一个一个连接起来，由此合成少量LDHA。为了获得大量的LDHA，可采用PCR技术对LDHA基因进行扩增。为了保证扩增过程的特异性，根据LDHA的两端序列设计相关引物。为了方便目的基因与质粒的正确连接，通常在引物1的5′端加上 　 　 （选填编号）识别序列，引物2的5′端加上 　 　 （选填编号）识别序列。 ①XbaⅠ ②BamHⅠ ③EcoRⅠ （2）pAUR123重组表达载体的构建过程中，下列实验步骤错误的为 　 　 。（多选） A.将LDHA和酿酒酵母表达载体pAUR123同时进行酶切，然后用DNA连接酶连接，得到重组的pAUR123表达载体 B.将上一步得到的pAUR123表达载体，转化到感受态酵母菌中，扩大培养 C.扩大培养时要将将转化后的菌株接种在固体培养基上 D.pAUR123重组表达载体上的乳酸脱氢酶编码序列能在大肠杆菌中高效表达。 （3）制备转LDHA基因酿酒酵母细胞时，将扩增的pAUR123重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，水浴一段时间，转化后的细胞接种于 　 　 的固体培养基表面，接种方法为 　 　 。倒置培养，筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 （4）如图2，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后，若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是 　 　 。（单选） A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种 为实现对菌体代谢的动态调控，研究人员设计了光感应系统，并导入绿色荧光蛋白（GFP）基因以检测光感应系统的调控能力。如图3，系统1在酵母中表达由V、L和H组成的融合蛋白。 （5）分别检测黑暗和光照下系统1的荧光强度，结果如图4。对照组能持续激活GFP表达。实验结果显示 　 　 ，可知系统1实现了光调控基因表达，但表达量较低。推测可能由于菌体密度高导致透光性差，不利于V﹣L﹣H对光照的响应。 （6）利用分级调节的放大效应，进一步优化设计出系统2（如图3），同等光照强度下，系统2荧光强度显著高于系统1，但是发现黑暗条件下系统2的GFP基因也有明显表达。为解决此问题，对系统2增加如图5所示组分，i、ii、iii依次为 　 　 （单选）。（注：G80蛋白可结合并抑制GAL4；含有PSD的融合蛋白在光下降解） A.持续表达型启动子、GAL4基因、PSD基因 B.Pc120、G80基因、PSD基因 C.PGAL、GAL4基因、PSD基因 D.持续表达型启动子、G80基因、PSD基因 （7）将优化后的系统2中GFP基因替换为乳酸脱氢酶基因，应用于酵母菌合成乳酸的发酵生产。发现在“先黑暗—后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，请推测“先黑暗—后光照”模式下乳酸产量高的原因 　 　 。 【答案】（1）提高翻译效率，有利于表达的高效进行 化学合成 ②① （2）BCD （3）缺乏尿嘧啶 稀释涂布平板法 （4）B （5）系统1在黑暗中荧光强度极低，光照后荧光强度升高但仍显著低于对照组 （6）D （7）发酵早期处于黑暗中，酵母菌不合成乳酸，物质和能量主要用于菌体生长繁殖；当菌体达到一定数量后，照光启动乳酸合成，因此乳酸总产量高 全程光照时，持续合成乳酸，消耗物质和能量较多，影响酵母菌生长繁殖，乳酸总产量低 【解析】（1）结合题干中信息，研究者为了获得了产乳酸的商用酿酒酵母菌，将人工合成的、来源于牛的乳酸脱氢酶A基因（LDHA）插入酿酒酵母表达载体pAUR123中，再经过转化、筛选、鉴定和培养，由此可知获得牛LDHA编码序列为1170bp后并将其编码起始密码子序列中的原核生物偏好的GTG替换为酿酒酵母偏好的ATG，目的是为了提高酵母菌的翻译效率，有利于基因的表达。然后再通过化学合成的方法，合成少量的LDHA。结合目的基因的转录方向，可推知其左端应靠近启动子，右端应靠近终止子，再结合质粒上启动子、终止子以及限制酶切割位点的分布进行分析，应选择BamHⅠ和XbaⅠ进行切割，引物1和引物2的5’端应分别加上BamHⅠ和XbaⅠ的识别序列。 （2）A、构建重组的pAUR123表达载体，需要将LDHA和酿酒酵母表达载体pAUR123用限制酶进行切割，再用DNA连接酶进行连接，A正确； B、导入重组质粒时，受体细胞若是大肠杆菌，针对微生物，通常采用钙离子处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组的pAUR123表达载体导入其中，B错误； C、扩大培养时要将将转化后的菌株接种于LB液体培养基中，于37℃下振荡培养，其目的是实现pAUR123表达载体的扩增，C错误； D、由于启动子具有特异性，pAUR123重组表达载体上带有真核酿酒酵母基因的启动子，而大肠杆菌为原核生物，故pAUR123重组表达载体上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达，D错误。 故选：BCD。 （3）酿酒酵母不能合成尿嘧啶，而质粒上含有尿嘧啶合成酶基因，其表达的尿嘧啶合成酶可催化合成尿嘧啶，因此导入重组DNA的酿酒酵母可在不含尿嘧啶的培养基上生长，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株则不能生存，因此可以通过以下方法进行筛选：将扩增的pAUR123重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，水浴一段时间，转化后的细胞稀释涂布于缺乏尿嘧啶的固体培养基表面，采用稀释涂布平板法接种培养，将培养皿倒置，置于30℃恒温箱培养48小时，再挑选单菌落进行鉴定。 （4）A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确； B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误； C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确； D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。 故选：B。 （5）由图4可以看出，系统1在黑暗中荧光强度极低，光照后荧光强度升高但显著低于对照组，可知系统1实现了光调控基因表达，但表达量较低。 （6）实验中发现黑暗条件下系统2的GFP基因有明显表达，为解决此问题，对系统2增加如图4所示组分，i、ii、iii依次为持续表达型启动子、G80基因（G80蛋白可结合并抑制GAL4）、PSD基因（含有PSD的融合蛋白在光下降解）或持续表达型启动子、PSD基因（含有PSD的融合蛋白在光下降解）、G80基因（G80蛋白可结合并抑制GAL4），D正确，ABC错误。 故选：D。 （7）在“先黑暗一后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，可能的原因是发酵早期处于黑暗中，酵母菌不合成乳酸，物质和能量主要用于菌体生长繁殖，当菌体达到一定数量后，照光启动乳酸合成，因此乳酸总产量高。全程光照时，持续合成乳酸，消耗物质和能量较多，影响酵母菌生长繁殖，乳酸总产量低。 1. 利用 PCR 扩增目的基因时，循环 4 次后，只含目的基因片段的 DNA 分子数为（） A．8 B．16 C．6 D．12 答案：A 【解析】PCR 扩增遵循 DNA 半保留复制规律，循环 n 次后，总 DNA 分子数为2n。其中，仅含目的基因的片段数计算公式为：2n−2n（原始模板链 2 条，每次循环新增 2 条含非目的序列的长链）。当n=4时，代入公式得：24−2×4=16−8=8，因此只含目的基因的 DNA 分子数为 8。 2. 构建重组质粒时，选用两种不同限制酶切割目的基因和载体的主要目的是（） A． 提高酶切效率 B．防止载体自身环化和目的基因反向连接 C．使切割位点更精准 D．避免破坏目的基因的编码序列 答案：B 【解析】A 错误：双酶切不会提高酶切效率，反而需要更长的酶切时间。 B 正确：两种不同限制酶会产生不同的黏性末端，载体两端无法互补连接，从而防止自身环化；同时目的基因只能以唯一方向与载体连接，避免反向连接，实现定向克隆。 C 错误：限制酶的切割精准度由其识别序列决定，与酶的数量无关。 D 错误：双酶切的选择需以不破坏目的基因为前提，但这不是双酶切的主要目的。 3.下列关于 PCR 技术与体内 DNA 复制的比较，正确的是（） A． 两者都需要解旋酶破坏氢键 B． 两者所用引物均为 RNA 引物 C．PCR 延伸阶段由 Taq 酶催化，不需要 ATP 供能 D．体内 DNA 复制与 PCR 均在细胞核内完成 答案：C 【解析】A 错误：PCR 通过高温（90~95℃）使 DNA 双链氢键断裂，无需解旋酶；体内 DNA 复制需要解旋酶。 B 错误：PCR 使用人工合成的单链 DNA 引物，体内 DNA 复制使用 RNA 引物。 C 正确：PCR 延伸阶段由热稳定的 TaqDNA 聚合酶催化，能量由脱氧核苷三磷酸（dNTP）水解提供，不需要额外添加 ATP。 D 错误：体内 DNA 复制主要在细胞核（线粒体、叶绿体也可）进行，PCR 在体外的反应体系（试管）中完成。 4.已知某质粒的标记基因上有 BamHⅠ 酶切位点，启动子旁有 EcoRⅠ 和 HindⅢ 位点。若要保证标记基因完整且能正确表达目的基因，应选择的酶切组合是（） A．仅用 BamHⅠ B．EcoRⅠ＋BamHⅠ C．EcoRⅠ＋HindⅢ D．仅用 EcoRⅠ 答案：C 【解析】A、B 错误：BamHⅠ 的酶切位点位于标记基因内，使用该酶会破坏标记基因，导致后续无法通过抗性筛选获得含重组质粒的受体细胞。 C 正确：EcoRⅠ 和 HindⅢ 的酶切位点均位于启动子旁，不破坏标记基因；双酶切可产生不同黏性末端，有效防止载体自身环化和目的基因反向连接，保证目的基因正确插入启动子下游，实现表达。 D 错误：仅用 EcoRⅠ 单酶切，载体两端黏性末端相同，易发生自身环化，且目的基因可能反向连接，无法保证正确表达。 5.角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶类，在饲料工业中具有较大的应用前景，但天然菌株产酶量低。为了获得高效表达的KerA工程菌，研究者分别构建了大肠杆菌和毕赤酵母工程菌，并实现了异源表达。下图1为含KerA基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoR1、BamH1、Sall、Xhol均为限制酶，Kanr、Tcr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。请回答下列相关问题： (1)为了获取KerA基因，从天然菌株中提取相应的DNA片段，再通过PCR技术大量扩增，PCR技术的原理是_____。 (2)在构建基因表达载体的过程中，应该选用图1中的_____限制酶切割外源DNA和质粒DNA。 (3)将目的基因导入大肠杆菌时，常出现三种情况：未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。下图是KerA大肠杆菌工程菌的筛选示意图，结合图1所获得的重组质粒分析，下图2中的_____（选用“A／B／C／D／E”字母作答）菌落为含有目的基因的“工程菌”。 (4)KerA基因在大肠杆菌和毕赤酵母工程菌是否实现异源表达，需要用_____技术检测，但经研究发现，只有毕赤酵母工程菌表达合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是_____。 (5)KerA在60℃以上时热稳定性差，限制了该酶的应用范围，研究人员在KerA的末端插入半胱氨酸，这不仅对酶活性影响小，且大大提高了其热稳定性。其运用到的这种现代生物技术为_____。 【答案】(1)DNA（双链）半保留复制 (2)BamHⅠ和 XhoⅠ (3)B、 D (4) 抗原-抗体杂交 毕赤酵母是具有内质网、高尔基体的真核生物，而大肠杆菌则没有，前者能将翻译出来的KerA肽链加工成具有活性（或空间结构）的蛋白质。 (5)蛋白质工程 【知识点】真核细胞与原核细胞、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）PCR是一项体外扩增DNA的技术，其原理是DNA的半保留复制。 （2）为避免自身环化和反向连接，在构建基因表达载体时，最好选择两种酶，据图可知，SalI或破坏目的基因，故不能选择，目的基因右侧只能选择XhoI，由于XhoI破坏了标记基因Tcr，则左侧的标记基因Kanr应保持完整，则左侧选择的限制酶应是BamHI（EcoRI会破坏左侧的标记基因），故应该选用图1中的XhoI和BamHI限制酶切割外源DNA和质粒DNA。 （3）据图可知，图示2号培养基中只有C不能生长，而3号培养基中B、C、D都不能生长，由于重组质粒和质粒上都含有完整的卡那霉素抗性基因，因此导入重组质粒和质粒的细胞都能在含有卡那霉素的培养基上生长，而重组质粒上四环素抗性基因被破坏，因此含有重组质粒的细胞在四环素的培养基上不能生长，而含有质粒的细胞可以生长，B和D菌落能在含卡那霉素的培养基上生长，不能在含四环素的培养基上生长，可说明是导入了重组质粒的细胞，故2中的B、D菌落为含有目的基因的“工程菌”。 （4）KerA基因在大肠杆菌和毕赤酵母工程菌是否能实现异源表达，需要用抗原-抗体杂交技术检测；酵母菌是真核生物，大肠杆菌是原核生物，只有毕赤酵母工程菌表达合成的KerA可直接投入使用，原因是毕赤酵母是具有内质网、高尔基体，能将翻译出来的KerA肽链进行加工成具有活性的蛋白质。 （5）由题干信息“研究人员在KerA的末端插入半胱氨酸，这不仅对酶活性影响小，且大大提高了其热稳定性”可知，其运用了蛋白质工程技术。 6.水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶_________切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′_________3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含_________的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是_________。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用______。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的_______，待发育成熟后，往水体中添加________进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。 （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。 （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 （4）目的基因的检测和表达。 【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 7.抗除草剂转基因作物可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。 注：内含子是真核生物基因的非编码序列，可被转录，在mRNA加工中被剪切掉，内含子被剪切后，报告基因GUS才能正常表达。 （1）构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过限制酶与　 　 酶与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列　 　 （“能”或“不能”）出现在目的基因内部，否则会导致目的基因被破坏。若目的基因两端缺少所需的限制酶识别序列，可通过PCR技术在引物的　 　 （“3’端”或“5’端”）添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。 （2）为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆In﹣Fusion技术（图2），其中In﹣Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。 ①关于图2所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有　 　 （可多选）。 A．免去传统方法双酶切的繁杂操作 B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确 C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性 ②科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In﹣Fusion反应。如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中片段　 　 。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过　 　 处理的农杆菌中。 ③为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物　 　 扩增目的基因并电泳检测。 （3）农杆菌转化愈伤组织时，用含　 　 的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基因GUS在　 　 细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，假阳性的农杆菌　 　 （出现/不出现）蓝色。 【答案】（1）DNA连接；不能；5'端 （2）ABC；a、d或d、a；Ca2+；引物1和4 （3）除草剂；真核；不出现 【解析】（1）在构建基因表达载体时，需用限制酶将载体切开，以便目的基因的插入，需要DNA连接酶将目的基因与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列不能出现在目的基因内部，要保持目的基因的完整性，否则目的基因会被破坏。若目的基因两侧缺少相应的限制酶识别序列，可通过PCR技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，由于DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，故一般在引物的5’端添加相应限制酶识别序列。 （2）①根据题意，无缝克隆In﹣Fusion技术中In﹣Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，无需限制酶切割，类似同源重组，该方法能免去传统方法双酶切的繁杂操作、能保证目的片段插入载体时方向正确、如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性，ABC正确。 故选：ABC。 ②结合图3分析，引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么进行In﹣Fusion反应时，A基因的右侧序列、GUS基因的左侧序列会连接在一起。还需要将A基因、GUS基因连接到载体上，根据质粒两条核苷酸链的方向（5'→3）判断，引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段a、d，才能确保A基因的左侧序列、GUS基因的右侧序列分别与质粒连接（或反向连接，引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段d、a）。经钙离子处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 ③为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以检测A基因与GUS基因，因而可以选取引物1、4扩增目的基因并电泳检测。 （3）农杆菌转化愈伤组织时，需要用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织，能在该培养基上正常生长的愈伤组织为具有对除草剂的抗性。由于成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因，也有GUS基因，而报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K分别处理上述的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的转化愈伤组织，不出现蓝色的是假阳性的农杆菌，这里依据的原理是GUS基因在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达。 8.广东顺德桑蚕养殖历史悠久，蚕丝主要由丝素重链（FibH）等蚕丝蛋白聚合而成，韧性不足。蜘蛛丝被称为“生物钢”，由蛛丝蛋白（MiSp）聚合而成，有着超强韧性。科研人员利用人工改造后的piggyBac质粒（如图）作为载体，构建能表达MiSp的转基因家蚕，以期改良蚕丝的品质。 （1）经改造的蛛丝可作为手术缝合线，术后无需拆线，推测其原因是　 　 。 （2）下表为构建转基因家蚕的过程，请完成表格内容。 基本步骤 操作要点 第一步：获取目的基因 运用PCR技术扩增MiSp基因时需要的条件有：　 　 （至少写出两点） 第二步：构建重组质粒 为保证MiSp基因能与质粒正确连接并准确表达，MiSp基因必须插入到piggyBac质粒的启动子和终止子之间，进行基因扩增时，需选择的引物是　 ，且在其5′端分别加上　 　 限制酶的识别序列。 第三步：将目的基因导入受体细胞 利用　 　 方法将重组质粒导入家蚕的受精卵细胞。 第四步：目的基因的检测和鉴定 若观察到家蚕　 　 ，则说明目的基因导入受体细胞。可采用⑥　 　 技术，检测家蚕是否能产生蛛丝蛋白。 （3）研究者提出可应用现代发酵工程技术生产蛛丝蛋白的思路：筛选出高产蛛丝蛋白的菌种经　 　 ，再接种到　 　 中大规模生产。 【答案】（1）蛛丝蛋白（MiSp）可以被人体组织逐渐降解并吸收 （2）模板DNA（MiSp基因）、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP 2和3 SalⅠ和BamHⅠ 显微注射法 红色荧光 抗原﹣抗体杂交技术 （3）扩大培养 发酵罐 【解析】（1）由于蛛丝蛋白（MiSp）可以被人体组织逐渐降解并吸收，因此经改造的蛛丝可作为手术缝合线，术后无需拆线。 （2）运用PCR技术扩增MiSp基因时需要的条件：模板DNA（MiSp基因）、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP等。目的基因的转录方向需要与载体的转录方向一致，含磷酸基团的一端为5'，PCR扩增时从模板的3'开始，因此选择引物2和3。为了保证目的基因成功表达，目的基因必须插入在载体启动子和终止子之间，而MhoⅠ在载体上有两个，切割时会破坏载体的完整性，同时也不能选择NheⅠ，原因是选择NheI和另一种限制酶切割，会导致红色荧光蛋白基因丧失，无法在后续选择过程中发挥作用，因此只能选择SalⅠ和BamHⅠ，即在引物5’端分别加上SalⅠ和BamHⅠ限制酶的识别序列。将目的基因导入动物细胞的方法一般为显微注射法。由于重组质粒上含有红色荧光蛋白基因，因此若观察到家蚕发出红色荧光，则说明目的基因导入受体细胞。可采用抗原﹣抗体杂交技术检测家蚕是否能产生蛛丝蛋白。 （3）发酵工程的中心环节是发酵罐中的发酵，筛选出高产蛛丝蛋白的菌种先经扩大培养后，再接种到灭菌的发酵罐中大规模生产。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $