专题9 争分点突破2 基因工程-【步步高·大二轮专题复习】2025年高考生物复习讲义课件(冀赣) (课件PPT+word教案)

　基因工程 1．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) (3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 2．基因表达载体的构建过程(如图) 3．Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 4．CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 5．In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 易错辨析 判断下列关于基因表达载体构建的叙述 (1)基因表达载体上的启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，而终止子是使翻译过程在需要的地方停下来(　×　) 提示：基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录；终止子使转录过程在所需要的地方停下来。 (2)基因表达载体具有多个限制酶切点，有助于目的基因的表达，而复制原点的作用是保证标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存(　×　) 提示：载体具有多个限制酶切点，以便构建基因表达载体；复制原点可以保证重组DNA分子在受体细胞中能自我复制。 (3)在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟(　√　) (4)利用蛋白质工程技术在腈水合酶(N0)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现(　√　) (5)“DNA粗提取与鉴定”实验中，在DNA溶液中加入二苯胺试剂后即呈现蓝色(　×　) 提示：将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热五分钟，待冷却后，溶液呈现蓝色。 (6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀(　×　) 提示：“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速细胞碎片的沉淀。 (7)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(　×　) 提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。 1．(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。 答案　避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶 2．(2024·重庆，19节选)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ。原因是___________________________________________________________________________。 (2)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有______________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。 (3)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是__________________________________________________________________。 答案　(1)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向连接　(2)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR　(3)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 解析　(1)分析题图可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，所以构建重组表达载体时，不能使用限制酶EcoR Ⅰ，否则会破坏目的基因；限制酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若使用这两种限制酶切割，在构建基因表达载体时，目的基因和质粒容易出现自我环化，且无法保证目的基因片段与载体片段能够正向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(2)本实验的目的为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，采用DNA电泳法进行鉴定时，若“启动子D＋基因S”连接在表达载体上，则用限制酶对重组表达载体酶切后的产物包括“启动子D＋基因S”片段和酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。检测重组表达载体是否成功转入农杆菌，即农杆菌是否存在目的基因，可采用PCR技术检测。(3)再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，由于基因S在大豆品种DN中的表达量高于品种TL，且两品种中基因S序列无差异，所以大豆品种DN较TL种子大的原因可能是品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 3．(2024·安徽，20节选)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。使用BamH Ⅰ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是__________________________________________。 答案　在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落是由导入目的基因的菌株形成的 解析　据图可知，使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是目的菌株。 4．(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题： (1)限制酶切割的化学键是__________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是____________ ____________________________________________________________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________________________________。 答案　(1)磷酸二酯键　不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达　(2)C－G、A－T、U－A 5．(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 (1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中______________的诱导作用最强。 (2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________。 答案　(1)Hind Ⅲ、BamH Ⅰ　交链格孢　(2)利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL 解析　(1)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。(2)欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。 6．(2024·河北，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________________________________________启动子。Nos为终止子，其作用为____________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶___________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测______________________________，通过________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为__________。选择纯合子进行后续研究的原因是___________ _______________________________________________________________________________。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的__________免疫和__________免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是__________________________________ _________________________________________________________________(答出两点即可)。 答案　(1)水稻胚乳细胞中特异表达的基因的　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ (2)农杆菌转化　r2HN是否转录出了mRNA　抗原—抗体杂交 (3)1/4　纯合子自交后代不发生性状分离 (4)体液　细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 解析　(1)根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)水稻是单子叶植物，可用农杆菌转化法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN基因表达情况，可用PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA，若要检测r2HN基因是否翻译出r2HN蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。(3)选择单一位点插入目的基因的植株(用RO表示)进行自交一代，根据分离定律，r2HN纯合体植株(RR)占1/4，无r2HN基因的纯合子植株(OO)占1/4，杂合子植株(RO)占1/2。由于纯合子植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合子植株进行后续研究。(4)通过体液免疫，机体可产生较多相应抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。据题图可知，实验组的抗体和CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平明显高于对照组，因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 1．研究人员将靛蓝色素酶基因(IDG)与启动子PTL12(棉纤维细胞特异启动子)相连以构建基因表达载体(如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamH Ⅰ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点)，并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是____________________________________ _______________________________________________________________________________。 过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是_________________________________________ _____________________________________________________________________________。 答案　PTL12是棉纤维细胞特异启动子，将IDG与特异启动子PTL12结合可以使IDG基因在棉纤维细胞中特异表达　形成相同的黏性末端，使PTL12片段能与IDG按设计方向正确连接，保证IDG的正确表达 2．人乳铁蛋白(hLTF)是一种铁结合的糖蛋白，具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因技术培育能生产hLTF的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF。回答下列问题： (1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达，主要原因是____________________________________________。 (2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA质粒中的部分序列，再拼接hLTF基因，最终形成pW2－hLTF重组质粒，过程如图所示： 注：NruⅠ、MluⅠ和NotⅠ是三种限制酶，图中表示相应限制酶的切割位点。pA、pW1、pW2和pW2－hLTF表示不同阶段的质粒。 通过PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子、终止子和hLTF基因时，均需引入限制酶的识别序列和切割位点，以便剪接到质粒的指定位置。据图分析，PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应分别包含__________、__________(限制酶)的识别序列，将修饰后的hLTF基因插入重组质粒的启动子和终止子之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是_________________________________________________________________。 答案　(1)真核生物和原核生物的RNA聚合酶所识别和结合的启动子有所不同　(2)NruⅠ　MluⅠ　hLTF基因两端被同一种限制酶切割成相同的末端，可能会使hLTF基因反向连接到质粒上 解析　(1)启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够启动转录过程，由于真核生物和原核生物的基因结构不同，RNA聚合酶所识别和结合的启动子有所不同，因此从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达。(2)由图分析可知，在pW2－hLTF这个质粒中，启动子两侧的限制酶的识别序列和切割位点分别是NruⅠ和MluⅠ，因此PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应分别包含NruⅠ和MluⅠ的识别序列。由图可知，hLTF基因两侧的限制酶识别序列和切割位点都是MluⅠ，相同酶切位点的序列一样，切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上，因此不一定能获得所需要的基因表达载体。 3．随着土壤盐渍化(主要是Na＋引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K＋可维持细胞内K＋/Na＋稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K＋转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP－B和YFP－H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP－B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300－CFP。相关信息如图所示。请回答下列问题： (1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是________________________________________ ____________________________________________________________________________。 (2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是__________________________________________________。 第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________ _______________________________________________________________________________。 用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。 答案　(1)BamH Ⅰ和Pst Ⅰ　BsrG Ⅰ在CFP基因中存在，不能使用；双酶切可避免目的基因和载体自身环化和反向连接　(2)使得CFP与B基因之间的碱基个数为3的倍数，翻译时B基因不发生移码　第一条引物与模板链配对，序列与图示B基因序列相同，第二条引物与非模板链配对，序列应与图示B基因序列互补 4．(2024·南昌高三模拟)酿酒酵母细胞质钙离子浓度的调控与酿酒酵母的抗逆性、生长增殖过程有关。Cchlp是一种位于酿酒酵母细胞膜的钙离子通道蛋白，调控细胞外钙离子流入细胞质。研究小组利用基因工程获取Cchlp抗原，制备Cchlp单克隆抗体来检测酿酒酵母Cchlp的表达情况。其中制备Cchlp抗原的流程如图1所示。请回答以下问题： (1)过程①需要________酶进行催化，并添加__________作为原料，从而获得多种cDNA单链。 (2)Cchlp含2 039个氨基酸，其中抗原区域约含300个氨基酸。现根据抗原区域氨基酸序列，查找对应基因序列，设计如下引物进行PCR(引物F为基因上游引物，引物R为基因下游引物)。 引物F：5′－AGGACG……CCATT－3′ 引物R：5′－GATTCC……GGGTT－3′ 为使PCR获得的Cchlp抗原基因能与PET－28a质粒正确连接，应在引物中加入合适的限制酶识别序列。加入限制酶序列后引物F序列为5′－GACACCATATGAGGACG……CCATT－3′(下划线部分为限制酶识别序列)，引物R序列应为__________。 A．5′－AGGACG……CCATTCATATGGACAC－3′ B．5′－GACACCTCGAGGATTCC……GGGTT－3′ C．5′－GATTCC……GGGTTCTCGAGGAGAC－3′ D．5′－GACACCCCGGGGATTCC……GGGTT－3′ (3)将PCR产物和标准参照物分别加入泳道1、泳道2进行电泳。加样孔位于__________(填“甲”或“乙”)端。泳道1条带中的PCR产物__________(填“一定”“可能”或“不”)是目的基因，理由是______________________________________________________________。 (4)应在含__________的固体培养基中培养重组大肠杆菌，经鉴定获得含目的基因的大肠杆菌，分离提纯得到Cchlp抗原。 答案　(1)逆转录　脱氧核苷酸(或dNTP)　(2)B　(3)甲　可能　Cchlp抗原区域约300个氨基酸，可知其对应的基因片段长度约900个碱基对。图2结果显示泳道1的PCR产物长度约900个碱基对，与预期相符。但是PCR结果不能说明产物的碱基序列与Cchlp抗原基因一致，还需进一步测序才能确定　(4)卡那霉素 解析　(1)据图分析可知，图中过程①表示逆转录，该过程需要逆转录酶进行催化；由于逆转录形成的产物为DNA，所以需要添加四种脱氧核苷酸(或dNTP)作为原料。(2)为使PCR获得的Cchlp抗原基因能与PET－28a质粒正确连接，防止自身环化和反向连接，需要使用两种不同的限制酶进行切割质粒和Cchlp抗原基因，结合图1分析，选择的限制酶为NdeⅠ和XhoⅠ，所以在PCR扩增Cchlp抗原基因时在引物上需要添加相应的序列，结合上游加入限制酶序列后引物F序列为5′－GACACCATATGAGGACG……CCATT－3′可知，上游5′端可以被限制酶NdeⅠ识别切割，下游引物的5′端在原有引物序列的基础上需要添加限制酶XhoⅠ的识别序列，再结合图1和选项，B符合条件，所以引物R序列应为5′－GACACCTCGAGGATTCC……GGGTT－3′。(3)根据电泳的原理分析，电泳条带的远近与分子质量大小有关，分子量越大，运动的速度越慢，距离加样孔越近，所以加样孔位于甲端。根据第(2)问可知，Cchlp抗原区域约300个氨基酸，所以其对应的基因片段长度约900个碱基对，图2结果显示泳道1的PCR产物长度约900个碱基对，与预期相符，所以可能是目的基因，但是PCR结果不能说明产物的碱基序列与Cchlp抗原基因一致，还需进一步测序才能确定。(4)根据图1可知，PET－28a质粒上含有卡那霉素抗性基因，可以作为标记基因，所以应在含卡那霉素的固体培养基中培养重组大肠杆菌，经鉴定获得含目的基因的大肠杆菌，分离提纯得到Cchlp抗原。 5．PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生______个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________________________________________。 (2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是_________________________________________。 (3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。 ①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列________________和________________，保证DNA片段定向插入。 ②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是________。 答案　(1)2　定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合　(2)既能专一性切除多余的PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠　(3)①5′－GTCGAC－3′　5′－GGATCC－3′　②Cas9基因 解析　(3)为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加Sal Ⅰ的识别序列；由于Xho Ⅰ与Sal Ⅰ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamH Ⅰ的识别序列。 6．(2024·济南高三二模)利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面(穿过细胞膜展示在细胞表面)，诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U－M为信号肽－细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题： (1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加____________，并在________(填“有氧”或“无氧”)的环境条件下培养。 (2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5′端应分别添加____________________序列，以实现融合基因定向插入质粒。 (3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149－2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149－3RBD。泳道1两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为__________bp，泳道2呈现一个条带的原因是_________________________________________________________________________。 (4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149－2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149－3RBD菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明_______________________________________________________________。 答案　(1)维生素　无氧　(2)限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别　(3)2 686　双酶切pNZ8149－3RBD后产生的两个片段大小相近　(4)二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面 解析　(1)在培养乳酸菌时，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，为满足乳酸菌生长的特殊需求，还要在培养基中添加维生素；乳酸菌的代谢类型为异养厌氧型，所以需要在无氧的环境条件下培养。(2)构建基因表达载体时，启动子位于目的基因上游，终止子位于目的基因下游，由于质粒上启动子和终止子之间存在限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别序列，为了使质粒和目的基因产生相同的末端，并准确插入，应选择两种限制酶切割质粒，所以用PCR技术扩增目的基因所用两种引物的5′端应分别添加限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别序列。(3)由图可知，pNZ8149－2RBD和pNZ8149－3RBD的碱基长度分别为4 527 bp和5 193 bp，所以RBD长度为5 193－4 527＝666(bp)，泳道1为双酶切pNZ8149－2RBD，两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，泳道2为双酶切pNZ8149－3RBD，只呈现一条带大小为2 507 bp，即2RBD的长度为2 020 bp，所以融合基因3RBD的长度为666＋2 020＝2 686(bp)；泳道2呈现一个条带的原因是双酶切pNZ8149－3RBD后产生的两个片段大小相近。(4)由题意可知，乳酸菌表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面(穿过细胞膜展示在细胞表面)，实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149－2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149－3RBD菌株表面三聚体蛋白多，由于抗原蛋白需穿过细胞膜展示在细胞表面，因此该现象说明二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面。 专题强化练 1～2题每题5分，3～10题每题6分，共58分 1．(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　) A．图示表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 答案　A 解析　由图示可知，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；由题干可知，E.coli B以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸，因此L-谷氨酸钠为反应底物，而不是起供能作用，B错误；E.coli A和E.coli B均为生产γ-氨基丁酸的菌种，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；根据题干及题图给出的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。 2．(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案　B 解析　限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 3．由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是(　　) A．构建重组载体P时，应选择EcoRⅤ进行酶切，再用T4 DNA连接酶连接 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P不能作为基因表达载体，是因为它不含起始密码子和终止密码子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 答案　A 解析　由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割产生平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端用T4 DNA连接酶，A正确，B错误；由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。 4．(2024·秦皇岛高三二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是(　　) A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶 B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温 C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选 D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功 答案　C 解析　由图可知，构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，若用限制酶BamH Ⅰ，则目的基因会因为产生相同的末端而出现自身环化现象，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温(第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸)和一次降温(使目的基因复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因在目的基因表达载体中存在，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，而后通过含有卡那霉素的培养基进行再次筛选，筛选出含有目的基因的受体细胞，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。 5．普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接)，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，图中Sma Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ和BamH Ⅰ代表相应的酶切位点。用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是(　　) A．正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A B．过程①得到的表达载体均为反义表达载体 C．反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度 D．用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21 kb和87 kb 答案　C 解析　由图可知，反义表达载体中，反义GhMnaA2基因转录方向是B→A，则正义GhMnaA2基因的转录方向是A→B，A错误；由于只能由Sma Ⅰ来构建反义表达载体，因此过程①得到的表达载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段，据此判断左侧Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是59 kb，A位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是3 kb，B位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是18 kb，右上角E6位置处Sma Ⅰ和Not Ⅰ之间的长度是28 kb，故用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D错误。 6．双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了图示表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是(　　) A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入该表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 答案　B 解析　将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 7．研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是(　　) A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶 B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态 C．将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因 D．在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落 答案　C 解析　目的基因两侧含有限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ的识别序列，将目的基因插入质粒中时，需要用到限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起，A正确；将目的基因导入受体细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，B正确；将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，D正确。 8．(多选)(2024·长春高三一模)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In－Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A．推测In－Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键 B．质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化 C．形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基更容易互补配对 D．该技术对目的基因进行PCR，需要经历2次循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因 答案　CD 解析　分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，推测In－Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，并且使目的基因与线性化质粒通过磷酸二酯键连接形成重组质粒，A正确；若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；重组质粒形成时如果温度远高于50 ℃，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C错误；根据DNA半保留复制的特点，可知PCR第3轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，需要经过3轮循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因，D错误。 9．(多选)(2024·保定高三二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，研究者提出了如下思路：剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。借助CRISPR－Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因，如图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列相关叙述正确的是(　　) A．上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因 B．上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与 C．上述基因编辑技术能定点切除目标基因取决于sgRNA D．可以利用显微注射技术将Cas9－sgRNA复合体导入猪的受精卵 答案　ACD 解析　免疫排斥反应主要与标明身份的标签蛋白相关，剔除猪的某些基因以解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，所以上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因，A正确；据分析可知，Cas9－sgRNA复合体中的sgRNA能够识别需剔除的DNA序列，Cas9蛋白再将识别的序列切割，因此该过程不需要细胞内的限制酶参与，且定点切除目标基因取决于sgRNA，B错误，C正确；将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射技术，因此可利用显微注射技术将Cas9－sgRNA复合体导入猪的受精卵，D正确。 10．(多选)(2024·抚州高三检测)幽门螺杆菌(Hp)感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割，通过基因工程制备相应的疫苗、质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述正确的是(　　) A．Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组 B．基因表达载体导入之前，可用Ca2＋处理大肠杆菌 C．培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素 D．能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中 答案　ABD 解析　图中质粒含氯霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，使用限制酶XhoⅠ和Xba Ⅰ切割质粒后会将氯霉素抗性基因切割掉，故含Ipp20基因的重组表达载体中只含潮霉素抗性基因，将表达载体转入大肠杆菌时，大肠杆菌可能有以下情况：一是大肠杆菌中未导入质粒，二是大肠杆菌中导入的是空质粒(Ipp20基因未插入，含氯霉素抗性基因和潮霉素抗性基因)，三是大肠杆菌中导入的是含Ipp20基因的重组质粒(只含潮霉素抗性基因)，由图可知，在培养基A中存活的部分大肠杆菌在培养基B中部分不能存活，故推知，培养基A中添加了潮霉素，导入空质粒和重组质粒的大肠杆菌可以存活，培养基B添加了氯霉素，导入空质粒的大肠杆菌可以存活，导入重组质粒的大肠杆菌不能存活，故菌落3和5上的大肠杆菌含重组质粒，因此能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中，C错误，D正确。 11．(14分)(2024·山东，25节选)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；AmpR氨苄青霉素抗性基因。 甲　载体信息 乙　目标基因L部分序列 丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－________－3′和5′－________－3′。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。 答案　(1)低　256(或44)　GTTT　CAAT(或CAAT　GTTT)　(2)卡那霉素　SacⅠ　④ 解析　(1)单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任意碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′端到3′端。(2)导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间只在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，突变序列存在限制酶SacⅠ酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。 12．(12分)人促红细胞生成素(EPO)是一种可用于治疗肾性贫血的糖蛋白类激素，可用乳腺生物反应器生产EPO。科研人员利用大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列构建了基因表达载体。构建前，科研人员扩增了WAP基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入EPO基因中，以确定WAP基因启动子的具体位置。相关信息如图所示，回答下列问题： (1)为将扩增后的产物定向插入基因表达载体中，以指导EPO基因的表达，需要在引物末端添加特定的限制酶识别序列。由图中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是________，在A末端添加的序列所对应的限制酶是________。 (2)将通过PCR处理后的含不同长度的WAP基因上游序列与EPO基因连接，构建成表达载体的过程中，需要________种限制酶切割上述DNA片段。检测转基因雌性大鼠时发现，导入含P1～P3与A扩增产物的个体乳汁中有EPO，而含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成的原因是_____________________________________ _______________________________________________________________________________。 (3)该实验中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子的理由是_______________________ _______________________________________________________________________________。 (4)科研人员不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞，从基因表达的角度分析，其原因是______________________________________________________________________________。 答案　(1)Cla Ⅰ　Mun Ⅰ　(2)4　P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达　(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达　(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO 解析　(1)需要将WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列与EPO基因相连，则扩增的WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位点，则P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是Cla Ⅰ，WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的3′端需要与EPO基因相连，但是不能破坏EPO基因序列，也不能破坏WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，则A末端添加的序列所对应的限制酶是Mun Ⅰ。(2)需要用两种限制酶切割WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，用两种限制酶切割EPO基因，所以共需要4种限制酶切割上述DNA片段。P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达，则含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。(3)启动子具有组织特异性，大鼠WAP基因启动子能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达，所以在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子。(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内被加工成熟，表达出来的产物不是EPO，所以不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞。 13．(16分)(2024·广东，21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的________________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。 (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为_________________________________，理由是_____________________________________________________________________________。 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为__________________________(答两点)。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是______________________________。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：______________________________________________________________________________。 答案　(1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达　(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株　(4)该处细胞中T7RNAP被激活，酪氨酸酶基因表达并形成黑色素　(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 解析　(1)微生物生长需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水、无机盐，培养不同微生物需要的水是相同的，无机盐基本相似，但是碳源、氮源会存在差异，所以可以优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌。(2)根据图二a分析，蓝光调控的基因表达载体的光控原理是在蓝光的作用下，细胞中无活性的T7RNAP被激活，变成有活性的T7RNAP，该RNA聚合酶会特异性地与图中启动子PT7结合，从而调控目的基因的表达，根据图二b分析可知，基因1编码的是酪氨酸酶，属于图a中的目的基因，应该在蓝光的调控下才表达，基因2和3编码的是T7RNAP的两个部分，其正常表达的产物是无活性的T7RNAP，所以启动子②和③为通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)，在蓝光的作用下，两者表达的无活性的T7RNAP被激活，再启动基因1表达，所以启动子①是特异型启动子PT7，仅被有活性的T7RNAP识别。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因，其表达的产物对大观霉素具有抗性，可以作为表达载体的标记基因，因此，长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其他微生物由于不具有抗性，生长被抑制，此外，丢失质粒的菌株也不具有抗性被淘汰，从而筛选出具有目的基因的菌株。(4)根据第(2)问分析可知，用蓝光照射已长出的BC菌膜，细胞中T7RNAP被激活，会调控酪氨酸酶基因表达合成酪氨酸酶，随后将其转至含有酪氨酸的染色池处理，只有经蓝光照射的区域，酪氨酸酶会催化酪氨酸形成黑色素，被染成黑色。(5)按照上述菌株的构建模式，要生产其他颜色图案的BC膜，可以构建其他颜色的蓝光表达载体，将原来表达产物酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶，或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白。 学科网（北京）股份有限公司 $基因工程 争分点突破 2　 一 核心提炼 1.限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 3 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) 4 (3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 5 2.基因表达载体的构建过程(如图) 6 3.Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个 8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 7 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 8 4.CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。 其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 9 5.In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。 具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 10 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置 进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 11 判断下列关于基因表达载体构建的叙述 (1)基因表达载体上的启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，而终止子是使翻译过程在需要的地方停下来(　　) 提示：基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录；终止子使转录过程在所需要的地方停下来。 × 易错辨析 (2)基因表达载体具有多个限制酶切点，有助于目的基因的表达，而复制原点的作用是保证标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存(　　) 提示：载体具有多个限制酶切点，以便构建基因表达载体；复制原点可以保证重组DNA分子在受体细胞中能自我复制。 × (3)在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟 (　　) (4)利用蛋白质工程技术在腈水合酶(N0)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现(　　) √ √ 易错辨析 (5)“DNA粗提取与鉴定”实验中，在DNA溶液中加入二苯胺试剂后即呈现蓝色(　　) 提示：将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热五分钟，待冷却后，溶液呈现蓝色。 × (6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀(　　) 提示：“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速细胞碎片的沉淀。 × 易错辨析 (7)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(　　) × 提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。 易错辨析 二 真题演练 1.(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________ _____________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是_______________。 避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的 基因和质粒的自身环化 T4 DNA连接酶 2.(2024·重庆，19节选)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是_________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是____________ _____________________________________________________________。 EcoRⅠ 酶切后形成的 片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向连接 分析题图可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，所以构建重组表达载体时，不能使用限制酶EcoRⅠ，否则会破坏目的基因；限制酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若使用这两种限制酶切割，在构建基因表达载体时，目的基因和质粒容易出现自我环化，且无法保证目的基因片段与载体片段能够正向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 (2)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______。 酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段 PCR 本实验的目的为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，采用DNA电泳法进行鉴定时，若“启动子D＋基因S”连接在表达载体上，则用限制酶对重组表达载体酶切后的产物包括“启动子D＋基因S”片段和酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。检测重组表达载体是否成功转入农杆菌，即农杆菌是否存在目的基因，可采用PCR技术检测。 (3)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________________________________________________ _____________。 品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，由于基因S在大豆品种DN中的表达量高于品种TL，且两品种中基因S序列无差异，所以大豆品种DN较TL种子大的原因可能是品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 3.(2024·安徽，20节选)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落是由导入目的基因的菌株形成的 据图可知，使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是目的菌株。 4.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌 株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引 物(P1～P4)的结合位置、片段 甲替换区如图所示，→表示引 物5′→3′方向。回答下列问题： (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_________________________________________ ________________________________。 磷酸二酯键 不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。 C－G、A－T、U－A 5.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 (1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中_________的诱导作用最强。 Hind Ⅲ、BamHⅠ 交链格孢 根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶Hind Ⅲ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。 (2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：_____________________________ ________________________________________。 利用转基因技术将百合B中基因L 的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL 欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。 6.(2024·河北，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________________________ _________启动子。Nos为终止子，其作用为__________。 r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶_________和_________对r2HN 基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 水稻胚乳细胞中特异表达的 基因的 终止转录 HindⅢ EcoRⅠ 根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。 (2)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________________________，通过________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 农杆菌转化 r2HN是否转录出了mRNA 抗原—抗体杂交 水稻是单子叶植物，可用农杆菌转化法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN基因表达情况，可用PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA，若要检测r2HN基因是否翻译出r2HN蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为_____。选择纯合子进行后续研究的原因是______________________________。 1/4 纯合子自交后代不发生性状分离 选择单一位点插入目的基因的植株(用RO表示)进行自交一代，根据分离定律，r2HN纯合体植株(RR)占1/4，无r2HN基因的纯合子植株(OO)占1/4，杂合子植株(RO)占1/2。由于纯合子植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合子植株进行后续研究。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分 析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的_________免疫和_________免疫。 体液 细胞 通过体液免疫，机体可产生较多相应抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。据题图可知，实验组的抗体和CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平明显高于对照组，因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是__________________ ______________________________(答出两点即可)。 不受性别的限制、 可大量种植、成本低、安全性高 三 模拟预测 1.研究人员将靛蓝色素酶基因(IDG)与启动子PTL12(棉纤维细胞特异启动子)相连以构建基因表达载体(如图，KpnⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点)，并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是_________________________________ _____________________________________________________________。 PTL12是棉纤维细胞特异启动子，将 IDG与特异启动子PTL12结合可以使IDG基因在棉纤维细胞中特异表达 过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是_________________ _________________________________________________________________。 形成相同的黏性末 端，使PTL12片段能与IDG按设计方向正确连接，保证IDG的正确表达 2.人乳铁蛋白(hLTF)是一种铁结合的糖蛋白，具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因技术培育能生产hLTF的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF。回答下列问题： (1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达，主要原因是_________ ___________________________________________________。 和原核生物的RNA聚合酶所识别和结合的启动子有所不同 真核生物 启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够启动转录过程，由于真核生物和原核生物的基因结构不同，RNA聚合酶所识别和结合的启动子有所不同，因此从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达。 (2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA质粒中的部分序列，再拼接hLTF基因，最终形成pW2－hLTF重组质粒，过程如图所示： 注：NruⅠ、MluⅠ和NotⅠ是三种限制酶，图中表示相应限制酶的切割位点。pA、pW1、pW2和pW2－hLTF表示不同阶段的质粒。 通过PCR扩增小鼠乳清酸蛋白 基因的启动子、终止子和hLTF 基因时，均需引入限制酶的识 别序列和切割位点，以便剪接 到质粒的指定位置。据图分析， PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因 的启动子所需的两种引物应分别包含______、_______(限制酶)的识别序列，将修饰后的hLTF基因插入重组质粒的启动子和终止子之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是___________________________ ___________________________________________________。 NruⅠ MluⅠ hLTF基因两端被同一种限制酶 切割成相同的末端，可能会使hLTF基因反向连接到质粒上 由图分析可知，在pW2－hLTF 这个质粒中，启动子两侧的限 制酶的识别序列和切割位点分 别是NruⅠ和MluⅠ，因此PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启 动子所需的两种引物应分别包 含NruⅠ和MluⅠ的识别序列。由图可知，hLTF基因两侧的限制酶识别序列和切割位点都是MluⅠ，相同酶切位点的序列一样，切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上，因此不一定能获得所需要的基因表达载体。 3.随着土壤盐渍化(主要是Na＋引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K＋可维持细胞内K＋/Na＋稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K＋转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP－B和YFP－H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP－B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300－CFP。相关信息如图所示。 请回答下列问题： (1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是_____________________________ ______________________________________________________。 BamHⅠ和PstⅠ BsrG Ⅰ在CFP基因中存在，不能使用；双酶切可避免目的基因和载体自身环化和反向连接 (2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是_________________________ __________________________________________。 使得CFP与B基因之间的碱基个数为3的倍数，翻译时B基因不发生移码 第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是___________________________ _________________________________________________________________________________。用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。 第一条引物与模板链配对，序列与图示B基因序列相同，第二条引物与非模板链配对，序列应与图示B基因序列互补 4.(2024·南昌高三模拟)酿酒酵母细胞质钙离子浓度的调控与酿酒酵母的抗逆性、生长增殖过程有关。Cchlp是一种位于酿酒酵母细胞膜的钙离子通道蛋白，调控细胞外钙离子流入细胞质。研究小组利用基因工程获取Cchlp抗原，制备Cchlp单克隆抗体来检测酿酒酵母Cchlp的表达情况。其中制备Cchlp抗原的流程如图1所示。 请回答以下问题： (1)过程①需要________酶进行催化，并添加___________________作为原料，从而获得多种cDNA单链。 逆转录 脱氧核苷酸(或dNTP) 据图分析可知，图中过程①表示逆转录，该过程需要逆转录酶进行催化；由于逆转录形成的产物为DNA，所以需要添加四种脱氧核苷酸(或dNTP)作为原料。 (2)Cchlp含2 039个氨基酸，其中抗原区域约含300个氨基酸。现根据抗原区域氨基酸序列，查找对应基因序列，设计如下引物进行PCR(引物F为基因上游引物，引物R为基因下游引物)。 引物F：5′－AGGACG……CCATT－3′ 引物R：5′－GATTCC……GGGTT－3′ 为使PCR获得的Cchlp抗原基因能与PET－28a质粒正确连接，应在引物中加入合适的限制酶识别序列。加入限制酶序列后引物F序列为5′－GACACCATATGAGGACG…… CCATT－3′(下划线部分为限制酶识别序列)，引物R序列应为_____。 A.5′－AGGACG……CCATTCATATGGACAC－3′ B.5′－GACACCTCGAGGATTCC……GGGTT－3′ C.5′－GATTCC……GGGTTCTCGAGGAGAC－3′ D.5′－GACACCCCGGGGATTCC……GGGTT－3′ B 为使PCR获得的Cchlp抗原基因能与PET－28a质粒正确连接，防止自身环化和反向连接，需要使用两种不同的限制酶进行切割质粒和Cchlp抗原基因，结合图1分析，选择的限制酶为NdeⅠ和XhoⅠ，所以在PCR扩增Cchlp抗原基因时在引物上需要添加相应的序列， 结合上游加入限制酶序列后引物F序列为5′－GACACCATATGAGGACG…… CCATT－3′可知，上游5′端可以被限制酶NdeⅠ识别切割，下游引物的5′端在原有引物序列的基础上需要添加限制酶XhoⅠ的识别序列，再结合图1和选项，B符合条件，所以引物R序列应为5′－GACACCTCGAGGATTCC……GGGTT－3′。 (3)将PCR产物和标准参照物分别加入泳道1、泳道2进行电泳。加样孔位于_____(填“甲”或“乙”)端。泳道1条带中的PCR产物______(填“一定”“可能”或“不”)是目的基因，理由是______________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 甲 可能 Cchlp抗原区域约300个氨基酸，可知其对应的基因片段长度约900个碱基对。图2结果显示泳道1的PCR产物长度约900个碱基对，与预期相符。但是PCR结果不能说明产物的碱基序列与Cchlp抗原基因一致，还需进一步测序才能确定　 根据电泳的原理分析，电泳条带的远近与分子质量大小有关，分子量越大，运动的速度越慢，距离加样孔越近，所以加样孔位于甲端。根据第(2)问可知，Cchlp抗原区域约300个氨基酸，所以其对应的基因片段长度约900个碱基对，图2结果显示泳道1的PCR产物长度约900个碱基对，与预期相符，所以可能是目的基因，但是PCR结果不能说明产物的碱基序列与Cchlp抗原基因一致，还需进一步测序才能确定。 (4)应在含__________的固体培养基中培养重组大肠杆菌，经鉴定获得含目的基因的大肠杆菌，分离提纯得到Cchlp抗原。 卡那霉素 根据图1可知，PET－28a质粒上含有卡那霉素抗性基因，可以作为标记基因，所以应在含卡那霉素的固体培养基中培养重组大肠杆菌，经鉴定获得含目的基因的大肠杆菌，分离提纯得到Cchlp抗原。 5.PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生____个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________ _______________________。 2 定向引导 Cas9蛋白与靶向基因结合 (2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是____________________ __________________________________ ___________________________________________。 既能专一性切除多余的 PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠 (3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/ Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。 ①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列__________________和__________________，保证DNA片段定向插入。 ②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是_________。 5′－GTCGAC－3′ 5′－GGATCC－3′ Cas9基因 为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加SalⅠ的识别序列；由于XhoⅠ与SalⅠ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamHⅠ的识别序列。 6.(2024·济南高三二模)利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面(穿过细胞膜展示在细胞表面)，诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建 流程如图1所示，NcoⅠ和SacⅠ 是pNZ8149质粒上的限制酶识别 位点，U－M为信号肽－细胞壁 锚定蛋白序列。回答下列问题： (1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加______，并在______(填“有氧”或“无氧”)的环境条件下培养。 维生素 无氧 在培养乳酸菌时，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，为满足乳酸菌生长的特殊需求，还要在培养基中添加维生素；乳酸菌的代谢类型为异养厌氧型，所以需要在无氧的环境条件下培养。 (2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5′端应分别添加_______ ___________________序列，以实现融合基因定向插入质粒。 限制酶 NcoⅠ和SacⅠ的识别 构建基因表达载体时，启动子位 于目的基因上游，终止子位于目 的基因下游，由于质粒上启动子 和终止子之间存在限制酶NcoⅠ 和SacⅠ的识别序列，为了使质粒 和目的基因产生相同的末端，并 准确插入，应选择两种限制酶切割质粒，所以用PCR技术扩增目的基因所用两种引物的5′端应分别添加限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别序列。 (3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149－2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149－3RBD。泳道1两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为_______bp，泳道2呈现一个条带的原因是____________________________________ ____________。 2 686 双酶切pNZ8149－3RBD后产生的两个片 段大小相近 由图可知，pNZ8149－2RBD和pNZ8149－3RBD的碱基长度分别为4 527 bp和5 193 bp，所以RBD长度为5 193－4 527＝666(bp)，泳道1为双酶切pNZ8149－2RBD，两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp，泳道2为双酶切pNZ8149－3RBD，只呈现一条带大小为2 507 bp，即2RBD的长度为2 020 bp，所以融 合基因3RBD的长度为666＋2 020＝2 686(bp)；泳道2呈现一个条带的原因是双酶切pNZ8149－3RBD后产生的两个片段大小相近。 (4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149－2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149－3RBD菌株表面三聚体蛋白多， 该现象说明____________________________________________________ _______。 二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细 胞表面 由题意可知，乳酸菌表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面(穿过细胞膜展示在细胞表面)，实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下， pNZ8149－2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149－3RBD菌株表面三聚体蛋白多，由于抗原蛋白需穿过细胞膜展示在细胞表面，因此该现象说明二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面。 四 专题强化练 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 对一对 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A B A C C B C CD ACD ABD 题号 11 答案 (1)低　256(或44)　GTTT　CAAT(或CAAT　GTTT)　(2)卡那霉素　SacⅠ　④ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对一对 题号 12 答案 (1)ClaⅠ　MunⅠ　(2)4　P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达　(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达　(4)EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO 题号 13 答案 (1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达　(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株　(4)该处细胞中T7RNAP被激活，酪氨酸酶基因表达并形成黑色素　(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 答案 1.(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 A.图示表明，可以从酿酒酵母S中分离 得到目的基因gadB B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷 氨酸钠的作用是供能 C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸 D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 由图示可知，可以从酿酒酵母S中分 离得到目的基因gadB，A正确； 由题干可知，E.coli B以L-谷氨酸钠 为底物高效生产γ-氨基丁酸，因此 L-谷氨酸钠为反应底物，而不是起 供能作用，B错误； E.coli A和E.coli B均为生产γ-氨基丁酸的菌种，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误； 根据题干及题图给出的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 2.(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； 在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B错误； 质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确； 质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 3.由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是 A.构建重组载体P时，应选择EcoRⅤ进 行酶切，再用T4 DNA连接酶连接 B.为了便于该目的基因接入载体E，可 用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C.载体P不能作为基因表达载体，是因 为它不含起始密码子和终止密码子 D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性 状，表明重组载体成功导入受体细胞 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割产生平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽 然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端用T4 DNA连接酶，A正确，B错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误； 受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 4.(2024·秦皇岛高三二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 下列相关叙述正确的是 A.为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶 B.PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温 C.表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选 D.由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 由图可知，构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，若用限制酶BamHⅠ，则目的基因会因为产生相同的末端而出现自身环化现象，A错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温(第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸)和一次降温(使目的基因复性)，B错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因在目的基因表达载体中存在，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，而后通过含有卡那霉素的培养基进行再次筛选，筛选出含有目的基因的受体细胞，C正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 5.普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接)，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，图中SmaⅠ、NotⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ代表相应的酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是 A.正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A B.过程①得到的表达载体均为反义表达载体 C.反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2 基因的翻译来保证棉纤维长度 D.用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段 的长度为21 kb和87 kb √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 由图可知，反义表达载体中，反义GhMnaA2基因转录方向是B→A，则正义GhMnaA2基因的转录方向是A→B，A错误； 由于只能由SmaⅠ来构建反义表达载体，因此过程①得到的表达 载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 用SmaⅠ和NotⅠ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段，据此判断左侧SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是59 kb，A位置处SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是3 kb，B位 置处SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是18 kb，右上角E6位置处SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是28 kb，故用Not Ⅰ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 6.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了图示表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是 A.可用农杆菌转化法将构 建好的表达载体导入植 物细胞 B.为连入GUS基因，需用 SalⅠ和SphⅠ酶切已整 合了双向启动子及LUC 基因的质粒 C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入该表达载体的微生物受体细胞 D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 将基因表达载体导入植物细胞常用 的方法是农杆菌转化法，A正确； 如果用SphⅠ酶切已整合了双向启 动子及LUC基因的质粒时就会破坏 LUC基因，B错误； 如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； 双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 7.研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是 A.将目的基因插入质粒中时，需要用到的 酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶 B.需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一 种能吸收周围环境中DNA分子的状态 C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌 后，大肠杆菌可正常表达该目的基因 D.在含X-gal的培养基上培养导入了重组质 粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 目的基因两侧含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的识别序列，将目的基因插入质粒中时，需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起，A正确； 将目的基因导入受体细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，B正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误； 在含X-gal的培养基上培养导入了 重组质粒的大肠杆菌，β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 8.(多选)(2024·长春高三一模)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In－Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端， 最终形成的重组质粒会在受体细 胞内形成完整的重组序列，主要 操作过程如图所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 下列叙述错误的是 A.推测In－Fusion酶的作用是识别 同源序列、形成黏性末端、连接 磷酸二酯键 B.质粒A端和B端的序列不同，可 防止目的基因与质粒反向连接及自身环化 C.形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基更容易互补 配对 D.该技术对目的基因进行PCR，需要经历2次循环才能得到两端含引物1 和引物2的目的基因 √ √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In－Fusion酶处理，使同源序列形 成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，推测In－Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，并且使目的基因与线性化质粒通过磷酸二酯键连接形成重组质粒，A正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，质粒A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确； 重组质粒形成时如果温度远高于 50 ℃，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C错误； 根据DNA半保留复制的特点，可知PCR第3轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，需要经过3轮循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因，D错误。 9.(多选)(2024·保定高三二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，研究者提出了如下思路：剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。借助CRISPR－Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因，如图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列相关叙述正确的是 A.上述需要剔除的基因可能是标明猪细 胞身份的标签蛋白基因 B.上述基因编辑过程还需细胞内的限制 酶及DNA连接酶参与 C.上述基因编辑技术能定点切除目标基 因取决于sgRNA D.可以利用显微注射技术将Cas9－sgRNA复合体导入猪的受精卵 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 √ √ 免疫排斥反应主要与标明身份的标签蛋白相关，剔除猪的某些基因以解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，所以上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因，A正确； 据分析可知，Cas9－sgRNA复合体中的sgRNA能够识别需剔除的DNA序列，Cas9蛋白再将识别的序列切割，因此该过程不需要细胞内的限制酶参与，且定点切除目标基因取决于sgRNA，B错误，C正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射技术，因此可利用显微注射技术将Cas9－sgRNA复合体导入猪的受精卵，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 10.(多选)(2024·抚州高三检测)幽门螺杆菌(Hp)感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割，通过基因工程制备相应的疫苗、质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述正确的是 A.Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于 基因重组 B.基因表达载体导入之前，可用Ca2＋处理 大肠杆菌 C.培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添 加了潮霉素 D.能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 √ √ 图中质粒含氯霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，使用限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割质粒后会将氯霉素抗性基因切割掉，故含Ipp20基因的重组表达载体中只含潮霉素抗性基因，将表达载体转入大肠杆菌时，大肠杆菌可能有以下情况：一是大肠杆菌中未导入质粒，二是大肠杆菌中导入的是 空质粒(Ipp20基因未插入，含氯霉素抗性基因和潮霉素抗性基因)，三是 大肠杆菌中导入的是含Ipp20基因的重组质粒(只含潮霉素抗性基因)， 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 由图可知，在培养基A中存活的部分大肠杆菌在培养基B中部分不能存活，故推知，培养基A中添加了潮霉素，导入空质粒和重组质粒的大肠杆菌可以存活，培养基B添加了氯霉素，导入空质粒的大肠杆菌可以存活，导入重组质粒的大肠杆菌不能存活，故菌落3和5 上的大肠杆菌含重组质粒，因此能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中，C错误，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 11.(2024·山东，25节选)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；AmpR氨苄青霉素抗性基因。 甲　载体信息 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 乙　目标基因L部分序列 丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越_____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有_________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－______－3′和5′－_______________________－3′。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 低 256(或44) GTTT CAAT(或CAAT　GTTT) 单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任意碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′端到3′端。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是_____(填序号)。 卡那霉素 SacⅠ ④ 导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知， 目标基因L的目标序列跟突变序列之间只在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要 以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物 完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列， 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 因此只能选用限制酶SacⅠ，突变序列存在限制酶SacⅠ酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带 会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 12.人促红细胞生成素(EPO)是一种可用于治疗肾性贫血的糖蛋白类激素，可用乳腺生物反应器生产EPO。科研人员利用大鼠乳清酸蛋白(WAP)基 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列构建了基因表达载体。构建前，科研人员扩增了WAP基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入EPO基因中，以确定WAP基因启动子的具体位置。相关信息如图所示，回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (1)为将扩增后的产物定向插入基因表达载体中，以指导EPO基因的表达，需要在引物末端添加特定的限制酶识别序列。由图中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是______，在A末端添加的序列所对应的限制酶是______。 ClaⅠ MunⅠ 需要将WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列与EPO基因相连，则扩增的WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位点，则P1～P4末端添加的序列所对应的限制酶是ClaⅠ，WAP基因上游的调控序列及 启动子和3′UTR序列的3′端需要与EPO基因相连，但是不能破坏EPO基因序列，也不能破坏WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，则A末端添加的序列所对应的限制酶是Mun Ⅰ。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 _________________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (2)将通过PCR处理后的含不同长度的WAP基因上游序列与EPO基因连接，构建成表达载体的过程中，需要____种限制酶切割上述DNA片段。检测转基因雌性大鼠时发现，导入含P1～P3与A扩增产物的个体乳汁中有EPO，而含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成的原因是________________ 4 P4与A扩增产物不 含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达 需要用两种限制酶切割WAP基因上游的调控序列及启动子和3′UTR序列，用两种限制酶切割EPO基因，所以共需要4种限制酶切割上述DNA片段。P4与A扩增产物不含完整的WAP基因的启动子，EPO基因不表达，则含P4与A扩增产物的个体没有EPO生成。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (3)该实验中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子的理由是___________________________________________。 能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达 启动子具有组织特异性，大鼠WAP基因启动子能使EPO基因在大鼠的乳腺细胞中特异性表达，所以在EPO基因上游插入大鼠WAP基因启动子。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (4)科研人员不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞，从基因表达的角度分析，其原因是____________ _______________________________________________________________________________________________。 EPO基因是 真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内加工成熟，表达出来的产物不是EPO EPO基因是真核生物的基因，该基因转录出的mRNA无法在大肠杆菌细胞内被加工成熟，表达出来的产物不是EPO，所以不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 13.(2024·广东，21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的____________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 碳源、氮源 微生物生长需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水、无机盐，培养不同微生物需要的水是相同的，无机盐基本相似，但是碳源、氮源会存在差异，所以可以优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为_________ _______，理由是__________ ________________________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 PT7、PBAD 和PBAD 基因2和3 正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达　 根据图二a分析，蓝光调控的基因表达载体的光控原理是在蓝光的作用下，细胞中无活性的T7RNAP被激活，变成有活性的T7RNAP，该RNA聚合酶会特异性地与图中启动子PT7结合，从而调控目的基因的表达，根据图二b分析可知，基因1编码的是酪氨酸酶，属于图a中的目的基因，应该在蓝光的 调控下才表达，基因2和3编码的是T7RNAP的两个部分，其正常表达的产物是无活性的T7RNAP，所以启动子②和③为通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)，在蓝光的作用下，两者表达的无活性的T7RNAP被激活，再启动基因1表达，所以启动子①是特异型启动子PT7，仅被有活性的T7RNAP识别。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_____________________________(答两点)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株 光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因，其表达的产物对大观霉素具有抗性，可以作为表达载体的标记基因，因此，长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其他微生物由于不具有抗性，生长被抑制，此外，丢失质粒的菌株也不具有抗性被淘汰，从而筛选出具有目的基因的菌株。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_________________ ______________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 该处细胞中T7RNAP被激活，酪氨酸酶基因表达并形成黑色素 根据第(2)问分析可知，用蓝光照射已长出的BC菌膜，细胞中T7RNAP被激活，会调控酪氨酸酶基因表达合成酪氨酸酶，随后将其转至含有酪氨酸的染色池处理，只有经蓝光照射的区域，酪氨酸酶会催化酪氨酸形成黑色素，被染成黑色。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：_________________________________________________ ____________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 按照上述菌株的构建模式，要生产其他颜色图案的BC膜，可以构建其他颜色的蓝光表达载体，将原来表达产物酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶，或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 答案 更多精彩内容请登录：www.xinjiaoyu.com 本课结束 THANKS $