3.2 基因工程的基本操作程序（第2课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章 基因工程 第2节基因工程的基本操作程序 第2课时 【本节聚焦】 1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪 些？ 复习回顾 基因工程的基本操程序 基因表达 将目的基因 目的基因的 载体的构 导入受体细 目的基因的 筛选与获取 建 胞 检测与鉴定 父第一步 第二步 第三步 第四步 思考：将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是 什么？各自适用于什么生物？ 三、将目的基因导入受体细胞 花粉管通道法 将目的基因导入 植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因导入 显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 Ca2+处理法 微生物细胞 我国科学家独创 (常用) 花粉粒 Pollen grain! 花粉管 Pollen tube 雄蕊 花柱 Stamen Stylus 子房 Ovary 胚珠 Ovule 卵 Ovum 精子 Sperm 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 (1)花粉管通道法 (我国独创) ①用微量注射器将含目的基因的 DNA溶液直接注入子房中； ②在植物授粉后一定时间内，剪去 柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使 目的基因通过花粉管通道进入还囊。 受体细胞： 受精郇 花粉粒 Pollen grain 花粉管 Pollen tube 雄蕊 花柱 Stamen. Stylus 子房 Ovary 胚珠 Ovule 卵 Ovum 精子 Sperm 花粉管通道法导入外源DNA 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 (2)农杆菌转化法 转基因方法 农杆菌介导法 2.农杆菌转化法 体细胞或授精卵 T-DNA ①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细 胞内维持稳定和表达的过程 Ti质粒 ②农杆菌特点： a.能在自然条件下侵染 双子叶植物和 裸子植物而对大多数 WHY 单子叶植物没有侵染能力： 随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 b.农杆菌细胞内含有 T质粒当它侵染植物细胞后，能将T质粒的 T-DNA可转移的DNA转移到被侵染的细胞，并且将其 整合到该细胞的染色体DNA上； ③利用农杆菌进行转化的思路：将目的基因插入 T质粒的T-DNA 通过 农杆菌的 转化，就可以使目的基因 进入植物细胞 2.农杆菌转化法 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■ ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■ 为什么农杆菌容易感染双子叶植物？ 科学研究发现，当植物体受到损伤时 I 伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物 吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌 中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的 DNA)转移至受体细胞染色体的DNA 上。这种酚类化合物主要在双子叶植物 细胞壁中合成，单子叶植物通常没有。 ■■■ 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 (2) 农杆菌转化法 “转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并目在受体细胞内钳持稳定和 表达的过程，实质是基因重组。 随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米 ①农杆菌特点： 等多种单子叶植物也取得了成功 a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没 有侵染能力： 质粒 T-DNA 细菌染色体 b.农杆菌细胞内含有T质粒，当它侵染植 物细胞后，能将T质粒上的T-DNA(可转移 的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将祺整 感染植 物细胞 合到孩细的染包D小NA上。 A.tumefaciens 后转入 目的基 因 体细胞或授精卵 三、将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 提醒：该过程经过两次拼接、 两欠导入？ 菲工操作)是指 耳的基因 将目的基因拼接到 含目的基因的 Ti质粒的T-DNA上。 T-DNA被拼接到受 第一次拼接 第二次拼接 体细胞的染色体DNA 构建基因 转入农 导入植 植物组 表现出 Ti质粒 重组 表达载体 杆菌 物细胞 织培养 新性状 Ti质粒 的植株 T—DNA 第一次导入 第二次导入 将含目的基因的Ti质 (非人工操作)含目的基因 粒重新导入农杆菌。 的T-DNA导入受体细胞。 三、将目的基因导入受体细胞 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA,如果不是， T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将 目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随缸-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细 胞的染色体上。 2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最 终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？ 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 三、将目的基因导入受体细胞 2将目的基因导入动物细胞 (1)常用方法： 显微注射法 (2)受体细胞： 受精卵 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ 5。E NAO 0.55 ①体积天，易架作。②易表现出全能 性 (3)过程： 构建基因表达载体带提纯 利用显微注射将基因表达载 体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 三、将目的基因导入受体细胞 知识拓展 2.将目的基因导入动物细胞 病毒介导法（主要用于导入动物细胞） 科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细 胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基 因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 Noagb 4 巴p中m 10 daya 四 Adenorires AFI ItocunHnan Vin Vertor 腺病毒包装 腺病毒感染细胞 (三)导入入微生物细胞Ca2+处理法 1受体细胞：常用原核往物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。 2.原核生物的优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。 3.一般过程： Ca2+处理大肠杆菌(Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性) Ca2+ 使细胞处于一种能吸收 周围环境中DNA分子的 重组 吸收 生理状态 Ti质粒 ↓（感爱态细胞） 将重组的基因表达载体导入其中 感受态细胞 2026-4-21 三、将目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入微生物细胞 (1)常用方法：Ca2+处理法 目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (2)受体细胞：常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛） 优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养 Artificial Transformation (3)过程： Antibiotic-sensitive CaC2(Ca2+)使细胞处于一种能 bacterial cell 3 1 大肠杆菌 吸收周围环境DNA CaCl,treatment to permeabilize Add Plasmid DNA 分子的生理状态 转化 cell walls 溶于缓冲液中的重组DNA分子 4,5 Selection on bacterial growth medium containing appropriate antibiotic "Transformed"bacterial cell 三、将目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入微生物细胞 (4)应用实例 利用转基因大肠杆菌生产药物 胰岛素原 胰岛素 mRNA CDNA 转化 mRNA 提取 逆转录 E·coi 胰腺 质粒 重组质粒 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（原 核细胞中没有高尔基体和内质网等)，需要在体外进行再加工。 知识拓展：基因的结构 真核细胞的基因结构 非编码区 00)e0207)07 前体mRNA 成熟mRNA 编码区 转录 剪接 非编码区 ① 外显子 0 内含子 三、将目的基因导入受体细胞 细胞种类 植物细胞 常用方法 花粉管通道法、农杆菌转化法 受体细胞 受精卵或体细胞 以农杆菌转化法为例：将目的基因 插入Ti质粒的T-DNA上 ↓ 转入农杆菌中 转化过程 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 动物细胞 显微注射技术 受精卵 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 获得具有性 状的个体 微生物细胞 Ca2+处理法 原核细胞 Ca2+处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞 吸收DNA分子 课堂练习 1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进 入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是 A.不必构建表达载体就可以直接导入 都需要构建 B.此方法可用于转基因动物~只适用于植物 C.受体细胞只能是植物的卵细胞 →体细胞 有时可以取代农杆菌转化法 课堂练习 2如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是 ,受体细胞A 转基因绵羊 目的基因 ③ 受体细胞B 转基因抗虫棉 母受体细胞A只能是绵羊的体细胞 受体细胞A一般是该种动物的受精卵 B.②过程中需要进行胚胎移植操作 C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素 思考：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即 使导入成功，标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 不一定！ 若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，！ 因此仅凭 标记基因有无，无法完全确定转基因生物是否培育成功。 四、目的基因的检测与鉴定 1.目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性； 2检测与鉴定 类型 检测内容 方法 受体细胞的染色体DNA上是 PCR及电泳技术 分子水平 否插入了目的基因 鉴定 的检测 目的基因是香转录出了mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 个体生物 抗原抗体杂交技术 学水平的 鉴定 个体是否具有相应性状 病原体接种实验等 四、目的基因的检测与鉴定 Bt基因 ①检测转基因生物染色体DNA 上是否插入了目的基因 3 mRNA TTTTTTTTTTTT ②检测目的基因是否转录 AUGGUGUUGAGO Triplet code words 出了mRNA B抗虫 Met Val Leu Ser ③检测目的基因是否翻译成 蛋白 蛋白质 2)个体水平的鉴定 抗性检测： ④检测是否具有抗 抗虫棉 性以及抗性程度等 功能活性 比较： 方法： 通过PCR等技 术检测 C分子检测法 抗原一抗体 杂交技术 抗虫、抗病接种实验： 基因工程产品与天然产 品的功能活性比较 四、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平检测 通过PCR等技术检测 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的 抗虫棉 害虫 基因 死亡 提取 DNA 方法：PCR扩增+电泳 原理：DNA半保留复制 PCR 判断标准：是否扩增出目的基因 操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 M:marker;1-阳性质粒； M 123456789 2:原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 500hp→ 四、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平检测 害虫 提取 通过PCR等技术检测 死亡 mRNA 逆转录 抗虫棉 产生CDNA ②检测目的基因是否转渌出了mRNA 方法：PCR扩增+电泳 原理： 逆转录+DNA半保留 PCR 复制 操作 判断标准：是否扩增出 是否扩增出目的基因 对扩增产物进行检测 目的基因cDNA M3 co ?⑧⑧及是 其他方法： PCR扩增+DNA分子杂交技 Bu 术 10个PCR阳性棉花植株中，有四株B基因发生转录 四、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平检测 通过抗原-抗体杂交检测 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法： 原理： 提取 标记抗体 苏云金芽孢 杆菌 Bt毒蛋白 抗体 注射小鼠体内 抗体 杂交 脱分化 提取蛋白 抗原 以“抗虫棉 抗原一抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 过程：提取转基因植 物的蛋白质+相应抗 体一→是否出现杂交 带 为例（含Bt抗虫蛋白基因） 四、目的基因的检测与鉴定 2.个体水平的检测 基因工程产品与天然产品的： ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 思路： 没有抗虫基因 棉铃虫没有死亡 饲猾喂 观察棉铃虫 棉即吐片 有县因 棉棉铃虫 存活情况 的棉花植株 棉铃虫死 功能活性比较 转基因 转Bt基因 四、目的基因的检测与鉴定 3.其他检测方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 抗病毒（菌）植物 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 获取目的基因产物的 提取细胞产物与天然产品进 功能、活性 转基因生物 行功能活性比较 正常 课堂练习 1.甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基 因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提 高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题： A链 上游 下游 B链 (1)为将PEP基因反向连接在启动子 PEP基因 后，构建反义PEP基因，需要将限 启动子G HamH I Sca I np终止子 制酶酶切位点设计在引物上，PEP -DNA Ti质粒 基因的上游引物和下游引物中应分 T-DNA 别引入ScaI、HamHI酶切位点。 GFP:绿色荧光蛋白基因 np:新霉素抗性基因 课堂练习 (2)用激光照射油菜愈伤组织时，可 在细胞膜上打出一个穿孔，转反义 PEP基因表达载体由此小孔进入油 菜细胞，几秒钟后小孔封闭，该过 程体现了细胞膜具有流动性。目的 基因表达载体进入细胞后，T质粒 上的T一DNA区段可转移到油菜细 胞的基因组中。 A链 上游 下游 B链 PEP基因 HamH I Sca I 启动子GF ntp 终止子 T-DNA Ti质粒 T-DNA GFP:绿色荧光蛋白基因 ntp:新霉素抗性基因 课堂练习 (3)筛选时，需在油菜愈伤组织培养 基中加入新霉素进行初步选择。在 激光照射下，存活的细胞一般会发 出绿色荧光。为检测反义PEP基因 是否整合到染色体上，研究者通常 检测细胞中是否存在np基因，而不 检测PEP基因。不直接检测PEP基因 的原因是油菜细胞的基因组中本身有 A链 上游 下游 B链 PEP基因 HamH I Sca I 启动子GF ntp 终止子 T-DNA Ti质粒 T-DNA GFP:绿色荧光蛋白基因 np:新霉素抗性基因 PEP基因 课堂练习 (4)己知PEP基因的转录模板链为A链 则反义PEP基因的转录模板为B链 转反义PEP基因油菜中PEP基因的表 达受阻，原因是以B链为模板转录出 的RNA与以A链为模板转录出的 RNA配对形成双链，抑制了PEP基 因的翻译过程 A链 上游 下游 B链 PEP基因 HamH I Sca I 启动子GF np 终止子 T-DNA Ti质粒 T-DNA GFP:绿色荧光蛋白基因 ntp:新霉素抗性基因 探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理： (I)PCR利用DNA的热变性原理 温度来控制DNA双链 3 通过调节 的解聚与结合 PCR仪实质上就是 合能够自动调控温度的仪器 5 3 3 5 2)PCR扩增DNA片段还利用了 DNA半保留复制 的原理。一次 53 PCR一般要经历 30 次循环 5' 高温 变性 3 5' ,1次循环 复性 5' 3 延伸 5 中温5' 3' r5' 探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、材料用具 1.仪器： ①PCR仪（自动控温，： 实现DNA的扩增) 调节旋钮 ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） 推动杆 ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） 卸枪头按钮 ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 体积刻度 吸液杆 微量离心管 枪头 PCR仪 电泳装置 (注意：加不同样品时，需要更换枪头 探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、材料用具 2.试剂：(1)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TagDNA 聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+) 5μL 为保证加入反应体系中 20mmol/L的4种脱氧核酸的等量混合液（实为dNTP) 1μL 的各试剂体积的准确性， 建议按照劭加入体积的大 20μmol/的引物1 2.5μL 小，由大到小依次加入 20μmol/L的引物Π 2.5μL 各试剂，即先加入无菌 H20(无菌水) 28~33μL 水。为保护酶的活性， 一般最后加入DNA聚 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1~2U 合酶。 模板DNA(用量为1pg-1μg) 5~10μL 探究实践 一DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 d抖音 赛斯聚信 生物科技 走进实验室 琼脂糖凝胶电泳实验（一） 探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 (1)DNA片段的扩增 ①移液：用微量移液器依次将名组分加入微量离心管中。 (注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。 酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活) ②离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里， 离心约10s,使反应液集中在离心管的底锫部（提高反应速率） ③反应：参照下表的参数，设置好 循环程序 变性 复性 延伸 PCR仪的环程序。将装有 预变性 94℃，5min 反应液的微量离心管放入 PCR仪中进行反应。 30次 94°℃，30s 55℃，30s 72C,1min 最后一次 94°℃，1min 55℃，30s 72C.1min 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 (2)制备凝胶 ①熔化：电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量 琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热琼脂糖熔化。 的核酸染料混匀。 ②倒模将温热的琼脂糖溶液迅 速倒入模具，并插入合适大小 的梳子，以形成加样孔。 ③疑固：待凝胶溶液完全疑固 小心拔出梳子，取出凝胶放入 电泳槽内。 积比0.8%~1.2%的 稍冷却后，加入适量 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 (3)进行电泳 ①加液：将电泳缓冲液劾加入电泳槽中，电泳缓 冲液没过疑胶1mm为宜。 ②加样：扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲 液（内含指示剂混合，再用微量移液器将混合 液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加 入指示分子大小的标准参照物。 50X Speed ③电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的 距离来设定电压，一般为1~5V/cm。待指示剂前 沿迁移接近疑胶边缘时，停止电泳 ④观察鉴定：取出疑胶置于紫外灯下观察和照相。 电泳结果 1100一 00.05 探究•实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 注意： 1.为避奂外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头 和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并 在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添动加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴效好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究实践一 DNA片段的扩增及电泳鉴定 四、实验结果及分析评价 123 [思考1]你是否成功扩增出DNA片段？判断的依 据是什么3 以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗 细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果 应该是一条条带。 [思考2]你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条 条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ①如果扩增不成功，可能的原因有漏加了PC的反应成分，各反应成分的用量 不当，PCR程序设置不当等。 ②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度 过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg+浓度过高等。 课堂练习 1.如图是从酵母菌细胞中获取某植物需要的某种酶基因的流程。结合所学 知识及相关信息回答下列问题： (1)图中B过程是逆转录。 分离 (2)为在短时间内大量获得目的基因，可用 目的基因 含目的基因的菌株 PCR扩增的方法，其原理是 构建 DNA半保留复制 DNA 基因组文库 (3)获取目的基因之后，需要进行 酵 提取 母 基因表达载体的构建 ，此步骤是基因工 菌 提取 构建 mRNA cDNA cDNA文库 程的核心。该步骤得到的结构必须含有 箭选 启动子、终止子、标记基因 (写出三项) 目的基因Ⅱ 分离 含目的基因的菌株 以及目的基因等。 (4)将目的基因导入某双子叶植物细胞， 常采用的方法是 农杆菌转化法 。其能否在此植物体内稳定遗传的关键是此植物的染 色体DNA中是否插入了目的基因，可以用PCR 技术进行检测。 课堂练习 课时作业P1389 2.用PC方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电 泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水。PCR时加入 的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( 3 4 5 6 bp 8 10 2000 1000 750 500 250- 100 2号：野生型植株DNA3号：？4-g号：转基因植株DNA A.PCR产物的分子大小在250至500bp之间 d.3号样品为不含目的基因的载体DNA3号PCR结果包含250500bp片段，应包含目的基 心：9号样品树应梢标不是所需的转基因梢株9整鞋基短 9号PCR结果不包含25050bp片段，所以 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结菓没有干扰 小结 基因工程的基本操作流程图 获取质粒、 用限制酶切割 噬菌体等载体 载体和含有目的基 将含有目的 检测和鉴定 因的DNA片段， 基因的表达 目的基因是 筛选和获取 然后用DNA连接 载体导入受 否稳定钳持 目的基因 酶连接，构建基因 体细胞 和表达其遗 表达载体 传特性 一 )导入植物细胞 一般用同种限 农杆菌转化法法 DNA\RNA 人工合成法、 制酶切割载体 花粉管通道法 水平 PCR扩增法、 和含有目的基 二) 导入动物细胞 蛋白质水平 基因文库法等。 因的DNA片段 显微注射法 三) 导入入微生物细胞 个体水平 (核心) Ca2+处理法 课堂小结 基因中工的基本村操作程序 〉第步 第二步 第三步 第四步 目的基因的 基因表达载 将目的基因 目的基因的 筛选与获取 体的构建 导入受体细 胞 检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 利用PCR获取和扩增 目的基因、启动子、 农杆菌转化法（植 分子检测：是否插入、 终止子、标记基因 物)、显微注射法 转录、翻译 (动物)、感受态细 个体水平：是否具有 胞转化法（微生物）： 抗性以及抗性强度等。 三、练习巩固 1.下列关于PCR技术的叙述，错误的是 )A.需要合成特定序列的引物 B.每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步C.需要解旋酶、DNA聚合酶 等酶类D.电泳出现位置不等的几条条带，说明鉴定的PCR产物不纯净 2.用某人胰岛素基因制成DNA探针，用来检测下列物质，不能形成杂交分子的是 )A.该人胰岛A细胞中的DNAB.该人胰岛B细胞的mRNAC.该人 胰岛A细胞的mRNA D.该人肝脏细胞中的DNA C DNA分子杂交： 基因探针：简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学 发光催化剂)，且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。 XN0X 变性 探针 X0X变性 引物 热变性 报告基团R 淬灭基团 DNA聚合酶 探针 ①方法： 分子杂交 引物和探针退火 ②过程：用上述探针和转基 延伸反应 带，表明含目的基因或已车 可检测目的基因是否导入成XE口权水厅 练习与应用 课本P88 一概念检测 l.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti 质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下 列相关表述是否正确。 (I)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因（√） (2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶 (X) (3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成 功(X) 练习与应用 一概念检测 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。 下列有关PCR的叙述错误的是(D) A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 练习与应用 二、拓展应用 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现 44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自 交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对 这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同 染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是 随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转 GUS基因(B-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的 染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢 失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。