3.2基因工程的基本操作程序教学设计-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

课题 第3章 第2节 基因工程的基本操作程序（4-5个课时） 时间 教学目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。（生命观念、科学思维） 2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。（科学思维、科学探究） 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。（科学思维、科学探究） 教学重难点 1.教学重点 (1)基因工程基本操作程序的四个步骤。 (2)DNA片段的扩增及电泳鉴定。 2.教学难点 (1)利用PCR获取和扩增目的基因。 (2)DNA片段的扩增及电泳鉴定。 教学内容及流程 学习任务 教学过程 备注 新课导入 【教师讲述】基因工程的基本操作程序： ①目的基因的获取 ②基因表达载体的构建（核心步骤） ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测与鉴定 【教师讲述】 PCR和电泳 【教师讲述】一、PCR的原理 思考：结合体内 DNA 复制过程，思考 PCR 的进行需要哪些条件？ ·体内 DNA 复制要点回顾： ①模板：DNA 的两条链 ②原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C） ③能量：ATP ④酶：DNA 解旋酶、DNA 聚合酶等 复制原则：碱基互补配对原则（保证复制的准确进行） ·体外 PCR 的条件： ①DNA 模板（需含有目的基因） ②分别与模板 DNA 相结合的 2 种引物 ③四种脱氧核苷酸（或四种 dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ④耐高温的 DNA 聚合酶 (Taq 酶） ⑤稳定的缓冲溶液（一般添加 Mg2+） ⑥能严格控制温度的温控设备 【教师讲述】PCR 的全称是聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。 DNA 聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。 DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的 3′- 端，即子链的延伸方向是 5 ′→3 ′。 ·什么是引物？ 引物是一小段能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于 PCR 的引物通常为 20~30 个核苷酸。在细胞中为一段单链 RNA，在 PCR 中为一段人工合成的单链 DNA。 在 DNA 复制时，DNA 聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供 3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。 【教师讲述】PCR 反应的过程 第一步：变性 当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链 DNA 解聚为两条单链 DNA。 思考：变性的温度为何是 90℃以上的一个温度范围，而不是 95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 第二步：复性 当温度下降到 50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。 思考：复性的过程一定是引物与 DNA 模板链结合吗？复性时引物与 DNA 模板的结合是随机的，也存在解开的两条 DNA 单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。 原因： ① 模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ② 加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 第三步：延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的 4 种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。 【1】为什么温度要上升至 72℃？ 72℃是 Taq 酶的最适温度 【2】Taq 酶结合在引物的 3’还是 5’端？ Taq 酶结合在引物的 3’端 1 个 DNA 片段→第一轮→2 个 DNA 片段→第二轮→4 个 DNA 片段→第三轮→8 个 DNA 片段 小结：PCR 重复多次后，DNA 分子呈指数形式扩增（约为 2ⁿ） 第 1 次扩增 长链 - 中长链 DNA 2 个 含有引物 A 的 DNA 1 个 含有引物 B 的 DNA 1 个 第 2 次扩增 中长链 - 短链 DNA 2 个 长链 - 中长链 DNA 2 个 含有引物 A 的 DNA 3 个 含有引物 B 的 DNA 3 个 第 3 次扩增 短链 - 短链 DNA 2 个 中长链 - 短链 DNA 4 个 长链 - 中长链 DNA 2 个 含有引物 A 的 DNA 7 个 含有引物 B 的 DNA 7 个 第 4 次扩增 短链 - 短链 DNA 2 个 中长链 - 短链 DNA 6 个 长链 - 中长链 DNA 8 个 含有引物 A 的 DNA 15 个 含有引物 B 的 DNA 15 个 PCR 扩增 "目的基因" 规律 【比较分析】PCR 技术与细胞内 DNA 复制的比较表格 思考 5、dATP 与 ATP 在结构上有什么区别？dATP 为什么能用作 DNA 复制的底物？ 引物：决定 PCR 特异性扩增的关键 ①引物与目的基因两端互补配对 ②引物之间不会自身配对（发夹结构）或者相互配对（引物二聚体） ③引物的长度适宜（20-30bp) ④两引物的CG含量相当，复性温度相差小 引物3'端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。  3'端防止连续三个C或G，引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 【教师讲述】二、PCR的应用 思考、若目的基因两侧无合适的限制酶切割位点怎么办？ 思考、如何利用 PCR 得到融合基因？ 思考、如何利用 PCR 对基因进行定点突变？ 三、电泳的原理和应用 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的 pH 下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小和形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它分子的大小以及所带净电荷的多少等因素。 · 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 · pH=8 左右时，DNA 分子带负电。在碱性环境下，不同的 DNA 分子具有相同的电荷密度。DNA 分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。 ·电泳一般需要 Marker（标记），为一组已知分子量的标准 DNA 片段，在电泳中作为未知样品大小的参照物。如 D2000 plus DNA Ladder 含有 9 条双链 DNA 分子，其分子量为 100，250，500，750，1000，1500 ，2000，3000，5000 bp。 ·SDS— 聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小。 SDS 的作用： ①SDS 能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链； ②SDS 能与各种蛋白质（肽链）形成复合物，SDS 所带负电荷的量大大超过蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 ·SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分子量，其原理是？ 分析：使用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定的换算，可以测定未知蛋白质的分子量。 【视频学习】观看琼脂糖凝胶电泳实验视频 让学生基于DNA复制的相关知识类比推出PCR反应所需的条件，既可以培养他们的科学思维，又能够深化他们对PCR原理的理解。 通过用多媒体课件分步讲解和微课总体简介相结合的方法，让学生理解用PCR技术扩增目的基因的过程和结果。 基因工程操作基本的程序 【教师讲述】一、目的基因的获取 目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质等相关的基因。 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的 “杀虫基因” 转到棉花里，让棉花也能产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。这个 “杀虫基因” 就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因 ——Bt 抗虫蛋白基因，简称Bt 基因。 当 Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt 抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从生物材料中分离。当基因比较小，核苷酸序列又已知，可用 DNA 合成仪人工合成。 ①基因组文库：从细胞中提取基因组 DNA，限制酶酶切，与质粒连接，导入细菌中保存。 ②cDNA 文库：以 mRNA 为材料，逆转录得到 cDNA，限制酶酶切，与质粒连接，导入细菌中保存。 基因组文库含有生物全部基因；cDNA 文库属于部分基因文库，不含内含子、启动子、终止子、非编码区。 【教师讲述】二、基因表达载体的构建 获取了足够量的目的基因（Bt 基因）后，下一步就是要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使 Bt 基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。这一步是培育转基因抗虫棉的核心工作。 ·基因表达载体组成： 1. 启动子：位于基因上游，是 RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录。 组成型启动子（一直干活） 组织特异性启动子（特定组织中干活） 诱导性启动子（特定诱导物下干活） 2.终止子：位于基因下游，提供转录终止信号。 3.目的基因：需要表达的基因。 4.标记基因：用于重组质粒的筛选（如抗卡那霉素基因）。 5.复制原点：保证载体复制。 6.T-DNA：可转移至细胞的染色体 DNA 上。 7.多克隆位点：目的基因插入部位，有多种限制酶酶切位点。 ·构建程序：先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶（同尾酶）切割载体和含有目的基因的片段，再用 DNA 连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组 DNA 分子。 【教师讲述】三、将目的基因导入受体细胞 转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 方法一（花粉管通道法）： 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加纯化的表达载体，使目的基因借助花粉管进入受体细胞。我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。 方法二（农杆菌转化法）： 把目的基因插入到农杆菌的Ti 质粒的T-DNA上，构建重组质粒。将重组质粒转入农杆菌，然后用农杆菌侵染植物细胞。侵染过程中，目的基因随着T-DNA转移到植物细胞，并插入到植物细胞的染色体 DNA上。转基因的植物细胞还需要通过植物组织培养技术才能发育成转基因植株。 思考、如果抗虫基因只插入到植物细胞的一条染色体上，转基因植物相当于杂合子。如果转基因植株的染色体上成功导入了 2 个抗虫基因，则理论上，该转基因植株自交的后代中，抗虫植株所占的比例为全为抗虫或抗虫：不抗虫 = 3：1或抗虫：不抗虫 = 15：1。 方法三（转化动物细胞）： 最常用的方法是显微注射法。 操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯→从雌性动物体内取出卵（卵可以在体内受精，也可以在体外受精）→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植到雌性动物的输卵管或子宫内→转基因动物。 方法四（转化微生物细胞）： 早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。转化大肠杆菌细胞最常用的方法是：首先用Ca²⁺处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体 DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。 思考：为什么早期基因工程都用原核细胞作为受体细胞？ 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 【教师讲述】四、目的基因的检测与鉴定 （一）分子水平的检测 1、分子水平的检测（检测目的基因是否插入到受体细胞染色体 DNA 上） 提取培育出的转基因植株细胞中的 DNA，依据目的基因两端的特异性序列设计两种引物，对转基因植物细胞中的 DNA 进行 PCR 扩增。对扩增产物进行电泳鉴定。 2、分子水平的检测（检测目的基因是否转录出 mRNA） 提取培育出的转基因植株细胞中的 RNA，逆转录成 cDNA，依据目的基因两端的特异性序列设计两种引物，对转基因植物细胞中的 DNA 进行 RT-PCR 扩增。对扩增产物进行电泳鉴定。 3、分子水平的检测（检测目的基因是否翻译为蛋白质） 采用抗原 — 抗体杂交，原理：抗原与抗体特异性结合。 （二）个体水平的检测 例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。 （3） 基因探针 一般是指一小段单链 DNA 或 RNA，能与目的基因的一条链碱基互补配对，并带有放射性同位素标记或荧光标记。 例如，胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的mRNA形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有胰岛素基因，也可以检测胰岛素基因是否转录。 人体的细胞中，胰岛 B 细胞的DNA 和 RNA能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有DNA能与之形成杂交分子，在其他细胞中不转录。 利用模式图、示意图的形式，帮助学生理解基因表达载体的结构、各部分的功能及基因表达载体构建的过程，结合易混淆概念的区分，培养学生的理解能力和科学思维核心素养。 围绕抗虫棉的培育过程，让学生了解将目的基因导人受体细胞的几种方法，重点强调花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，培养学生的民族自豪感。 让学生联系上节课的知识内容，通过分析基因表达载体的组成，自主设计构建基因表达载体的流程，这有利于他们将所学的知识融会贯通学以致用。 思考、回答，认识到可以分别从DNA、RNA和蛋白质水平进行检测;检测棉花是否具有抗虫特性最直接的办法是观察它是否对棉铃虫产生了抗性，这属于个体水平的检测。 让学生结合学过的基因表达相关的知识推出检测与鉴定目的基因的几个水平，可以促进他们对这一操作环节的理解，发展思维能力。 小结与练习 【课堂小结】同板书 【课堂练习】处理教材中的思考讨论、练习与应用，处理双导学案和分层作业 引导学生关注知识内容的梳理，尝试构建概念图。 板书设计 3.2基因工程的基本操作程序 1、 PCR和电泳 （一）PCR的原理 （二）PCR的应用 （三）电泳的原理和应用 二、基因工程的基本操作程序 （一）目的基因的获取 （二）基因表达载体的构建 （三）将目的基因导入受体细胞 （四）目的基因的检测与鉴定 作业布置 【课后作业】1.完成分层训练课后素养评价、2.完成双导学案对应内容和下一节问题式预习部分 教学反思 基因工程这个词汇对于学生来讲并不陌生，这是一个社会事件高频词。在系统学习基因工程之前，学生对于基因工程有着各种或对或错、或深或浅的认识。因此，本节课在教学设计上，基于科学事实，遵循科学程序，对基因工程的基本操作程序进行解读，培养学生对基因工程系统的、科学的认知，进而用自己所学知识影响家人或亲属对基因工程的看法，承担相应的社会责任。 通过让学生初步掌握PCR的原理和方法，发展学生的科学思维。以转基因抗虫棉为主线介绍基因工程的四个操作步骤，了解科学家在选取目的基因、基因表达载体的构建、将目的基因导人受体细胞、目的基因的检测与鉴定等方面的探索和解决方案，学习基因工程的基本步骤，了解科学探究的方法，培养民族自豪感。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $