第3章 基因工程（知识清单）生物沪科版选择性必修3

该高中生物学“基因工程”知识清单系统涵盖基因工程的理论基础、技术工具、操作过程、应用及蛋白质工程延伸，通过可视化思维导图建立知识框架，分考点梳理必背知识与陷阱规避，搭建从基础概念到实践应用的学习支架。 清单采用星级标注区分考点重要程度，如DNA重组工具和过程为五星重点，结合易错辨析（如限制酶切割末端类型）和跨学科热点（CRISPR技术迭代）培养科学思维与探究实践。设计基因表达载体构建等练习题，助力学生高效掌握，教师可据此优化教学，提升复习针对性。

第3章 基因工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、陷阱规避 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性（2个考点） 考点1 基因工程的理论基础和技术支撑 ★★★☆☆ 考点2 基因工程的应用 ★★★☆☆ 第2节 基因工程是一种重组DNA技术（2个考点+1个特别提醒） 考点1 DNA重组的三种基本工具 ★★★★★ 考点2 基因工程的过程 ★★★★★ 第3节 蛋白质工程是基因工程的延伸（2个考点+1个易错辨析） 考点1 定点突变 ★★★☆☆ 考点2 定向进化 ★★★☆☆ （星级越高，重要程度越高） 素养加油站：跨学科内容与热点问题分析、聚焦考点预测 方法储备库：高频考点，方法归纳 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性 考点1 基因工程的理论基础和技术支撑 ★★★☆☆ 1、概念：又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物（供体）的____DNA__与___载体___在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。 2、地位：基因工程是现代生物工程的核心技术 3、科学意义：打破物种之间遗传信息交流的屏障 4、理论依据： ① 揭示_DNA__是遗传物质：是基因工程中基因转移操作的先驱性工作。 ② 确立DNA双螺旋结构和中心法则：为基因工程中提升目的基因的复制和表达水平奠定了基础。 ③ 破译_遗传密码子：为基因的鉴别和合成等提供了理论依据。 5、技术支撑：发现运载工具、开发工具酶、实现DNA体外重组。 考点2 基因工程的应用 ★★★☆☆ 1、应用价值：探究基因功能、改良遗传性状、制造生产产品 2、医学领域的应用： ① 生产药物：利用大肠杆菌生产重组人胰岛素，利用酵母菌生产乙肝疫苗等； ② 基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。 3、农牧业领域的应用： 1　 抗虫转基因植物：将Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因等导入植物，培育出抗虫棉、抗虫玉米等。 2　 抗病转基因植物：将抗病毒基因（如病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因）、抗真菌基因（如几丁质酶基因、抗毒素合成基因）导入植物，培育出抗病毒烟草、抗真菌小麦等。 4、食品工业领域的应用：改良生产菌株提高谷氨酸产量等 第2节 基因工程是一种重组DNA技术 考点1 DNA重组的三种基本工具 ★★★★★ 1、限制性内切核酸酶（又称限制酶）——“分子手术刀” 1　 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 2　 结果：产生黏性末端或平末端。 3　 例：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。 EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。 2、DNA连接酶——“分子缝合针” 作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 3、载体——“分子运输车” （1）种类 1　 质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。 2　 λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。 （2）目的 1　 将目的基因转运到宿主细胞中去。 2　 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）必备条件 1　 在宿主细胞中保存下来并大量复制。 2　 有多个限制酶切割位点。 3　 有一定的标记基因，便于筛选。 4　 对受体细胞无害。 考点2 基因工程的过程 ★★★★★ （1）获取目的基因 方法 前提 化学合成法 目的基因的完整序列已知 基因文库法 基因序列未知 PCR 目的基因的部分序列已知 ①PCR概念：是一项模拟细胞内_DNA复制_过程的DNA体外扩增技术。 ②PCR意义：利用这项技术可由微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列。 ③PCR前提：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成__引物__。 ④PCR体系：缓冲液、DNA模板、四种dNTP（脱氧核苷三磷酸）、____耐高温的DNA聚合（Taq）__酶、两种__引物和双蒸水。 ⑤PCR基本程序： 基本程序 控制温度 变化 变性 95℃ 使待扩增双链DNA样品解旋，形成单链模板 退火 55～68℃ 使两条不同的引物分别与两条单链DNA模板结合 聚合 75℃左右 DNA聚合酶催化从两条引物的一端以相反方向合成新的DNA子链 重复上述操作n次，理论上可从1分子双链DNA模板扩增至___2n___个分子。 （2）构建表达载体 先“切割”和“连接”：将目的基因和合适的载体用相应的__限制___酶切割出黏性末端，然后加入____DNA连接__酶将目的基因和载体连接为一体，形成含目的基因且能表达的表达载体。 表达载体构建需注意： ①若用同一种限制性内切核酸酶切割目的基因和载体，目的基因两侧的黏性末端相同，能以正反两种方式等概率接入载体；载体两端的黏性末端相同，可能___自身环化___，导致载体空载。 ②只要目的基因和载体的黏性末端___相同___，并不必须用同一种酶切开。 ③用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会___消失___。 （3）导入受体细胞 先“转化”后“扩增”：为了提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理，这一操作称为转化。转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 转化方法 实例 物理方法 电击法、_____显微注射法_____（动物细胞） 化学方法 __氯化钙___法 生物方法 _农杆菌转化___法、病毒感染 （4）筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （1）分子水平检测： · 检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上：采用DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的目的基因作探针，与受体细胞的DNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已插入。 · 检测目的基因是否转录出mRNA：采用分子杂交技术，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已转录。 · 检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用抗原-抗体杂交技术，用相应的抗体与受体细胞提取的蛋白质进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已翻译出蛋白质。 （2）个体水平鉴定： · 植物：抗虫或抗病的接种实验，观察受体生物是否表现出相应的抗虫或抗病特性；观察转基因植物的性状是否符合预期。 · 动物：观察转基因动物的性状是否符合预期，如转基因动物的生长速率、产奶量等。 特别提醒 筛选含目的基因的受体细胞常用抗药性筛选法和显色筛选法。 抗药性筛选法 实施的前提条件是载体DNA携带___抗生素___的抗性基因（作为标记基因）。将转化扩增的细菌涂布在含有_____抗生素_的固体平板上，理论上能长出的菌落便是转化成功的克隆 显色筛选法 有些质粒上含有标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。外源DNA插在标记基因内部，转化扩增的细菌涂布在同时含有抗生素和___X-gal___的固体培养基上，在长出来的克隆中，__白____色克隆即为含重组质粒的克隆 第3节 蛋白质工程是基因工程的延伸 蛋白质工程，又称第二代基因工程，是由___人为突变___或____设计__基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程。包括__修饰改造天然蛋白_____和____设计制造全新蛋白________两大方面。修饰改造天然蛋白一方面可实现___氨基酸___序列改造，优化其功能；另一方面还可以确定多肽链中某个__氨基酸____残基在蛋白质结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象和生物功能之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。 考点1 定点突变 ★★★☆☆ 1、概念：在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列。如突变型人胰岛素、新型L-天冬酰胺酶、优质t-PA突变蛋白等； 2、策略：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），然后通过基因工程技术改造或合成基因，最终表达出符合要求的蛋白质。 考点2 定向进化 ★★★☆☆易错辨析：定点突变 ①　依照待突变位点旁侧序列设计一对含突变碱基的局部引物 P1 和 P2，同时设计合成突变基因(或片段)两端的全匹配引物 P3 和 P4； ②　P1和 P2 引物介导的 PCR 反应将产生缩短型含突变碱基的扩增产物； ③　P3 和 P4 引物的存在又引导其合成各自的互补链； ④　这两组缩短突变型的双链片段在随后的退火过程中，可形成交叉互补结构，并实现两端延伸，最终合成出突变型的全长基因或片段； ⑤　值得注意的是，由于 P3 和 P4 全匹配引物的存在,基于上述程序合成的 DNA 分子中含有高比例的非突变型基因或片段； ⑥　一般而言,高浓度的P1、P2 倾向于突变型扩增产物的富集;而高浓度的 P3、P4 则有利于扩增产物总产量的提高。 1、 概念：在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因； 2、 策略：利用易错PCR技术（即改变PCR过程中的温度），在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因。 热点问题分析 1、基因编辑技术的迭代升级（CRISPR/Cas系统的优化与新突破） 背景： CRISPR/Cas9基因编辑技术自问世以来持续迭代，近年来在编辑效率、精准度、递送方式等方面取得多项突破性进展，成为基因工程领域最受关注的研究方向。 考点预测： 1　 小型化CRISPR系统：研究发现，Alistipes sp. Cas12f（Al3Cas12f）体积仅为Cas9的三分之一，却能在人类细胞中实现超过50%的编辑效率，部分靶点甚至超过90%。这一突破解决了Cas9体积过大、难以装入AAV病毒载体进行体内递送的难题。 2　 高精度无痕编辑技术ESS-HDR：研究人员开发了ESS-HDR平台，通过共编辑必需基因提供内源性筛选，将HDR编辑效率提升7~41倍，实现了无需外源标记的无痕精准基因组修饰。 3　 肿瘤DNA选择性切割：ThermoCas9能够识别DNA甲基化模式，可精准区分肿瘤DNA与健康DNA，选择性切割肿瘤细胞DNA，为癌症靶向治疗开辟新方向。 4　 体内直接生成CAR-T细胞：利用“双粒子”递送系统，直接在患者体内改造T细胞为抗癌CAR-T细胞，绕过了传统CAR-T疗法体外培养的复杂流程，在动物模型中两周内几乎清除所有癌细胞。 热点问题分析 2、基因治疗与细胞治疗的临床转化突破 单克隆抗体在新冠病毒检测（抗原/抗体检测）、中和抗体治疗中发挥关键作用。制备过程中涉及动物细胞融合、杂交瘤细胞筛选、大规模培养等技术。 考点预测： 1　 FDA批准首款LAD-I基因疗法：2026年3月，FDA批准了Rocket Pharmaceuticals的Kresladi，用于治疗重度白细胞黏附缺陷症I型（LAD-I），通过提取患者自身造血干细胞、导入健康的ITGB2基因后回输，恢复免疫功能。 2　 3　 CAR-T细胞治疗适应证拓展：合源生物的纳基奥仑赛注射液获批治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤，成为国内覆盖白血病、淋巴瘤两大血液肿瘤适应证的CAR-T产品。通用型CAR-T、CAR-NK等创新技术路线持续突破。 4　 5　 基因治疗递送载体优化：重组腺相关病毒（rAAV）作为递送载体的基因治疗产品持续获批，在眼科疾病、神经肌肉疾病等领域取得进展。 一、基因表达载体的构建 下图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对（bp），质粒有5 369个碱基对（bp）。请据图回答问题： (1)质粒中“氨苄青霉素抗性基因”的作用是 。研究发现复制原点处的A和T特别多，有利于DNA复制时 过程的发生。 (2)限制酶BamHⅠ的识别序列和切割位点是5´-G↓GATCC-3´，该酶切形成的黏性末端是 。 (3)已知图中质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切割后进行电泳，出现了一条长度为5300 bp的DNA条带，则重组质粒的长度为 的DNA片段条带。 (4)过程①②用两种限制酶切割质粒和目的基因，与单一酶切相比，其优势有 。过程②通过PCR技术实现，进行PCR时，需要在两种引物的 端分别添加BamHⅠ和HindⅢ的识别序列。 (5)将重组质粒导入大肠杆菌前，要用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 ；进行筛选时，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、碳源、氮源、琼脂等物质外，还要分别添加 。 【答案】(1) 鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞 解旋 (2)5´GATC3´ (3)6020 bp (4) 可以避免目的基因和质粒自身环化，可使目的基因定向插入质粒中 5′ (5) 使大肠杆菌处于感受态 四环素、氨苄青霉素 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的筛选和获取、构建基因表达载体、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）氨苄青霉素抗性基因属于标记基因，质粒中标记基因的作用都是便于鉴别和筛选目的基因是否导入受体细胞。A-T碱基对之间形成两个氢键，C-G碱基对之间形成三个氢键，研究发现复制原点处的A和T特别多，说明氢键较少，便于解旋过程的发生。 （2）限制酶BamHⅠ的识别序列和切割位点是5´-G↓GATCC-3´，，则该酶切割DNA后形成的黏性末端是5´GATC3´。 （3）绿色荧光蛋白基因有720个碱基对（bp），质粒有5369个碱基对（bp），质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切割后进行电泳，出现了一条长度为5300 bp的DNA条带，说明5 300 bp的DNA条带是原质粒中切去部分片段的质粒，重组质粒的长度＝5300＋720＝6020 bp。 （4）用同一种酶切割目的基因和质粒，可形成相同的黏性末端，在质粒和目的基因连接的时候可能出现反向连接，目的基因和质粒也会出现自身环化的可能性；故用两种限制酶切割质粒和目的基因，与单一酶切相比，可以避免目的基因和质粒自身环化，可使目的基因定向插入质粒中（可以避免目的基因和质粒自身环化，可避免目的基因与质粒反向连接）。DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链，故进行PCR时，需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和HindⅢ的识别序列，以确保扩增所得的DNA可以被正确切割。 （5）CaCl2处理大肠杆菌后，大肠杆菌会处于容易吸收DNA的状态，也就是处于感受态。图中的标记基因有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因已经被破坏，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、碳源、氮源、琼脂等物质外，还要分别添加四环素、氨苄青霉素，选择抗氨苄青霉素而不抗四环素的菌株，即为需要的目的菌株。 二、转基因抗盐马铃薯的培育 马铃薯块茎含有大量的淀粉，富含多种维生素和无机盐，我国已将马铃薯作为主粮产品进行产业化开发。下页左上图是转基因抗盐马铃薯的培育过程，请分析回答下列问题。    (1)上图构建基因表达载体时，最好选用限制酶 切割含目的基因的外源DNA和质粒，不能使用Smal切割的原因是 构建好的重组质粒在抗盐基因前要加上特殊的启动子，启动子是一段有特殊结构的 片段。 (2)将基因表达载体导入农杆菌中的T质粒上的T-DNA上的原因是 ，通过农杆菌的转化作用，使抗盐基因插入马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以 。 (3)从个体水平上检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功的方法是 。 【答案】(1) EcoRⅠ和HindⅢ SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因 DNA (2) T-DNA是可以转移的DNA(T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上)　 稳定维持和表达 (3)将转基因马铃薯幼苗栽种在盐碱地或较高浓度盐溶液中，观察是否能正常生长 【分析】分析题图：图示表示转基因抗盐马铃薯的培育过程，其中①表示获取目的基因的过程，②表示切割质粒的过程，③表示基因表达载体的构建过程，④表示采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，⑤表示脱分化过程，⑥表示再分化过程。 【详解】（1）图中质粒上的标记基因为M抗生素抗性基因，而SmaI的切割位点就在该基因和目的基因中，因此用质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaI切割，则应该用EcoRⅠ和HindⅢ酶切割含目的基因的外源DNA和质粒，保证目的基因和质粒的准确连接。基因表达载体中启动子是一段有特殊结构的DNA片段。启动子是一段特殊的DNA片段，与RNA聚合酶结合，启动转录。 （2）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA是可以转移的DNA，可以将目的基因带入马铃薯细胞，并将目的基因插入到马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 （3）检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功，从个体水平上来讲，可以将转基因马铃薯幼苗栽种在盐碱地或较高浓度盐溶液中，观察是否能正常生长。 【解题方法归纳】 1. 限制酶切出特定末端，连接酶缝补DNA切口，标记基因是筛选转化细胞的“身份证”。 2. 构建载体优先双酶切，既能防止自身环化，又能让目的基因“对号入座”。 3. 看质粒图谱先找酶切位点，再看抗性基因哪个被破坏，据此确定筛选培养基加哪种抗生素。 4. 分子水平用PCR和杂交查基因有无，个体水平直接看性状。 学科网（北京）股份有限公司 $ 第3章 基因工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、陷阱规避 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性（2个考点） 考点1 基因工程的理论基础和技术支撑 ★★★☆☆ 考点2 基因工程的应用 ★★★☆☆ 第2节 基因工程是一种重组DNA技术（2个考点+1个特别提醒） 考点1 DNA重组的三种基本工具 ★★★★★ 考点2 基因工程的过程 ★★★★★ 第3节 蛋白质工程是基因工程的延伸（2个考点+1个易错辨析） 考点1 定点突变 ★★★☆☆ 考点2 定向进化 ★★★☆☆ （星级越高，重要程度越高） 素养加油站：跨学科内容与热点问题分析、聚焦考点预测 方法储备库：高频考点，方法归纳 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性 考点1 基因工程的理论基础和技术支撑 ★★★☆☆ 1、概念：又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物（供体）的______与________在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。 2、地位：基因工程是现代生物工程的核心技术 3、科学意义：打破物种之间遗传信息交流的屏障 4、理论依据： ① 揭示_______是遗传物质：是基因工程中基因转移操作的先驱性工作。 ② 确立__________________：为基因工程中提升目的基因的复制和表达水平奠定了基础。 ③ 破译____________：为基因的鉴别和合成等提供了理论依据。 5、技术支撑：发现运载工具、开发工具酶、实现DNA体外重组。 考点2 基因工程的应用 ★★★☆☆ 1、应用价值：探究基因功能、改良遗传性状、制造生产产品 2、医学领域的应用： ① 生产药物：利用大肠杆菌生产重组人胰岛素，利用酵母菌生产乙肝疫苗等； ② 基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。 3、农牧业领域的应用： 1　 抗虫转基因植物：将Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因等导入植物，培育出抗虫棉、抗虫玉米等。 2　 抗病转基因植物：将抗病毒基因（如病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因）、抗真菌基因（如几丁质酶基因、抗毒素合成基因）导入植物，培育出抗病毒烟草、抗真菌小麦等。 4、食品工业领域的应用：改良生产菌株提高谷氨酸产量等 第2节 基因工程是一种重组DNA技术 考点1 DNA重组的三种基本工具 ★★★★★ 1、____________（又称限制酶）——“分子手术刀” 1　 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的___________键断开。 2　 结果：产生___________末端或平末端。 3　 例：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。 EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。 2、___________酶——“分子缝合针” 作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 3、___________——“分子运输车” （1）种类 1　 ___________：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的___________分子，独立于___________之外。 2　 _________________________________。 （2）目的 1　 将目的基因转运到宿主细胞中去。 2　 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）必备条件 1　 ______________________。 2　 有多个___________切割位点。 3　 有一定的___________，便于筛选。 4　 对受体细胞无害。 考点2 基因工程的过程 ★★★★★ （1）______________________ 方法 前提 ___________ 目的基因的完整序列已知 ___________ 基因序列未知 ___________ 目的基因的部分序列已知 ①PCR概念：是一项模拟细胞内____________过程的DNA体外扩增技术。 ②PCR意义：利用这项技术可由微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列。 ③PCR前提：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成______________。 ④PCR体系：缓冲液、DNA模板、四种dNTP（脱氧核苷三磷酸）、_____________酶、两种___________和双蒸水。 ⑤PCR基本程序： 基本程序 控制温度 变化 ___________ 95℃ 使待扩增双链DNA样品解旋，形成单链模板 ___________ 55～68℃ 使两条不同的引物分别与两条单链DNA模板结合 ___________ 75℃左右 DNA聚合酶催化从两条引物的一端以相反方向合成新的DNA子链 重复上述操作n次，理论上可从1分子双链DNA模板扩增至____________个分子。 （2）___________ 先“切割”和“连接”：将目的基因和合适的载体用相应的______________酶切割出黏性末端，然后加入______________酶将目的基因和载体连接为一体，形成含目的基因且能表达的表达载体。 表达载体构建需注意： ①若用同一种限制性内切核酸酶切割目的基因和载体，目的基因两侧的黏性末端相同，能以正反两种方式等概率接入载体；载体两端的黏性末端相同，可能______________，导致载体空载。 ②只要目的基因和载体的黏性末端_______________，并不必须用同一种酶切开。 ③用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会______________。 （3）_________________________________ 先“转化”后“扩增”：为了提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理，这一操作称为转化。转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 转化方法 实例 物理方法 电击法、____________________（动物细胞） 化学方法 ______________法 生物方法 ______________法、病毒感染 （4）_________________________________ （1）分子水平检测： · 检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上：采用___________技术，用___________素标记的目的基因作探针，与受体细胞的DNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已插入。 · 检测目的基因是否转录出mRNA：采用___________，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已转录。 · 检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用___________杂交技术，用相应的抗体与受体细胞提取的蛋白质进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因已翻译出蛋白质。 （2）个体水平鉴定： · 植物：抗虫或抗病的接种实验，观察受体生物是否表现出相应的___________特性；观察转基因植物的性状是否符合预期。 · 动物：观察转基因动物的性状是否符合预期，如转基因动物的生长速率、产奶量等。 特别提醒 筛选含目的基因的受体细胞常用抗药性筛选法和显色筛选法。 抗药性筛选法 实施的前提条件是载体DNA携带_____________的抗性基因（作为标记基因）。将转化扩增的细菌涂布在含有________________的固体平板上，理论上能长出的菌落便是转化成功的克隆 显色筛选法 有些质粒上含有标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。外源DNA插在标记基因内部，转化扩增的细菌涂布在同时含有抗生素和_____________的固体培养基上，在长出来的克隆中，______________色克隆即为含重组质粒的克隆 第3节 蛋白质工程是基因工程的延伸 蛋白质工程，又称第二代基因工程，是由________________或_______________基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程。包括_________________和_______________________两大方面。修饰改造天然蛋白一方面可实现_______________序列改造，优化其功能；另一方面还可以确定多肽链中某个______________残基在蛋白质结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象和生物功能之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。 考点1 定点突变 ★★★☆☆ 1、概念：在___________水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列。如突变型人胰岛素、新型L-天冬酰胺酶、优质t-PA突变蛋白等； 2、策略：从预期的___________出发→设计预期的蛋白质___________→推测应有的氨基酸___________→找到相对应的___________（基因），然后通过基因工程技术改造或合成基因，最终表达出符合要求的蛋白质。 考点2 定向进化 ★★★☆☆易错辨析：定点突变 ①　依照待突变位点旁侧序列设计一对含突变碱基的局部引物 P1 和 P2，同时设计合成突变基因(或片段)两端的全匹配引物 P3 和 P4； ②　P1和 P2 引物介导的 PCR 反应将产生缩短型含突变碱基的扩增产物； ③　P3 和 P4 引物的存在又引导其合成各自的互补链； ④　这两组缩短突变型的双链片段在随后的退火过程中，可形成交叉互补结构，并实现两端延伸，最终合成出突变型的全长基因或片段； ⑤　值得注意的是，由于 P3 和 P4 全匹配引物的存在,基于上述程序合成的 DNA 分子中含有高比例的非突变型基因或片段； ⑥　一般而言,高浓度的P1、P2 倾向于突变型扩增产物的富集;而高浓度的 P3、P4 则有利于扩增产物总产量的提高。 1、 概念：在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因； 2、 策略：利用易错PCR技术（即改变PCR过程中的温度），在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因。 热点问题分析 1、基因编辑技术的迭代升级（CRISPR/Cas系统的优化与新突破） 背景： CRISPR/Cas9基因编辑技术自问世以来持续迭代，近年来在编辑效率、精准度、递送方式等方面取得多项突破性进展，成为基因工程领域最受关注的研究方向。 考点预测： 1　 小型化CRISPR系统：研究发现，Alistipes sp. Cas12f（Al3Cas12f）体积仅为Cas9的三分之一，却能在人类细胞中实现超过50%的编辑效率，部分靶点甚至超过90%。这一突破解决了Cas9体积过大、难以装入AAV病毒载体进行体内递送的难题。 2　 高精度无痕编辑技术ESS-HDR：研究人员开发了ESS-HDR平台，通过共编辑必需基因提供内源性筛选，将HDR编辑效率提升7~41倍，实现了无需外源标记的无痕精准基因组修饰。 3　 肿瘤DNA选择性切割：ThermoCas9能够识别DNA甲基化模式，可精准区分肿瘤DNA与健康DNA，选择性切割肿瘤细胞DNA，为癌症靶向治疗开辟新方向。 4　 体内直接生成CAR-T细胞：利用“双粒子”递送系统，直接在患者体内改造T细胞为抗癌CAR-T细胞，绕过了传统CAR-T疗法体外培养的复杂流程，在动物模型中两周内几乎清除所有癌细胞。 热点问题分析 2、基因治疗与细胞治疗的临床转化突破 单克隆抗体在新冠病毒检测（抗原/抗体检测）、中和抗体治疗中发挥关键作用。制备过程中涉及动物细胞融合、杂交瘤细胞筛选、大规模培养等技术。 考点预测： 1　 FDA批准首款LAD-I基因疗法：2026年3月，FDA批准了Rocket Pharmaceuticals的Kresladi，用于治疗重度白细胞黏附缺陷症I型（LAD-I），通过提取患者自身造血干细胞、导入健康的ITGB2基因后回输，恢复免疫功能。 2　 3　 CAR-T细胞治疗适应证拓展：合源生物的纳基奥仑赛注射液获批治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤，成为国内覆盖白血病、淋巴瘤两大血液肿瘤适应证的CAR-T产品。通用型CAR-T、CAR-NK等创新技术路线持续突破。 4　 5　 基因治疗递送载体优化：重组腺相关病毒（rAAV）作为递送载体的基因治疗产品持续获批，在眼科疾病、神经肌肉疾病等领域取得进展。 一、基因表达载体的构建 下图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对（bp），质粒有5 369个碱基对（bp）。请据图回答问题： (1)质粒中“氨苄青霉素抗性基因”的作用是 。研究发现复制原点处的A和T特别多，有利于DNA复制时 过程的发生。 (2)限制酶BamHⅠ的识别序列和切割位点是5´-G↓GATCC-3´，该酶切形成的黏性末端是 。 (3)已知图中质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切割后进行电泳，出现了一条长度为5300 bp的DNA条带，则重组质粒的长度为 的DNA片段条带。 (4)过程①②用两种限制酶切割质粒和目的基因，与单一酶切相比，其优势有 。过程②通过PCR技术实现，进行PCR时，需要在两种引物的 端分别添加BamHⅠ和HindⅢ的识别序列。 (5)将重组质粒导入大肠杆菌前，要用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 ；进行筛选时，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、碳源、氮源、琼脂等物质外，还要分别添加 。 二、转基因抗盐马铃薯的培育 马铃薯块茎含有大量的淀粉，富含多种维生素和无机盐，我国已将马铃薯作为主粮产品进行产业化开发。下页左上图是转基因抗盐马铃薯的培育过程，请分析回答下列问题。    (1)上图构建基因表达载体时，最好选用限制酶 切割含目的基因的外源DNA和质粒，不能使用Smal切割的原因是 构建好的重组质粒在抗盐基因前要加上特殊的启动子，启动子是一段有特殊结构的 片段。 (2)将基因表达载体导入农杆菌中的T质粒上的T-DNA上的原因是 ，通过农杆菌的转化作用，使抗盐基因插入马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以 。 (3)从个体水平上检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功的方法是 。 学科网（北京）股份有限公司 $