3.2基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3-2 基因工程的基本操作程序 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 转基因抗虫棉 非转基因抗虫棉 你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 苏云金杆菌 产生 Bt基因 伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 表达 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，破坏鳞翅目昆虫的消化系统。 杀死棉铃虫 棉花细胞 导入 抗虫棉 培育 从社会中来 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 知识梳理 苏云金杆菌 与载体重组 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （一）筛选合适的目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 1.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能的基因中进行筛选 2.获取目的基因的方法： 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 人工化学合成 5 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （一）筛选合适的目的基因 某生物所有DNA 提取、切割后与载体连接 导入受体菌 基因文库 6 知识梳理 基因组文库 把某种生物的基因组DNA全部提取出来， 切成适当大小的片段， 分别与载体连接构建成重组DNA分子， 导入到适宜的宿主细胞，形成克隆。 汇集这些克隆，应包含基因组中的各种DNA序列。这样的克隆片段的总汇，叫基因组文库。 知识梳理 cDNA文库 将生物某一组织细胞中的全部mRNA分离出来作为模板， 在体外用逆转录酶合成与之互补的cDNA第一条链， 在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA的第二条链。 将双链cDNA分子连接到合适的载体上，转入到宿主细胞后形成的克隆的集合体。 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （一）筛选合适的目的基因 序列数据库（如GenBank） 序列比对工具（如BLAST） 公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 9 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （二）利用PCR获取和扩增目的基因 1. PCR （1）概念： PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 原理 操作环境 目的 优点： 10 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （二）利用PCR获取和扩增目的基因 1. PCR 1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖。 凯利·穆利斯（Kary Mullis） PCR扩增仪 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （二）利用PCR获取和扩增目的基因 1. PCR （2）基本条件： 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 模板 DNA母链 提供DNA复制的模板 原料 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 DNA 聚合酶 催化合成DNA子链 引物 2种引物（单链DNA，长度通常为20~30个核苷酸） 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（引物的设计需要已知目的基因的一段序列） 缓冲液 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此缓冲液中一般要添加Mg2+。 一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 12 知识梳理 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （二）利用PCR获取和扩增目的基因 1. PCR （3）过程： ①变性 ②复性 ③延伸 PCR的每个循环可以分为三个步骤： 变性（温度超过_____）：双链DNA受热变性，断开氢键，形成___________； 复性（温度下降到______左右）：___种引物通过______________与两条单链DNA结合，形成局部__________； 延伸（温度上升到_____左右）：以___________为模板，4种脱氧核苷酸在____________________ 的作用下，根据______________原则合成新的DNA链，该DNA链的延伸方向是_______________。 PCR过程中，每个循环得到的产物都将作为下一个循环的模板，因此经过n次循环，1个DNA分子将被扩增为_____个，成______形式扩增。 PCR过程完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 90℃ DNA单链 50℃ 2 碱基互补配对 DNA双链 72℃ DNA单链 耐高温的DNA聚合酶 碱基互补配对 5’端3’端 2n 指数 14 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （二）利用PCR获取和扩增目的基因 1. PCR （3）过程： ①变性 ②复性 ③延伸 15 知识梳理 知识梳理 采用PCR技术对一个DNA进行扩增， 1次循环后有 种DNA 2次循环后有 种DNA 3次循环后有 种DNA 4次循环后有 种DNA n次循环后有 种DNA(n≥3) 2 4 5 5 5 知识梳理 采用PCR技术对一个DNA进行扩增， n次循环共需 个引物（引物A、引物B)，第n次循环共需要 个引物 n次循环共需 个引物A或引物B n次循环后，含引物A或引物B的DNA分子有 个 n次循环后，只含引物A或引物B的DNA分子有 个 n次循环后，含引物A和引物B的DNA分子有 个 扩增n次后有 个等长的目的基因片段(n≥3) (2n-1)×2 2n-1 2n-1 1 2n-2 (2n - 2n-1)×2=2n 2n-2n 知识梳理 扩增次数 链型数量 0 1 2 3 4 …… n-1 n DNA总数 1 2 4 8 16 …… 2n-1 2n 长链数 2 2 2 2 2 …… 2 2 中链数 0 2 4 6 8 …… an-1 an=2n 短链数 0 0 2 8 22 …… bn-1 bn 目的基因数 0 0 0 2 8 …… bn-1 以长链为模板复制出的是中链 以中链为模板复制出的是短链 以短链为模板复制出的是短链 扩增n次后，除目的基因外，其他DNA分子均含中链(n≥3) 由an=an-1+2 可得出an=2n 由bn=2×bn-1+an-1=2×bn-1+2n-2可得出bn=2n+1-2n-2 目的基因数=DNA总数－中链数=2n－2n(n≥3) 目的基因数=bn-1=2n－2n 知识梳理 知识梳理 知识梳理 一、第一步：目的基因的筛选与获取 （二）利用PCR获取和扩增目的基因 1. PCR （4）应用： ①扩增目的基因 ②检测受体细胞中是否转入了目的基因步骤：根据目的基因的序列设计PCR引物，利用待检DNA为模板进行PCR，再通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物。 ③检测目的基因是否转录出了mRNA（需要先逆转录得到cDNA）。PCR技术具有简便、快速、灵敏的特点，如今已广泛地应用在医疗、法医鉴定、古生物学等行业。 22 PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 不同点 场所 解旋方式 酶 引物 温度 子链合成 结果 相同点 复制方式 基本条件 方向 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制（PCR扩增仪内） 主要细胞核内 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶、解旋酶 大量的DNA片段或目的基因 形成整个DNA分子 一小段RNA 一般为单链DNA片段 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行 一条连续，一条不连续 两条子链都是连续合成 模板、原料、引物、酶等 从5′端到3′端 半保留复制 知识梳理 复制原点： 标记基因： 目的基因： 启动子： 终止子： 知识梳理 二、第二步：基因表达载体的构建 基因表达载体的作用： ①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代； ②使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。 位于基因的下游，终止转录。 控制特定性状或表达特定产物 筛选重组DNA分子 （鉴别和筛选含有含有目的基因的受体细胞） DNA聚合酶结合位点，驱动DNA复制 位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。 24 知识梳理 二、第二步：基因表达载体的构建 ①用限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出末端。 ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 25 知识梳理 微专题：限制酶的选择 知识梳理 限制酶的选择：尽量避免单酶切 GGATCCAAGCTTGGG CCTAGGTTCGAACCC CCCAAGCTT GGGTTCGAA HindⅢ HindⅢ BamH Ⅰ Bt基因 问题：选用哪种限制酶同时切割Bt基因和pBI121（一种质粒）？ 5′ 5′ 3′ 3′ 微专题：限制酶的选择 知识梳理 微专题：限制酶的选择 AGCTT A G CCTAG Bt 双酶切优点： 利于载体与目的基因正确连接，避免二者反向连接 避免质粒自身环化或目的基因自身环化 大肠杆菌自身修复，比例很少 DNA连接酶 5′ 5′ Bt 只有正 向连接，没有反向连接 知识梳理 限制酶的选择：双酶切 微专题：限制酶的选择 知识梳理 二、第二步：基因表达载体的构建 ①用限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出末端。 ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 30 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 1、花粉管通道法 用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 （1）子房注射： （2）花柱滴加： 在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 （一）将目的基因导入植物细胞 31 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 2、农杆菌转化法 （1）转化： 指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 （2）农杆菌： ①一种土壤微生物，在自然条件下能感染 植物和 植物，而对大多数 植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的 可转移至被侵染的细胞，并将其上整合到 。 双子叶 祼子 T-DNA 该细胞的染色体DNA上 单子叶 （一）将目的基因导入植物细胞 32 冠瘿瘤 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 2、农杆菌转化法 （一）将目的基因导入植物细胞 知识梳理 Ti质粒 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 导入植物细胞 表现出新性状的植物 将目的基因插入染色体DNA中 T-DNA 组织培养 知识梳理 该过程经过____次拼接、____次导入？ (1)第一次拼接 ________________________________________ (2)第二次拼接 ______________________________________________________________________ (3)第一次导入 ____________________________________________________________________ (4)第二次导入 ______________________________________________________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） （3）具体操作方法： ①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________。 与农杆菌共培养 筛选转化细胞 再生成植株 ②可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得_______，再进行________、_________等。 花序 含有农杆菌的溶液 种子 筛选 鉴定 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 （一）将目的基因导入植物细胞 2、农杆菌转化法 （4）注意： 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 36 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 （二）将目的基因导动物细胞 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内） 获得具有新性状的动物 显微注射法 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 （三）将目的基因导微生物细胞 感受态法 使用Ca2+处理： 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 （三）将目的基因导微生物细胞 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸DNA分子 知识梳理 三、第三步：将目的基因导入受体细胞 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 是否扩增出目的基因 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 电泳操作 知识梳理 四、第四步：目的基因的检测与鉴定 1、分子水平的检测 （1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA。 方法1：PCR扩增 知识梳理 四、第四步：目的基因的检测与鉴定 基因探针：单链DNA或RNA片段，带有某种标记，能与目标DNA的一条链或RNA发生碱基互补配对。 方法2：DNA分子杂交技术 知识梳理 Southern杂交—检测受体细胞中是否有目的基因 Southern印迹杂交（DNA分子杂交技术）是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，用于分析DNA。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量或检测是否有目的基因【若DNA中含有目的基因，则变性处理的单链DNA会与DNA分子探针（DNA分子探针：根据目的基因碱基序列设计出的DNA单链，一般用放射性标记，结构简图与杂交原理如下图）互补配对，从而出现杂交带而显色】。 知识梳理 方法3：RNA分子杂交技术 Nouthern杂交—检测目的基因是否在受体细胞中转录出RNA Northern印迹杂交（RNA分子分子杂交）是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，用于分析RNA。 知识梳理 四、第四步：目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。 1、分子水平的检测 （1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA。 方法1：PCR扩增 （2）检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。 方法：用相应的抗体进行抗原—抗体杂交 2、个体水平的检测 方法2：DNA分子杂交技术 方法3：RNA分子杂交技术 基本思路：从转基因个体中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。 注意：转基因个体所提取的蛋白质作为抗原（被检测物）     人工制备的特异性标记抗体作为抗体（检测工具） 知识梳理 （2）检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。 方法：用相应的抗体进行抗原—抗体杂交 知识梳理 例如用抗原抗体杂交技术检测转基因抗虫棉中的Bt基因是否表达出Bt抗虫蛋白： 步骤：1、制备对应抗Bt抗虫蛋白抗体    2、抗原抗体反应 知识梳理 获取质粒、噬菌体等载体 筛选和获取目的基因 用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体 将含有目的基因的表达载体导入受体细胞 检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性 4.(2025安徽）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 典例 C 49 小结 基因表达载体的构建 基因表达载体的组成 目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点 构建流程 用限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段 DNA连接酶连接形成 重组DNA分子 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 目的基因的筛选与获取 方法 花粉管通道法、农杆菌转化法、显微注射法、感受态法（Ca2+） 包括 分子水平：检测DNA、mRNA、蛋白质 个体水平：是否出现相应的性状 获取方法 人工合成、PCR（常用）、构建基因文库 筛选方法 从已知结构和功能的基因中筛选 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ） 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 练习与应用 一、概念检测 ✔ D ✘ ✘ 51 1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 练习与应用 二、拓展应用 ①插入位点不确定性：可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入； ②插入的拷贝数也是随机的。 ③外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。 52 2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 练习与应用 二、拓展应用 （1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是 ，标记基因是 ，质粒pSYN12424的作用是 。 ctrⅠ基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 （2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？ 不能。 如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 53 典例 (3)请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开 54 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够 的仪器，一次PCR一般要经历____次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了____________________的原理。 DNA半保留复制 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 1.实验原理 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些___________会向着__________________的电极移动，这个过程就是________。（DNA分子因含有磷酸基团而带有负电荷） 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过____________________来鉴定。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、________________和_____等有关 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的 下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 1.实验原理 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 2.材料用具 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） 2.材料用具 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。 2.材料用具 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 （1）DNA片段的扩增 ①移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 ②离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） ③反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 预变性： 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 3.方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 （2）DNA片段的电泳鉴定 ①配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料（常见的如溴化乙锭即EB）混匀 ②制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 3.方法步骤 ③加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 ④电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1-5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑤观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 （2）DNA片段的电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 3.方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 条带模糊可能是凝胶浓度不当（片段小用高浓度凝胶，片段大用低浓度凝胶。片段越小，需用越高浓度的凝胶，如100bp片段用2%琼脂糖凝胶，1000bp 片段用1%琼脂糖凝胶）。 条带亮度反映 DNA 含量（含量越高越亮），与片段大小无关。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 知识梳理 4.注意事项 知识梳理 （1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ （2）你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有： 漏加了PCR的反应成分； 各反应成分的用量不当； PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体； 退火温度过低； DNA聚合酶的质量不好等。 5. 结果分析与评价 $