3.1重组DNA技术的基本工具（2课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

普通棉花 转基因抗虫棉 苏云金杆菌 毒蛋白基因 毒蛋白 杀死害虫 第3章 基因工程 　　指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。 【归纳定义】工程别名： 操作对象： 操作水平： 工程实质： DNA重组技术 基因 DNA分子水平 基因重组 【基因工程的定义】 科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？ 3 1.基因是什么？ 2.基因的功能是什么？ 基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状。 转录 DNA mRNA 蛋白质 翻译 （RNA聚合酶） ——体现相关的生物性状 基因是有遗传效应的DNA片段。 【知识回顾——基因】 4 板书画图 基因是有遗传效应的DNA片段。 ①组成元素:　　　　　　　 ② DNA中文全称:　　　　　　　 ③基本单位:　　　　　　　　　 脱氧核糖核酸 C H O N P 脱氧核糖核苷酸 = 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 1′ 4′ 3′ 2′ 5′ A T G C 脱氧核苷酸 (4种) 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 【知识回顾——DNA】 脱氧 核糖 A 磷酸 脱氧 核糖 G 磷酸 脱氧 核糖 T 磷酸 T 磷酸 脱氧 核糖 C 磷酸 脱氧 核糖 A 磷酸 脱氧 核糖 氢键 磷酸二酯键 脱氧核苷酸如何链接成脱氧核苷酸链的呢？ 【知识回顾——DNA】 双螺旋结构 【知识回顾——DNA】 DNA的结构特点： 5’ 3’ 3’ 5’ ② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。 ③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。 ①DNA是由两条单链组成的，这两条链按 方式盘旋成双螺旋结构。 反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 基本骨架 氢键 碱基互补配对原则 【知识回顾——DNA】 ①DNA分子的两条链反向平行盘旋成双螺旋结构。 ②脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。 ③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，且遵循碱基互补配对原则。 …… ATGCCGTGGAATTCC …… …… TACGGCACCTTAAGG …… ① ② ①磷酸二酯键 ②氢键 简图： 【知识回顾——DNA】 转移的基础 1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） 表达的基础 2.都遵循碱基互补配对原则 3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 1.基因是控制生物性状的结构与功能单位 2.遗传信息的传递都遵循中心法则 3.生物界几乎共用一套遗传密码 接 剪 运 基因工程诞生的理论基础 基因在空间上转移并成功表达 10 3.1 重组DNA技术的基本工具 12 01 1、来源： 2、种类： 主要来自原核生物 3、特点： 数千种 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。 旁栏思考 ? ① ② ③ 一、“分子手术刀”--限制性内切核酸酶 13 01 　 黏性末端　　　　 黏性末端 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 EcoRI 限制酶的切割： 一、“分子手术刀”--限制性内切核酸酶 EcoR I (在G与A之间切割) Sma I (在G与C之间切割) 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 黏性末端 平末端 4、结果： 产生黏性末端或平末端 一、“分子手术刀”--限制性内切核酸酶 （1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？ （2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。 实践活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作 5’... G 3’... CTTAA AATTC...3’ G...5’ AATTC ...... B t ...... G G .....基因......CTTAA 目的基因 要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。 一、“分子手术刀”--限制性内切核酸酶 【思考·讨论】 不能 17 2.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 提示　如图 同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。 BamHⅠ形成的黏性末端 EcoRⅠ 形成的黏性末端 Hind Ⅲ 形成的黏性末端 Bgl Ⅱ 形成的黏性末端 GATC AATT AGCT GATC 【思考·讨论】 【思考·讨论】 18 3.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 提示　限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。 三 4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 5.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 提示　含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 【思考·讨论】 02 什么样的末端才能连接起来？ 1. 作用： 2. 种类： ⑴ E·coli DNA连接酶 ⑵ T4 DNA连接酶 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 （1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接黏性末端 二、“分子缝合针”----DNA连接酶 20 02 （2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率高 二、“分子缝合针”----DNA连接酶 DNA聚合酶和DNA连接酶有什么异同？ 种类 DNA聚合酶 DNA连接酶 不同点 作用实质 催化 加到已有脱氧核苷酸片段上，形成 。 催化 之间形成 键 作用结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子 模板 需要 不需要 相同点 【思考】DNA聚合酶与DNA连接酶 单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 两个DNA片段 磷酸二酯 ①化学本质都是蛋白质；②都是催化形成磷酸二酯键 4.几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 二、“分子缝合针”----DNA连接酶 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 随堂练习 In-class practice 2.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（ ） A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 D 随堂练习 In-class practice 3.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 C 随堂练习 In-class practice 26 03 质粒 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制. 1.作用： 动植物病毒 噬菌体 2.种类： 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 三、“分子运输车”----基因进入细胞的载体 27 03 大肠杆菌及质粒结构模式图 3、运载体需具备的条件 （1）载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？ （2）要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ （3）我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 进入受体细胞后能进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。 具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 （4）对受体细胞无害 三、“分子运输车”----基因进入细胞的载体 28 质粒 人的DNA分子 用EcoRⅠ限制酶切割 用EcoRⅠ限制酶切割 用DNA连接酶粘合 计划让大肠杆菌表达人类生长激素？ 视频演示：重组DNA分子 限制酶 DNA连接酶 载体 ①有一个至多个限制酶切割位点； ②有特殊的标记基因； ③能自我复制或能整合到宿主DNA上； ④对受体细胞无害； s 质粒、噬菌体、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 识别特定核苷酸序列 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位： 种类： 作用： 【小结】 把两条双链DNA片段拼接起来 磷酸二酯键 E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 31 04 实验原理 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定 32 04 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） 1.选材： 2.试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 材料用具 研磨液、二苯胺的配制方法 课本P117 【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定 33 04 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 2.去除杂质—— 3.DNA的析出—— 1.破碎细胞—— 洋葱 研磨液 上清液 上清液 预冷的酒精 白色丝状物 方法步骤 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 析出DNA 【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定 34 04 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 4.DNA的鉴定—— 二苯胺 2mol/L的NaCl 方法步骤 空白对照组： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 思考：如何评价结果？ ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定 视频演示：DNA的粗提取与鉴定 （1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ （3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？ 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。 加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。 思考与讨论： 如果是猪肝呢？ 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定 1、操作提示 (1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止__ 。 (2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 ，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 DNA分子的断裂 血液凝固 2、关键点拨 1.利用动物细胞提取DNA时，破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可 使其吸水涨破。 2.不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 细胞核。 3.提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精 更佳。 直接 无 提纯效果 【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定 Lavf59.16.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $