【汇总版必背清单】期中考前核心必背（期中知识清单）高二生物下学期人教版

高二下学期期中汇总版核心必备速记清单 第1章 发酵工程 【考点01】传统发酵技术的应用★★★★☆ 一、发酵与传统发酵技术 1．发酵的历史：约9000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、水果等发酵成含酒精的饮料。 2.1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。 3.腐乳的发酵参与发酵的微生物：多种微生物，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。 4.腐乳的发酵发酵原理：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸,味道鲜美，易于消化吸收。 5.发酵的概念：人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 6.发酵原理：不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力，因此利用它们既可以生产出人们所需要的多种产物。 7.传统发酵技术的概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。 8.使用酵母制作馒头属于传统发酵技术吗？ 不属于，使用前一次发酵保存下来的面团进行的才算；例如直接利用空气中毛霉孢子制作腐乳属于传统发酵技术，若直接接种毛霉，则不属于。 9.传统发酵技术的特点:以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。 10.传统发酵技术的主要食品:有腐乳、酱、酱油、醋、泡菜和豆豉。 二、尝试制作传统发酵食品 1．乳酸发酵微生物----乳酸菌的特点：厌氧细菌，原核生物，以二分裂方式增殖，代谢类型为异养厌氧型，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，反应简式：C6H12O6 酶→2C3H6O3(乳酸)＋能量。 2.乳酸发酵的生产应用：用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。 3.乳酸菌的分布空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内。 4.常见的乳酸类型乳酸链球菌和乳酸杆菌。 5.酒精发酵微生物-----酵母菌的特点：单细胞真菌，真核生物，兼性厌氧微生物，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源。，在无氧条件下能进行酒精发酵，发酵原理（反应简式）为C6H12O6 酶→2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。温度是影响酵母菌生长的重要因素；酿酒酵母的最适生长温度约为为28℃。 6.酒精发酵生产应用：用于酿酒、制作馒头和面包等。 7.醋酸发酵微生物—醋酸菌的代谢特点：好氧细菌，代谢类型为异养需氧型，当O2、糖源都充足时能将糖分解成醋酸，反应简式为C6H12O6＋2O2 酶→2CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反应简式为C2H5OH＋O2 酶→CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量。最适生长温度为30～35_℃。 8.醋酸发酵生产应用：用于制作各种风味的醋。 9.制作泡菜 （1）发酵原理: ①利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵； ②发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量百分比为0.4%-0.8%时，泡菜的口味、品质最佳。 （2）制作泡菜发酵条件:适宜的温度、严格控制厌氧条件。 （3）制作泡菜方法步骤:配制盐水→蔬菜装坛→加盐水→封坛发酵 ①配制盐水:用清水和食盐配制质量百分比为5%~20%的盐水,并将盐水煮沸,冷却待用。 ②蔬菜装坛:将新鲜蔬菜洗净,切成块状或条状,混合均匀,晾干后装坛,装至半坛时,放入蒜瓣、生姜、及ITA香辛料,继续装至八成满。 ③加盐水:将冷却好的盐水缓缓倒入坛中,使盐水没过全部菜料。 ④封坛发酵:盖好坛盖,向坛盖边沿的水槽中注满水,发酵过程中注意补充水,根据室内温度控制发酵时间。 （2）制作泡菜实验分析 ①盐的作用：调味，抑制其他微生物生长及调味。 ②盐水浓度为质量百分比为5%-20%。 盐水浓度要适宜的原因：盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳酸菌死亡；过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。 ③盐水煮沸的目的：杀菌，去除水中的溶解氧。 ④盐水冷却后使用的目的：为了不影响乳酸菌的生命活动（为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响）。 ⑤在冷却后的盐水中可加入少量“陈菜泡液”，目的是增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间。 ⑥泡菜坛子使用之前要检查密封性的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件，利于乳酸菌发酵。 ⑦用水密封泡菜坛的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件。 ⑧泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用？  不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌。 （4）蔬菜应新鲜的原因：若不新鲜，蔬菜中的亚硝酸盐含量会升高。 （5）泡菜坛应装至八成满？为什么？ 防止由于产生CO2而导致发酵液溢出坛外（初期大肠杆菌、酵母菌会产生） 防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂。 （6）为什么含有抗生素的牛奶不易发酵为酸奶？ 牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。 （7）发酵中期时，由于前期乳酸的积累，pH下降，嫌气状态形成，乳酸杆菌进行活跃的同型乳酸发酵（发酵产物只有乳酸或达到80%以上），大肠杆菌、酵母菌等微生物的活动受到抑制。试分析这种微生物消长现象的原因（为什么乳酸菌会逐渐成为优势菌种）：乳酸菌比其他种类微生物更耐酸；发酵中期pH下降，导致其他种类的微生物的生命活动受到抑制。 （8）说出乳酸发酵过程中下列变化 乳酸菌数量变化先增多后减少； 乳酸含量变化持续增多，最后保持稳定； 亚硝酸盐含量变化先增多后减少，最后保持稳定。 （9）泡菜制作过程中，各阶段菌种变化： ①发酵初期：主要是大肠杆菌、酵母菌活跃，消耗大量氧气，使坛内形成无氧环境，会使好氧菌生命活动逐渐被抑制。 ②发酵中期（风味最佳）：乳酸菌活跃使乳酸不断积累，pH下降，会使不耐酸菌被抑制。 ③发酵后期：乳酸继续增加，到一定程度后会使乳酸菌的生长繁殖被抑制。 （10）泡菜坛的发酵液表面会长出一层白膜，这层白膜是乳酸菌吗？ 不是，是酵母菌繁殖形成的，因为表面氧气含量丰富，不适于乳酸菌生长。 （11）进一步探究——亚硝酸盐： 泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生；膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡；亚硝酸盐为强氧化剂，能够把血液中的低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而导致缺氧性中毒症状；膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”形式随尿排出，只有在特定的条件下(如适宜的 pH、温度和一定的微生物作用)，才会转变成致癌物──亚硝胺。（霉变的食品亚硝胺可增至数十倍至数百倍）。 （12）拓展应用： 某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加人一些“陈泡菜水”；在用质量百分比为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。请你帮他分析相关问题。 ①据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适?为什么? 应该在11天后食用比较合适；因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平。 ②他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么? 可能是食盐浓度过高，抑制乳酸菌生长，产生乳酸较少，导致泡菜未能正常发酵（也可能是由于温度较低）。 ③加入“陈泡菜水”的目的是什么？ “陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌。 ④泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素哪些？ 腌制方法、食盐用量、腌制时间长短、温度高低。泡菜中亚硝酸盐的含量与腌制时间、腌制温度和有关。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，易造成细菌大量繁殖，使亚硝酸盐含量增加。 10.制作果酒发酵原理： (1)许多新鲜水果的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌； (2)在酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒；（通过有氧呼吸大量繁殖，通过无氧呼吸进行酒精发酵产酒精） (3)相关反应式C6H12O6＋6O2＋6HO2 酶→6CO2＋12HO2＋能量 C6H12O6 酶→2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量 11.制作果酒发酵条件： (1)温度——将温度控制在18-30℃进行发酵； (2)氧气含量a.氧气充足的情况下，大量繁殖；b.无氧条件下，进行酒精发酵. 12.制作果酒方法步骤:器具消毒→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵 ①器具消毒:将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净,用体积分数为70%的酒精消毒,晾干备用。 ②冲洗:新鲜葡萄用清水冲洗1~2次,再去除枝梗和腐烂的的籽粒,沥干。 ③榨汁:用榨汁机榨取葡萄汁,装人发酵瓶中,留大约1/3的空间,盖好瓶盖。 ④酒精发酵:温度控制在18~30℃,每隔12h左右将瓶盖拧松一次,但不要打开瓶盖。发酵时间为10~12 d。 ⑤醋酸发酵:葡萄酒制作完成后,打开瓶盖,盖上一层纱布,进行葡萄醋发酵,温度为30~35 ℃,时间为7~8 d。 13.制作果酒实验分析: (1)用体积分数为70%的酒精给发酵瓶、榨汁机消毒。 (2)冲洗葡萄的目的：去除表面灰尘、污物。 (3)冲洗1-2次即可，能否连续冲洗？为什么？不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少。 (4)去梗之前冲洗还是去梗之后冲洗？之前。 为什么？避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会。 (5)葡萄汁装入发酵瓶时，能装满吗？不能，要留约1/3的空间。 为什么？ a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵；b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。 (6)每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的：排出气体（CO2）。 (7)能全部打开吗？不能为什么？防止杂菌污染。 (8)果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？ 发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。 (9)在制作果酒过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？ 还有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能将糖分解为甘油、酒石酸等，从而使果酒变质，而在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇转化为乙醛进而转化为醋酸。可以通过调节发酵的温度、pH等来控制乳酸菌含量；可以通过减少O2含量、调节发酵温度、pH来控制醋酸菌含量。 （10）如何检测果酒的发酵情况:闻、品尝、用酸性重铬酸钾溶液检测（橙色→灰绿色）。 （11）葡萄酒呈现深红色的原因：在发酵过程中，红葡萄皮的色素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红色。 （12）果酒制作中，酒精含量达一定程度后不变，CO 2 也不产生，原因可能是原料耗尽或高浓度的酒精抑制了酵母菌细胞呼吸。 14.制作果醋参与发酵的主要微生物及来源：空气中的醋酸菌。 15.制作果醋的发酵原理： （1）在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用可以进一步发酵成果醋； （2）当糖源、氧气充足时，醋酸菌还可以直接将糖分解为醋酸； （3）相关反应式：C2H5OH＋O2 酶→CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量 C6H12O6＋2O2 酶→2CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量 16.制作果醋的发酵条件： （1）温度——发酵温度为30-35℃。 （2）氧气含量——氧气供应充足。 17.制作果醋的步骤：果酒制作→打开瓶盖，盖上纱布→果醋检测 18.制作果醋的实验分析 （1）在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？ 随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低，不会继续发酵。 （2）醋酸菌从何而来？ 打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入果酒发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件（不能利用乙醇）而不能繁殖。 （3）采用什么措施可以加快果醋的制作？ 在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌；或者买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜（即醋酸菌膜），用这层薄膜进行接种亦可。 （4）在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？ a.在葡萄酒的制作过程中，发酵液会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生了CO2； b.开始发酵后，CO2产生越来越多，会使发酵液出现“沸腾”现象，在发酵的10天后，这种现象最明显； c.发酵过程产热，会使发酵液温度上升，应注意控温； d.发酵过程中，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色； e.果醋发酵完成后，发酵液的液面上会出现一层菌膜，即醋酸菌膜。 （5）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止发酵液被污染？ a.发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用； b.处理葡萄时应先冲洗再去除枝梗； c.排气时只需拧松瓶盖，不要打开瓶盖。 （6）如何检测果醋的发酵情况？ 闻、品尝、使用pH试纸检测检测和比较发酵前后的pH值、观察醋酸菌膜是否形成。 19.果酒和果醋制作的发酵装置（见右图） （1）充气口：在酒精发酵时应关闭；在醋酸发酵时连接充气泵泵入无菌空气。 （2）排气口：酒精发酵时排出酵母菌产生的 CO 2 ；醋酸发酵时排出剩余的空气、 CO 2。 （3）出料口：取样、监测。 （4）排气口连接长而弯曲的胶管目的是防止空气中微生物的污染。 【考点02】微生物的培养技术与应用★★★★★ 一、微生物的基本培养技术 1.防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提（即发酵工程的重要基础）。 2.在实验室培养微生物：一方面：为微生物提供合适的营养和环境条件（培养基）。另一方面：要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来（无菌技术）。 （一）培养基的配制 1．培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 2.培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 3．培养基的分类（按照物理性质分类） （1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态。 用途：扩大培养获得大量菌种、常用于工业生产。目的是增加目的菌的数量。 （2）固体培养基：含凝固剂（如琼脂），呈固体状态。 用途：分离、计数、鉴定等。 4.如何将液体培养基制成固体培养基？加入适量琼脂。 5.微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。 6.实验室中最常用的培养基之一：琼脂固体培养基。 7.微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长，可以形成菌落。 8.培养基的基本成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。如培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌(真菌)时需将培养基的 pH 调至酸性，培养细菌时需将 pH 调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。 9.牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，蛋白胨提供的主要营养为氮源、维生素。牛肉膏提供的主要营养为碳源、磷酸盐、维生素。 10.为什么培养基需要氮源？ 培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。 11.含C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。 12.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。 13.能否根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型？ 可以，例如自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源。 14.无机氮源能给自养型微生物提供能源吗？ 可以，例如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。 15.无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，还能有什么功能？ 有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌） 有些无机盐离子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶） 16.是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源？ 不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。 （二）无菌技术 1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。无菌技术应围绕如何避免杂菌的污染展开。 无菌技术主要包括消毒和灭菌。 2.无菌技术（消毒和灭菌）工作主要包括两个方面： (1)对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。常用的消毒方法有：煮沸消毒、巴氏消毒。 (2)对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。灭菌的方法有：湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌。 3.做好消毒灭菌工作后，要注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。 4.为避免周围环境中微生物的污染，应如何操作？在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。 5.无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。 6.消毒: (1)概念：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 (2)方法: a.日常生活中经常用到煮沸消毒法，操作方法：100 ℃煮沸5～6min； b.对于一些不耐高温的液体如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s-1min； c.生物活体、水源等还可使用化学药物进行消毒，操作方法：用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等； d.接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射，操作方法：紫外线照射30min。 7.灭菌: （1）概念：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 （2）方法: a.培养基等一般用湿热灭菌法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，操作方法：高压蒸汽灭菌锅内,100kPa，温度121℃,15～30min。 b.耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)、金属用具等，可以用干热灭菌法，操作方法：物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h。 c.接种过程中，微生物的接种工具、试管口、瓶口通过灼烧灭菌法来灭菌，操作方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。 8.使用高压蒸汽灭菌锅时，能不能直接密封升温？ 不能，一定要将锅内冷空气彻底排出，才能密封升温，否则，可能引起锅内压力达到设定值而温度不能达到要求。 9.高压蒸汽灭菌锅灭菌完毕后，可以立刻放气减压吗？ 不能，若立即放气减压瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢，甚至导致容器爆裂（须待灭菌锅内压力降至与大气压相等后才可打开排气阀开盖）。 10.酒精消毒的最适范围是体积分数为70%-75%的酒精。 原因：酒精浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，从而凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中，酒精浓度过低时，杀菌能力减弱。 11.用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果？ 照射前，适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。 12.高压蒸汽灭菌使用的仪器为高压蒸汽灭菌锅，以水蒸气为介质，灭菌条件为压力200kPa、温度121℃、时间15-30min。 13.干热灭菌法使用的仪器为干热灭菌箱，以热空气为介质，灭菌条件为温度160-170℃、时间2-3h。 14.灼烧灭菌是将需灭菌的用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，优点是可以迅速彻底地灭菌。 15.培养基的灭菌方法高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）； 培养皿的灭菌方法干热灭菌（也可用湿热灭菌法）。 （三）微生物的纯培养 1．纯培养概念：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。 2.纯培养物概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 3.获得纯培养物的过程就是纯培养。 4.微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。 5.微生物纯培养的原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。 6.酵母菌的纯培养:用马铃薯琼脂培养基培养酵母菌。 (1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。一个单菌落即一个种群。菌落通常可以用来作为鉴定菌种的重要依据。获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。 (2)酵母菌的纯培养:制备培养基、接种和分离酵母菌、培养酵母菌。 制备培养基的步骤：配制培养基→灭菌→倒平板。 ①配制培养基：称取去皮的马铃薯200g,切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 ②将50ml培养基用玻棒转移至锥形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。 ③倒平板时使培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。 a.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？ 琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，温度过高，太烫，不易操作；若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。 b.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？因为酒精灯火焰附近存在着无菌区域,避免避免周围环境中微生物的污染。 拔掉瓶塞后为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 c.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？不能。为什么？因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 d.倒平板时，能将培养皿的皿盖拿下来放在一边吗？不能。 应如何做？用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙。 为什么？防止杂菌污染培养基。 f.刚倒完平板，可以直接倒置吗？不能，应等培养基冷却凝固。 g.培养基冷凝后，为什么要将培养皿倒过来放置（倒置）？ 既可防止皿盖上冷凝的水滴滴人培养基造成污染;又可避免培养基表面的水分过快蒸发。 接种和分离酵母菌: ①通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作将聚集的菌种逐步稀释分散到培养及表面。经数次划线后培养，可以分离得到单个菌落。 ②平板划线法接种、划线的工具接种环。 ③连续划线的目的：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。 ④平板划线法过程中，接种环蘸了1次菌液；若分五个区划线，则接种环共需灼烧6次；灼烧次数＝划线次数＋1。 ⑤灼烧后的接种环可以直接划线吗？不可以。应如何操作？待接种环冷却后再划线。目的？避免温度过高杀死菌种。 ⑥从第二次划线开始，都应从上一次划线的末端开始往下一区域划线。 ⑦整个操作中灼烧接种环的不同目的： 第一次灼烧（取菌种前）：杀死接种环上原有微生物，避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。 以后每次划线前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。 划线结束灼烧：及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。 ⑧除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？ 将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经数次划线后培养，可以分离得到单菌落（使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落）。 ⑨为什么划线时要注意不能划破培养基？ a.一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； b.存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 ⑩用平板划线法接种划线某个平板培养后，第一区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他环线有菌落。造成划线无菌落的原因：a.接种环未冷却。b.划线未从第一区域末端开始划线（第二区域的第一条线未接到第一区域末端）。 培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板（一般做三组，目的：平行重复实验）和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48h。 7.如何确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？ 将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底(该操作也可确定培养基灭菌是否彻底）。 8.未接种的培养基直接培养起什么作用？ 做空白对照，判断培养基是否被污染，判断培养基灭菌是否彻底；若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。 9.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。 10.注意： （1）在实验室中，切不可饮食，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染； （2）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 二、微生物的选择培养和计数 （一）选择培养基 1.寻找耐高温DNA聚合酶的思路是什么？根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 2．水生栖热菌的筛选：水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 3.从环境中获得某种特定种类的微生物的原理：某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，就可以从特定的环境中筛选得到特定种类的微生物。 （1）在被石油污染的土壤中可以筛选石油分解微生物。 （2）在冰川冻土层可以筛选耐寒微生物。 （3）漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？不是。 4.实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 5．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 6.选择培养基三种筛选方法： （1）利用营养缺陷进行选择培养。某种营养缺陷的微生物不能正常生长 （2）利用添加某种化学物质进行选择培养。 *添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡 （3）利用改变培养条件进行选择培养。*调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长 7.选择培养基实例 （1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长。 原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用。 配制：使用加入青霉素的培养基。 （2）目的：分离固氮菌。 原理：固氮微生物能利用空气中的氮气。 配制：使用不加氮源（以N2为氮源）的培养基。 （3）目的：分离自养型微生物。 原理：自养型微生物能利用无机碳源。 配制：使用不加有机碳源（以CO2为碳源）的培养基。 （4）目的：分离耐酸菌。 原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长。 配制：使用将pH调至酸性的培养基。 8.选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或对其某一化学、物理因素的抗性不同而制备选择培养基。 9.如何设计培养基筛选分解尿素的细菌？ 以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 10.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 11.在选择培养基上生长的一定是所选择的目的菌吗？ 不一定，有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。 12.怎么证明一个选择培养基具有选择性？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 13.尿素可为尿素分解菌提供氮源的原因？尿素可为尿素分解菌提供碳源吗？为什么？ 尿素分解菌能合成脲酶，脲酶能催化分解尿素产生NH3和CO2，NH3可作为尿素分解菌的氮源。但不能作为碳源，因为尿素分解菌不是自养生物，不能利用CO2作为氮源。 （二）微生物的选择培养 1.稀释涂布平板法（活菌计数法），稀释涂布平板法基础操作包括：梯度稀释和涂布平板。 2.稀释涂布平板法方法概述：由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 3.平板划线法的作用：分离纯化微生物。稀释涂布平板法的作用：分离纯化微生物、统计样品中活菌的数目。 4.分离纯化微生物具体含义：将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到单菌落（即纯培养物）。 5.③号试管稀释倍数为104。 6．分解尿素的细菌的分离：分解尿素的细菌能合成脲酶，该酶能催化尿素分解产生NH3，以此作为细菌生长的氮源。要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方设计思路是培养基中除含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，只含有尿素一种氮源。 7．稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌操作过程如下： 采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面（多了不易被吸收）→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 8.注意： ①在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多（0.1ml）的原因是培养基表面的菌菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。 梯度稀释原因：培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落；目的：将聚集的菌体分散开，以便获得单菌落。 ②梯度稀释中，每次取样前需用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。 ③涂布器浸在酒精中的主要目的是为涂布器的灼烧灭菌做准备；为保证菌液均匀分布，应在涂布时转动培养皿。 ④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放到盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 ⑤a.以上操作均在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染。 b.若要分离并统计活菌数，应选用稀释涂布平板法。 c.平板划线法不能用于活菌计数的原因是菌落连成片，无法计数。 （三）微生物的数量测定 1.微生物的数量测定方法：间接计数法——稀释涂布平板法；直接计数法——显微镜直接计数法、滤膜法。 2．稀释涂布平板法原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 3.样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。 4.稀释涂布平板法的计数原则： （1）选择菌落数为30-300的平板计数； （2）同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 5.稀释涂布平板法结果分析： （1）统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 （2）统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 6.C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M代表稀释倍数；则每g样品中的细菌数=（C÷V）×M。 7.将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。 8.恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 9．显微镜直接计数法原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 10.显微直接计数法使用的计数工具： 血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等计数； 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 11.显微直接计数法优点：快速直观。 12.显微直接计数法缺点： （1）统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。原因：不能区分死菌与活菌。 （2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。 二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.实验原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 2.实验步骤： 土壤取样→制备培养基→样品的稀释与涂布平板→微生物的培养与观察。 3.土壤取样： （1）取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。 原因：细菌适宜在该环境中生长。 （2）取样过程：取样时一般要铲去表层土。原因：细菌绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。 （3）注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。 4.制备培养基: （1）作对照：牛肉膏蛋白胨培养基。作用：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 （2）实验组：选择培养基。 特点：以尿素为唯一氮源。 KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供无机盐、调节pH。尿素作用：氮源。 葡萄糖作用：碳源。 5.样品的稀释与涂布平板: (1)1g土的体积约为_1_ml ，10g土加入到90ml无菌水，相当于稀释了10倍。 假如104稀释度下涂布的3个平板的菌落数分别为42、40和38，则1ml稀释液中的菌株数为400，104稀释度的试管中的菌株数为4×103，102稀释度的试管中的菌株数为4×105，101稀释度的锥形瓶中的菌株数为4×107。101稀释度的锥形瓶中的菌株来自于10g土，所以1g土中的菌株数为4×106。 （2）每个浓度至少设置4个平板。 1.2.3平板是实验组，为选择培养基，做3组的目的平行重复。4是对照组，为牛肉膏蛋白胨培养基。 （3）整个实验还需要设置2个平板，是哪两个？不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 目的：用来判断培养基中是否含有杂菌（培养基灭菌是否合格）。 （4）为获得菌落数在30-300之间适于计数的平板，测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。 （5）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样才能保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养（例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养）。 （6）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记，例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。 （7）标记时注意标记在皿底，不能标记在皿盖。 6.微生物的培养与观察 （1）培养条件：细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。 （2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 （3）为什么选取菌落数目稳定时的记录作为结果？防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 （4）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 7.结果分析 （1）说出下列各组培养基的目的： 3组接种的选择培养基：对土壤中分解尿素的细菌分离和计。 1组接种的牛肉膏蛋白胨培养基：判断选择培养基是否具有选择作用。 不接种的选择培养基：验证选择培养基中是否含有杂菌。 不接种的牛肉膏蛋白胨培养基：验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。 （2）说出以下现象对应的结果分析： 现象 分析 未涂布培养基上无菌落生长 培养基未被杂菌污染 未涂布培养基上有菌落生长 培养基被杂菌污染 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目 选择培养基具有选择作用 （3）样品稀释操作成功的标志是什么？得到2个或2个以上菌落数在30-300的平板。 （4）得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定。 进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定 1.原理:分解尿素细菌合成的脲酶将尿素分解为CO2和NH3，NH3溶于水会电离出NH4+和OH-，使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌； 2.方法: 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 液体培养基可以直接看液体的变色情况； 固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带； 红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 拓展应用----纤维素分解菌的分离 纤维素分解菌的筛选方法是刚果红染色法。刚果红(简称 CR)是一种染料，能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，透明圈的大小可反应细菌降解纤维素的能力。 实验流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。 选择纤维素含量丰富的土壤环境采集土样。 【考点03】发酵工程及其应用★★★☆☆ 一、发酵工程的基本环节 1.发酵工程的基本环节：菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵罐内发酵，产品分离、提纯等方面。 (1)选育菌种 ①选育菌种目的：获得性状优良的菌种。 ②选育方法（菌种来源）：可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。 ③)菌种选育的重要性（意义）:优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。 （2）扩大培养： ①目的：获得更多的菌种。 ②原因：工业发酵罐的体积一般较大，因此，需要接入的菌种总体积大（数目多）。 ③扩大培养的培养基：一般为液体培养基。 （3）配制培养基的要求： ①在菌种确定之后，（结合菌种代谢特点）选择原料制备培养基。 ②在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。（即不断优化培养基） （4）灭菌 ①目的：避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量。 ②培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌原因：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。 （4）接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵罐中。大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制。 （5）发酵罐内发酵 ①发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节。 ②发酵罐内发酵严格控制发酵条件的原因： a.环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成； b.严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态。 ③发酵罐内发酵要求：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。 ④不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵 a.在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸。 b.在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺。 ⑤发酵罐结构和用途 a.培养物或营养物质的加入口、放料管、阀门：制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养。 b.空气入口：控制溶解氧。 c.观察孔、取样管、pH计、生物传感器装置、温度传感器和控制装置：通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程，取样管处抽取样品进一步检测。 d.冷却水进入口、冷却水排出口：通过控制冷水流速调节罐温。 e.排气管：调节罐压。 f.电动机、搅拌叶轮：电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热。 ⑥现代发酵工程使用的发酵罐的优点：均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶氧量、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制，还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。 (6)产品的分离、提纯 ①产品的分离、提纯目的：获得产品。 ②产品的两种形式：微生物细胞本身、代谢物。 ③分离、提纯产物采取手段：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。 2.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用菌时，需要考虑哪些因素？ （1）在低成本的培养基上能迅速生长繁殖。 （2）生产所需代谢物的产量高。 （3）发酵条件易控制。 （4）菌种不易变异，退化等。 3.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？ （1）反复试验确定培养基的配方； （2）对培养基和发酵设备进行严格的灭菌； （3）随时检测培养液中微生物的数量、产物浓度等； （4）及时添加必需的营养组分； （5）严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件，使用计算机控制系统对各种条件进行监测和控制，以及反馈控制。 4.在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处？ 传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物，很多时候不会再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离提纯产物。发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、吸附或离子交换等方法；在进一步纯化阶段，会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格后才能成为正式产品。 5.在进行发酵生产时,排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么？ 不能；因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废气培养液进行二次清洁或灭菌处理。 6.注意： （1）谷氨酸发酵常用菌种为谷氨酸棒状杆菌； （2）谷氨酸棒状杆菌的代谢类型为异养需氧型，其与有氧呼吸有关的酶主要存在于细胞膜上； （3）C:N的数值也会影响谷氨酸发酵过程： C:N=4:1时，菌体大量繁殖，谷氨酸产生量较少； C:N=3:1时，菌体繁殖受抑制，谷氨酸产生量较多。 二、发酵工程的应用 1.发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理。等特点，在食品工业、医药工业、农牧业等等许多领域得到广泛应用。 2.食品工业是微生物最早开发和应用的领域。一直以来，与发酵有关的食品工业的产量和产值都居于发酵工业的首位。 3.发酵工程在食品工业的应用包括： (1)生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。 (2)生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。常见的食品添加剂种类：酸度调节剂、增味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂。食品添加剂优点：增加食物的营养，改善食品的口味、色泽和品质，延长食品的保存期。 (3)生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶、脂肪酶等。酶制剂应用：食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等。酶制剂来源：少数由动植物生产，绝大多数通过发酵工程生产。 4.发酵工程在生产传统发酵食品中的意义：使这些产品的产量和质量明显提高。 5.啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的。 6.发酵工程在医药工业的应用： （1）采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物。 （2）直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。 7.利用基因工程生产疫苗具体操作：将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。 8.发酵工程在农牧业的应用： (1)生产微生物肥料。微生物肥料的作用：微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。 (2)生产微生物农药。微生物农药的作用：利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。 (3)生产微生物饲料。生产微生物饲料的原理：微生物含有丰富的蛋白质，且繁殖速度快。微生物饲料实例：①单细胞蛋白：以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。②乳酸菌：在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。 9．在其他方面的应用 （1）解决资源短缺与环境污染问题：随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。 （2）将极端微生物应用于生产实践：自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在极端恶劣的环境（高温、高压、高盐和低温等环境）中正常生活。例如嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。 第2章 细胞工程（动植物细胞工程） 本章内容导览 1.思维导图 2.考点清单（3大考点） 3.素养提升清单（7个易错清单、5个妙招清单、7个术语规范清单） 【考点01】植物细胞工程★★★☆☆ 一、植物细胞工程的基本技术 （一）细胞工程概念： 1．细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性生物工程。 原理和方法 细胞生物学、分子生物学和发育生物学等 操作水平 细胞水平、细胞器水平或组织水平 目的 获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品 分类 植物细胞工程和动物细胞工程 2.细胞的全能性 (1)定义：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。 (2)在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。 （二）植物组织培养技术 1．概念：将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。 (1)外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。 (2)脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程。 (3)愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。 (4)再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。 (5)激素的作用：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。 (6)由愈伤组织进行细胞分化时，一般要先诱导其生芽，然后诱导其生根，可通过控制培养基中生长素和细胞分裂素的比例来实现。 (7)生长素和细胞分裂素用量的比例影响植物细胞的发育方向。 生长素用量/细胞分裂素用量 结果 比值高 有利于根的分化，抑制芽的形成 比值低 有利于芽的分化，抑制根的形成 比值适中 促进愈伤组织的形成 （三）、植物体细胞杂交技术 1．概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。 2．过程 (1)去壁：用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体。 (2)诱导原生质体融合的方法 ①物理法：电融合法、离心法等。 ②化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋－高pH融合法等。 3．原理 原生质体融合的过程利用了细胞膜的流动性，杂种细胞发育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。 4．意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种。 二、植物细胞工程的应用 （一）植物繁殖的新途径 1．快速繁殖 (1)概念：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，也叫作微型繁殖技术。 (2)特点： ①高效、快速地实现种苗的大量繁殖 ②无性繁殖，保持优良品种的遗传特性 ③可实现产业化生产 (3)实例：一些优良的观赏植物、经济林木、无性繁殖作物和濒危植物等都实现了利用快速繁殖技术来提供苗木。 2．作物脱毒 (1)选材部位：植物顶端分生区附近的部位(如茎尖)，此部分病毒极少,甚至无病毒。 (2)优点：提高作物的产量和品质。 （二）作物新品种的培育 1．单倍体育种 (1)原理：细胞的全能性和染色体变异。 (2)过程：花药(或花粉) 单倍体植株 纯合二倍体植株 优良品种。 (3)优点 ①子代是能稳定遗传的纯合子。 ②极大地缩短了育种的年限。 ③进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。 2．突变体的利用 (1)原理：在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突变。从产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 (2)过程 (3)利用：筛选出有用的突变体，培育新品种。如培育抗病、抗盐、高产以及蛋白质含量高的突变体。 （三）细胞产物的工厂化生产 1．细胞产物类型 （1）初生代谢物：初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，在整个生命过程中一直进行着。初生代谢物是通过初生代谢产生的，自身生长繁殖所必需的物质，如糖类、脂质、蛋白质和核酸等。 （2）次生代谢物：次生代谢不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下进行，在该过程中产生的一类小分子有机化合物就是次生代谢物，如酚类、萜类和含氮化合物等。 2．技术：植物细胞培养，指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。 3．过程 4．意义：不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，因此对于社会、经济、环境保护具有重要意义。 (1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。 (2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。 (3)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。 (4)植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体提供营养，还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。 【考点02】动物细胞工程★★★☆☆ 一、动物细胞培养 1.概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 2.原理：细胞增殖。 3.培养过程 4.条件 （1）营养：一般使用液体培养基，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，通常需要加入血清等一些天然成分。 （2）无菌、无毒的环境 ①需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。 ②培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 （3）温度、pH和渗透压 ①哺乳动物细胞培养的温度多以（36.5±0.5）__℃为宜。 ②多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ③渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。 （4）气体环境 ①动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 ②在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 5.相关概念的辨析 （1）悬浮生长：细胞悬浮在培养液中生长增殖。密度过大时，由于有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素，细胞分裂受阻。 （2）细胞贴壁：多数细胞贴附在培养瓶的瓶壁上生长。 （3）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖的现象称为细胞的接触抑制。 （4）原代培养：指动物组织经处理后的初次培养（即在出现首次接触抑制之前）。 （5）传代培养：分瓶后的细胞培养。当出现接触抑制，需要传代培养时要先用胰蛋白酶等处理，使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱离下来，再用离心法收集。 6．干细胞培养及其应用 (1)干细胞：动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 (2)干细胞的种类和用途 种类 胚胎干细胞 成体干细胞 诱导多能干细胞 来源 早期胚胎 骨髓、脐带血和外周血 体细胞（如成纤维细胞等） 特点 能分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的组织和器官甚至个体 分化成特定的细胞或组织 能诱导分化成类似胚胎干细胞的细胞 应用 分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等 造血干细胞用于治疗白血病；神经干细胞用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等 治疗小鼠的镰状细胞贫血、阿尔茨海默病、心血管疾病等 二、动物细胞融合技术与单克隆抗体 1．动物细胞融合技术：是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。细胞融合的实质是核融合。 (1)原理：动物细胞融合的基本原理为细胞膜的流动性。 (2)诱导融合的方法 ①化学方法：PEG融合法。 ②物理方法：电融合法。 ③生物方法：灭活病毒诱导法。 (2)过程：具有不同遗传信息的两个或多个细胞杂交。 (3)结果：形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。 (4)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。 (5)应用 ①成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 ②用于制造单克隆抗体。 2．单克隆抗体的制备及其应用 （1）传统抗体的获得 ①方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。 ②缺陷：产量低、纯度低、特异性差。 （2）大量制备单一抗体的思路 ①存在的问题：B淋巴细胞不可能无限增殖。 ②解决方案：把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。 ③制备过程 （3）单克隆抗体的优点 ①准确地识别抗原的细微差异。 ②可以与特定抗原发生特异性结合。 ③可以大量制备。 （4）单克隆抗体的应用 ①用作诊断试剂，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 ②运载药物，如ADC（抗体—药物偶联物）。 ③直接用于治疗疾病。 （5）制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的 项目 第一次筛选 第二次筛选 筛选原因 诱导融合后得到多种融合细胞，另外还有未融合的细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，产生分泌其他抗体的淋巴细胞 筛选方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 用96孔板进行克隆化培养和抗体检测（每个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞），经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群 筛选目的 得到杂交瘤细胞 得到既能分泌所需抗体又能大量增殖的杂交瘤细胞 （6）血清抗体与单克隆抗体比较 名称 产生 特点 血清抗体 由浆细胞分泌 一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差 单克隆抗体 由杂交瘤细胞分泌 准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 三、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物细胞核移植技术 （1）概念：将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 （2）原理：动物细胞核的全能性。 （3）哺乳动物核移植分类 种类 难易程度 原因 胚胎细胞核移植 相对容易 分化程度低，表现全能性相对容易 体细胞核移植 十分困难 分化程度高，表现全能性十分困难 （4）非人灵长类动物的体细胞核移植困难的原因 ①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态。 ②对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。 2.动物体细胞核移植技术的过程（以克隆高产奶牛为例） 3.结果：克隆动物性状与供体基本相同。 4.体细胞核移植技术的应用前景 （1）畜牧生产方面：加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。 （2）医药卫生领域 ①转基因克隆动物作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白。 ②转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以用于异种移植。 ③人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官后，将它们移植给患者时可以避免发生免疫排斥反应。 （3）科学研究 ①了解胚胎发育及衰老过程。 ②分析致病基因，研究疾病的致病机制，开发相应药物。 （4）保护濒危物种方面：保护濒危物种，增加濒危物种的存活数量。 5.体细胞核移植技术存在的问题 （1）成功率非常低，各个技术环节也有待进一步改进。 （2）绝大多数克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷，如体形过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。 （3）相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。 1.区分原代培养和传代培养 ①分瓶前，第一次用胰蛋白酶对动物组织进行处理后的培养是原代培养。 ②第二次用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，分瓶后的细胞培养为传代培养。 2.培养前分散成单个细胞的原因：①分散后细胞的生长与增殖不会被彼此限制；②分散有利于细胞与培养液充分接触，保证O2与营养的供应和代谢物的及时排出。 3.区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。 4.用酶两次处理的目的：第一次使用的目的是使组织细胞分散开；第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分散后继续传代培养。 5.接触抑制和细胞贴壁都离不开细胞表面的糖蛋白，涉及基因的选择性表达。 6.与骨髓瘤细胞融合的是混杂细胞（脾脏细胞经离心分离所得，成分复杂，含活化的B细胞及少量浆细胞），单独分离纯化浆细胞技术复杂、成本过高。 7.两次筛选的目的： 第一次是在诱导融合之后，利用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞。 第二次是对上述杂交瘤细胞进行筛选，利用96孔板培养，采用专一抗体检测的方法筛选出能产生所需特定抗体的杂交瘤细胞。 第2章 细胞工程（胚胎工程） 【考点01】胚胎工程的理论基础★★★☆☆ 1．胚胎工程：是指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。 胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。 (1)操作对象：生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞(细胞水平)。 (2)所需技术：体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术。 (3)特点：经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。 (4)理论基础：哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律。 (5)实质：在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。 2.体内受精 (1)哺乳动物受精场所：雌性动物的输卵管内。 (2)受精前的准备阶段 ①准备阶段1——精子获能：刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力。 ②准备阶段2——卵子的准备：动物排出的卵子成熟度不同，有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。卵子要在输卵管内进一步成熟，到MⅡ期时，才具备与精子受精的能力。 (3)受精阶段 过程 主要变化 精子穿越卵细胞膜外的结构 获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出多种酶，以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜 精子入卵 防止多精入卵的第一道屏障：精子的细胞膜与卵细胞膜融合，卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带。防止多精入卵的第二道屏障：精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内 形成雄、雌原核 精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，形成雄原核；同时卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核 受精卵形成 雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵 3.胚胎早期发育 (1)场所：输卵管。 (2)过程：早期发育的胚胎包括以下几个阶段：受精卵→①桑葚胚→②囊胚。 (3)卵裂期的特点 ①细胞分裂方式：有丝分裂，发生在透明带内。 ②有机物：有机物总量不断减少，但有机物种类增加。 ③细胞体积：胚胎总体积不变或略有减小，但细胞数目增多，所以每个细胞体积减小。 ④细胞中DNA含量：伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA含量保持相对稳定。 (4)桑葚胚：由卵裂产生的子细胞形成的致密细胞团，形似桑葚。 (5)囊胚：细胞逐渐分化，结构如图所示。 ①内细胞团——其细胞具有全能性，将来发育成胎儿的各种组织。 ②滋养层——沿透明带内壁扩展和排列的细胞，将来发育成胎膜和胎盘。 ③囊胚腔——胚胎内部含有液体的腔。 (6)原肠胚：形成外胚层、中胚层、内胚层三个胚层，这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。 4.孵化 (1)概念：囊胚进一步扩大，透明带破裂，胚胎从其中伸展出来的过程。 (2)意义：如果不能正常孵化，胚胎就无法继续发育。 1.精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量；排卵是指卵子从卵泡中排出，而不是卵泡从卵巢中排出。 2.卵子的减数分裂Ⅱ、受精作用和受精卵的早期细胞分裂都是在雌性动物的输卵管中进行的。 3.卵子减数分裂Ⅱ是在精子和卵子结合的过程中完成的。 4.受精的标志≠受精完成的标志 受精的标志是在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体，或观察到雌、雄原核的形成。受精完成的标志是雌、雄原核的融合。 5.桑葚胚的细胞和囊胚期内细胞团的细胞都具有全能性。 6.卵裂时胚胎中有机物的含量不断减少，但有机物的种类增加；胚胎总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA含量保持稳定。 7.卵裂期胚胎发育过程中物质和体积变化的规律 (1)有机物：胚胎没有和母体建立联系，没有从母体获取有机物，而胚胎一直呼吸消耗，有机物总量减少。 (2)细胞数目和体积：胚胎总体积并不增加，但细胞数目增多，每个细胞体积减小。 (3)细胞中DNA含量：伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA含量保持相对稳定。 【考点02】胚胎工程技术及其应用★★★☆☆ 1．体外受精 (1)基本步骤：卵母细胞的采集和培养，精子的采集和获能，受精。 (2)意义：提高动物繁殖能力的有效措施；为胚胎移植提供可用的胚胎。 2．胚胎移植 胚胎移植：指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。 供体 提供胚胎的个体 受体 接受胚胎的个体 移植条件 供体与受体为同种且生理状态相同 实质 早期胚胎在相同生理条件下空间位置的转移 地位 胚胎工程的最后一道“工序” (1)胚胎移植的胚胎有的来源： 有性生殖——体外受精或体内受精(配种)→早期胚胎； 无性生殖——核移植或胚胎分割→早期胚胎。 (2)过程：对供受体母畜进行选择，并同期发情处理→对供体母畜进行超数排卵→配种或人工授精→收集胚胎→对胚胎检查、培养或保存→胚胎移植→对受体母畜进行妊娠检查→产生具有优良性状的后代。 ①供体母牛：选择遗传性状优良，生产能力强的个体。用促性腺激素进行超数排卵处理。 ②受体母牛：选择有健康的体质和正常繁殖能力的个体。 ③用激素对供体母牛和受体母牛进行同期发情处理。 ④冲卵：是指用配制好的冲卵液，借助特制的冲卵装置，将供体母畜子宫或输卵管中的胚胎冲洗出来。 ⑤胚胎的检查、培养或保存：适合移植的阶段是桑葚胚或囊胚阶段。胚胎冷冻保存(-196℃液氮中）。 (3)意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力+迅速扩大良种畜群，加速育种和品种改良。 (4)胚胎移植的生理学基础 胚胎移入的基础 排卵后，同种动物的供受体生殖器官的生理变化是相同的。 胚胎收集的基础 早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织联系，而是处于游离状态，为胚胎收集提供可能。 移入胚胎存活的基础 受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。 保留胚胎遗传特性基础 供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，其遗传物质不会发生改变。 3.胚胎分割 (1)概念：指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 (2)实质：动物的无性繁殖或克隆。 (3)特点：后代遗传性状相同。 (4)主要仪器设备：体视显微镜和显微操作仪。 (5)操作程序 ①选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿中。 ②在显微镜下用分割针或分割刀分割，在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割。 ③分割后的胚胎可以直接移植给受体，或经体外培养后，再移植给受体。 (6)意义 ①可以促进优良动物品种的繁殖。 ②产生的遗传性状相同的后代是进行遗传学研究的宝贵材料。 ③在胚胎移植前，进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。 (7)胚胎分割时应注意的问题 ①胚胎选择：选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚。 ②分割要求：在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割。 ③做DNA分析，鉴定性别时，要取滋养层细胞。 ④实质：通过无性繁殖或克隆增加后代数量。 1.超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。 2.胚胎移植的生理学基础 3.体外受精、体内受精形成的胚胎进行胚胎移植属于有性生殖，动物体细胞核移植形成的胚胎进行胚胎移植属于无性生殖，即判断胚胎移植为何种生殖方式时，关键是看胚胎通过何种方式获得。 4.将内细胞团均等分割，以免影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 5.胚胎移植前进行性别鉴定的方法：取滋养层细胞做DNA分析。 第3章 基因工程 第4章 生物技术安全性与伦理问题 【考点01】基因工程★★★★☆ 一、重组DNA技术的基本工具 1.DNA基因工程至少需要三种工具：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）；“分子缝合针”——DNA连接酶；“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体。 （1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） ①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ②功能：能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 ③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：粘性末端和平末端。 （2）“分子缝合针”——DNA连接酶 ①)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： a.相同点：都缝合磷酸二酯键。 b.区别：E·coli DNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 ②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （3） DNA 连接酶——“分子缝合针” ① 作用: 将双链 DNA 片段“缝合” 起来, 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ② 种类: 种类 来源 特点 E.coliDNA连接酶 大肠杆菌 只能“缝合”具有互补粘性末端的双链DNA片段 T4DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补粘性末端，又可“缝合”双链DNA片段的平末端。 (4)“分子运输车”——载体 ①载体具备的条件： a.能在受体细胞中复制并稳定保存。 b.具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 c.具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 ②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 ③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 2.比较与DNA有关的六种酶 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 二、基因工程的基本操作程序 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建（核心）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 1.目的基因的筛选与获取 （1）目的基因 ①概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 ②实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。 （2）筛选合适的目的基因 ①较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 ②实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。 ③认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 ①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ②条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。 ③过程： a.变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。 b.复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 c.延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。 d.重复循环多次。 （4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。 2.基因表达载体的构建 （1）构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 ②使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成 （3）基因表达载体的构建 首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。 3.将目的基因导入受体细胞 （1）转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 （2）目的基因导入受体细胞的方法 ①目的基因导入植物细胞 a.花粉管通道法 Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入胚囊。 b.农杆菌转化法 Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；农杆菌的Ti质粒上的T­DNA能够整合到所侵染细胞的染色体DNA上。 Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T­DNA中，让农杆菌侵染植物细胞。 ②目的基因导入动物细胞 a.常用方法：显微注射法。 b.常用受体细胞：受精卵。 ③目的基因导入微生物细胞 a.方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。 b.常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。 4.目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平检测 ①通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。 ②从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。 （2）个体水平鉴定 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 3.扩增DNA片段的电泳 (1)根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 (2)将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 (3)待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 (4)将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。 (5)将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 (6)接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 (7)取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 【注意】1、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用之前必须进行高压灭菌处理。 2、 PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后放在冰块上缓慢融化。 3、 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。 【结果】DNA片段进行电泳鉴定的结果是1条条带 如果结果不止一条条带，原因可能的原因有：引物设计不合理、退火温度过低、DNA聚合酶的质量不好、它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体等 四、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理： （1）提取DNA的原理：DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进行分离。 （2）DNA的鉴定原理：DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色（沸水浴加热）。 2.方法步骤： （1）研磨：称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10ml研磨液，充分研磨。 （2）过滤或离心取上清液： ①在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 ②或直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中 （3）加酒精，搅拌或离心得DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 ①用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 ②或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干 （4） 鉴定：取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 五、基因工程的应用 1.基因工程在各方面的应用 分类 实例 处理或作用 在农牧业方面的应用 转基因 抗虫植物 转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯 从某些生物中分离出抗虫基因导入作物，使之具有抗虫性状。可减少因化学农药的使用而造成的环境污染和对人类健康的损害，降低生产成本、提高产量  转基因 抗病植物 转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等 将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入作物，培育出抗病作物 转基因抗除草剂植物 转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等 将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，培育出抗除草剂的作物品种 改良植物的品质 高赖氨酸玉米、含大量纤维素的转基因玉米、转基因矮牵牛 改善植物的营养成分含量（如氨基酸、蛋白质）或提升观赏价值等 提高动物的生长速率 转生长激素基因的鲤鱼 由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，可将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率 改善畜产品的品质 转肠乳糖酶基因牛 将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响 在医药卫生领域的应用 转基因动物生产药物 乳腺生物反应器 （乳房生物反应器） 将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 转基因动物作器官移植的供体　 克隆猪器官 抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官  在食品工业方面的应用 淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生产 利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等，如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过③　工业发酵　生产凝乳酶  2.乳腺生物反应器与工程菌生产药物比较 比较项目 乳腺生物反应器 工程菌 概念 指导入的外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌或酵母菌等基因的结构与人类基因的结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞 导入目的基因的方式 显微注射技术 感受态细胞法 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 3.抗虫转基因植物与抗病转基因植物的比较 类型 项目 抗虫转基因植物 抗病转基因植物 方法 从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入植物中 将抗病基因导入植物中 基因种类 Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 ①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因 ②抗真菌基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因 成果 转基因抗虫棉、转基因抗虫水稻等 抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等 1、在构建基因表达载体时注意的问题： （1）用同一种限制酶切割目的基因和载体为单酶切易出现的问题 ①目的基因和质粒的自身环化。 ②目的基因和运载体之间反向拼接 所以在构建基因表达载体时一般使用双酶切法即用不同种限制酶切割目的基因，再用这两种酶切割运载体。 （2）使用限制酶切割目的基因构建表达载体时还需要注意：保留标记基因、启动子、终止子、复制原点，不破坏目的基因。 2、本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。 3、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀 。 4、二苯胺试剂要现配现用 ，否则会影响鉴定的效果。 5、提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜 ，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。 （5）在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精 的作用是溶解杂质和析出DNA。 【考点02】蛋白质工程★★☆☆☆ 一、蛋白质工程的原理和应用 蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能 的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质 ，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 1.概念理解 （1）基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 （2）操作：　基因修饰　或基因合成。  （3）结果：　改造了　现有蛋白质或制造出　新的蛋白质　。  （4）目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对　蛋白质结构　进行分子设计。  2.操作过程 从预期的蛋白质　功能　出发→设计预期的　蛋白质结构　→推测应有的　氨基酸序列　→找到并改变相对应的　脱氧核苷酸序列　（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 二、蛋白质工程及其崛起的缘由 1.基因工程的实质：将一种生物的_基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 。 2.基因工程的局限性：__只能生产自然界中已存在的蛋白质____ 3. 蛋白质工程崛起的缘由 基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的,它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 实例: 蛋白质缺陷 改造措施 改造后果 玉米中赖氨酸 含量低 赖氨酸合成中两种酶的 氨基酸被替换 叶片和种子中游离的赖氨酸分别 提高5倍和2倍 三、蛋白质工程的基本原理 1.蛋白质工程的目标：根据人们对蛋白质__功能__的特定需求，因此要对蛋白质的__结构_进行设计改造。 2.蛋白质工程的实质：__改造或合成基因 （定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质）。 3.天然蛋白质合成过程：天然蛋白质合成的过程是按照__中心法则__进行的。 基因→ 表达 →形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→形式生物功能 4.蛋白质工程思路 蛋白质工程与天然蛋白质合成的过程_相反_，而从__预期的蛋白质功能_出发→设计_预期的蛋白质结_→推测__应有的氨基酸序列_→找到并改变_相对应的脱氧核苷酸序列_或__合成新基因_→获得所需要的蛋白质。 四、蛋白质工程和基因工程的比较 比较项目 蛋白质工程 基因工程 操作对象 基因 基因 操作起点 预期蛋白质功能 目的基因 操作水平 DNA分子水平 DNA分子水平 操作流程 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞 →目的基因的检测与鉴定 结果 可生产自然界没有 的蛋白质 可生产自然界已有的蛋白质 实质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程 基本操作。 蛋白质工程是一项难度很大的工程；主要原因是__蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂_。 四、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面: ①速效胰岛素类似物: 改变氨基酸序列, 抑制胰岛素的聚合。 ②干扰素:一个半胱氨酸替换为丝氨酸, 延长保存时间。 ③单克隆抗体:将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接” 到人的抗体上, 降低诱发免疫反应的强度。 2.其他工业方面: 用于改进酶的性能或开发新的工业用酶，如利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的突变体，筛选出符合工业化生产需求的突变体，提高该酶的使用价值。 3.农业方面: ① 科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶, 提高植物光合作用的效率。 ② 科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，改造微生物蛋白质的结构, 增强防治病虫害的效果。 1.如何区分蛋白质工程和基因工程 【考点03】生物技术的安全性与伦理问题★☆☆☆☆ 一、转基因生物的安全性 1.基因生物与食物安全的争论： ①反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变 ②正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据 2.转基因生物与生物安全（对生物多样性的影响）的争论： ①反方观点：扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染” ②正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限 3.转基因生物与环境安全（对生态系统稳定性的影响）的争论： ①反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体 ②正方观点：不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境 4.理性看待转基因技术 5.我国的农业转基因生物实行了标识制度：农业转基因生物分为四个等级： 安全等级I：尚不存在危险； 安全等级II：具有低度危险； 安全等级III：具有中度危险； 安全等级IV：具有高度危险。 二、关注生物技术的伦理问题 关于生物技术的伦理的热点问题: 1.克隆人： (1)否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上都不健全的人。 (2)肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。 (3)中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。 2.试管婴儿： (1)否定的理由：把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利，抛弃或杀死多余胚胎，无异于“谋杀”。 (2)肯定的理由：解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。 3.基因身份证： (1)否定的理由：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。 (2)肯定的理由：通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。 4.基因检测 (1)基因检测的优点：通过基因检测可以及早采取预防的措施,适时进行治疗,达到挽救患者生命的目的。 (2)基因检测引发的问题： ①目前人类对基因结构及基因间相互作用尚缺乏足够的认识,要想通过基因检测达到预防疾病的目的是困难的; ②基因检测结果本身会给受检者带来巨大的心理压力; ③个人基因资讯的泄露会造成基因歧视. (3)解决的办法: 对于基因歧视现象,可以通过正确的科学知识传授,伦理道德教育,立法得以解决 5.治疗性克隆和生殖性克隆 (1)治疗性克隆 ①概念： 指利用克隆技术产生特定细胞或组织(皮肤、 神经或肌肉等)用于治疗性移植。 ②原理： 干细胞具有强大的多方向分化潜能和自我更新能力。 (2)生殖性克隆 ①概念： 指将克隆技术用于生育目的， 即用于产生人类个体。 ②原理： 动物体细胞核的全能性。 (3)二者主要区别：获得的早期胚胎在治疗性克隆中用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的特定的组织或细胞； 在生殖性克隆中获得的胚胎则通过胚胎移植到母体的子宫内，由母体孕育出婴儿。 三、禁止生物武器 1.生物武器： (1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。 (2)散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。 (3)特点：致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。 (4)《禁止生物武器公约》及中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。 2.生物武器的传播途径 (1)经食物与水传播： 霍乱、 肉毒毒素、 病毒、 炭疽。 (2)空气传播： 鼠疫、 炭疽、 类鼻疽、 球孢子菌病。 (3)接触传播： 炭疽、 破伤风。 (4)虫媒传播： 黄热病、 马脑炎、 落矶山斑疹热、 斑疹伤风、 Q 热、 腺鼠疫。 (5)病原体直接传播。 3.生物武器的特点 (1)单位面积效应大： 生物武器单位战剂的杀伤面积效应很大。 因为生物战剂的感染剂量极小。 (2)有特定的伤害对象 伤害对象只限于有生命的人、 畜和农作物， 而不破坏无生命的物质。 因而适用于攻击不易破坏的目标区， 这一特点正符合侵略者发动战争的目的。 (3)具有传染性 它能以多种性状如致病性气溶胶、 媒介昆虫及媒介物、 毒菌、 毒液等， 多种途径如借空气经呼吸道、 借水及食物经消化道、 借媒介昆虫及创口经皮肤粘膜等使人、 畜和农作物受害， 受害者若不及时处理， 就能互相传染， 不断蔓延， 造成传染病流行， 致使人、 畜及农作物大量死亡。 (4)危害时间久 某些致病菌如炭疽杆菌及毒素能长期存在于外界， 有持久的危害作用， 甚至使当地形成疫源地， 以致传染病不断蔓延。 (5)不易被发现和鉴定 施放生物武器时， 因为没有巨大的爆炸声， 亦无光、 气味和颜色， 鉴定技术也较复杂，需时也较长。 (6使用者本身易受伤害 生物武器很容易受自然条件如气温、 风力、 阳光和雨雪的影响而丧失作用， 若使用不当或选择时机不好， 也很容易使使用者本身受到伤害。 (7)生物武器造价低、 技术难度不大、 隐蔽性强、可以在任何地方研制和生产。 4.生物武器的局限性 (1) 生物武器主要指病原微生物， 所以它们的生存、 繁殖、 死亡易受环境条件的影响。 如温度： 适宜温度——37℃左右。 若温度过高， 40—50℃， 细胞停止繁殖； 50—70℃，死亡； 但芽孢必须在 100℃以上的温度条件下才会死亡。若温度过低， 一般会停止繁殖、生长， 但不会死亡。 (2)还受地形、 风向等多种条件影响。 (3)生物武器使用时不易控制， 使用不当可危害本方安全。 1.三个不同层次的克隆 (1)分子水平：一般指DNA克隆，即DNA复制，如PCR技术。 (2)细胞水平：是指由一个单一的共同祖先细胞分裂形成一个细胞群体的过程，如动物细胞培养。 (3)个体水平：是指形成基因型完全相同的两个或更多的个体的过程，如扦插、嫁接等。 2.混淆“生殖性克隆与治疗性克隆”、“试管婴儿技术与设计试管婴儿”等概念而出错 (1)生殖性克隆与治疗性克隆：生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。 (2)为解决不孕夫妇的生育问题而发明的试管婴儿技术，与“设计试管婴儿”的区别是：“设计19.试管婴儿”实际上是指在将体外受精形成的胚胎植入母体前，根据人们的需要，将胚胎的细胞取出，进行特定基因的检测;当检测结果符合人们的需要时，再把胚胎植入母体。一般我们所说的试管婴儿技术，不必经过基因检测这一步骤。 学科网（北京）股份有限公1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $