第3章 第2节 第2课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定（课件PPT+Word教案）【步步高】2024-2025学年高二生物选择性必修3教师用书（人教版 苏冀赣）

第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 [学习目标]　1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。2.阐明目的基因的检测与鉴定的方法。 1．将目的基因导入受体细胞 (1)将目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法 a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 ②农杆菌转化法 a．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 b．农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 c．目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表现出新性状的植株。 (2)将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射技术。 ②受体细胞：受精卵。 ③过程：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物。 (3)将目的基因导入微生物细胞 常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 2．目的基因的检测与鉴定 (1)分子水平的检测 ①导入水平：通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因。 ②转录水平：利用PCR等技术检测目的基因是否转录出了mRNA。 ③翻译水平：用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质等。 (2)个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病接种实验等。 3．基因工程的基本操作程序 判断正误 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞(　　) (2)Ti质粒上的T－DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起(　　) (3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞(　　) (4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(　　) (5)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则(　　) (6)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(　　) 答案　(1)×　(2)√　(3)×　(4)√　(5)√　(6)√ 提示　(1)为培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。(3)常用受精卵作为培育转基因动物的受体细胞。 任务：分析将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 1．在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA(可转移的DNA)上，原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 2．基因表达载体中具备标记基因(如抗生素抗性基因)，已经对受体细胞进行了筛选，基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定，原因是：在含抗生素的选择培养基上能生长的可能是导入了基因表达载体或未插入目的基因的空载体，因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 3．如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上检测的方法是进行抗虫接种实验；如果目的基因是耐盐基因，在个体水平上检测的方法是用一定浓度的盐水浇灌。 1．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 2．受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 3．个体水平上检测转基因生物的方法举例 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡 抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑 抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性是否正常 4.目的基因的检测与鉴定 [拓展延伸] 1．复制水平的检测(DNA分子杂交技术) (1)原理：碱基互补配对原则。 (2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。 (3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程： 2．表达水平的检测 进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理相似，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的 mRNA；进行翻译水平的检测则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。 1．如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法不正确的是(　　) A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 答案　B 解析　题图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；题图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；基因的表达具有一定的独立性，剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。 2．(2023·连云港高二调研)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是(　　) A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录 D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞 答案　B 解析　若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译出蛋白质，B错误。 课时对点练　[分值：100分] 第1～9题，每题6分；第10～11题，每题7分，共68分。 题组一　将目的基因导入受体细胞 1．(2024·扬州高二期中)我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”，该方法有多种操作方式。如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是(　　) A．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法还适用于玉米等单子叶植物的转基因培育 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法省去了植物组织培养这一操作 C．花粉管通道法的操作方式还可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 答案　D 解析　花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，相比于农杆菌转化法，花粉管通道法省去了植物组织培养这一操作，B正确；要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并表达和发挥作用，不管采用什么导入方法，都需要构建基因表达载体才能实现，D错误。 2．(2023·常州高二检测)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是(　　) A．用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态 B．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射技术 C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵 D．通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更有优势 答案　B 解析　将目的基因转入动物细胞常用显微注射技术，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2＋处理法，B错误。 题组二　目的基因的检测与鉴定 3．(2024·洛阳高二期中)科学家将苏云金杆菌中的Bt基因(抗虫基因)利用农杆菌转化法导入棉花的愈伤组织细胞，并进行组织培养获得棉花植株。下列相关检测方法与结果的分析错误的是(　　) A．提取棉花细胞核DNA，利用PCR技术检测Bt基因是否插入T－DNA上 B．提取棉花细胞中的RNA，利用PCR技术检测Bt基因是否转录出了mRNA C．提取棉花细胞中的蛋白质，利用抗原—抗体杂交技术检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白 D．用棉花的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性程度 答案　A 解析　提取棉花细胞核DNA，利用PCR技术检测Bt基因是否插入棉花的染色体DNA上，A错误。 4．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是(　　) A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质 D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测 答案　C 解析　目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。 题组三　基因工程基本操作程序 5．下列叙述不正确的是(　　) A．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游 B．在基因工程的基本步骤中，不需要进行碱基互补配对的是将目的基因导入受体细胞 C．细菌常常用作基因工程的受体细胞，主要原因是繁殖速度快 D．某医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛，可以想象这头牛发生了基因突变 答案　D 解析　某医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛，这头牛发生了基因重组，D错误。 6．科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是(　　) A．过程①合成人生长激素基因的过程需要用到逆转录酶 B．过程③是将重组质粒溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的细菌B混合 C．成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长 D．可采用抗原—抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达 答案　C 解析　成功导入了重组质粒的细菌B，因目的基因插入质粒后，破坏了四环素抗性基因，所以在含有四环素的培养基上不能生长，在含氨苄青霉素的培养基上能生长，C错误。 7．下列叙述正确的是(　　) A．欲培育出在肝细胞特异性表达目的基因的转基因小鼠，需将基因表达载体导入小鼠肝细胞 B．PCR扩增目的基因需设计特异性的引物 C．构建基因表达载体需要限制酶和RNA聚合酶 D．通过PCR检测目的基因是否完成表达 答案　B 解析　将基因表达载体导入小鼠受精卵以获得转基因小鼠，A错误；构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，C错误；检测目的基因是否完成表达常用抗原—抗体杂交技术，D错误。 8．科研人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，获得转基因大豆。如图为重组Ti质粒上T－DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　) A．通过PCR扩增获得大量OsPTF基因时需要了解该基因的全部序列 B．RNA聚合酶识别到终止子后，会使转录过程停止 C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织 D．用图中所示两种限制酶切割重组Ti质粒后，至少得到两条不同长度的片段 答案　A 解析　通过PCR扩增目的基因时，不需要知道目的基因全部的碱基序列，只需要知道目的基因的部分碱基序列，以便合成引物，A错误；Ti质粒为环状DNA分子，若重组质粒上只含有图中所示的两个限制酶的识别位点，那么用这两种限制酶切割该质粒后，可以得到两条不同长度的片段，若重组质粒上其他位置还有这两种限制酶的识别位点，则可以得到不止两种不同长度的DNA片段，D正确。 9．α1-抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1-抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。下列关于该过程的叙述中，错误的是(　　) A．载体上绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的作用是便于筛选含有目的基因的受体细胞 B．将目的基因导入羊受精卵中，可以使用显微注射技术 C．培养出的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖产生的后代也都能产生α1-抗胰蛋白酶 D．转基因母羊乳腺细胞中α1-抗胰蛋白酶基因才会得以表达，因此可以从乳汁中提取α1-抗胰蛋白酶 答案　C 解析　转基因羊有性生殖产生的后代会发生性状分离，产生的后代可能没有目的基因，也就不能产生α1-抗胰蛋白酶，C错误。 10．(多选)如图是利用转基因技术培育新品种植物的部分操作程序，下列相关叙述错误的是(　　) A．过程①需使用不同的限制酶切割 B．过程②只能用E.coli DNA连接酶连接 C．过程③需采用农杆菌转化法介导 D．过程④需采用选择性培养基进行筛选 答案　BC 解析　过程②是目的基因表达载体的构建过程，由题图可知，该过程既要连接黏性末端又要连接平末端，因此该过程中常用T4 DNA连接酶连接，B错误；过程③是将重组质粒导入农杆菌的过程，该过程可以用钙离子处理使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。 11．(多选)(2024·北京海淀区高二期末)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是(　　) A．可用农杆菌转化法将含目的基因的T－DNA导入植物细胞 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加大观霉素可筛选出成功导入基因表达载体的植物细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 答案　BC 解析　如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，会破坏LUC基因，B错误；Ti质粒的T－DNA能整合到受体细胞的染色体DNA上，图中两个标记基因中潮霉素抗性基因位于T－DNA上，在培养基中添加潮霉素可筛选出导入T－DNA的植物细胞，C错误。 12．(14分)科学家通过基因工程技术，将苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因转入到普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其大致过程如图所示。 (1)用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上有____________，它能将Bt抗虫蛋白基因整合到棉花细胞的____________________上。 (2)将Bt抗虫蛋白基因导入棉花细胞内采用的方法是____________________。将基因表达载体转入农杆菌，首先必须用________处理农杆菌，目的是______________________________。 (3)检测Bt抗虫蛋白基因在抗虫棉中是否成功表达，在分子水平上的检测方法是___________；要确定抗虫棉是否具有抗虫特性，还需要进行____________水平的鉴定。 答案　(1)T－DNA　染色体DNA　(2)农杆菌转化法　Ca2＋　使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　(3)抗原—抗体杂交技术　个体生物学 13．(每空3分，共18分)(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是__________________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有__________________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物______________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 答案　(1)RNA聚合酶　复制原点、标记基因、限制酶切割位点等　(2)F1和R2(或F2和R1)　a链　(3)J－V5融合蛋白　不是 解析　(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。作为载体必须具备的条件为要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶的切割位点等。(2)据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b链是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知，转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′端→5′端，非模板链(a链)是5′端→3′端；考虑到DNA复制的方向是子链的5′端→3′端，引物延伸的方向也是5′端→3′端，所以引物结合的单链延伸方向是3′端→5′端；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′端→5′端的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 学科网（北京）股份有限公司 $ 第3章 基因工程 <<< 第2课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 学习目标 1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。 2.阐明目的基因的检测与鉴定的方法。 1.将目的基因导入受体细胞 (1)将目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法 a.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中。 b.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 进入胚囊。 子房 梳理　教材新知 花粉管通道 ②农杆菌转化法 a.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持___________ 的过程。 b.农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 (可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的 上。 c.目的基因插入 质粒的 中→导入 →整合到受体细胞的 上→表现出新性状的植株。 稳定和表达 Ti T－DNA 染色体DNA Ti T－DNA 植物细胞 染色体DNA (2)将目的基因导入动物细胞 ①方法： 技术。 ②受体细胞： 。 ③过程：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物。 (3)将目的基因导入微生物细胞 常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能 周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 显微注射 受精卵 Ca2＋ 吸收 2.目的基因的检测与鉴定 (1)分子水平的检测 ①导入水平：通过 等技术检测受体细胞的 上是否插入了 。 ②转录水平：利用PCR等技术检测目的基因是否转录出了 。 ③翻译水平：用相应的抗体进行 检测目的基因是否翻译成蛋白质等。 (2)个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病接种实验等。 PCR 染色体DNA 目的基因 mRNA 抗原—抗体杂交 3.基因工程的基本操作程序 目的基因 限制酶 DNA连接酶 基因 表达载体 表达载体 检测和鉴 定 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞(　　) 提示　为培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。 (2)Ti质粒上的T－DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起(　　) × √ 判断正误 8 (3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞(　　) 提示　常用受精卵作为培育转基因动物的受体细胞。 (4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(　　) (5)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则(　　) (6)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(　　) × √ √ √ 判断正误 9 任务：分析将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 1.在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA(可转移的DNA)上，原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA_________________________________________________ __________。 探究　核心知识 可转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 2.基因表达载体中具备标记基因(如抗生素抗性基因)，已经对受体细胞进行了筛选，基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定，原因是：在含抗生素的选择培养基上能生长的可能是_________________________ ，因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的 等是否正确，能否正确 ，因此也需要在 水平上进行检测和鉴定。 3.如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上检测的方法是_____________ ；如果目的基因是耐盐基因，在个体水平上检测的方法是________ 。 导入了基因表达载体或未插 入目的基因的空载体 位置、方向 表达 转录和翻译以及个体 进行抗虫接种 实验 用一定浓 度的盐水浇灌 核心归纳 1.农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 核心归纳 2.受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 核心归纳 3.个体水平上检测转基因生物的方法举例 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡 抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑 抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性是否正常 核心归纳 4.目的基因的检测与鉴定 拓展延伸 1.复制水平的检测(DNA分子杂交技术) 拓展延伸 (1)原理：碱基互补配对原则。 (2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。 (3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程： 拓展延伸 2.表达水平的检测 进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理相似，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的 mRNA；进行翻译水平的检测则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。 1.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法不正确的是 A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要 用到限制酶和DNA连接酶 B.图中Ⅱ是含目的基因的重组 质粒，步骤②是将重组质粒 导入棉花细胞 C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 √ 落实　思维方法 题图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确； 题图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误； 基因的表达具有一定的 独立性，剔除培育成功 的抗虫棉体内的四环素 抗性基因不影响抗虫基 因的表达，D正确。 2.(2023·连云港高二调研)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是 A.提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt 抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达 B.若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若检 测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译 C.若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的 DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能 正常转录 D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入 了受体细胞 √ 若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译出蛋白质，B错误。 网络构建 课时对点练 24 题组一　将目的基因导入受体细胞 1.(2024·扬州高二期中)我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”，该方法有多种操作方式。如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是 A.相比于农杆菌转化法，花粉管通道法还适用于玉米等单子叶植物的转基因培育 B.相比于农杆菌转化法，花粉管通道 法省去了植物组织培养这一操作 C.花粉管通道法的操作方式还可以用 微量注射器将含目的基因的DNA溶 液直接注入子房中 D.外源DNA不需要构建基因表达载体， 就能借助花粉管通道进入受体细胞 并表达 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，相比于农杆菌转化法，花粉管通道法省去了植物组织培养这一操作，B正确； 要让目的基因进入受体细胞 后能稳定存在并表达和发挥 作用，不管采用什么导入方 法，都需要构建基因表达载 体才能实现，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 2.(2023·常州高二检测)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是 A.用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态 B.将目的基因转入微生物细胞常用显微注射技术 C.对于动物来说，受体细胞一般是受精卵 D.通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更 有优势 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 将目的基因转入动物细胞常用显微注射技术，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2＋处理法，B错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 题组二　目的基因的检测与鉴定 3.(2024·洛阳高二期中)科学家将苏云金杆菌中的Bt基因(抗虫基因)利用农杆菌转化法导入棉花的愈伤组织细胞，并进行组织培养获得棉花植株。下列相关检测方法与结果的分析错误的是 A.提取棉花细胞核DNA，利用PCR技术检测Bt基因是否插入T－DNA上 B.提取棉花细胞中的RNA，利用PCR技术检测Bt基因是否转录出了mRNA C.提取棉花细胞中的蛋白质，利用抗原—抗体杂交技术检测Bt基因是否翻译成 Bt抗虫蛋白 D.用棉花的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性程度 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 提取棉花细胞核DNA，利用PCR技术检测Bt基因是否插入棉花的染色体DNA上，A错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 4.目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是 A.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA B.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 C.可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质 D.抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平 的检测 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误； PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误； 抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 题组三　基因工程基本操作程序 5.下列叙述不正确的是 A.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游 B.在基因工程的基本步骤中，不需要进行碱基互补配对的是将目的基因 导入受体细胞 C.细菌常常用作基因工程的受体细胞，主要原因是繁殖速度快 D.某医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛， 可以想象这头牛发生了基因突变 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 某医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛，这头牛发生了基因重组，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 6.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 A.过程①合成人生长激素基因的过程需要用到逆转录酶 B.过程③是将重组质粒溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的细菌B混合 C.成功导入了重组质粒的 细菌B在含有氨苄青霉 素的培养基上不能生长 D.可采用抗原—抗体杂交 技术检测工程菌中生长 激素基因是否成功表达 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 成功导入了重组质粒的细菌B，因目的基因插入质粒后，破坏了四环素抗性基因，所以在含有四环素的培养基上不能生长，在含氨苄青霉素的培养基上能生长，C错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 7.下列叙述正确的是 A.欲培育出在肝细胞特异性表达目的基因的转基因小鼠，需将基因表达 载体导入小鼠肝细胞 B.PCR扩增目的基因需设计特异性的引物 C.构建基因表达载体需要限制酶和RNA聚合酶 D.通过PCR检测目的基因是否完成表达 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 将基因表达载体导入小鼠受精卵以获得转基因小鼠，A错误； 构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，C错误； 检测目的基因是否完成表达常用抗原—抗体杂交技术，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 8.科研人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，获得转基因大豆。如图为重组Ti质粒上T－DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是 A.通过PCR扩增获得大量 OsPTF基因时需要了解该基因的全部序列 B.RNA聚合酶识别到终止子后，会使转录过程停止 C.可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织 D.用图中所示两种限制酶切割重组Ti质粒后，至少得到两条不同长度的 片段 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 通过PCR扩增目的基因时，不需要知道目的基因全部的碱基序列，只需要知道目的基因的部分碱基序列，以便合成引物，A错误； Ti质粒为环状DNA分子，若重组质粒上只含有图中所示的两个限制酶的识别位点，那么用这两种限制酶切割该质粒后，可以得到两条不同长度的片段，若重组质粒上其他位置还有这两种限制酶的识别位点，则可以得到不止 两种不同长度的DNA片 段，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 对点训练 9.α1-抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1-抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。下列关于该过程的叙述中，错误的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 A.载体上绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的作用是便于筛选含有目的基因 的受体细胞 B.将目的基因导入 羊受精卵中，可 以使用显微注射技术 C.培养出的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖 产生的后代也都能产生α1-抗胰蛋白酶 D.转基因母羊乳腺细胞中α1-抗胰蛋白酶基因才会得以表达，因此可以从 乳汁中提取α1-抗胰蛋白酶 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 转基因羊有性生殖产生的后代会发生性状分离，产生的后代可能没有目的基因，也就不能产生α1-抗胰蛋白酶，C错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 10.(多选)如图是利用转基因技术培育新品种植物的部分操作程序，下列相关叙述错误的是 A.过程①需使用不同的 限制酶切割 B.过程②只能用E.coli DNA连接酶连接 C.过程③需采用农杆菌转化法介导 D.过程④需采用选择性培养基进行筛选 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ 综合强化 过程②是目的基因表达载体的构建过程，由题图可知，该过程既要连接黏性末端又要连接平末端，因此该过程中常用T4 DNA连接酶连接，B错误； 过程③是将重组质粒 导入农杆菌的过程， 该过程可以用钙离子 处理使农杆菌处于一 种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 11.(多选)(2024·北京海淀区高二期末)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 A.可用农杆菌转化法将含目的基因的T－DNA导入植物细胞 B.为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC 基因的质粒 C.在培养基中添加大 观霉素可筛选出成 功导入基因表达载 体的植物细胞 D.可通过观察是否出 现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ 综合强化 如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，会破坏LUC基因，B错误； Ti质粒的T－DNA 能整合到受体细胞 的染色体DNA上， 图中两个标记基因 中潮霉素抗性基因位于T－DNA上，在培养基中添加潮霉素可筛选出导入T－DNA的植物细胞，C错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 12.科学家通过基因工程技术，将苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因转入到普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其大致过 程如图所示。 (1)用Ti质粒作为载体，是 因为Ti质粒上有________， 它能将Bt抗虫蛋白基因整 合到棉花细胞的________ _______上。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 T－DNA 染色体 DNA 综合强化 (2)将Bt抗虫蛋白基因导入棉花细胞内采用的方法是______________。将基因表达载体转入农杆菌，首先必须用_____处理农杆菌，目的是____________ ____________________________________________。 农杆菌转化法 Ca2＋ 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 (3)检测Bt抗虫蛋白基因在抗虫棉中是否成功表达，在分子水平上的检测方法是____________________；要确定抗虫棉是否具有抗虫特性，还需要进行____ _______水平的鉴定。 抗原—抗体杂交技术 个体 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 生物学 综合强化 13.(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________ ______(答出2个结构即可)。 RNA聚合酶 点等 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 复制原点、标记基因、限制酶切割位 综合强化 启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。作为载体必须具备的条件为要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶的切割位点等。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F1和R2(或F2和R1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 a链 综合强化 据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b链是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知，转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′端→5′端，非模板链(a链)是5′端→3′端；考虑到DNA复制的方向是子链的5′端→3′端，引物延伸的方向也是5′端→3′端，所以 引物结合的单链延伸方向是3′端→5′端； 图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的 单链是3′端→5′端的b链，故其序列应该 与a链相应部分的序列相同。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋白_____(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 不是 综合强化 据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 综合强化 $