2.2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA是主要遗传物质 第二章 细胞工程 第2节 动物细胞工程 第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体 选必三 REN JIAO BAN GAO ZHONG SHENG WU XUAN BI SAN 植物体细胞杂交 植物细胞融合 植物组织培养 意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。　　　　　 温故知新 飞马？ 需要什么技术？ 情境导入 有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？马的动物细胞A。天鹅的动物细胞B 3 实验：人——鼠细胞荧光标记融合实验 温故知新 必修1第三章第1节：以前学习：这一实验以及相关的其他实验证据表明，细胞膜具有流动性。现在学习：什么是细胞融合？人细胞和小鼠细胞如何融合在一起？ 4 思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？ 肺结核病人病理切片 诱导 融合 病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。 动物细胞融合技术 01. 细胞融合的现象早在19世纪就已经被发现了。1838年在肿瘤中观察到了细胞融合后产生的多核细胞。 5 1.概念： 使____或_____动物细胞结合形成____细胞的技术。 2.结果： 形成的________具有原来两个或多个细胞的_________。 3.原理： 与植物原生质体融合的基本原理相同体现了 。 4.诱导融合的常用方法： 两个 多个 一个 杂交细胞 遗传信息 细胞膜具有一定的流动性 是动物细胞融合特有的诱导融合方法 物理法：电融合法 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活病毒诱导法 与植物原生质体融合的方法相同 5.意义： 突破了 的局限，使 成为可能。 有性杂交 远缘杂交 对比 动物细胞融合技术 01. 6 相关信息：生物方法：灭活病毒诱导法 用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力（即丧失感染活性，不感染细胞）， 但并不破坏它们的抗原结构（即保留融合活性，诱导细胞融合） 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？ 2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？ 病毒的不同 “身份”： 在免疫调节中病毒属于抗原； 在基因工程中可作为载体； 在细胞工程中可作为诱导剂。 （如：仙台病毒 ） 7 相关信息：生物方法：灭活病毒诱导法 3、灭活病毒诱导细胞融合过程： 动物细胞融合实质及完成的标志： 细胞核的融合 6.过程： 动物细胞融合 动物细胞培养 AA、AB、BB 细胞膜的流动性 细胞增殖 动物细胞融合技术 01. 动物细胞融合和植物体细胞杂交比较 项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合前的处理方法 诱导细胞融合的方法 细胞融合成功的标志 主要用途 意义 细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性 用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞 电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 再生出细胞壁 细胞核的融合 获得完整的杂种植株 主要用于制造单克隆抗体 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 7.应用： 至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。 细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞 动物细胞融合技术 01. （一）补充资料：动物细胞融合技术的发展历史 时间 成果 19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞 1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。 1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合 1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合) 1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？ 2.抗体由什么细胞产生？ 3.抗体的化学本质是什么？ 抗体是机体受抗原刺激后B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞产生 具有免疫功能的球蛋白 抗体 体液免疫 温故知新 4.与抗原作用的特点？ 5.抗体主要分布在哪里？ 1）血清（主要） 2）组织液及外分泌液（如乳汁中） 能与该抗原发生特异性结合的 抗体 定义：机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 温故知新 要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。 什么细胞能产生抗体？ 能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？ 什么细胞具有无限增殖的能力？ 能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？ 单克隆抗体及其应用 02. 1.传统抗体的获得 向动物体内反复注射某种抗原，从动物血清中分离所需抗体 产量低、纯度低、特异性差、灵敏度低 (2)缺点： (1)方法: 不能无限增殖产生大量抗体。 动物体内 抗原 刺激 浆细胞 抗体 B淋巴细胞 增殖分化 抗原不纯 抗体不纯 单克隆抗体及其应用 02. 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 单一B淋巴细胞 细胞群 选择 克隆 产生 大量纯度高特异性强的抗体 遗憾：B淋巴细胞不可能无限增殖 如何解决这一难题？ 癌细胞能无限增殖，但不能产生抗体 1、科学家发现： 1）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体 2）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上 如何获得大量、单一的抗体？ 干细胞培养及其应用 03. 浆细胞 能产生抗体 骨髓瘤细胞 能无限增殖 单克隆抗体及其应用 02. 19 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖 动物细胞融合 杂交瘤细胞 动物细胞培养 单克隆抗体 杂交瘤细胞：既能迅速大量增殖，又能产生抗体 (2)单克隆抗体的制备思路 1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案： 1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖 米尔斯坦 科勒 单克隆抗体及其应用 02. 2.单克隆抗体的制备 (1)单克隆抗体的概念: 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 一个B淋巴细胞 克隆 细胞群 抗体 单 克 隆 抗 体 单克隆抗体及其应用 02. 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图 单克隆抗体及其应用 02. 单克隆抗体及其应用 02. 23 用抗原注射小鼠 从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养 已免疫多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 诱导融合 多种杂交细胞 小鼠的脾脏中获取 (3)制备过程： PEG融合法、 电融合法、 灭活病毒诱导法 单克隆抗体及其应用 02. 置于选择性培养基上培养 2 杂交瘤细胞 1 3 第一次筛选 多种杂交 瘤细胞 融合的细胞 骨髓瘤细胞 自身融合 B细胞自身融合 杂交细胞 1 3 2 未融合的B淋巴细胞 未融合的骨髓瘤细胞 未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 25 克隆化培养 抗体检测 第二次筛选 (抗原-抗体杂交技术) 多种杂交瘤细胞 能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 阳性细胞 26 注射到小鼠体内 体外培养 分离、提纯单克隆抗体 体内或体外培养 能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 细胞培养工程师在工作 补充资料1：如何进行第一次筛选获得多种杂交瘤细胞？ ←B淋巴细胞及同型融合细胞 ←骨髓瘤细胞及同型融合细胞 ←杂交瘤细胞 ①已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。 ②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不能分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。 筛选出杂交瘤细胞方法？ 不能无限增殖，死亡 不能无限增殖，死亡 能无限增殖，生长 培养基中加入氨基嘌呤 HAT培养基 28 将这些杂交瘤细胞进行培养并稀释 稀释到之后将培养液滴入96孔板的每个孔中，每一个孔中尽量只接种一个杂 交瘤细胞。 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 抗原1 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 抗体检测呈阳性 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 阳性孔 抗体检测板 抗原-抗体杂交(分子水平的鉴定） 抗体检测原理： 34 补充： 若不是滴入每个孔中的不是一个杂交瘤细胞，可再进行多次稀释并检测！ 单克隆抗体及其应用 02. 补充了解——克隆化培养和抗体检测 ★ 有限稀释法 每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞 侧面模拟图 克隆化培养一段时间 取上清液进行抗体检测 将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养） 一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体 上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞 多次克隆化培养以及有限稀释法 补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？ 将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养） 一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体 上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞 多孔细胞培养板 阳性孔 抗体检测板 多次克隆化培养以及有限稀释法 37 比较两次筛选的原因、方法和结果。 第一次筛选 第二次筛选 原因 方法 结果 诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞 用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 筛选获得杂交瘤细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 用96多孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 动物细胞融合 动物细胞培养 给小鼠注射特定的抗原蛋白 B淋巴细胞（免疫） 骨髓瘤细胞 杂交细胞 杂交瘤细胞 单克隆抗体 能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞 第一次筛选 第二次筛选 诱导融合 选择培养基 克隆化培养，专一抗体检验 体外培养或小鼠腹腔内增殖 特异性强 灵敏度高 可大量制备 既能大量繁殖又能产生专一抗体 单克隆抗体及其应用 02. 培养杂交瘤细胞的方法比较 项目 腹腔培养 体外培养 优点 缺点 易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低 规模小，产量少 可大规模培养，大量生产 需要人为控制培养条件，成本相对较高 克隆化培养和抗体检测 用培养液将杂交瘤细胞群稀释 注射到小鼠体内 （体内培养） 体外培养 单克隆抗体 约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养） 多孔细胞培养板 (1)能准确地识别抗原的细微差异; (2)与特定抗原发生特异性结合; (3)可以大量制备。 3.单克隆抗体的优点： 单克隆抗体及其应用 02. 单克隆抗体制备过程中的相关考点总结 （1）该过程中应用到的技术_______________________________________ （2）原理_______________________________________ （3）注射特定抗原的目的______________________________________________ （4）诱导融合的方法______________________________________ 动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________ 动物细胞融合、动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 灭活病毒诱导法 （5）第一次筛选的目的______________________ 第一次如何筛选___________________________ 筛选原理____________________________________________________ _____________________________ 筛选获得杂交瘤细胞 用特定的选择培养基进行筛选 在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 归纳总结 43 单克隆抗体制备过程中的相关考点总结 （6）杂交瘤细胞的特点__________________________________ （7）第二次筛选的目的________________________________________________ 如何筛选_______________________________________ ____________ 选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即______________________________ （8）抗体检测原理_______________________________________ 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选） 分泌的抗体能与特定的抗原结合 抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定） 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 （9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________ （10）如何获取单克隆抗体 ①体外培养___________________________ ②小鼠腹腔内培养_________________________ （11）单克隆抗体的优点_____________________________ _________________________________________________ 在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖 从细胞培养液中获取 从小鼠腹水中获取 能准确地识别抗原的细微差异， 与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 阳 归纳总结 资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。 资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 单克隆抗体的应用 思考讨论 1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ 抗体：主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞； 药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 ①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗； ②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。 单克隆抗体的应用 思考讨论 3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？ ①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高； ②生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒； ③ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 单克隆抗体的应用 思考讨论 （1）诊断试剂——最广泛应用 抗原-抗体杂交法 抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体 在妊娠第8天就可以作出诊断， 比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。 具有准确、高效、简易、快速特点 诊断优点： 4.单克隆抗体的应用 单克隆抗体及其应用 02. 乙肝测定试剂 艾滋病检测试剂 血型检测试剂 新冠病毒检测试剂 （1）诊断试剂——最广泛应用 4.单克隆抗体的应用 单克隆抗体及其应用 02. 抗体-药物偶联物（ADC）通过将 与能特异性识别肿瘤抗原的 结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由_____、______和______三部分组成。 单克隆抗体 细胞毒素 抗体 接头 药物 “生物导弹” =单克隆抗体＋化学药物 或＋细胞毒素 或＋放射性同位素 优点：位置准确、疗效高、副作用小 单抗导向，药物为弹头 靶向运输作用 （2）运载药物 单克隆抗体及其应用 02. （2）运载药物 单克隆抗体+同位素（荧光标记） 在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 结合荧光标记的单克隆抗体药物 单克隆抗体及其应用 02. 单克隆抗体可单独使用，也可直接用于治疗疾病 （3）治疗疾病 单克隆抗体及其应用 02. 单克隆抗体 筛选二 杂交细胞 杂交瘤细胞 体外或 体内培养 筛选一 骨髓瘤 细胞 诱导融合 分泌特异抗体 的杂交瘤细胞 杂交瘤细胞群 提取 已免疫的 B淋巴细胞 动物细胞融合技术 动物细胞培养技术 单克隆抗体的制备 既能大量繁殖 又能产生专一抗体 特异性强 灵敏度高 可大量制备 注射 抗原 课堂小结 53 概述 应用 动物细胞融合 技术 过程 结果 意义 原理 融合方法 原理 应用 单克隆抗体的制备 免疫处理 第一次筛选 诱导融合 第二次筛选 大规模培养 诊断试剂 运载药物 治疗疾病 克隆化培养 抗体检测 体外培养 小鼠腹腔 课堂小结 1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是( ) A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性 B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合 C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞 D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株 C 一.概念检测 针对训练 2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是( ) A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒 B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体 C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞 D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体 A 针对训练 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。 可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。 二、拓展应用 针对训练 补充了解——不同水平的克隆及实例 分子水平 细胞水平 个体水平 DNA复制、PCR技术 动物细胞培养 植物组织培养、动物细胞核移植 细胞水平 单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？ 思考 $