3.2基因工程的基本操作程序 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 选修三 问题探讨 我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。 如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？ 转基因抗虫棉 将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花 2 问题探讨 培育转基因抗虫棉的简要过程 苏云金杆菌 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达 Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 3 目的基因的筛选与获取 1 一 第一步：目的基因的筛选与获取 目的基因： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或 获得预期表达产物等的基因就是目的基因。 主要是指编码蛋白质的基因 使棉花抗虫 转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒 转基因抗除草剂植物 …… 抗逆性 毒物降解 转基因芥属能多吸收土壤中5.3倍的有毒金属硒，而自身却不会死亡 生产药物 重组人胰岛素注射液 工业用酶 那么，如何筛选目的基因呢？ 如：现在需要选择一种抗虫基因，该如何筛选？ 5 Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因。当害虫食用含有转基因的植物时，Bt基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道，在消化酶的作用下，蛋白质能够降解成相对分子质量比解，最后造成害虫死亡。由于Bt毒蛋白对哺乳动物无毒害作用，因而广泛用于抗虫转基因植物。 蛋白酶抑制剂基因广泛存在于植物中它生的抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形复合物，从而阻断或降低蛋白酶的活性，使昆虫不能正常摄取、消化食物中的蛋白质。这种复合物还能刺激昆虫分泌过量的消化酶，引起害虫的厌食反应。 淀粉酶抑制剂基因产生的粉酶抑制剂可以抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性,使害虫不能消化所摄取的淀粉，从而阻断害虫的能量来源。 植物凝集素基因控制植物合成一种糖蛋白糖蛋白可与昆虫肠道黏膜上的某种物质结而影响害虫对营养物质的吸收和利用。 资料卡：可用于转基因植物的抗虫基因 如何选择？ 一 第一步：目的基因的筛选与获取 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 P27 1.3发酵工程及其应用 在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。 ——筛选 7 一 第一步：目的基因的筛选与获取 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 P27 1.3发酵工程及其应用 在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。 研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物 — Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此，Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 还有没有其他筛选方法？ ——筛选 8 序列比对工具 利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因 测序技术 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 序列数据库 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 2 目的基因的筛选 (2)认识基因结构和功能的技术方法： 基因的结构指什么？ 基因在DNA分子上的具体组成和排列方式（碱基排列顺序） 基因的结构指什么？如何检测DNA中碱基排列顺序？随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 9 一 第一步：目的基因的筛选与获取 ——获取 获取目的基因的常用方法有： 人工合成 从基因文库中获取 利用PCR获取和扩增目的基因 10 2 获取目的基因常用的方法 人工合成 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA(即目的基因) 反转录 合成 反转录法： 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 ①前提： ②方法： DNA 合成仪 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 11 供体生物 基因组 DNA DNA片段 限制酶 酶切 与载体重组 导入 成熟的mRNA 逆转录 cDNA 与载体重组 导入 基因组 文库 cDNA 文库 基因文库 提取 提取 第一步：目的基因的筛选与获取 2 获取目的基因常用的方法 从基因文库中获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 （包含一种生物的所有基因） （包含一种生物的一部分基因） 是成熟的RNA 什么是文库？百度文库——储存信息，储存基因的信息 cDNA（互补DNA） 12 扩展：基因文库 01 基因组文库 cDNA文库 某生物体内全部DNA 限制酶 与载体 连接导入 许多DNA片段 受体菌群体 某生物某时期的mRNA 逆转录等 与载体 连接导入 cDNA（互补DNA） 受体菌群体 14 02 目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。 获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？ 思考：各个元件有什么作用？ 15 02 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 基因通常是有遗传效应的DNA片段 DNA片段 基因1 基因2 基因3 放大 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。 非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。 基因的结构 16 基因的结构 2.真核生物的基因结构 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 间隔的、不连续的 内含子 外显子 外显子 内含子 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。 能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。 17 基因的结构 2.真核生物的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 转录 初级RNA 成熟mRNA 剪切、拼接 18 基因的结构 1.原核生物的基因结构 启动子 终止子 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 连续的、不间隔的 RNA聚合酶识别并结合的位点， 驱动基因转录出mRNA。 启动子 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段 位于基因上游 19 基因的结构 1.原核生物的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 连续的、不间隔的 终止转录。 终止子 本质： 位置： 作用： 也是一段有特殊序列结构的DNA片段 位于基因下游 20 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的 相同点 都由能够 的编码区和具有 作用的非编码区组成的 连续 不连续 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较 （2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ （1）非编码序列： 包括非编码区和内含子 【思考】 真核细胞基因结构更长，因为真核生物的基因还包括内含子（不编码蛋白质）。 编码蛋白质 调控 原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列= 非编码区 真核生物的基因：不能编码蛋白质的序列= 非编码区+内含子 21 基因的结构 原核生物 真核生物 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的 相同点 都有能够编码蛋白质的 和 具有调控作用的 区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 非编码序列 =非编码区 原核基因 非编码序列 真核基因 =非编码区+内含子 22 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 有无非编码区 基因中内含子 基因多少 小 大 无 真核生物有 无 真核生物有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 cDNA文库和基因组文库的比较 （在构建表达载体时，必须加入 _________等调控元件才能实现基因的表达） 启动子 如果要将人胰岛素基因导入到大肠杆菌中表达，从哪种基因文库获取目的基因较好？为什么？ 从cDNA文库获取目的基因较好。基因组文库的基因含内含子，大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制（剪切、连接RNA），而cDNA文库不含内含子。 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子） 1. 大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制 内含子无法被剪切：人胰岛素基因是真核基因，含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，其转录系统无法识别和剪切内含子。若直接导入含内含子的基因组DNA，转录后的mRNA会包含内含子序列，导致翻译出的蛋白质错误或无功能。 cDNA文库不含内含子：cDNA文库是通过逆转录mRNA获得的，已去除内含子，因此直接导入大肠杆菌后可直接转录和翻译，生成正确的人胰岛素。 2. cDNA文库更高效 避免冗余序列：基因组DNA包含大量非编码区（如内含子、调控序列），而cDNA仅包含编码区，基因长度更短，便于克隆和操作。 简化表达载体构建：使用cDNA可直接连接至表达载体，无需额外处理内含子，提高重组效率。 23 苏云金杆菌 Bt基因 ？ 大量Bt基因 提取 2 获取目的基因常用的方法 （4）利用PCR（Polymerase Chain Reaction）获取和扩增目的基因 全称： 原理： 操作环境： 目的： 优点： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖 PCR扩增仪 ①PCR的概念： 模拟细胞内DNA的复制过程，在体外快速扩增特定的DNA片段。 获取到一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？ 24 引物 3′ 5′ 子链的延伸方向是5 ′→3 ′ DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 子链 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端 引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 子链合成需要引物 27 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 反应还需要其它条件： 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） 如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备 ②PCR的进行需要的条件： dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 功能：①提供原料；②提供能量 31 【拓展】 DNA的复制的原料--dNTP dNTP 是脱氧核苷三磷酸的缩写，N 是指 A、T、G、C 四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简图如下： P P P ～ ～ N 脱氧核糖 A T G C 脱氧核苷酸 dNTP 为子链合成供能。 dATP dGTP dCTP dTTP 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 32 ③PCR的过程： 33 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 一、目的基因的筛选与获取 4.过程 （三）利用PCR获取和扩增目的基因： 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 (1)变性： 氢键 单链DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ (2)复性： 50℃ 两 思考：引物结合在模板链的什么位置？ 引物结合在DNA模板链 3'端位置， 引导子链从 5'端→3'端方向复制。 设计引物的要求： ①同种引物之间不能发生碱基互补配对，防止引物自身折叠； ②两种引物之间不能互补配对，防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合。③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。 原因是 ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 （4）PCR的过程 第2步：复性 37 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ (3)延伸： 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 ① ： 当温度 时， 双链DNA 为单链。 ② ： 当温度下降到 时， 通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合。 ③ ： 当温度上升到 时， 溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下， 根据 原则合成 新的DNA链。 变性 超过90℃ 解聚 复性 50℃左右 两种引物 延伸 72℃左右 耐高温的DNA聚合酶 碱基互补配对 3.DNA体外复制（PCR）的过程：在 中自动完成。 PCR扩增仪 2、PCR扩增过程中 需要源源不断的加入。 1、一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的 。 模板 引物、原料 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物1的DNA分子数 同时含引物1和2的DNA分子数 消耗引物数量 2n 2n 2n-1 2n-2 2n+1-2 2 4 8 2 4 8 1 3 7 0 2 6 2 6 14 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 40 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升②】PCR中的数量关系： (设n为扩增循环的次数，即DNA复制次数) 1.DNA分子数： 。 2.含引物的DNA分子数： 。 3.含其中一种引物的DNA分子数： 。 4.同时含两种引物的DNA分子数： 。 （注：以两条引物均从DNA分子中间部位结合为例） 第三轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 2n 2n 2n－1 2n－2 长链-中长链DNA____个 2 第一次扩增 0＝21－2 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 2 第二次扩增 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝22－4 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 2 短链-短链DNA______个 2 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 2＝23－6 第四次扩增 中长链-短链DNA____个 6 长链-中长链DNA____个 2 短链-短链DNA______个 8 2n－2n 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 问题3：利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考 · 讨论 47 ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 问题1：用PCR可以扩增mRNA吗？（p79） 不能！ 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 思考 · 讨论 需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 问题2：如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ mRNA是单链RNA分子，无法直接作为PCR的模板。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；核酸酶H（RNase H）是一类能够特异性识别并切割RNA-DNA杂交体中RNA链的核酸内切酶。 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 48 一般不是； 扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段； 问题1：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 思考 · 讨论 设计引物时必须依据： 目的基因的核苷酸序列 问题2：由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？ PCR进行的前提条件是： 已知目的基因的DNA序列 PCR进行的前提条件是已知目的基因的DNA序列。两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 49 要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。 2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。 5’-ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA-3’ 3’-TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT-5’ ① ② ③ ④ 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ 问题：根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。 1、PCR扩增时至少需要____种引物，原因是________________________________________ 2 2、设计引物的要求： ①2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_______________________________。 ②同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_________________________ 防止引物自身配对折叠 防止引物之间配对， 导致引物不能与模板链结合 DNA的两条链是反向平行的（序列不同） 同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：防止引物自身折叠 2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合 50 （5）PCR产物鉴定 3.利用PCR获取和扩增目的基因 常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。 当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向看与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 51 PCR相关应用 扩增目的基因 检测目的基因 产生突变基因 用模板DNA和目的基因相关引物扩增 用待测DNA和 相关引物扩增 有扩增产物则含有目的基因 无扩增产物则不含目的基因 可在引物中或引物的5`端引入突变序列 产生大量目的基因 产生大量突变基因 PCR的应用 52 1.（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作： ①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA； ③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是________________________________________。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指________________________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 ④②③① Taq酶(耐高温的DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 　实战训练　 基因表达载体的构建 2 基因表达载体的构建 2 获得目的基因后直接转入受体吗？ 不是。游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。 基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。 一、基因表达载体的作用 1.使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代; 2.使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。 55 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 1.基因表达载体构建的目的： ①让目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代。 ②同时使目的基因能够 和 。 2.基因表达载体的组成： 稳定存在 表达 发挥作用 呆得住 能表达：转录、翻译 :便于重组DNA分子的筛选； : 位置：位于基因的上游； 作用：RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录； : :主要是指编码特定蛋白质的基因； 位置：位于基因的下游； 作用：终止转录； 终止子 启动子 标记基因 目的基因 复制原点：能够完成自主复制； 问题:目的基因该插入什么位置？ 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： 问题: 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。 一、基因表达载体的构建 （二）组成： 基因工程的核心 启动子与终止子位于DNA分子中， 作用：起始和终止转录过程。 启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中， 作用：起始和终止翻译过程。 问题: 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。 问题: 请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。 一、基因表达载体的构建 （二）组成： 基因工程的核心 一、基因表达载体的构建 （三）构建过程： 基因工程的核心 质粒 限制酶 限制酶切割位点 首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口； 01 一、基因表达载体的构建 （三）构建过程： 基因工程的核心 限制酶 限制酶切割位点 获取目的基因 目的基因 然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段 02 一、基因表达载体的构建 （三）构建过程： 基因工程的核心 DNA 连接酶 重组 DNA分子 获取目的基因 质粒 利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 03 一、基因表达载体的构建 （三）构建过程： 基因工程的核心 质粒 限制酶 限制酶 DNA 连接酶 同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割 重组 DNA分子 限制酶切割位点 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 基因表达载体的构建·判断正误P61 02 (1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　) (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　) (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) × 基因表达载体的构建。 × 终止子 √ 位置 作用 特点 启动子 的起始点 起 作用， 本身 ；. 终止子 的终点 起始密码子 的起始点 氨基酸 终止密码子 的终点 氨基酸 DNA上 mRNA上 翻译 翻译 转录 转录 不转录 编码 不编码 调控 提示： ； 原因：用SmaⅠ会破坏质粒的 ， 不利于 。 重难点：限制酶的选择原则 02 １．构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 抗生素抗性基因（标记基因） 进一步筛选重组DNA分子 提示： ； 弊端：① ； ② ； ③ ； 重难点：限制酶的选择原则 02 相同的黏性末端，可以相互连接！ 2.只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？ 能 质粒、目的基因会发生自身环化连接 质粒与目的基因会发生反向连接 会发生两两自身连接 注：用同种限制酶或 同尾酶处理，产生的 都是相同的黏性末端，均会出现以上弊端。 单酶切法 提示： ； 优点：① ； ② ； 重难点：限制酶的选择原则 02 3.使用Bam HⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA， 能否构建基因表达载体？ 可以防止质粒、目的基因的自身环化连接 还可以防止目的基因与载体的反向连接 注：不能防止 两两自身连接。 相同的黏性末端，可以相互连接！ 能 双酶切法 善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。 重难点：限制酶的选择原则 02 【小结】选择限制酶的基本原则: ①切割目的基因时: ； ②切割质粒时:至少保留一个完整的 ,便于筛选； 除此之外还需保留 、 、 。 ③确保目的基因和载体上有 黏性末端 (补充说明：平末端也可以，但连接平末端效率低）。 能切下目的基因且不破坏目的基因 相同 标记基因 复制原点 启动子 终止子 将目的基因导入受体细胞 3 三 第三步：将目的基因导入受体细胞 受体细胞类型 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 我国科学家独创 常用 显微注射法 Ca2+处理法 植物细胞 1、花粉管通道法 方法一：子房注射法 用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中 含目的基因的DNA 溶液 （我国科学家独创） 1 将目的基因导入植物细胞 70 2.适用生物： 1.受体细胞： 受精卵 1、花粉管通道法 1 将目的基因导入植物细胞 方法二： 柱头处理法 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 3.特点： 简便经济，但要求花朵较大 开花植物 71 （1）花粉管通道法 优点 ①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进 入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的 DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 ②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株 的全套人工培养过程。 受精卵 受体细胞 花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。 72 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 2.农杆菌转化法：(常用) 【资料】转化： 是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 和 的过程 【资料】农杆菌的特点： 农杆菌细胞内含有 质粒， 当它侵染植物细胞后， 能将Ti质粒上的 (可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞内， 并且将其整合到该细胞的 上。 维持稳定 表达 注：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力； 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 Ti T-DNA 染色体DNA 三 第三步：将目的基因导入受体细胞 植物细胞 花粉管通道法 农杆菌转化法 转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 农杆菌 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 Ti质粒 T-DNA （可转移的DNA） 三 第三步：将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 农杆菌 Ti质粒 T-DNA （可转移的DNA） 目的基因 构建表达载体 含目的基因的 重组 Ti 质粒 转入农杆菌 含重组 Ti 质粒的农杆菌 三 第三步：将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 农杆菌 Ti质粒 T-DNA （可转移的DNA） 目的基因 构建表达载体 含目的基因的 重组 Ti 质粒 转入农杆菌 含重组 Ti 质粒的农杆菌 导入植物细胞 将目的基因插入 染色体 DNA 中 三 第三步：将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 农杆菌 Ti质粒 T-DNA （可转移的DNA） 目的基因 构建表达载体 含目的基因的 重组 Ti 质粒 转入农杆菌 含重组 Ti 质粒的农杆菌 导入植物细胞 将目的基因插入 染色体 DNA 中 表现出新性状的植株 三 第三步：将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 农杆菌 Ti质粒 T-DNA （可转移的DNA） 目的基因 构建表达载体 含目的基因的 重组 Ti 质粒 转入农杆菌 含重组 Ti 质粒的农杆菌 导入植物细胞 将目的基因插入 染色体 DNA 中 第一次拼接 第二次拼接 第一次导入 第二次导入 该过程涉及两次拼接和两次导入，你能总结吗？ 两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。 两次拼接 第一次拼接： 目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。 第二次拼接： 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 2、农杆菌转化法 （3） 过程： 两次导入 第一次导入： 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。 第二次导入： 含含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 农杆菌转化法共有几次DNA分子的拼接，几次导入细胞？ 79 方法 ①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与 农杆菌共培养，然后筛选转化细胞， 并再生成植株； ②可以将花序直接浸没在含有农杆菌 的溶液一段时间，然后培植植株并 获得种子，再进行筛选、鉴定等。 受体细胞为_______ 体细胞 受体细胞为_______ 受精卵 （2）农杆菌转化法 80 2 将目的基因导入动物细胞 1、导入方法： 2、受体细胞: 显微注射法 受精卵 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ ①体积大，易操作。 3、过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 ②易表现出全能性。 81 拓展 科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。 如慢病毒载体、腺病毒载体等。 82 将目的基因导入受体细胞·微生物细胞 03 Ga2+处理法（感受态细胞法）： 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 基因表达载体 缓冲液 吸收DNA 完成转化 Ca2+的作用是什么？ 思考 增加细菌细胞壁的通透性。 感受态细胞有什么特点？ 思考 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的 T-­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞 吸收DNA分子 二、将目的基因导入受体细胞的方法 84 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 转录 翻译 如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 剪切、连接 加工 真核基因：编码区（外显子+内含子） 前体mRNA 成熟mRNA 多肽链 蛋白质（四级结构） 原因： ①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA； ②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 一般不能产生原来的蛋白质 85 胰腺 提取筛选 胰岛素mRNA 胰岛素 cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 胰岛素 加工 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达？ 通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。因为原核生物没有内质网和高尔基体，无法对蛋白质进行进一步的加工。 86 目的基因的检测与鉴定 4 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 检测水平： 分子水平 个体水平 Bt基因 结合Bt基因表达的过程，推测可以从哪些方面（或水平）进行检测与鉴定？ 检测内容： 分子水平 分子水平 将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？ 已知目的基因的序列 88 分子水平检测 方法一：DNA分子杂交技术 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。 89 探针 目的基因 带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带，说明 了。 方法一：DNA分子杂交技术 问题1 ：探针的本质是什么？与目的基因的关系是什么？ 探针是一段DNA片段（通常结合放射性同位素或荧光蛋白等）， 探针的序列应与目的基因高度互补，避免与其他基因发生非特异性结合 变性 碱基互补配对原则 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 目的基因整合到受体生物染色体DNA上 若探针与PCR扩增后的基因杂交，出现杂交带，说明目的基因整合到受体生物染色体DNA上了。基本原理: 具有一定同源性的两条DNA单链，热处理后变为单链。在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。 90 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 方法二：PCR扩增 转基因生物 提取DNA 根据目的基因的序列设计PCR引物 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳（常用） DNA测序技术；DNA分子杂交技术等 M：marker； 1：阳性质粒 2：原始品系 3-9：转Bt品系 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 问题1 ：对受体细胞的DNA进行PCR操作，引物该如何设计？结果如何检测？ 判断标准： 91 2 检测目的基因是否转录（mRNA） 转基因生物 PCR操作 电泳检测是否 扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 方法二：分子杂交技术 方法一：PCR扩增 基因探针 转基因生物的mRNA 杂交分子 （可检测） 变性 碱基互补配对原则 基本思路： 1.制作基因探针，并用PCR扩增 2.提取受体细胞全部mRNA，使基因探针和转基因生 物的mRNA杂交，若出现 杂交带，表明转录出了mRNA。 92 注射小鼠体内 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） 2 检测目的基因是否翻译（蛋白质） 方法： 抗原—抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 原理： 思考：如何检测目的基因是否翻译产生了Bt抗虫蛋白？（提示：免疫学方法） 93 二、个体水平的检测 检测目的基因是否表现出相应的性状。 方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等 棉铃虫 棉铃虫（死亡） 94 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未侵染上病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 二、个体水平的检测 95 目的基因的检测与鉴定 4 96 1.目的基因的筛选和获取-前提 DNA合成仪合成 基因文库获取 利用PCR获取和扩增 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.将目的基因导入受体细胞-关键 花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物) 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子水平：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 课堂总结 97 1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？ 转两个T基因 普通棉花细胞 有三种情况，如下图所示。 2.若甲、乙、丙三种植株自交， 其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？ 甲自交→全为抗虫 乙自交→抗虫：不抗虫=3:1 丙自交→抗虫：不抗虫=15:1 甲 乙 丙 思考 · 讨论 98 DNA片段的扩增及电泳鉴定 5 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 一、实验原理 （一）DNA体外扩增的原理： ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 变性 90˚C 延伸 72˚C 退火 50˚C DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 一、实验原理 电泳鉴定原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 （一）DNA体外扩增的原理： DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 二、材料用具 （一）仪器： PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 二、材料用具 （二）材料： ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ③PCR反应体系的配方(见教材) ②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 三、实验步骤 （一）DNA片段扩增的具体过程： 1 2 3 移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。 扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 问题1：预变性的目的是什么？ 问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3 方法步骤 105 问题1：PCR的产物是什么？ 问题2：如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 106 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 1.DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是 。 2.PCR的产物一般通过 来鉴定。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 等有关。 3.凝胶中的DNA分子通过 ，可以在波长为300nm的 下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 注：一般情况下，DNA分子带负电，可以向 极移动。 正 凝胶的浓度 DNA分子的大小和构象 注：①凝胶浓度越大，迁移速度越 ；②DNA分子越大，迁移速度越 。 慢 慢 紫外灯 染色 电泳 注：常用核酸染料为溴化乙锭(简称EB)。 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 110 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 指示剂 ①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。 ②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。 ①常使用一种有颜色的标记物指示样品迁移的速率及方向；通过观察指示剂位置变化判断电泳是否完成 ②使样品呈现颜色，便于加样。 111 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 紫外灯 112 四、注意事项 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、 枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成 小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放 在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 113 DNA片段的扩增及电泳鉴定 5 五、结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 114 五、结果分析与评价 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带， 请分析产生这个结果的可能原因。 115 习题检测 6 习题检测 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的 Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。 判断下列相关表述是否正确。 afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ） (2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ） (3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ） √ × × 117 习题检测 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。 下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 D 118 习题检测 1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时， 发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律， 在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。 请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 119 习题检测 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时,发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外,外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 120 习题检测 2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 121 习题检测 （1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是 ，标记基因是 ，质粒pSYN 12424的作用是 。 ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 （2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？ 不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 122 习题检测 （3）请查找相关资料，了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前 关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。 你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。 123 习题检测 关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。 β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转人了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。 124 THANKS Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.37 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $