3.2.1基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

Bt基因 Bt抗虫蛋白 表达 与表面受体结合 细胞膜穿孔 破坏细胞渗透平衡 最终导致昆虫停止取食而死亡 昆虫中肠细胞 导入 棉花细胞 培育 抗虫棉 想一想：培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤? 1.目的基因的筛选和获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 1 第一步：目的基因的筛选和获取 【自主学习】阅读教材P76-79，思考下列问题： 1.目的基因的定义和主要类型？ 2.如何获取目的基因？ 3.PCR操作原理和基本条件是？ 4.描述PCR的扩增过程及其注意事项。 5.如何鉴定PCR产物？ 第一步：目的基因的筛选和获取 （一）目的基因的筛选 1.目的基因的定义： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 2.目的基因的主要类型： 主要是指编码蛋白质的基因 如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 3.筛选目的基因的方法： 从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效方法之一。 明确了目的基因后，该怎么获得它？ 测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具(如BLAST) 中国抗虫棉GFM Cry1A杀虫基因的合成及表达载体的构建 郭三堆 崔志红 （中国农业科学院生物技术研究所 北京 100081） 摘要： 根据苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1A（b）和Cry1A（c）的氨基酸序列，采用植物偏爱密码子，人工合成了全长1824bp的融合系GFM Cry1ABt杀虫基因，并构建了许带有多个表达调控元件的该基因高效植株表达载体pGB I1214AB，以及该基因和修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTⅠ）基因的双价杀虫基因植物表达载体pGB I1214ABC。经在烟草中验证，这两种表达载体，在植物中可高效表达，并赋予转基因烟草抗虫性。为我国抗虫棉的研究打下了基础。 阅读郭三堆的论文片段，思考：如何获得目的基因? 【思考·讨论】 4.获取目的基因的方法： 方法一、人工合成目的基因（较短的DNA） 在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段 方法二、从基因文库中获取目的基因 方法三、利用PCR扩增获得目的基因 蛋白质氨基酸序列 mRNA序列 基因序列 cDNA文库 逆转录 逆转录酶 酶切的cDNA片段 限制酶酶切 质粒 质粒酶切 连接 导入细菌中 cDNA文库克隆 提取 基因组文库 从细胞中提取DNA 细胞 基因组DNA 质粒 质粒酶切 DNA连接酶连接 限制酶酶切 导入细菌中 基因组文库克隆 提取 酶切的DNA片段 基因组文库 部分基因文库（cDNA文库） （二）目的基因的获取——利用PCR技术扩增目的基因 PCR——多聚酶链式反应（polymerase chain reaction） 1.原理： DNA半保留复制 2.操作环境： 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 3.目的： 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 思考：结合体内DNA复制过程，PCR的进行需要哪些条件？ 第一步：目的基因的筛选和获取 知识回顾：体内DNA复制 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶（打开DNA双链）、DNA聚合酶 条件 ATP 复制方式: 半保留复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） 复制原则: 那么体外复制（PCR）需要什么？ 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 其他条件： 引物、一定的缓冲液、控制温度 （一般会加Mg2+，激活DNA聚合酶） 什么是引物？有什么作用？ 定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单 链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸） 作用：引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端开 始拼接单个的核苷酸进行PCR扩增。 引物 探究•实践 -3′ 5′- -5′ 3′- 3′- -5′ 子链延伸 5′- -3′ 子链延伸 由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需2种引物。2种引物之间无关系，序列不同，不互补。 四种脱氧核苷酸(实际上是4种dNTP) 微量离心管 缓冲液 DNA模板 引物 耐高温的DNA聚合酶 PCR反应过程 3` 5` 5` 3` 92 55 75 ℃ 变性 3` 5` 5` 3` 复性 92 55 75 ℃ 延伸 5` 3` 3` 5` 3` 3` 3` 5` 5` 3` 5` 5` PCR的扩增具体过程： 变性 复性 延伸 温度：90℃以上 过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链 温度：50℃左右 过程：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 温度：72℃左右 过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的3’端，合成新的DNA链。 反复循环 思考：PCR技术要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 第一次 第二次 5’ 3’ 3’ 5’ 第三次 思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？ 每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 PCR技术至少要循环三次才能从DNA分子中分离出目的基因 PCR扩增过程中产生等长的目的基因片段的分析 （1）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过 循环后产生等长的目的基因片段，有 个； （2）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过4次循环后产生等长的目的基因片段有 个； （3）循环n次，会得到 个DNA分子； （4）循环n次，需要 对引物； （5）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过n次循环后产生等长的目的基因片段有 个。 3 2 2n – 2n 【思考·讨论】 8 2n 2n-1 前提：模板DNA的起始数量为1，且引物与DNA分子的中间部位结合时 思考1：PCR过程中，如果两种引物之间的互补序列较长的话，会有什么样的结果？ 引物之间互补序列过长，引物互相结合，从而使引物不能很好的与模板DNA链结合。 若引物自身互补序列过长，引物自身会折叠形成发夹结构。影响引物与待增DNA的靶序列杂交结合。 思考2：用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 （三）PCR扩增产物的鉴定 第一步：目的基因的筛选和获取 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 原理： DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。通过比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋 方式 场所 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化 边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋 全部解旋后再复制 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链 PCR技术和细胞内DNA复制的比较 拓展延伸 1.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其基本原理与细胞内DNA的复制类似。下列不是两者共同点的是（ ） ①边解旋边复制 ②遵循碱基互补配对原则 ③需要引物④反应条件需要高温 A.①② B.②③ C.③④ D.①④ D 2.请为下列目的基因选择引物序列，并标出子链的方向。 TTAGCCGGAAT 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ GGGCCTTAATC 3’ 5’ 引物1 引物2 AATCGGCCTTA 5’ 3’ AATCGGCCTTA CCCGGAATTAG TTAGCCGGAAT GGGCCTTAATC CCCGGAATTAG 5’ 3’ 引物3 引物2 引物3 引物4 课 堂 检 测 3.用Xho I和 Sal I 两种限制性内切核酸酶分别处理同一 DNA 片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述正确的是（     ） A．PCR 扩增图1 所示 DNA片段 所需温度最高的步骤是复性 B．图2中泳道②是用 XhoⅠ处理得 到的酶切产物 C．图2中酶切产物可用DNA聚合酶催化重组 D．DNA 聚合酶和 DNA 连接酶起作用时都需要模板 B 课 堂 检 测 A．为达到目的需要添加限制 性引物的数量为31n B．经过5轮的扩增可形成32n 个双链DNA分子 C．应选择引物Ⅰ和Ⅳ，且引物Ⅰ作为非限制性引物 D．DNA 在体内复制时使用的酶和PCR体系相同 4.（不定项）不对称PCR是一种特殊的PCR技术，通过使用数量不等的一对引物来产生大量单链DNA，其中少的称为限制性引物，多的称为非限制性引物。现有DNA分子n个，已知A链是需大量扩增产生的单链DNA，限制性引物仅可供前5轮扩增，如图所示。下列叙述错误的是（　 　） CD n+ 2n+4n+8n+16n= 31n n×25=32n 引物Ⅳ 体内DNA复制用的酶是DNA聚合酶、解旋酶，PCR体系只用耐热DNA聚合酶，不需要解旋酶（高温代替） 课 堂 检 测 获得目的基因后，能直接导入受体细胞吗？ 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 1 2 构建基因表达载体 目的：确保目的基因在受体细胞中能够稳定存在和表达， 并且能够遗传给下一代。 如何构建基因表达载体？ 22 2 第二步：基因表达载体的构建 【自主学习】阅读教材P80，思考下列问题： 1.基因表达载体由哪些部分组成？分别有什么作用？ 2.描述构建基因表达载体的过程？ 3.用限制酶切割目的基因和载体可能会出现哪些问题？如何解决？ 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 限制酶切割位点：供外源DNA片段插入其中。 目的基因：改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。必须插到 和 之间 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA DNA 下游 转录 启动子 终止子 第二步：基因表达载体的构建 DNA复制的起始位点（DNA聚合酶结合位点） 便于重组DNA分子的筛选 如抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等 24  项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 作用 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 基因上游 基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 拓展延伸 25 构建基因表达载体的过程 1.用限制酶在载体的基因插入位点处切割质粒 2.用同种限制酶切割含有目的基因的片段，获取目的基因 3.用DNA连接酶把目的基因和载体连接，构建重组DNA分子 思考：在切割目的基因和载体时，可能会出现什么问题 ？ 注意：切割时切点不能在目的基因上 A B A B A G C T T A A B G A A T T C A B G A A T T C G C T T A A A—B G C T T A A G A A T T C A—B G A A T T C G C T T A A 自身环化 A-A B-B 反向连接 可能出现的问题： A B A B A-B B-A 思考：导致DNA（质粒）出现自身环化的原因有哪些？ 1.用同一种限制酶（单酶切） 2.同裂酶切：不同限制酶，但能识别相同的DNA序列且切点相同。（例：MboⅠ、DpnⅠ） 3.同尾酶切：识别不同的核苷酸序列，但是酶切产生相同的黏性末端。（例：AgeⅠ、AvaⅠ） 不能被原来的限制酶识别 4.平末端链接（可能不被原来的限制酶识别） 解决方法： 用不同限制酶的得到不同的末端（双酶切） 模拟基因表达载体的构建过程，此过程用到了哪些酶，分析原因。 探究活动 限制酶：BamHI 、EcoRI DNA连接酶：连接磷酸二酯键 产物：重组DNA分子 在不破坏目的基因的前提下，保证目的基因和质粒正向连接，防止质粒和目的基因自身环化。 5.（不定项）如图为基因表达载体的模式图，下列叙述正确的是（　 　） A．构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶 B．启动子是一段有特殊序列的DNA片段 C．终止子位于基因的下游，使翻译在所需要的地方停下来 D．抗生素抗性基因可检测受体细胞中是否导入了目的基因 ABD 课 堂 检 测 6.目的基因的序列长度为2.0kb(1kb为1000个碱基对)，质粒的序列长度为3.8kb，两者具有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ的识别切割位点，如图所示。使用BamHⅠ对目的基因和质粒进行酶切后构建重组质粒，通过酶切和电泳可检测目的基因是否正确接入质粒。检测时选用的限制酶是（　　） A．EcoRⅠ 和 BamHⅠ B. EcoRⅠ 和 HindⅢ C. BamHⅠ 和 HindⅢ D. BamHⅠ 和 EcoRⅠ B 课 堂 检 测 7.（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒 （该质粒的部分结构如图所示）。 重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。  782   终止子（复制原点）   P1 和 P3 课 堂 检 测 Lavf58.46.101 Lavf58.46.101 $