专题03 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题（期中真题汇编，北京专用）高二生物下学期

专题03 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具和基本操作程序 考点02 基因工程的应用 考点03 生物技术的安全性与伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具和基本操作程序 一、单选题 1．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)下列有关基因工程的叙述，正确的是（　　） A．目的基因导入受体细胞后，一定能稳定遗传 B．构建载体与目的基因重组的DNA是基因工程的核心 C．DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 2．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)利用PCR技术分析粪便已成为珍稀野生动物种群调查的有效手段，同种生物不同个体在同源染色体某些位置上DNA片段长度存在差异，这些片段可作为辨别不同个体的依据。下列叙述错误的是（　　） A．需去除粪便中微生物的DNA以免干扰实验结果 B．设计PCR引物时需要考虑物种特异性 C．反应体系中需加入四种脱氧核苷酸作为原料 D．PCR添加的两种引物均成为每个主要产物分子的一部分 3．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　） A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA分子 C．泳道①中是用Sal Ⅰ处理得到的酶切产物 D．限制酶既可切割双链DNA也可以切割单链DNA 4．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)下列与生物工程中有关的酶的说法，正确的是（　　） A．限制性内切核酸酶和解旋酶都作用于氢键 B．逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板 C．DNA聚合酶和RNA聚合酶发挥作用时都需要引物 D．DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成 5．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)荒漠植物的Z基因与其抗旱性强有关。科学家利用Z基因和农杆菌的Ti质粒（如图，T-DNA为可转移的DNA）构建表达载体，培育抗旱转基因小麦。下列说法错误的是（　　） A．T-DNA能整合到小麦细胞染色体上 B．可用限制酶Cla Ⅰ和Sac Ⅰ处理Z基因 C．可用卡那霉素筛选含重组Ti质粒的农杆菌 D．可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状 6．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)用含有特定抗生素抗性基因的质粒载体将目的基因导入大肠杆菌，然后接种在固体培养基上进行培养。以下操作不能确定受体细胞中是否含有目的基因的是（　　） A．用含有相应抗生素的选择性培养基来培养转化后的细菌 B．用筛选出的菌落中的菌体DNA作为模板，用相应引物进行PCR扩增 C．提取筛选出的菌落中菌体的质粒DNA，用相应限制酶切割后进行电泳 D．提取筛选出的菌落中菌体的质粒DNA，进行测序后与目的基因序列进行比对 7．(24-25高一下·北京市陈经纶中学·期中)化疗会造成癌症病人血小板减少，血小板生成素（TPO）可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中，获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述不正确的是（　　） A．构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶 B．用PCR技术可获取和扩增人TPO基因 C．表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等 D．用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况 8．(24-25高一下·北京市第八十中学·期中)利用PCR可以在体外进行DNA片段扩增，下列叙述错误的是（　　） A．通过改变体系中的温度，控制PCR的反应进程 B．PCR是酶促反应，需加入解旋酶和DNA聚合酶 C．通过引物的设计可以做到选择性扩增DNA片段 D．根据DNA分子的大小和构象，通过电泳鉴定产物 9．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中·期中)某遗传病的正常基因和突变基因单链片段如图1，研究人员拟用PCR扩增2种基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点如图2）酶切，检测基因突变情况。下列叙述不正确的是（　　） A．PCR可以用5'-GGCATG-3'作为其中一条引物 B．PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶 C．限制酶酶切后形成的末端为-GATG- D．限制酶酶切后突变基因不会形成两个片段 10．(24-25高一下·北京市延庆区·期中)科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，检测原理（a、b）及结果（c）如下图。下列叙述错误的是（　　） A．需要针对不同病原体设计特异性引物和荧光探针 B．图中b是PCR反应的复性过程 C．多重PCR同时完成对4种病原体的检测 D．由结果推测该检测样品中有A病原体的核酸 11．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（　　） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择Sma Ⅰ进行醇切，再用DNA连接酶连接 C．构建载体P和载体E时使用的DNA连接酶均需选用T4 DNA连接酶 D．构建表达载体时，应选择Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切载体E和含目的基因的载体P 12．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)转基因抗虫棉在我国的种植面积已占全国棉花种植面积的90%。研究者利用PCR技术检测杂草中有无转基因成分，得到如图所示结果。相关分析错误的是（　　） A．空白实验是未加入DNA模板得到的电泳结果 B．推测棉田杂草6、7与抗虫棉的亲缘关系较近 C．结果说明校园杂草与棉花间一定存在生殖隔离 D．转基因成分进入杂草体内可能会引发生态问题 13．(24-25高一下·北京市通州区·期中)将某病毒的外壳蛋白（L1）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建L1-GFP融合基因，再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中限制酶E1～E4处理产生的黏性末端均不相同。相关叙述不正确的是（　　） A．构建L1-GFP融合基因需要用到E1、E2、E4三种酶 B．E1、E4双酶切确保L1-GFP融合基因与载体的正确连接 C．GFP可用于检测受体细胞中目的基因是否表达 D．将表达载体转入羊的乳腺细胞中可培育乳汁中含L1蛋白的转基因羊 14．(24-25高一下·北京市第八十中学·期中)关于DNA粗提取与鉴定的实验，下列叙述错误的是（　　） A．洋葱、香蕉、菜花、猪血可作为理想的实验材料 B．用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA去除不溶杂质 C．用95%的冷酒精析出DNA，去除蛋白质等杂质 D．溶解粗提取的DNA加入二苯胺试剂沸水浴，溶液呈蓝色 15．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)蛛丝的强度和柔韧度得益于蛛丝蛋白的特殊布局，使它产生了一个由坚硬的结晶区和非结晶区构成的混合区域。有人试图通过破解蛛丝蛋白的结构从而推测出其相应的基因结构，以指导对蚕丝蛋白的修改，从而让蚕也吐出像蛛丝蛋白一样坚韧的丝。此过程运用的技术及基本思路分别是（　　） A．基因突变；DNA→RNA→蛋白质 B．基因工程；RNA→RNA→蛋白质 C．蛋白质工程；DNA→RNA→蛋白质 D．蛋白质工程；蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质 16．(24-25高一下·北京市第五十七中学·期中)利用基因工程技术生产特定单克隆抗体的流程如下图。下列叙述错误的是（　　） A．过程①需要使用限制酶、DNA连接酶 B．过程②是将重组质粒导入噬菌体并启动基因表达 C．过程③利用抗原-抗体的特异性结合筛选目标抗体 D．过程④可将目标抗体A的基因导入酵母菌进行发酵生产 17．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)噬菌体展示技术（如图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　） A．建立噬菌体展示库需限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白 C．用含有碳源、氮源等营养物质的培养基培养噬菌体 D．该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因 18．(24-25高一下·北京市通州区·期中)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。相关叙述不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS基因，需用Sal Ⅰ和Sph Ⅰ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 19．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)油菜是我国的重要油料作物，其生长受到核盘菌引起的菌核病威胁。科研人员试图培育抗菌核病的转基因油菜新品种，其抗性机理如下图所示，相关叙述正确的是（　　） A．将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜获得转基因植株 B．核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因表达出相应蛋白质抵御核盘菌侵染 C．未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能合成转录因子B，不启动防御基因表达 D．转基因油菜中的启动子pB属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达 20．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中学·期中)酵母人工染色体pYAC2是以酵母菌为受体细胞构建基因文库时的常用载体。下图为pYAC2的结构示意图，导入受体细胞前用限制酶BamH Ⅰ切割可使其成为线性的染色体。pYAC2适配的受体菌菌落呈红色，sup4基因表达能够抑制其性状表现，使菌落呈白色。相关叙述错误的是（　　） A．导入pYAC2的受体菌能够在不含色氨酸的培养基中生存 B．用BamH Ⅰ切割pYAC2后，TEL端粒序列位于染色体的两端 C．着丝粒序列CEN4的存在可防止pYAC2在细胞分裂中丢失 D．将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选白色菌落 二、非选择题 21．(24-25高一下·北京市平谷中学·期中)以侯云德院士为首的研究人员，成功研制出我国第一个基因工程药物——重组人干扰素。下图为研制重组人干扰素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构示意图。已知大肠杆菌原本不含lacZ和氨苄青霉素抗性基因。lacZ：β-半乳糖苷酶基因，编码的β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。回答下列有关问题： （1）据图分析，为使目的基因与载体正确连接，应选择的限制酶是________。 （2）已知人体内干扰素基因不能在大肠杆菌中正确表达，一般从淋巴细胞中提取mRNA经________合成cDNA，然后利用PCR技术扩增。 （3）由于干扰素cDNA的两端无限制酶切割位点，需要分别在引物的5′端引入限制酶识别序列，已知干扰素cDNA①处的碱基序列为5′—CCTTTCAGCTCA—3′，则a链引物设计的序列是5′—________—3′（写出10个碱基序列）。 （4）标记基因具有指示和筛选的作用，欲筛选转化成功的大肠杆菌，应将其接种到添加了________的培养基上，最终选择________色的菌落。 （5）干扰素在体外保存相当困难，如果将分子上一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么-70℃条件下可以保存半年，实现上述目标利用的技术属于________，本质上设计改变的是________（填“蛋白质”或“DNA”）分子。 22．(24-25高一下·北京市海淀区人大附中·期中)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 （1）将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。 （2）为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是________，因而被用于制备监测鱼（MO）。 （3）现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：________。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因：________ A．GFPB．Gal4C．雌激素受体基因（ER）D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） （4）SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后________造成不育。 （5）使拟用于实际监测的SM不育的目的是________。 23．(24-25高一下·北京市通州区·期中)人β防御素是一种抗菌肽。为了达到高效纯化人β防御素的目的，科研人员对能生产该抗菌肽的基因工程酵母菌进行了下列改造。 （1）ELP是一段人工合成的DNA片段，科研人员将该片段插入pGE—H中，构建重组质粒pGE—H—ELP，以融合表达H—ELP蛋白，如下图所示。 注：Xba Ⅰ的识别序列为：5′-TCTAGA-3' Nhe Ⅰ的识别序列为：5′-GCTAGC-3' EcoR Ⅰ的识别序列为：5′-GAATTC-3' 为大量扩增ELP序列，可以采用________法。在上述改造过程中，需要使用________切割ELP序列和pGE-H质粒，再使用________构建重组质粒。 （2）为鉴定筛选出的酵母菌菌落中是否含有正确插入ELP序列的重组质粒，科研人员将上述酵母菌培养在有________的培养基中，挑取了1～4号菌落。扩大培养后，使用Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ对菌落中提取到的质粒进行了双酶切和电泳。由右图可知，1～4号单菌落中，________是含有正确插入ELP序列重组质粒的酵母菌。请结合上述信息解释2号菌落中出现长度为3.7kb条带的原因________。 （3）为探寻高效纯化H—ELP融合蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对H—ELP融合蛋白纯化效果的影响，如下图所示。 结合上述研究成果，你认为，高效纯化H—ELP蛋白的条件是________。 24．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)近年来，在处理富营养化水体的污水过程中，与化学、物理除氮方法比较，目前认为微生物反硝化去除氮素污染更为经济有效。科研工作者采用基因工程技术构建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，进行了相关研究。请回答问题。 （1）微生物的反硝化作用，是氮循环中一个重要的生物过程。亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）转录后，再翻译出具有________作用的蛋白质。 （2）工程菌的构建 ①研究者利用NCBI数据库查到nirS基因的碱基序列，设计引物，利用PCR技术扩增nirS基因。PCR技术利用了________的原理。 ②研究者用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ两种限制酶处理nirS基因与p质粒，在________酶的作用下进行体外连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含庆大霉素的培养基中进行培养并提取质粒，如果用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，得到两个片断电泳结果分别与________电泳结果基本一致，说明获得重组质粒pYP4S。 ③将pYP4S转化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培养后进行PCR鉴定。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图1所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是________。某学生错选了图中的另外一对引物组合，扩增出长度为2.1kb的片段，原因是________。 （3）检测工程菌YP4S除氮的效能 工程菌株YP4S在已灭菌的模拟污水中培养36h后，检测结果如图2。结果表明________。 25．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)β-胡萝卜素可在人体内转化为维生素A。普通水稻胚乳细胞中不含B-胡萝卜素，科研人员利用基因工程技术培育富含β-胡萝卜素的“黄金大米”。 （1）培育黄金大米时，需要将psy基因（八氢番茄红素合成酶基因）和crt Ⅰ基因（胡萝卜素脱饱和酶基因）转入水稻，为此研究者需构建含有图1所示重组T-DNA片段的重组Ti质粒。 ①据图分析，构建重组T-DNA片段时，科研人员首先要用限制酶________和DNA连接酶处理，将psy基因和crtⅠ基因接入，再用________处理，将潮霉素抗性基因接入。再通过________法将该T-DNA片段导入水稻细胞。 ②重组T-DNA片段中接入潮霉素抗性基因的作用是________。 ③重组T-DNA片段中有两种启动子，推测________（填“启动子1”或“启动子2”）是水稻种子的胚乳细胞特异性表达的启动子。 ④据图分析潮霉素抗性基因和psy基因转录时所使用的模板链________（选填“相同”或“不同”），下列选项可作为判断依据的是________（选填下列字母）。 a．潮霉素抗性基因和psy基因转录方向不同 b．转录时，均以基因的一条链为模板 c．转录时，RNA延伸方向均为5'→3' d．DNA聚合酶催化转录过程 （2）黄金大米细胞内，上述两种酶参与β-胡萝卜素的合成途径如图2： 上述途径获得的第一代黄金大米中β-胡萝卜素含量不够高，经检测发现是八氢番茄红素含量较低造成的。科研人员据此分析，________的活性影响了β-胡萝卜素含量。请提出设计方案，以获得β-胡萝卜素含量更高的“第二代黄金大米”：________。 26．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)人血清白蛋白（HSA）是血液中最丰富的循环蛋白，承担着多种物质运输的功能，同时参与多项生命活动的调节，因此在医疗领域有着十分广泛的用途。在生产真核生物蛋白时，动物乳腺反应器具有产量高、易于纯化、产物更接近天然活性等优势。 （1）人血清白蛋白基因的结构及控制HSA合成的过程如下图所示。 图1中步骤一是________，完成步骤二需要________等细胞器参与。 （2）研究者通过一系列方法获得了大量的含有HSA基因14个外显子的cDNA片段HSA-1（没有内含子，如图2所示）。但实践研究发现，HSA的部分内含子尽管不直接参与HSA蛋白的编码，却具有提高表达效率的重要作用，因而必须保留。 为此研究者还需要从________（选填“cDNA文库”或“基因组文库”）中调取含有内含子序列的HSA基因信息，并获得了如图2所示的HSA-2。为了保证HSA-2能插入HSA-1中原始位置，应选用图2中的________酶同时切割HSA-1和HSA-2，并用________连接，得到最终所需的HSA-3片段。从外显子和内含子组成上判断，HSA-3片段含有________序列，经检测其编码的氨基酸序列与天然HSA蛋白完全相同。 （3）研究者用构建好的含有目的基因的重组DNA导入牛的成纤维细胞，检测到成纤维细胞所分泌的HSA蛋白________，说明目的基因在受体细胞中成功表达。接下来，进行染色体核型分析确定染色体组成正常后，需要再借助________技术，才能获得分泌HSA的转基因牛。 地 城 考点02 基因工程的应用 一、单选题 1．(24-25高一下·北京工业大学附属中学·期中)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是（　　） A．使转染到膜上的细菌的DNA变性就是加热让脱氧核苷酸上的磷酸二酯键打开 B．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 C．重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接 D．放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置 2．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)CRISPR/Cas9基因编辑技术是利用Cas9蛋白—sgRNA复合体对双链DNA的特定序列进行识别并切割，从而达到基因定点敲除、插入、替换的目的。其中sgRNA的引导序列负责对DNA上的靶序列进行定位，再由被激活的Cas9蛋白对靶序列进行切割（如图所示），下列相关叙述错误的是（　　） A．sgRNA的引导序列可在DNA聚合酶的催化下合成 B．Cas9蛋白—sgRNA复合体的功能类似于限制酶 C．sgRNA引导序列对DNA靶序列进行定位，利用了碱基互补配对原理 D．该技术能实现对基因的定向改造，可用于某些疾病的基因治疗 二、非选择题 3．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)科研人员开发出了能编辑叶绿体基因组的基因编辑系统CyDENT。 （1）这套系统的核心是FokI-TALE融合蛋白，Fok Ⅰ是一种低特异性的内切核酸酶，TALE是一种能识别特异性序列的DNA结合蛋白，形成的基因编辑复合物如图1。使用CyDENT系统进行基因编辑属于________水平的研究。研究团队在CyDENT系统中设计的TALE-FokI蛋白在功能上类似于常用基因工程工具中的________。 （2）研究团队利用叶绿体定位序列（CTP）构建了如图2所示的基因表达载体，请结合图3阐述CyDENT系统编辑叶绿体基因组的机制：________。 （3）研究团队决定进一步挖掘CyDENT编辑系统的潜力，根据不同的编辑需求选择不同载体模块组合成系统：例如换用不同类型的启动子。假设需要仅在人类大肠组织中编辑名为BST114的细胞核基因，请参照图2，选择合适的模块设计CyDENT系统的表达载体： ①________ ②________ ③________ 终止子 （4）CyTENT系统编辑核基因的效率尚不如成熟的CRISPR基因编辑系统。请提出CyDENT编辑技术在人类健康领域内的应用方向：________。 4．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)生长季节气温每升高2℃，作物产量就会下降3%至13%。为保障全球粮食安全，科学家拟利用转基因技术育种，培育出在正常条件下能实现高产、在高温胁迫下能保持稳定产量的“气候智能型”作物。 （1）转基因技术的实现需要利用限制酶、________和载体三种基本工具。 （2）科学家实验后发现：在高温胁迫下LIN5基因表达量下调，导致发育中的果实果糖含量下降，导致番茄减产。科学家将持续高表达启动子与LIN5基因连接后构建基因表达载体，通过________导入番茄体内，获得了持续高表达LIN5番茄。测量两类植株在不同条件下的产量，结果如图1。 结果显示：________；在高温条件下，两类植株的果实产量无明显差异。请结合上述实验，提出稳定番茄产量的改进方案：________。 （3）研究者找到了能响应高温条件表达的热休克元件HSE。科学家构建了3类载体（如图2所示），利用植物中的荧光素酶报告基因检测改造后LIN5启动子的功能。请写出支持上述方案的预期实验结果：________。 （4）科学家重新构建了基因表达载体，转入番茄体内，获得了新的转基因植物“智能”番茄。“智能”番茄在常温和高温下果实产量均高于野生型，而两种情况下CO2吸收速率与野生型相同。请尝试提出一种能解释上述情况的假说，并说明验证假说时所采用的技术________。 5．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中学·期中)疫霉菌感染会造成辣椒严重减产，科研人员开展相关研究。 （1）红光可以激活光敏色素，进而促进相关蛋白（如H蛋白）的合成，调节植物体对病原菌的响应。已知水杨酸（SA）可以抵御疫霉菌侵染，科研人员测定辣椒叶片中的SA含量，如图1。据此分析，两种不同光处理后，辣椒感染程度不同的原因是________。 （2）已知P酶催化合成SA。研究发现，正常辣椒叶片几乎不表达H蛋白；若发生感染，4天后叶片中的H蛋白含量显著升高。额外施加红光处理感染叶片，H蛋白在1小时内可达到相同水平。科研人员推测，H蛋白可能调控P基因表达P酶。为验证上述推测，开展如下实验。 实验一：进行如图2所示转基因操作，随后用荧光素处理获得的转基因辣椒叶片，检测荧光素酶催化荧光素发出的荧光，结果显示，与对照组相比，转基因植株荧光强度较高。 图2中，质粒上甲、乙、丙处依次应为________（填选项前字母）。 a．P基因启动子 b．组成型启动子 c．H基因启动子 d．P基因 e．H基因 f．荧光素酶基因 注：组成型启动子能够调控基因在全部组织中稳定转录。 实验二：将不同组分混合保温后，电泳检测标记条带如图3。本实验中的X是________（填选项前字母）。结果表明，H蛋白直接结合P基因启动子。 a．标记的P基因启动子 b．未标记的P基因启动子 c．标记的无关基因启动子 d．未标记的无关基因启动子 （3）证实“辣椒感染后H蛋白促进P基因表达”这一结论，实验一比实验二更具有说服力，体现在________。 （4）结合以上研究，请提出一种减轻疫霉菌感染造成减产的措施________。 6．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，可大幅节约生产成本。科研人员研究了R基因来提高酵母的絮凝能力。 （1）啤酒生产中，酵母菌产酒过程的反应式为：________。 （2）科研人员利用基因工程技术获得R基因被敲除的酵母菌菌株。 ①构建含有卡那霉素抗性基因和R基因上、下游序列的打靶DNA序列，用LiC1处理酵母菌，使其处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，以实现________。打靶DNA序列上的卡那霉素抗性基因通过同源重组机制，替换了酵母菌基因组中的R基因（如图1）。这种机制与减数分裂中的________过程机制相似，都属于基因重组。 ②利用含有卡那霉素的培养基获得单菌落。挑取单菌落，利用PCR技术进行扩增，以确定酵母细胞的R基因是否被成功敲除，供选择的引物如图1所示。除引物1、4组合外，还可以选用的引物组合有________，请在答题纸上画出用引物1、4组合进行PCR时敲除和未敲除对应的电泳结果，要求标出每个电冰条带对应的DNA片段长度________。 （3）科研人员对野生菌株和R基因敲除菌株的酒精发酵能力和絮凝能力进行了测定，结果如下表。 菌株\指标 酒精发酵能力 絮凝能力 野生菌株 4.5% 63.06% R基因敲除菌株 4.5% 83.12% ①检测酒精发酵能力时，将菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，11℃静置发酵7天。发酵期间，每个锥形瓶应注意保持________条件和定时排气。 ②实验结果表明，获得的R基因敲除菌株符合生产需求，依据是________。 （4）科研人员进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制。 ①将R基因敲除菌株和野生菌株分别用________水进行稀释。将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30μg/mL钙荧光白（细胞壁组装抑制剂）的YPD平板培养（培养酵母菌的常用培养基）上，培养适当时间后结果如图2。 ②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是________。 （5）若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒，请尝试提出一个还需要进一步研究的问题：________。 【答案】（1）C6H12O62C2H5OH（酒精）+2CO2+能量 （2）打靶DNA序列的导入 同源染色体的非姐妹染色单体交换片段 2和3、1和3、2和4 见图 （3）密闭 不影响酒精发酵能力，但絮凝能力提高 （4）无菌 R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，进而提高絮凝能力 （5）R基因敲除菌株的食用安全性/R基因敲除菌株的遗传稳定性 7．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)东方果蝇会在瓜果的内部产卵，引起果实早落，给果农带来极大的经济损失。研究人员尝试利用蓖麻毒素，研发雌性特异性致死基因系统，以减少雌果蝇的数量。 （1）蓖麻毒素是蓖麻种子中的一种毒蛋白，由RTA和RTB两部分功能不同的肽链组成。其中RTB可与细胞表面的糖蛋白或糖脂结合，毒蛋白以________方式进入细胞，随后在________（填细胞器）内被部分水解，毒蛋白链间二硫键断裂，释放出RTA。RTA具有rRNA酶的活性，可导致________（填细胞器）失活，影响蛋白质合成。 （2）东方果蝇的dsx基因具有特异性剪切识别序列，雌性个体中该序列能使dsx基因的内含子转录的序列被剪切掉，而雄性个体无此功能，因而雌雄果蝇会产生不同的dsx成熟mRNA。研究人员将dsx基因的部分序列与RTA基因融合（如图1），获得融合基因1，构建________，导入果蝇的________，进而得到转基因果蝇。转基因雌蝇中表达的肽链对应的mRNA为________（填图2中字母）。由于存在性别选择性剪接机制，雌蝇会特异性致死。请分析转基因雄蝇不会致死的原因是________。 （3）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为引物a精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，对融合基因1进行定点突变获得融合基因2（如图3）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，并标明每条链的5'端和3'端________。 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： i：在29℃收集雄性果蝇（G0）。 ii：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 iii：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若________，则说明G1具有cs效应。 iv：在________℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代相互交配，得到转基因纯合子。 8．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中学·期中)土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，培育耐盐碱农作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。 （1）为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建过表达植株（AT1-OE）。以高粱cDNA为模板，利用_________方法获取目的基因。如图1，选取最佳限制酶_________处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选T-DNA成功转入的愈伤组织，使用既能杀死原核细胞，又能杀死真核细胞的潮霉素，效果优于仅能杀死原核细胞的抗生素（如卡那霉素），原因是_________。进一步筛选获得所需愈伤组织，经_________发育成完整植株。同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。 （2）检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株_________，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 （3）高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图3。 ①检测总蛋白的目的是_________。 ②通过条带_________可以判断，AT1与PIP2有相互作用。若想进一步验证该相互作用，可用_________抗体与新磁珠偶联再次进行实验。 （4）细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是_________。 9．(24-25高一下·北京市陈经纶中学·期中)人β防御素（由H基因编码）是一种抗菌肽，科研人员欲利用酵母对其进行生产。 （1）获得H基因的序列信息后，可以其cDNA为模板通过_________方法获得该基因。 （2）由于人β防御素会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员在酵母菌基因组DNA中插入Р和S基因，使质粒上H基因的表达受到红光控制。红光调控H基因表达的原理如图1所示。 P和S基因应为_________（填“组成型表达”或“红光诱导表达”）。 （3）发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统（图2），在酵母菌基因组中插入了2个E基因，使F基因的表达受到蓝光控制（图3）。 图3中两个E基因作用分别是_________。 （4）工程菌泄露到环境中可能引发环境问题。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T和L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，进而诱导工程菌死亡（图4）。 图4中①②应选用的启动子为：①_________，②_________。 A．Jub B．ACT C．CYC 图4中③④处结合的阻遏蛋白为：③_________，④_________。 a、T蛋白 b、L蛋白 （5）写出利用该工程菌发酵生产人β防御素的步骤。_________。 10．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)请阅读以下文章并回答问题。 “基因魔剪”CRISPR/Cas9系统 20世纪90年代，研究发现细菌DNA中存在一种特殊的DNA序列，由重复序列和间隔序列交替排列组成，如图1所示。研究发现这些序列与很多核酸酶关联，之后，将这些序列命名为CRISPR，并以Cas来命名相关的核酸酶。 研究发现，间隔序列中往往会有一些来自噬菌体的DNA片段。科学家假设：CRISPR/Cas是细菌在长期消化过程中形成的用以保护自身对抗病毒的适应性免疫防御系统。为此，科学家用两种噬菌体（P1和P2）侵染野生型嗜热链球菌，对幸存的嗜热链球菌进行培养，研究其对噬菌体侵染的敏感性与CRISPR的关系，实验结果如图2所示，据结果可判断上述假设成立。 CRISPR中的“间隔序列”是细菌对这些外来入侵者的“记录”，怎么打击二次入侵者呢？当噬菌体再次入侵宿主菌时，会诱导相关CRISPR序列和附近的Cas基因表达。CRISPR序列的转录产物是一段记录病毒信息的RNA，Cas基因表达产物是具有内切核酸酶活性的Cas，二者形成复合物，找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。 正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，2012～2013年，CRISPR/Cas9技术（基因编辑技术）应运而生。CRISPR/Cas9系统由Cas9和人工设计的向导RNA构成。向导RNA是20个碱基左右的识别序列，在其引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后，细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，如果细胞中有DNA修复模板（由需插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因插入到指定位点。 CRISPR/Cas9技术在基因功能研究、医疗健康、家畜育种等领域的应用不断取得喜人的新成果。但是，基因编辑技术还存在编辑对象出错造成的“脱靶”，科研人员还需要继续对其进行优化。 （1）间隔序列中噬菌体的DNA片段，能与细菌自身的重复序列整合在一起，其结构基础是二者的DNA分子基本组成单位相同，脱氧核苷酸的连接方式相同，且________。 （2）据图2分析，________，因而可初步判断上述假设成立。 （3）病毒再次入侵细菌引起了记录________的CRISPR序列在________酶的催化下形成相应RNA，与附近的Cas基因表达的蛋白产物形成复合物，此RNA通过________原则结合外源DNA上的靶序列，并引导Cas9切割病毒DNA的靶序列。 （4）“基因魔剪”CRISPR/Cas9系统的优势是：可以通过对________的设计，定点敲除或插入目的基因。 （5）为预防遗传病的发生，有人提议使用CRISPRCas9系统对人受精卵进行基因编辑，你同意这种做法吗？为什么？________。 11．(24-25高一下·北京市通州区·期中)请学习以下材料，回答问题。 酵母菌中的“鱼钩、鱼饵和鱼” 酵母菌中存在一种转录激活因子——GAL4，它由两个主要的功能结构域组成：DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）。BD能够识别并结合基因上游某段序列，AD可以启动该序列的下游基因进行转录。有趣的是，BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才可以激活转录。 利用酵母菌这套独特的基因表达调控系统的原理，科研人员构建重组质粒pBR与pGA，并将其导入不具有Trp（色氨酸）、Leu（亮氨酸）合成能力的GAL4缺陷型的酵母菌中，通过控制酵母培养基中Met（甲硫氨酸）的有无，可以检测报告基因是否表达，进而分析“鱼饵物质”Z对“鱼钩蛋白”X和“鱼蛋白”Y互作的影响（如下图所示）。 组别 导入基因 pBR质粒 pGA质粒 1 BD AD 2 X-BD AD 3 BD Y-AD 4 X-BD Y-AD 5 X-BD、Z Y-AD 注：Pmet25启动子（Met缺陷诱导型启动子）：只有在Met缺乏的情况下才能使下游蛋白表达，且缺乏Met不影响酵母细胞正常存活。 基于GAL4转录激活因子发展起来的酵母系统，不仅可以用于研究蛋白质的互作，也为研究RNA-蛋白质、小分子药物-蛋白质的相互作用提供了新的手段，但也存在部分局限性。 （1）结合所学知识与文中信息，在酵母菌中，转录激活因子GAL4通过识别并结合________，招募________以启动相关基因的转录。 （2）将1～5组酵母菌接种于三种培养基，部分培养结果如下表所示。由此可见，设置培养基Ⅰ的目的为________，同时，培养基Ⅱ和Ⅲ中还应添加________。若实验结果表明，Z抑制了X和Y的互作，请在表中空格处补全实验结果（“+”代表存在菌落，“-”代表不存在菌落）。 组别 培养基Ⅰ 培养基Ⅱ 培养基Ⅲ -Trp、-Leu -Trp、-Leu -Trp、-Leu、-Met 1 + - - 2 + - - 3 + - - 4 + ________ ________ 5 + ________ ________ （3）你认为这种基于GAL4转录激活因子发展起来的酵母系统，在研究蛋白质互作方面存在哪些局限性？________（答出一条即可） 12．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)学习以下材料，回答（1）～（4）题。 蛋白相互作用的研究 蛋白相互作用是指蛋白质之间相互结合并发挥特定的生物学功能的现象，是生物分子之间交互作用的重要形式。IKK复合体由IKKα、IKKβ和NEMO三个亚基组成，细胞周期调控激酶PLK1是一种催化蛋白质磷酸化的酶。PLK1可通过磷酸化IKKβ抑制IKK复合体的活化，为研究PLK1与IKK的互作，进而确定IKK的作用机制，进行了如下实验。 研究人员通过免疫共沉淀技术进行研究。该技术的原理是，在细胞内如果A蛋白能够与B蛋白结合，若用预先固定在琼脂糖珠子上的蛋白A的抗体去沉淀A蛋白，则B也会一起沉淀下来。通过检测沉淀中是否存在B蛋白，即可确定A和B蛋白是否存在相互作用。研究人员向人胚肾H细胞中转入分别含有Flag—PLK1融合基因和Myc-NEMO融合基因的表达载体，将细胞裂解后，用含有抗Flag抗体的琼脂糖珠子进行沉淀。检测细胞裂解液和沉淀中蛋白情况，结果如图1。用同样方法研究了PLK1与IKKα、IKKβ相互作用的情况，结果如图2。 Pull-down实验也是研究蛋白质相互作用的方法。将细胞裂解，获得含有待测蛋白的细胞裂解液。在体外，利用一种带有特定蛋白标签（如GST）的纯化融合蛋白作为钓饵，与细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，利用抗体检测并鉴定沉淀中的蛋白。研究人员利用该技术验证了PLK1与NEMO的相互作用情况，结果见图3。 利用上述两种技术，研究人员初步确定了PLK1发挥作用的分子机制。 （1）Flag-PLK1融合基因在转录时，Flag基因和PLK1基因共用同一个_________和终止子，翻译时所用起始密码子和终止密码子_________。 （2）分析免疫共沉淀结果可知，研究人员通过_________技术检测相关蛋白互作情况，对细胞裂解液进行检测的目的是_________。免疫共沉淀实验结果表明_________。 （3）根据Pull-down实验结果推测PLK1不能与NEMO直接结合。请补充Pull-down实验的操作步骤（从下列选项中选择）：纯化_________蛋白→将含有_________基因的表达载体导入大肠杆菌中→将纯化的蛋白与大肠杆菌裂解液混合温育→用相应的琼脂糖凝胶沉淀→对裂解液和沉淀进行抗体检测和鉴定。 A．GST-PLK1 B．His-PLK1 C．GST-NEMO D．His-NEMOE.GST （4）依据免疫共沉淀和Pull-down实验的结果，请尝试解释PLK1蛋白作用于IKK复合体的机制_________。 13．(24-25高一下·北京市延庆区·期中)向细菌中导入一些特殊的DNA序列作为生物传感器，可制备出在特定环境中优先生长的工程菌，应用于生物治疗。 （1）研究者利用图1所示的原理分别设计氧气传感器和乳酸传感器。 ①利用基因工程技术构建含氧传感器的大肠杆菌工程菌时，需将含有________和特定基因的DNA片段与载体连接，构建表达载体，导入用________处理的大肠杆菌细胞内。 ②根据图1，氧气传感器在有氧的条件下________（促进/抑制）特定基因的表达；乳酸传感器在有乳酸的条件下________（促进/抑制）特定基因的表达。 （2）研究者用GFP（绿色荧光蛋白）基因作为特定基因制备出含乳酸传感器的试验性工程菌，发现在无乳酸状态下GFP基因的表达量偏高，传感器灵敏度低。请据图1提出改造重组质粒以提高灵敏度的一条措施：________。 （3）将不同的传感器导入同一细菌，可使工程菌同时感知多种环境因素。请选填下列字母到图2中，利用所给出的材料，构建下图所示的两种工程菌________。 传感器的类型：a.氧气传感器 b.乳酸传感器 可选择的特定基因：c.细菌生长必需的asd基 d.细菌生长必需glms基因 e.对细菌生长有毒性的T基因 受体菌类型：甲：普通细菌乙：asd基因缺失突变型细菌丙：asd基因与glms基因双缺失突变型细菌 14．(24-25高一下·北京工业大学附属中学·期中)多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，猪肉是我国最主要的肉类消费品，提高其PUFAs含量对居民健康具有重要意义。为解决猪肉中PUFAs含量不足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs合成的必需酶基因fat1，培育转fat1基因猪，操作过程如图1。 （1）利用PCR技术扩增fat1基因时，应在两种引物的一端分别加上限制酶________和________识别与切割的序列。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体一般选用两种限制酶，选择的原则是________。 a、目的基因编码蛋白质的序列中有两种限制酶切割位点 b、表达载体内，每种限制酶只有一个切割位点 c、酶切后，目的基因两端的黏性末端序列相同 d、酶切后，载体形成的两个黏性末端序列不同 （2）图1中的连接产物需先导入大肠菌中的原因是________；所构建的重组基因表达载体中未标注出的必需元件还有________。 （3）将重组表达载体转染猪成纤维细胞，另设一组空白对照。48小时后于荧光显微镜下观察到________，说明转染成功。然后以转基因细胞为核供体构建克隆胚胎，最终获得转fat1基因猪。 （4）研究者提取转基因猪的基因组DNA，利用限制酶Dra Ⅲ将其完全酶切并电泳分离。然后用探针通过________的方法，检测fat1基因是否成功整合在猪基因组DNA中，酶切方式及检测结果如图2。 ①转基因猪1、2、3中分别被转入了________个fat1基因。 ②请解释图2检测结果中4条杂交带位置不同的原因：________。 ③该实验________（填“能”或“不能”）说明成功培育转基因猪，理由是________。 15．(24-25高一下·北京市第五十七中学·期中)温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 （1）大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括________（写出2点）。 （2）为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了方案1，构建表达载体（见图1），将其导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖，当培养温度为30℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，________，因而大肠杆菌表达________荧光蛋白。 （3）为更精准调控荧光蛋白表达，将上述表达载体改造为方案2中载体（见图2）。与方案1相比，方案2的主要优势是________。 （4）为检测方案2，科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图3。依据方案2，每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带，请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色________。 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 （5）聚羟基脂肪酸酯（PHA）常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB和4HB随机聚合，或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5），其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5。请完善以下表格，通过改造方案2以实现应用工程菌大规模生产优质PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。 操作 目的 对方案2表达载体的改造为：________。将构建好的表达载体导入大肠杆菌，获得工程菌。 获得可以合成PHA的工程菌。 以葡萄糖为原料配制培养基，灭菌后加入上述工程菌。 配制培养基、接种。 控制发酵条件：________。 发酵48小时，获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。 地 城 考点03 生物技术的安全性与伦理问题 一、单选题 1．(24-25高一下·北京市延庆区·期中)下列关于生物技术安全性与伦理问题的叙述，不正确的是（　　） A．加强对高风险实验室的监管，避免病原微生物的泄露 B．目的基因通过花粉的散布转移到其他植物体内，从而可能打破生态平衡 C．利用人体的成纤维细胞转变成iPS细胞，进而利用iPS细胞治疗阿尔茨海默病 D．利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期得到智力超群的“完美婴儿” 2．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)法律和法规是规范生物技术研究，防止生物技术滥用的有力武器。下列叙述与我国相关法规不符的是（　　） A．用农业转基因生物加工制成的产品需提供标识 B．不得将体外受精获得的人类胚胎植入人体生殖系统 C．在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器 D．禁止非医学需要的胎儿性别鉴定和选择性别人工终止妊娠 3．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)虾酱是以虾为原料的传统发酵食品。在乳酸菌、芽孢杆菌等多种微生物共同作用下，原料中的蛋白质和脂肪发生水解，形成虾酱的特有风味。下列叙述错误的是（　　） A．虾酱特有风味的形成受发酵时间的影响 B．传统虾酱的制作过程需要严格执行无菌操作 C．原料中的蛋白质会被水解成小分子的肽和氨基酸 D．虾酱发酵过程微生物种类和数量的分析有助于改良风味 4．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风险。下列叙述与我国政府相关法规或主张不符的是（　　） A．禁止人的生殖性克隆和治疗性克隆 B．禁止非医学需要的胎儿性别鉴定 C．销售转基因农产品应有明确标注 D．全面禁止和彻底销毁生物武器 5．(24-25高一下·北京市第八十中·期中)下列关于生物技术与伦理问题的观点，正确的是（　　） A．利用体外受精技术筛选早期胚胎性别，设计试管婴儿 B．基于科学和理性讨论转基因作物的安全性问题 C．通过基因筛查禁止重大疾病基因携带者就业 D．大量引入国外转基因作物与本地近缘作物品种杂交 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具和基本操作程序 考点02 基因工程的应用 考点03 生物技术的安全性与伦理问题 地 城 考点01 基因工程的基本工具和基本操作程序 一、单选题 1．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)下列有关基因工程的叙述，正确的是（　　） A．目的基因导入受体细胞后，一定能稳定遗传 B．构建载体与目的基因重组的DNA是基因工程的核心 C．DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解析】A、转基因植株一般视为杂合子，因此目的基因导入受体细胞后，不一定能稳定遗传，A错误； B、构建基因基因表达载体是基因工程的核心步骤，B正确； C、DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的磷酸二酯键连接起来，C错误； D、常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，D错误。 故选B。 2．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)利用PCR技术分析粪便已成为珍稀野生动物种群调查的有效手段，同种生物不同个体在同源染色体某些位置上DNA片段长度存在差异，这些片段可作为辨别不同个体的依据。下列叙述错误的是（　　） A．需去除粪便中微生物的DNA以免干扰实验结果 B．设计PCR引物时需要考虑物种特异性 C．反应体系中需加入四种脱氧核苷酸作为原料 D．PCR添加的两种引物均成为每个主要产物分子的一部分 【答案】A 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【解析】A、由于不同的生物DNA具有特异性，故利用PCR技术辨别不同个体时不需要去除粪便中微生物的DNA，A错误； B、引物是一端目的基因的核苷酸序列，需跟模板配对，因此设计PCR引物时需要考虑物种特异性，B正确； C、PCR是对目的基因进行扩增的技术，反应体系中需加入四种脱氧核苷酸作为原料，C正确； D、引物与模板结合后，DNA聚合酶开始延伸，引物成为产物的一部分，D正确。 故选A。 3．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　） A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA分子 C．泳道①中是用Sal Ⅰ处理得到的酶切产物 D．限制酶既可切割双链DNA也可以切割单链DNA 【答案】D 【分析】DNA一般是双螺旋结构；限制酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割。 【解析】A、限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确； B、同种限制酶切割出的DNA片段，具有黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确， C、Sal Ⅰ将DNA片段切成4段，Xho Ⅰ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为Sal Ⅰ，泳道②为Xho Ⅰ，C正确； D、限制酶切割双链DNA，不能切割单链DNA或RNA，D错误。 故选D。 4．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)下列与生物工程中有关的酶的说法，正确的是（　　） A．限制性内切核酸酶和解旋酶都作用于氢键 B．逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板 C．DNA聚合酶和RNA聚合酶发挥作用时都需要引物 D．DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成 【答案】D 【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。其中限制酶和DNA连接酶的作用对象都是磷酸二酯键。 2、DNA连接酶和DNA聚合酶的区别：①DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键。②DNA连接酶是同时连接双链的切口，而DNA聚合酶只是在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来。③DNA连接酶不需要模板，而DNA聚合酶需要模板。 【解析】A、限制酶作用于磷酸二酯键，不作用于氢键，A错误； B、逆转录酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶发挥作用时不需要模板，B错误； C、RNA聚合酶发挥作用时不需要引物，C错误； D、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸通过磷酸二酯连接形成DNA，RNA聚合酶催化核糖核苷酸通过磷酸二酯连接形成RNA，D正确。 故选D。 5．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)荒漠植物的Z基因与其抗旱性强有关。科学家利用Z基因和农杆菌的Ti质粒（如图，T-DNA为可转移的DNA）构建表达载体，培育抗旱转基因小麦。下列说法错误的是（　　） A．T-DNA能整合到小麦细胞染色体上 B．可用限制酶Cla Ⅰ和Sac Ⅰ处理Z基因 C．可用卡那霉素筛选含重组Ti质粒的农杆菌 D．可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状 【答案】B 【解析】A、农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，A正确； B、限制酶Cla Ⅰ在Ti质粒的T-DNA上没有酶切位点，且会破坏标记基因卡那霉素抗性基因，限制酶Sac Ⅰ在Ti质粒的T-DNA上没有酶切位点，且会破坏复制起点，不能用限制酶Cla Ⅰ和Sac Ⅰ处理Z基因，B错误； C、农杆菌Ti质粒上存在卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素筛选含重组Ti质粒的农杆菌，C正确； D、荒漠植物的Z基因与其抗旱性强有关，可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状，D正确。 故选B。 6．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)用含有特定抗生素抗性基因的质粒载体将目的基因导入大肠杆菌，然后接种在固体培养基上进行培养。以下操作不能确定受体细胞中是否含有目的基因的是（　　） A．用含有相应抗生素的选择性培养基来培养转化后的细菌 B．用筛选出的菌落中的菌体DNA作为模板，用相应引物进行PCR扩增 C．提取筛选出的菌落中菌体的质粒DNA，用相应限制酶切割后进行电泳 D．提取筛选出的菌落中菌体的质粒DNA，进行测序后与目的基因序列进行比对 【答案】A 【分析】若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有特点抗生素的固体培养基，即含有重组质粒的大肠杆菌在其中不能生长，而含有普通质粒的大肠杆菌能生长。 【解析】A、虽然含有特定抗生素抗性基因的质粒载体导入了大肠杆菌，但能在该选择性培养基上生长的细菌只能说明含有质粒载体（含抗性基因），不能确定质粒载体上一定成功插入了目的基因，因为有可能只是单纯的质粒载体导入，而没有目的基因的插入，所以该操作不能确定受体细胞中是否含有目的基因，A错误； B、如果能扩增出特定的DNA片段，说明在受体细胞的DNA中存在与引物互补配对的序列，也就意味着含有目的基因，所以该操作可以确定受体细胞中是否含有目的基因，B正确； C、若能得到与预期大小相符的DNA片段，说明质粒上含有目的基因，因为只有存在目的基因且被相应限制酶切割后，才会出现特定大小的片段，所以该操作可以确定受体细胞中是否含有目的基因，C正确； D、通过直接将测序结果与目的基因序列比对，能明确是否含有目的基因，所以该操作可以确定受体细胞中是否含有目的基因，D正确。 故选A。 7．(24-25高一下·北京市陈经纶中学·期中)化疗会造成癌症病人血小板减少，血小板生成素（TPO）可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中，获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述不正确的是（　　） A．构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶 B．用PCR技术可获取和扩增人TPO基因 C．表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等 D．用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况 【答案】A 【分析】基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。 1、启动子在基因的首端，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始； 2、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束； 3、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。 【解析】A、构建表达载体需要限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，不需要解旋酶和DNA聚合酶。解旋酶用于DNA复制时解开双链，而构建载体时无需此过程，A错误； B、PCR技术可通过体外扩增快速获取大量人TPO基因，B正确； C、表达载体必须包含目的基因（TPO基因）、标记基因、启动子（启动转录）和终止子（终止转录）等结构，C正确； D、抗原—抗体杂交技术通过特异性结合检测TPO蛋白（基因表达的产物），D正确。 故选A。 8．(24-25高一下·北京市第八十中学·期中)利用PCR可以在体外进行DNA片段扩增，下列叙述错误的是（　　） A．通过改变体系中的温度，控制PCR的反应进程 B．PCR是酶促反应，需加入解旋酶和DNA聚合酶 C．通过引物的设计可以做到选择性扩增DNA片段 D．根据DNA分子的大小和构象，通过电泳鉴定产物 【答案】B 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的；实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程；DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【解析】A、PCR反应中，每次循环一般分为变性（超过90℃）、复性（50℃左右）和延伸（72℃左右），所以通过改变体系中的温度，控制PCR的反应进程，A正确； B、PCR是酶促反应，需加入耐高温的DNA聚合酶，不需要加解旋酶，B错误； C、PCR技术可在生物体外复制特定的DNA片段，其中“特定DNA片段”是指两引物之间的DNA序列，所以通过引物的设计可以做到选择性扩增DNA片段，C正确； D、DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关，故根据DNA分子的大小和构象，通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物，D正确。 故选B。 9．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中·期中)某遗传病的正常基因和突变基因单链片段如图1，研究人员拟用PCR扩增2种基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点如图2）酶切，检测基因突变情况。下列叙述不正确的是（　　） A．PCR可以用5'-GGCATG-3'作为其中一条引物 B．PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶 C．限制酶酶切后形成的末端为-GATG- D．限制酶酶切后突变基因不会形成两个片段 【答案】C 【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段： PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 【解析】A、DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，据此可知，PCR可以用5´-GGCATG-3´作为其中一条引物，A正确； B、PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和缓冲液等，B正确； C、由图2可知，限制酶酶切后形成的末端为平末端，C错误； D、限制酶酶切后突变基因不会形成两个片段，因为从图中可以看出，突变基因发生了碱基对的替换，使得突变基因中没有了该限制酶的识别序列，D正确。 故选C。 10．(24-25高一下·北京市延庆区·期中)科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，检测原理（a、b）及结果（c）如下图。下列叙述错误的是（　　） A．需要针对不同病原体设计特异性引物和荧光探针 B．图中b是PCR反应的复性过程 C．多重PCR同时完成对4种病原体的检测 D．由结果推测该检测样品中有A病原体的核酸 【答案】B 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【解析】A、不同的病原体的碱基序列是不同的，因此需要根据病原体的碱基序列设计不同的特异性引物和荧光探针，A正确； B、图中b是PCR反应的延伸过程，该过程中发生合成子链的过程，B错误； CD、科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，由图c可知，多重PCR同时完成对（A、B、C、D）4种病原体的检测，实验组中B、C、D的剩余探针荧光强度与阴性对照组相似，说明该检测样品中没有B、C、D病原体的核酸，实验组中A的剩余探针荧光强度与阴性对照组不同，说明该检测样品中有A病原体的核酸，CD正确。 故选B。 11．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（　　） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择Sma Ⅰ进行醇切，再用DNA连接酶连接 C．构建载体P和载体E时使用的DNA连接酶均需选用T4 DNA连接酶 D．构建表达载体时，应选择Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切载体E和含目的基因的载体P 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解析】A、由图可知，不直接选择Р构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，A错误； BD、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体Р接入载体E，同时防止载体E自身环化。需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体Р和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶识别序列。故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶切，载体Р的这两种酶识别序列中含有EcoR V识别位点。并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，Sma Ⅰ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体Р进行切割，B错误，D正确； C、两种DNA连接酶均可以连接年黏性末端和平末端，但E.coli DNA连接酶连接平末端效率较低，构建载体E时是连接黏性末端，两种都可以用，C错误。 故选D。 12．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)转基因抗虫棉在我国的种植面积已占全国棉花种植面积的90%。研究者利用PCR技术检测杂草中有无转基因成分，得到如图所示结果。相关分析错误的是（　　） A．空白实验是未加入DNA模板得到的电泳结果 B．推测棉田杂草6、7与抗虫棉的亲缘关系较近 C．结果说明校园杂草与棉花间一定存在生殖隔离 D．转基因成分进入杂草体内可能会引发生态问题 【答案】C 【分析】由图可知，2转基因抗虫棉和棉田杂草6和7均含有转基因成分。转基因抗虫棉是指棉花细胞染色体上整合有外源抗虫基因的棉花品种。抗虫基因通常为来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因。 【解析】A、空白对照是为了消除或减少实验误差，提高实验结果的准确性和可靠性；未加入DNA模板得到的电泳结果是空白实验，作为空白对照，A正确； B、根据杂草6和7含有转基因成分可以推测，杂草6和7可能与抗虫棉的亲缘关系较近，获得了转基因特性，B正确； C、由题图可知，棉田杂草（6号和7号）含有转基因成分，校园杂草不含有转基因成分，但不能说明两者存在生殖隔离，C错误； D、转基因成分进入杂草内，可能导致杂草获得转基因特性，可能会引发生态问题，D正确。 故选C。 13．(24-25高一下·北京市通州区·期中)将某病毒的外壳蛋白（L1）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建L1-GFP融合基因，再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中限制酶E1～E4处理产生的黏性末端均不相同。相关叙述不正确的是（　　） A．构建L1-GFP融合基因需要用到E1、E2、E4三种酶 B．E1、E4双酶切确保L1-GFP融合基因与载体的正确连接 C．GFP可用于检测受体细胞中目的基因是否表达 D．将表达载体转入羊的乳腺细胞中可培育乳汁中含L1蛋白的转基因羊 【答案】D 【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等。根据题意，将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建L-GFP融合基因，其中绿色荧光蛋白（GFP）基因属于标记基因，用于筛选和鉴定。 【解析】A、构建L1-GFP融合基因需要先用内切酶处理获得L1基因和GFP基因，并将二者连接，故需要用到E1、E2、E4三种酶，A正确； B、图中限制酶E1～E4处理产生的黏性末端均不相同，E1、E4双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因自身连接，保证L1-GFP融合基因与载体准确连接，B正确； C、绿色荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达情况，C正确； D、为了获得L1蛋白，可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞，用于培育乳汁中含有L1蛋白的转基因羊，D错误。 故选D。 14．(24-25高一下·北京市第八十中学·期中)关于DNA粗提取与鉴定的实验，下列叙述错误的是（　　） A．洋葱、香蕉、菜花、猪血可作为理想的实验材料 B．用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA去除不溶杂质 C．用95%的冷酒精析出DNA，去除蛋白质等杂质 D．溶解粗提取的DNA加入二苯胺试剂沸水浴，溶液呈蓝色 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的实验原理： 1、DNA的溶解性 （1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。 （2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响．大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 3、DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【解析】A、猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含细胞核和细胞器，即不含DNA，因此猪血不能作为实验材料来提取DNA，A错误； B、DNA能溶解于2mol/L的NaCl溶液中，因此可用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA去除不溶杂质，B正确； C、DNA不溶于95%的冷酒精，而其它杂质如蛋白质溶于酒精，因此可用95%的冷酒精析出DNA，去除蛋白质等杂质，C正确； D、溶解粗提取的DNA加入二苯胺试剂后需要沸水浴，才会呈现蓝色，D正确。 故选A。 15．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)蛛丝的强度和柔韧度得益于蛛丝蛋白的特殊布局，使它产生了一个由坚硬的结晶区和非结晶区构成的混合区域。有人试图通过破解蛛丝蛋白的结构从而推测出其相应的基因结构，以指导对蚕丝蛋白的修改，从而让蚕也吐出像蛛丝蛋白一样坚韧的丝。此过程运用的技术及基本思路分别是（　　） A．基因突变；DNA→RNA→蛋白质 B．基因工程；RNA→RNA→蛋白质 C．蛋白质工程；DNA→RNA→蛋白质 D．蛋白质工程；蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【解析】通过破解蛛丝蛋白的结构从而推测出其相应的基因结构，以指导对蚕丝蛋白的修改，从而让蚕也吐出像蛛丝蛋白一样坚韧的丝，此过程运用的是蛋白质工程技术。其基本思路是：推测蛛丝蛋白的氨基酸序列，推出其mRNA的碱基序列，再改造或合成控制蛛丝蛋白合成的DNA（目的基因），然后借助基因工程技术将目的基因导入蚕的体内，在蚕的体内完成由DNA转录形成RNA，再翻译形成蛋白质（蛛丝蛋白），即基本思路为：蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质。D正确，ABC错误。 故选D。 16．(24-25高一下·北京市第五十七中学·期中)利用基因工程技术生产特定单克隆抗体的流程如下图。下列叙述错误的是（　　） A．过程①需要使用限制酶、DNA连接酶 B．过程②是将重组质粒导入噬菌体并启动基因表达 C．过程③利用抗原-抗体的特异性结合筛选目标抗体 D．过程④可将目标抗体A的基因导入酵母菌进行发酵生产 【答案】B 【分析】据图分析，①表示构建基因表达载体的过程，②表示将目的基因表达产生噬菌体蛋白质外壳的过程，③表示对噬菌体外壳的蛋白质进行筛选的过程，④表示合成大量噬菌体获得更多抗体的过程。 【解析】A、过程①利用质粒构建表达载体，该过程需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确； B、②表示将目的基因导入大肠杆菌或酵母菌并将抗体蛋白表达的过程，从而产生外壳上携带不同抗体的不同的噬菌体，B错误； C、③表示利用抗原抗体特异性结合的原理筛选能与特定抗原结合的抗体，C正确； D、酵母菌是真核表达系统，适合生产复杂蛋白如抗体，④表示将目标抗体A的基因导入酵母菌进行发酵生产，D正确。 故选B。 17．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)噬菌体展示技术（如图）可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（　　） A．建立噬菌体展示库需限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白 C．用含有碳源、氮源等营养物质的培养基培养噬菌体 D．该技术可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因 【答案】C 【分析】抗原抗体杂交技术是一种用于检测蛋白质、多肽等大分子的技术，其原理是基于抗原和抗体的特异性结合。 【解析】A、建立噬菌体展示库需要将目标基因和噬菌体DNA相连，需限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A正确； B、抗原—抗体杂交技术是利用特定的抗原与特定的抗体结合，可以筛选目标蛋白，B正确； C、噬菌体是病毒，没有细胞结构，不能直接用培养基培养，C错误； D、噬菌体展示技术可将某些蛋白质呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定，可用于获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因，D正确。 故选C。 18．(24-25高一下·北京市通州区·期中)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。相关叙述不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS基因，需用Sal Ⅰ和Sph Ⅰ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【答案】B 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【解析】A、将基因表达载体导入植物细胞，常用的方法是农杆菌转化法，A正确； B、如果用Sph Ⅰ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选B。 19．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)油菜是我国的重要油料作物，其生长受到核盘菌引起的菌核病威胁。科研人员试图培育抗菌核病的转基因油菜新品种，其抗性机理如下图所示，相关叙述正确的是（　　） A．将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜获得转基因植株 B．核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因表达出相应蛋白质抵御核盘菌侵染 C．未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能合成转录因子B，不启动防御基因表达 D．转基因油菜中的启动子pB属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】A、将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜，之后还需要对防御基因进行检测和鉴定，A错误； B、分析题图可知，核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因转录出小干扰RNA抵御核盘菌侵染，而非表达出蛋白质，B错误； C、未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能激活细胞内的转录因子B，导致防御基因不能表达，C错误； D、转基因油菜中的启动子pB只有在核盘菌侵染时才能激活目的基因的表达，属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达，D正确。 故选D。 20．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中学·期中)酵母人工染色体pYAC2是以酵母菌为受体细胞构建基因文库时的常用载体。下图为pYAC2的结构示意图，导入受体细胞前用限制酶BamH Ⅰ切割可使其成为线性的染色体。pYAC2适配的受体菌菌落呈红色，sup4基因表达能够抑制其性状表现，使菌落呈白色。相关叙述错误的是（　　） A．导入pYAC2的受体菌能够在不含色氨酸的培养基中生存 B．用BamH Ⅰ切割pYAC2后，TEL端粒序列位于染色体的两端 C．着丝粒序列CEN4的存在可防止pYAC2在细胞分裂中丢失 D．将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选白色菌落 【答案】D 【分析】载体：除质粒外，还有噬菌体和动植物病毒等。质粒作为载体的条件：①有一个至多个限制酶酶切位点；②进入受体细胞后能自我复制或整合到宿主细胞DNA上进行同步复制；③有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 【解析】A、pYAC2上含有TRP1（色氨酸合成酶基因），导入pYAC2的受体菌能够合成色氨酸，能够在不含色氨酸的培养基中生存，A正确； B、pYAC2上有两个BamH Ⅰ切割位点，用BamH Ⅰ切割后，pYAC2成为线性的染色体，TEL端粒序列位于染色体的两端，B正确； C、着丝粒是确保细胞分裂时染色体正确分离的重要结构，pYAC2上的CEN4（着丝粒序列）可防止pYAC2在细胞分裂中丢失，C正确； D、分析题图可知，目的基因插入会破坏sup4基因，导致sup4基因不能表达，故pYAC2适配的受体菌菌落仍呈红色，将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选红色菌落，D错误。 故选D。 二、非选择题 21．(24-25高一下·北京市平谷中学·期中)以侯云德院士为首的研究人员，成功研制出我国第一个基因工程药物——重组人干扰素。下图为研制重组人干扰素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构示意图。已知大肠杆菌原本不含lacZ和氨苄青霉素抗性基因。lacZ：β-半乳糖苷酶基因，编码的β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。回答下列有关问题： （1）据图分析，为使目的基因与载体正确连接，应选择的限制酶是________。 （2）已知人体内干扰素基因不能在大肠杆菌中正确表达，一般从淋巴细胞中提取mRNA经________合成cDNA，然后利用PCR技术扩增。 （3）由于干扰素cDNA的两端无限制酶切割位点，需要分别在引物的5′端引入限制酶识别序列，已知干扰素cDNA①处的碱基序列为5′—CCTTTCAGCTCA—3′，则a链引物设计的序列是5′—________—3′（写出10个碱基序列）。 （4）标记基因具有指示和筛选的作用，欲筛选转化成功的大肠杆菌，应将其接种到添加了________的培养基上，最终选择________色的菌落。 （5）干扰素在体外保存相当困难，如果将分子上一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么-70℃条件下可以保存半年，实现上述目标利用的技术属于________，本质上设计改变的是________（填“蛋白质”或“DNA”）分子。 【答案】（1）Xho Ⅰ和Mun Ⅰ （2）逆转录 （3）CTCGAGCCTT （4）氨苄青霉素和X-gal 白 （5）蛋白质工程 DNA 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）由图中不同限制酶的切割位点，可知EcoR Ⅰ会破坏氨苄青霉素抗性基因，Sal Ⅰ及Nhe Ⅰ会破坏目的基因，所以不能选，应选择Xho Ⅰ和Mun Ⅰ。 （2）利用从淋巴细胞中提取的mRNA得到cDNA的过程属于逆转录。 （3）根据目的基因的转录方向判断目的基因的a链为模板链，为使目的基因与载体能正确连接，应在图中目的基因的右侧引入Xho Ⅰ的识别序列，根据①处的碱基序列为5′—CCTTTCAGCTCA—3′，可知设计的引物的序列应为5′—CTCGAGCCTT—3′。 （4）选择培养基中应添加氨苄青霉素和X-gal，根据正常质粒和重组质粒均含有氨苄青霉素抗性基因，可知导入了正常质粒和重组质粒的大肠杆菌均能在选择培养基上存活，并且形成菌落，若菌落为蓝色，则导入的是正常质粒，若菌落为白色，则说明导入的是含有目的基因的重组质粒。 （5）对天然蛋白质进行改造属于蛋白质工程，故干扰素在体外保存相当困难，如果将分子上一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么-70℃条件下可以保存半年，实现上述目标利用的技术属于蛋白质工程；本质上改造的是DNA，所以蛋白质工程也称为第二代基因工程。 22．(24-25高一下·北京市海淀区人大附中·期中)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 （1）将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。 （2）为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是________，因而被用于制备监测鱼（MO）。 （3）现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：________。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因：________ A．GFPB．Gal4C．雌激素受体基因（ER）D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） （4）SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后________造成不育。 （5）使拟用于实际监测的SM不育的目的是________。 【答案】（1）显微注射 （2）监测灵敏度更高 （3）② D （4）激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 （5）避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【解析】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。 （2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。 （3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。 （4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。 （5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 23．(24-25高一下·北京市通州区·期中)人β防御素是一种抗菌肽。为了达到高效纯化人β防御素的目的，科研人员对能生产该抗菌肽的基因工程酵母菌进行了下列改造。 （1）ELP是一段人工合成的DNA片段，科研人员将该片段插入pGE—H中，构建重组质粒pGE—H—ELP，以融合表达H—ELP蛋白，如下图所示。 注：Xba Ⅰ的识别序列为：5′-TCTAGA-3' Nhe Ⅰ的识别序列为：5′-GCTAGC-3' EcoR Ⅰ的识别序列为：5′-GAATTC-3' 为大量扩增ELP序列，可以采用________法。在上述改造过程中，需要使用________切割ELP序列和pGE-H质粒，再使用________构建重组质粒。 （2）为鉴定筛选出的酵母菌菌落中是否含有正确插入ELP序列的重组质粒，科研人员将上述酵母菌培养在有________的培养基中，挑取了1～4号菌落。扩大培养后，使用Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ对菌落中提取到的质粒进行了双酶切和电泳。由右图可知，1～4号单菌落中，________是含有正确插入ELP序列重组质粒的酵母菌。请结合上述信息解释2号菌落中出现长度为3.7kb条带的原因________。 （3）为探寻高效纯化H—ELP融合蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对H—ELP融合蛋白纯化效果的影响，如下图所示。 结合上述研究成果，你认为，高效纯化H—ELP蛋白的条件是________。 【答案】（1）PCR 限制酶（Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ）DNA连接酶 （2）庆大霉素 1 因Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ两种限制酶切割后的黏性末端相同，故ELP序列可以反向连接入pGE—H质粒，总长度为3.7kb。但重组质粒构建完成后，两种酶的识别位点均消失，故重组质粒无法再被该两种酶重新切割，所以呈现3.7kb的条带。 （3）20℃、加NaCl 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）可以采用PCR法大量扩增ELP序列。在上述改造过程中，需要使用限制酶（Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ）切割ELP序列和pGE-H质粒，再使用DNA连接酶构建重组质粒。 （2）分析右图可知，重组质粒含有庆大霉素抗性基因，所以可以将上述酵母菌培养在有庆大霉素的培养基中以鉴定筛选出的酵母菌菌落中是否含有正确插入ELP序列的重组质粒。扩大培养后，使用Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ对菌落中提取到的质粒进行了双酶切和电泳，则重组质粒会切成两段，故1是含有正确插入ELP序列重组质粒的酵母菌。因Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ两种限制酶切割后的黏性末端相同，故ELP序列可以反向连接入pGE—H质粒，总长度为3.7kb。但重组质粒构建完成后，两种酶的识别位点均消失，故重组质粒无法再被该两种酶重新切割，所以呈现3.7kb的条带。 （3）分析柱状图可知，相比其他组，20℃、加NaCl组H—ELP融合蛋白含量较高，酵母菌自身蛋白较低，所以高效纯化H—ELP蛋白的条件是20℃、加NaCl。 24．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)近年来，在处理富营养化水体的污水过程中，与化学、物理除氮方法比较，目前认为微生物反硝化去除氮素污染更为经济有效。科研工作者采用基因工程技术构建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，进行了相关研究。请回答问题。 （1）微生物的反硝化作用，是氮循环中一个重要的生物过程。亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）转录后，再翻译出具有________作用的蛋白质。 （2）工程菌的构建 ①研究者利用NCBI数据库查到nirS基因的碱基序列，设计引物，利用PCR技术扩增nirS基因。PCR技术利用了________的原理。 ②研究者用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ两种限制酶处理nirS基因与p质粒，在________酶的作用下进行体外连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含庆大霉素的培养基中进行培养并提取质粒，如果用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，得到两个片断电泳结果分别与________电泳结果基本一致，说明获得重组质粒pYP4S。 ③将pYP4S转化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培养后进行PCR鉴定。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图1所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是________。某学生错选了图中的另外一对引物组合，扩增出长度为2.1kb的片段，原因是________。 （3）检测工程菌YP4S除氮的效能 工程菌株YP4S在已灭菌的模拟污水中培养36h后，检测结果如图2。结果表明________。 【答案】（1）催化 （2）DNA半保留复制 DNA连接 p质粒和插入片段（目的基因）乙和丙 目的基因反向连接 （3）工程菌株除氮效果优于野生菌 【分析】PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【解析】（1）亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，酶是经基因的转录和翻译过程形成的有催化作用的蛋白质。 （2）①PCR技术依据的原理是DNA分子的复制。 ②连接两个DNA片段所用的酶是DNA连接酶；因实验中nirS基因与p质粒是分别用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ两种限制酶处理的，故若再用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切之后，得到两个片段电泳结果分别与p质粒和插入片段（nirS基因）电泳结果基本一致，可说明获得重组质粒pYP4S。 ③PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反方向合成子链，结合目的基因的插入位置可知，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是乙和丙；若某学生错选了图中的另外一对引物组合（甲和乙），只有反向连接后才能扩增出长度为2.1kb的片段（2+0.1kb）。 （3）图2结果表明，无论是总氮还是NH4+、NO3-的去除率，工程菌株除氮效果优于野生菌。 25．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)β-胡萝卜素可在人体内转化为维生素A。普通水稻胚乳细胞中不含B-胡萝卜素，科研人员利用基因工程技术培育富含β-胡萝卜素的“黄金大米”。 （1）培育黄金大米时，需要将psy基因（八氢番茄红素合成酶基因）和crt Ⅰ基因（胡萝卜素脱饱和酶基因）转入水稻，为此研究者需构建含有图1所示重组T-DNA片段的重组Ti质粒。 ①据图分析，构建重组T-DNA片段时，科研人员首先要用限制酶________和DNA连接酶处理，将psy基因和crtⅠ基因接入，再用________处理，将潮霉素抗性基因接入。再通过________法将该T-DNA片段导入水稻细胞。 ②重组T-DNA片段中接入潮霉素抗性基因的作用是________。 ③重组T-DNA片段中有两种启动子，推测________（填“启动子1”或“启动子2”）是水稻种子的胚乳细胞特异性表达的启动子。 ④据图分析潮霉素抗性基因和psy基因转录时所使用的模板链________（选填“相同”或“不同”），下列选项可作为判断依据的是________（选填下列字母）。 a．潮霉素抗性基因和psy基因转录方向不同 b．转录时，均以基因的一条链为模板 c．转录时，RNA延伸方向均为5'→3' d．DNA聚合酶催化转录过程 （2）黄金大米细胞内，上述两种酶参与β-胡萝卜素的合成途径如图2： 上述途径获得的第一代黄金大米中β-胡萝卜素含量不够高，经检测发现是八氢番茄红素含量较低造成的。科研人员据此分析，________的活性影响了β-胡萝卜素含量。请提出设计方案，以获得β-胡萝卜素含量更高的“第二代黄金大米”：________。 【答案】（1）I-Sec Ⅰ Kpn Ⅰ和DNA连接酶 农杆菌转化 筛选含重组T-DNA的水稻（细胞）启动子2 不同 abc （2）八氢番茄红素合成酶 对psy基因进行诱变取定向改造（从其他生物中筛选），获得表达产物活性更高的psy基因，进行转基因操作 【分析】1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在-定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。 2、植物体细胞杂交：（1）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等，化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂；（2）细胞融合完成的标志是新的细胞壁的生成；（3）植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束；（4）杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征，原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质；（5）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 【解析】（1）①据图分析，构建重组T-DNA片段时，科研人员首先要用限制酶I-Sec Ⅰ获取psy基因，再用DNA连接酶处理，将psy基因和crt Ⅰ基因接入，再用kpn Ⅰ和DNA连接酶处理，将潮霉素抗性基因接入。再通过农杆菌转化法将该T-DNA片段导入水稻细胞。 ②已知潮霉素对原核细胞和真核细胞的生长都有抑制作用，据此分析重组T-DNA片段中接入潮霉素抗性基因的作用是筛选转入重组T-DNA的农杆菌和含重组T-DNA的水稻。 ③重组T-DNA片段中有两种启动子，因为要培育富含β-胡萝卜素的“黄金大米”，所以可以推测启动子2是水稻种子的胚乳细胞特异性表达的启动子。 ④abc、潮霉素抗性基因和psy基因转录方向不同，转录时，均以基因的一条链为模板，转录时，RNA延伸方向均为5'→3'，都可以作为判断潮霉素抗性基因和psy基因转录时所使用的模板链不同的依据d、DNA聚合酶不能催化转录过程，RNA能催化转录过程，abc正确。 故选abc。 （2）上述途径获得的第一代黄金大米中β-胡萝卜素含量不够高，经检测发现是八氢番茄红素含量较低造成的。科研人员据此分析，八氢番茄红素合成酶的活性影响了β-胡萝卜素含量。为获得β-胡萝卜素含量更高的“第二代黄金大米”：对psy基因进行诱变或定向改造（从其他生物中筛选），获得表达产物活性更高的psy基因，进行转基因操作。 26．(24-25高一下·北京市育才学校·期中)人血清白蛋白（HSA）是血液中最丰富的循环蛋白，承担着多种物质运输的功能，同时参与多项生命活动的调节，因此在医疗领域有着十分广泛的用途。在生产真核生物蛋白时，动物乳腺反应器具有产量高、易于纯化、产物更接近天然活性等优势。 （1）人血清白蛋白基因的结构及控制HSA合成的过程如下图所示。 图1中步骤一是________，完成步骤二需要________等细胞器参与。 （2）研究者通过一系列方法获得了大量的含有HSA基因14个外显子的cDNA片段HSA-1（没有内含子，如图2所示）。但实践研究发现，HSA的部分内含子尽管不直接参与HSA蛋白的编码，却具有提高表达效率的重要作用，因而必须保留。 为此研究者还需要从________（选填“cDNA文库”或“基因组文库”）中调取含有内含子序列的HSA基因信息，并获得了如图2所示的HSA-2。为了保证HSA-2能插入HSA-1中原始位置，应选用图2中的________酶同时切割HSA-1和HSA-2，并用________连接，得到最终所需的HSA-3片段。从外显子和内含子组成上判断，HSA-3片段含有________序列，经检测其编码的氨基酸序列与天然HSA蛋白完全相同。 （3）研究者用构建好的含有目的基因的重组DNA导入牛的成纤维细胞，检测到成纤维细胞所分泌的HSA蛋白________，说明目的基因在受体细胞中成功表达。接下来，进行染色体核型分析确定染色体组成正常后，需要再借助________技术，才能获得分泌HSA的转基因牛。 【答案】（1）转录 核糖体 （2）基因组文库 Ava Ⅱ和Nco Ⅰ DNA连接酶 14个外显子和前6个内含子 （3）与天然HSA蛋白氨基酸序列和结构完全相同 体细胞核移植 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）图1中步骤一是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，即转录。步骤二是翻译，翻译在核糖体上进行，形成的多肽链还需内质网和高尔基体进行加工，所以完成步骤二需要核糖体等细胞器参与。 （2）cDNA文库中没有内含子，要从基因组文库中调取含有内含子序列的HAS基因信息。 为保证HSA-2能插入HSA-1中原先位置，需要用相同的限制酶切割，图2中Ava Ⅱ和Nco Ⅰ可同时切割HSA-1和HSA-2。切割后用DNA连接酶连接，得到最终所需的HSA-3片段。根据题意，HSA-3片段含有14个外显子和前6个内含子。 （3）若导入的目的基因在受体细胞中成功表达，那么成纤维细胞所分泌的HSA蛋白应与天然HSA蛋白氨基酸序列结构完全相同。要获得分泌HSA的转基因牛，在检测到成纤维细胞成功表达后，需要借助体细胞核移植技术，将含有目的基因的成纤维细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，再经过胚胎培养和胚胎移植等过程获得转基因牛。 地 城 考点02 基因工程的应用 一、单选题 1．(24-25高一下·北京工业大学附属中学·期中)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是（　　） A．使转染到膜上的细菌的DNA变性就是加热让脱氧核苷酸上的磷酸二酯键打开 B．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 C．重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接 D．放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置 【答案】D 【分析】分析题图：图示为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图，先采用DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌，再采用放射自显影显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，最后进行克隆化培养。 【解析】A、使转染到膜上的细菌的DNA变性就是加热让双链DNA解旋，脱氧核苷酸上的氢键打开，A错误； B、启动子和终止子分别控制转录的开始和终止，外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行转录，B错误； C、重组质粒变性后与探针能进行分子杂交是因为二者之间可以发生碱基互补配对，C错误； D、放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，因为菌落附着在膜上的位置是固定的，放射自显影后可以一一对应起来，D正确。 故选D。 2．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)CRISPR/Cas9基因编辑技术是利用Cas9蛋白—sgRNA复合体对双链DNA的特定序列进行识别并切割，从而达到基因定点敲除、插入、替换的目的。其中sgRNA的引导序列负责对DNA上的靶序列进行定位，再由被激活的Cas9蛋白对靶序列进行切割（如图所示），下列相关叙述错误的是（　　） A．sgRNA的引导序列可在DNA聚合酶的催化下合成 B．Cas9蛋白—sgRNA复合体的功能类似于限制酶 C．sgRNA引导序列对DNA靶序列进行定位，利用了碱基互补配对原理 D．该技术能实现对基因的定向改造，可用于某些疾病的基因治疗 【答案】A 【解析】根据题意，新一代基因编辑CRISPR/Cas9技术的实质是用特殊的引导序列（sgRNA）将Cas9蛋白-基因剪刀精准定位到所需切割的基因上，可知Cas9蛋白是一种核酸内切酶，可断开DNA上的磷酸二酯键。 【解析】A、sgRNA的引导序列可在RNA聚合酶的催化下合成，A错误； B、根据分析可知，Cas9蛋白—sgRNA复合体的功能类似于限制酶，可断开DNA上的磷酸二酯键，B正确； C、据图分析sgRNA的引导序列通过与DNA靶序列间的碱基互补配对进行定位，C正确； D、CRISPR/Cas9基因编辑技术是利用Cas9蛋白—sgRNA复合体对双链DNA的特定序列进行识别并切割，从而达到基因定点敲除、插入、替换的目的，所以该技术能实现对基因的体外定向改造，可用于某些疾病的基因治疗，D正确。 故选A。 二、非选择题 3．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)科研人员开发出了能编辑叶绿体基因组的基因编辑系统CyDENT。 （1）这套系统的核心是FokI-TALE融合蛋白，Fok Ⅰ是一种低特异性的内切核酸酶，TALE是一种能识别特异性序列的DNA结合蛋白，形成的基因编辑复合物如图1。使用CyDENT系统进行基因编辑属于________水平的研究。研究团队在CyDENT系统中设计的TALE-FokI蛋白在功能上类似于常用基因工程工具中的________。 （2）研究团队利用叶绿体定位序列（CTP）构建了如图2所示的基因表达载体，请结合图3阐述CyDENT系统编辑叶绿体基因组的机制：________。 （3）研究团队决定进一步挖掘CyDENT编辑系统的潜力，根据不同的编辑需求选择不同载体模块组合成系统：例如换用不同类型的启动子。假设需要仅在人类大肠组织中编辑名为BST114的细胞核基因，请参照图2，选择合适的模块设计CyDENT系统的表达载体： ①________ ②________ ③________ 终止子 （4）CyTENT系统编辑核基因的效率尚不如成熟的CRISPR基因编辑系统。请提出CyDENT编辑技术在人类健康领域内的应用方向：________。 【答案】（1）分子 限制性内切核酸酶（限制酶） （2）核糖体合成的TALE-FokI蛋白带有CTP，CTP可以引导蛋白质向叶绿体内进行转运，将TALE-FokI蛋白带入到叶绿体中完成基因编辑 （3）大肠特异性启动子 核定位序列 BST114序列特异性TALE—FokI融合基因 （4）可用于线粒体疾病的基因治疗 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定。 【解析】（1）使用CyDENT系统进行基因编辑属于分子水平的研究。FokI是一种低特异性的内切核酸酶，TALE是一种能识别特异性序列的DNA结合蛋白，CyDENT系统中设计的TALE-FokI蛋白在功能上类似于常用基因工程工具中的限制性内切核酸酶。 （2）CyDENT系统编辑叶绿体基因组的机制：核糖体合成的TALE-FokI蛋白带有CTP，CTP可以引导蛋白质向叶绿体内进行转运，将TALE-FokI蛋白带入到叶绿体中完成基因编辑。 （3）基因表达载体应具备：限制酶酶切位点，启动子，终止子，复制原点，标记基因等。假设需要仅在人类大肠组织中编辑名为BST114的细胞核基因，设计CyDENT系统的表达载体：大肠特异性启动子、核定位序列、BST114序列特异性TALE—FokI融合基因和终止子。 （4）科研人员开发出了能编辑叶绿体基因组的基因编辑系统CyDENT，CyDENT编辑技术在人类健康领域内的应用方向：可用于线粒体疾病的基因治疗。 4．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)生长季节气温每升高2℃，作物产量就会下降3%至13%。为保障全球粮食安全，科学家拟利用转基因技术育种，培育出在正常条件下能实现高产、在高温胁迫下能保持稳定产量的“气候智能型”作物。 （1）转基因技术的实现需要利用限制酶、________和载体三种基本工具。 （2）科学家实验后发现：在高温胁迫下LIN5基因表达量下调，导致发育中的果实果糖含量下降，导致番茄减产。科学家将持续高表达启动子与LIN5基因连接后构建基因表达载体，通过________导入番茄体内，获得了持续高表达LIN5番茄。测量两类植株在不同条件下的产量，结果如图1。 结果显示：________；在高温条件下，两类植株的果实产量无明显差异。请结合上述实验，提出稳定番茄产量的改进方案：________。 （3）研究者找到了能响应高温条件表达的热休克元件HSE。科学家构建了3类载体（如图2所示），利用植物中的荧光素酶报告基因检测改造后LIN5启动子的功能。请写出支持上述方案的预期实验结果：________。 （4）科学家重新构建了基因表达载体，转入番茄体内，获得了新的转基因植物“智能”番茄。“智能”番茄在常温和高温下果实产量均高于野生型，而两种情况下CO2吸收速率与野生型相同。请尝试提出一种能解释上述情况的假说，并说明验证假说时所采用的技术________。 【答案】（1）DNA连接酶 （2）农杆菌转化法或花粉管通道法 在常温下，转基因植株的果实产量低于野生型植株 仅在高温下提高LIN5的表达量 （3）常温下，荧光强度①②③组相似；高温下，②组荧光强度高于①组和③组，①和③类似 （4）假说：更多光合作用产物从叶片转移到了子房中，使得果实的产量上升。技术：14C同位素标记法 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解析】（1）转基因工程需要限制酶、DNA连接酶和载体三种工具。 （2）基因表达载体导入番茄（双子叶植物）的方法通常用农杆菌转化法或花粉管通道法。分析图1，常温下，转基因植株的果实产量低于野生型植株；在高温条件下，两类植株的果实产量无明显差异。高温条件下，野生型植物产量有所降低，所以为稳定番茄产量，仅在高温下提高LIN5的表达量。 （3）①中没有热休克元件，②中含有热休克元件，③中含有反向热休克元件，所以常温条件下，三者的荧光素酶都会表达，荧光强度①②③组相似；而高温条件下，只有②中的热休克元件可以顺序表达，所以②组荧光强度高于①组和③组，①和③类似。 （4）“智能”番茄在常温和高温下果实产量均高于野生型，而两种情况下CO2吸收速率与野生型相同，可能是加快了有机物的转移，所以提出假说更多光合作用产物从叶片转移到了子房中，使得果实的产量上升，可采用14C同位素标记法进行检验。 5．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中学·期中)疫霉菌感染会造成辣椒严重减产，科研人员开展相关研究。 （1）红光可以激活光敏色素，进而促进相关蛋白（如H蛋白）的合成，调节植物体对病原菌的响应。已知水杨酸（SA）可以抵御疫霉菌侵染，科研人员测定辣椒叶片中的SA含量，如图1。据此分析，两种不同光处理后，辣椒感染程度不同的原因是________。 （2）已知P酶催化合成SA。研究发现，正常辣椒叶片几乎不表达H蛋白；若发生感染，4天后叶片中的H蛋白含量显著升高。额外施加红光处理感染叶片，H蛋白在1小时内可达到相同水平。科研人员推测，H蛋白可能调控P基因表达P酶。为验证上述推测，开展如下实验。 实验一：进行如图2所示转基因操作，随后用荧光素处理获得的转基因辣椒叶片，检测荧光素酶催化荧光素发出的荧光，结果显示，与对照组相比，转基因植株荧光强度较高。 图2中，质粒上甲、乙、丙处依次应为________（填选项前字母）。 a．P基因启动子 b．组成型启动子 c．H基因启动子 d．P基因 e．H基因 f．荧光素酶基因 注：组成型启动子能够调控基因在全部组织中稳定转录。 实验二：将不同组分混合保温后，电泳检测标记条带如图3。本实验中的X是________（填选项前字母）。结果表明，H蛋白直接结合P基因启动子。 a．标记的P基因启动子 b．未标记的P基因启动子 c．标记的无关基因启动子 d．未标记的无关基因启动子 （3）证实“辣椒感染后H蛋白促进P基因表达”这一结论，实验一比实验二更具有说服力，体现在________。 （4）结合以上研究，请提出一种减轻疫霉菌感染造成减产的措施________。 【答案】（1）感染和未感染时，红光处理组的SA含量均高于白光处理组，能有效抵御疫霉菌感染 （2）a、f、e b （3）实验一是植物体内实验，荧光强度的检测结果可反映H蛋白促进P基因的表达；实验二是体外实验，不能判断H蛋白对P基因的调控方向 （4）参考样例：给辣椒植株适当增加红光照射；向辣椒植株适时适量喷施SA溶液；培育H基因或P基因过表达的辣椒品种。 【分析】1、植物激素是由植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微量有机物。 2、红光可以激活光敏色素，引起光敏色素空间结构的改变，进而促进相关蛋白（如H蛋白）的合成，调节植物体对病原菌的响应。 【解析】（1）已知水杨酸（SA）可以抵御疫霉菌侵染，科研人员测定辣椒叶片中的SA含量，图中结果显示，感染和未感染时，红光处理组的SA含量均高于白光处理组，据此推测两种不同光处理后，辣椒感染程度不同的原因是红光处理组的SA含量高，因而有效抵御疫霉菌感染。 （2）基因表达载体应该有的结构有启动子、终止子、目的基因、标记基因等；题意显示，P酶催化合成SA，正常辣椒叶片几乎不表达H蛋白，若发生感染，4天后叶片中的H蛋白含量显著升高，H蛋白可能作用于P基因的启动子，调控P基因表达P酶，为了验证上述推测，需要通过质粒2将H基因转入辣椒叶片，同时需要通过质粒1转入P基因启动子和荧光素酶基因以便用于检测，因此，图2质粒上甲、乙、丙处依次应为P基因启动子、荧光素酶基因、H基因。结果显示，与对照组相比，转基因植株荧光强度较高，该结果可推测H基因促进了P基因的表达。将不同组分混合保温后，电泳检测标记条带如图3。本实验的结果表明，H蛋白可直接结合P基因的启动子，又知探针是带有标记的，因此这里的P基因启动子不需要标记，因此，本实验中的X是（b）未标记的P基因启动子，实验结果表明，随着P基因启动子的含量增加，H蛋白与未标记的P基因启动子结合更多，与标记探针结合逐渐较少，最后几乎都与未标记的P基因启动子结合，所以没有条带了，因而可证明H蛋白直接结合P基因启动子，进而调控P基因的表达。 （3）证实“辣椒感染后H蛋白促进P基因表达”这一结论，实验一比实验二更具有说服力，这是因为实验一是植物体内实验，即实验中具有了活体环境，实验中荧光强度的检测结果可反映H蛋白促进P基因的表达；而实验二是体外实验，不能判断H蛋白对P基因的调控方向，只能确定H蛋白与P基因的启动子进行了结合。 （4）上述研究表明，细胞中SA含量的增加可以抵御疫霉菌侵染，因此需要设法促进辣椒细胞中SA的合成，SA的合成受红光调控；又有研究表明，与SA合成相关的基因有P基因和H基因，且H基因的表达产物能促进P基因的表达，据此设计的减轻疫霉菌感染造成减产的措施如下：给辣椒植株适当增加红光照射（可增加SA的含量）；向辣椒植株适时适量喷施SA溶液；培育H基因或P基因过表达的辣椒品种。 6．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，可大幅节约生产成本。科研人员研究了R基因来提高酵母的絮凝能力。 （1）啤酒生产中，酵母菌产酒过程的反应式为：________。 （2）科研人员利用基因工程技术获得R基因被敲除的酵母菌菌株。 ①构建含有卡那霉素抗性基因和R基因上、下游序列的打靶DNA序列，用LiC1处理酵母菌，使其处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，以实现________。打靶DNA序列上的卡那霉素抗性基因通过同源重组机制，替换了酵母菌基因组中的R基因（如图1）。这种机制与减数分裂中的________过程机制相似，都属于基因重组。 ②利用含有卡那霉素的培养基获得单菌落。挑取单菌落，利用PCR技术进行扩增，以确定酵母细胞的R基因是否被成功敲除，供选择的引物如图1所示。除引物1、4组合外，还可以选用的引物组合有________，请在答题纸上画出用引物1、4组合进行PCR时敲除和未敲除对应的电泳结果，要求标出每个电冰条带对应的DNA片段长度________。 （3）科研人员对野生菌株和R基因敲除菌株的酒精发酵能力和絮凝能力进行了测定，结果如下表。 菌株\指标 酒精发酵能力 絮凝能力 野生菌株 4.5% 63.06% R基因敲除菌株 4.5% 83.12% ①检测酒精发酵能力时，将菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，11℃静置发酵7天。发酵期间，每个锥形瓶应注意保持________条件和定时排气。 ②实验结果表明，获得的R基因敲除菌株符合生产需求，依据是________。 （4）科研人员进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制。 ①将R基因敲除菌株和野生菌株分别用________水进行稀释。将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30μg/mL钙荧光白（细胞壁组装抑制剂）的YPD平板培养（培养酵母菌的常用培养基）上，培养适当时间后结果如图2。 ②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是________。 （5）若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒，请尝试提出一个还需要进一步研究的问题：________。 【答案】（1）C6H12O62C2H5OH（酒精）+2CO2+能量 （2）打靶DNA序列的导入 同源染色体的非姐妹染色单体交换片段 2和3、1和3、2和4 见图 （3）密闭 不影响酒精发酵能力，但絮凝能力提高 （4）无菌 R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，进而提高絮凝能力 （5）R基因敲除菌株的食用安全性/R基因敲除菌株的遗传稳定性 【分析】PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。 【解析】（1）酵母菌无氧呼吸可以产生酒精，可依据该原理将其应用于酒精生产，反应式为C6H12O6→2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量。 （2）①将目的基因导入微生物细胞时，常用感受态细胞法，即使其处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，以实现重组质粒的导入。打靶DNA序列上的卡那霉素抗性基因通过同源重组机制，替换了酵母菌基因组中的R基因，这种机制与减数分裂中的同源染色体的非姐妹染色单体交换片段过程机制相似，都属于基因重组。 ②R基因的碱基长度不同于打靶DNA序列，不同长度的DNA片段电泳时迁移的速率不同，根据电泳结果就可以判断酵母细胞的R基因是否被成功敲除，PCR扩增时需要两种引物，延伸的方向均是从模板的3'→5'，可以选择的引物可以是引物1和引物3或引物1和引物4或引物2和引物3或引物2和引物4。用引物1、4组合进行PCR时敲除，能够扩增出的DNA片段长度为36+38+2073=2147bp，未敲除时扩增的DNA片段长度为36+38+1062=1136bp，电泳结果如图所示： （3）①酒精发酵是在无氧条件下进行的，故发酵期间，每个锥形瓶应注意保持密闭条件。 ②分析表格数据可知，与野生菌株相比，R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，絮凝能力提高，故获得的R基因敲除菌株符合生产需求。 （4）①微生物培养和计数应注意无菌操作，则将R基因敲除菌株和野生菌株分别用无菌水进行梯度稀释。 ②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是：R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，絮凝能力提高。 （5）由于啤酒是饮用食品，应保证其安全性，故还需要进一步研究的问题是R基因敲除菌株的食用安全性。 7．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)东方果蝇会在瓜果的内部产卵，引起果实早落，给果农带来极大的经济损失。研究人员尝试利用蓖麻毒素，研发雌性特异性致死基因系统，以减少雌果蝇的数量。 （1）蓖麻毒素是蓖麻种子中的一种毒蛋白，由RTA和RTB两部分功能不同的肽链组成。其中RTB可与细胞表面的糖蛋白或糖脂结合，毒蛋白以________方式进入细胞，随后在________（填细胞器）内被部分水解，毒蛋白链间二硫键断裂，释放出RTA。RTA具有rRNA酶的活性，可导致________（填细胞器）失活，影响蛋白质合成。 （2）东方果蝇的dsx基因具有特异性剪切识别序列，雌性个体中该序列能使dsx基因的内含子转录的序列被剪切掉，而雄性个体无此功能，因而雌雄果蝇会产生不同的dsx成熟mRNA。研究人员将dsx基因的部分序列与RTA基因融合（如图1），获得融合基因1，构建________，导入果蝇的________，进而得到转基因果蝇。转基因雌蝇中表达的肽链对应的mRNA为________（填图2中字母）。由于存在性别选择性剪接机制，雌蝇会特异性致死。请分析转基因雄蝇不会致死的原因是________。 （3）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为引物a精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，对融合基因1进行定点突变获得融合基因2（如图3）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，并标明每条链的5'端和3'端________。 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： i：在29℃收集雄性果蝇（G0）。 ii：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 iii：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若________，则说明G1具有cs效应。 iv：在________℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代相互交配，得到转基因纯合子。 【答案】（1）胞吞 溶酶体 核糖体 （2）基因表达载体 受精卵 C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 （3） 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解析】（1）蛋白进入细胞的方式是胞吞；水解蛋白的细胞器是溶酶体；蛋白质的合成场所是核糖体，核糖体失活影响蛋白质的合成。 （2）得到转基因果蝇，得到融合基因后，需要构建基因表达载体，将融合基因导入果蝇的受精卵内。由（1）可知，RTA使核糖体失活，会导致细胞死亡，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。而在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。 （3） ①图2虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：。 ②由题意可知：RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。 对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，低温下雌性个体存活率高，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。 ⅳ：在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 8．(24-25高一下·北京市西城区北京师范大学附属中学·期中)土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，培育耐盐碱农作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。 （1）为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建过表达植株（AT1-OE）。以高粱cDNA为模板，利用_________方法获取目的基因。如图1，选取最佳限制酶_________处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选T-DNA成功转入的愈伤组织，使用既能杀死原核细胞，又能杀死真核细胞的潮霉素，效果优于仅能杀死原核细胞的抗生素（如卡那霉素），原因是_________。进一步筛选获得所需愈伤组织，经_________发育成完整植株。同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。 （2）检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株_________，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 （3）高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图3。 ①检测总蛋白的目的是_________。 ②通过条带_________可以判断，AT1与PIP2有相互作用。若想进一步验证该相互作用，可用_________抗体与新磁珠偶联再次进行实验。 （4）细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是_________。 【答案】（1）PCR BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 未转入T-DNA的植物细胞无法生长 再分化 （2）幼苗长势好、作物产量高 （3）确保免疫共沉淀前的样品中有靶蛋白A和待测蛋白B 3 抗PIP2 （4）高碱环境中AT1与PIP2相互作用抑制其磷酸化，从而抑制H2O2外排，导致植物细胞死亡；敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上升，促进H2O2外排，作物存活率提高。 【分析】基因工程的基本原理是让目的基因在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）以高粱cDNA为模板，利用PCR技术可获得目的基因；为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，需要用两种酶进行切割，据图可知，Xho Ⅰ会破坏标记基因，故不能选择，结合目的基因和质粒的限制酶位点可知，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ为最佳限制酶；T-DNA能够将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，故使用既能杀死原核细胞，又能杀死真核细胞的潮霉素筛选时，未转入T-DNA的植物细胞无法生长，筛选效果会优于仅能杀死原核细胞的抗生素；植物组织培养过程中，由愈伤组织培育为完整植株的过程是再分化。 （2）分析题意可知，基因敲除植株是AT1-KO，而过表达植株是AT1-OE，野生型是对照组，若AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用，则预期结果应为：相比野生型植株，AT1-KO植株幼苗长势好、作物产量高，AT1-OE植株表型相反。 （3）①结合题意“若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A杭体使A沉淀，则B也会被沉淀下来”可知，该过程中靶蛋白A和待测蛋白B是重要检测目标，故检测总蛋白的目的是确保免疫共沉淀前的样品中有靶蛋白A和待测蛋白B。 ②据图可知，对总蛋白进行抗PIP2抗体检测时对照组和实验组均有条带3出现，转入空质粒的对照组对免疫共沉淀蛋白进行抗PIP2抗体检测时无条带3出现，而转入重组质粒的实验组有条带3出现，说明AT1与PIP2有相互作用，能够相互反应、结合；由于实验假设是AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用，若想进一步验证该相互作用，可用抗PIP2抗体与新磁珠偶联再次进行实验。 （4）分析题意，PIP2磷酸化能够促进H2O2外排，综合上述信息，敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是：碱环境中AT1与PIP2相互作用抑制其磷酸化，从而抑制H2O2外排，导致植物细胞死亡；敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上升，促进H2O2外排，作物存活率提高。 9．(24-25高一下·北京市陈经纶中学·期中)人β防御素（由H基因编码）是一种抗菌肽，科研人员欲利用酵母对其进行生产。 （1）获得H基因的序列信息后，可以其cDNA为模板通过_________方法获得该基因。 （2）由于人β防御素会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员在酵母菌基因组DNA中插入Р和S基因，使质粒上H基因的表达受到红光控制。红光调控H基因表达的原理如图1所示。 P和S基因应为_________（填“组成型表达”或“红光诱导表达”）。 （3）发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统（图2），在酵母菌基因组中插入了2个E基因，使F基因的表达受到蓝光控制（图3）。 图3中两个E基因作用分别是_________。 （4）工程菌泄露到环境中可能引发环境问题。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T和L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，进而诱导工程菌死亡（图4）。 图4中①②应选用的启动子为：①_________，②_________。 A．Jub B．ACT C．CYC 图4中③④处结合的阻遏蛋白为：③_________，④_________。 a、T蛋白 b、L蛋白 （5）写出利用该工程菌发酵生产人β防御素的步骤。_________。 【答案】（1）PCR （2）组成型表达 （3）左侧E基因：照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E蛋白，进而激活F基因表达 右侧E基因：使细胞中始终含有少量E蛋白，保持接受蓝光信号的能力 （4）①C ②A ③a ④b（或①A②C③a④b） （5） 第1步 黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适 第2步 红光照射至人β防御素在培养液中达到适宜浓度 第3步 蓝光照射至工程菌凝集，回收发酵产物 第4步 红光蓝光同时照射，杀死工程菌 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 【解析】（1）已知基因序列信息后，可制作引物，其cDNA为模板通过PCR技术获得目的基因。 （2）组成型表达即持续表达，从图1分析，S蛋白与启动子结合，当存在红光时P蛋白与S蛋白结合导致H基因表达，说明P和S蛋白一直存在，是否结合会影响H基因的表达，P和S基因是组成型表达。 （3）左侧E基因的启动子是CYC，照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E蛋白，进而激活F基因表达；右侧E基因的启动子是ACT，为组成型表达的弱启动子，使细胞中始终含有少量E蛋白，保持接受蓝光信号的能力。 （4）从图中分析，蓝光照射时可使CYC启动子后续基因表达，红光照射时可使Jub启动子后续基因表达，①②位置选择这两种启动子可保证酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，①②位置这两种启动子位置可颠倒。为了保证酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，当④位置是L蛋白结合位点、③位置是T基因结合位点时，红光和蓝光同时照射时T基因表达的T蛋白与③位点结合，阻止了L基因的表达，使N基因可以表达而致死。 （5）根据题目信息，红光照射使产物增多，蓝光照射使产物凝集，红蓝光同时照射使工程菌死亡，故第一步应在黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适，第二步红光照射至人β防御素在培养液中达到适宜浓度，第三步蓝光照射至工程菌凝集，回收发酵产物；第四步红光蓝光同时照射，杀死工程菌。 10．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)请阅读以下文章并回答问题。 “基因魔剪”CRISPR/Cas9系统 20世纪90年代，研究发现细菌DNA中存在一种特殊的DNA序列，由重复序列和间隔序列交替排列组成，如图1所示。研究发现这些序列与很多核酸酶关联，之后，将这些序列命名为CRISPR，并以Cas来命名相关的核酸酶。 研究发现，间隔序列中往往会有一些来自噬菌体的DNA片段。科学家假设：CRISPR/Cas是细菌在长期消化过程中形成的用以保护自身对抗病毒的适应性免疫防御系统。为此，科学家用两种噬菌体（P1和P2）侵染野生型嗜热链球菌，对幸存的嗜热链球菌进行培养，研究其对噬菌体侵染的敏感性与CRISPR的关系，实验结果如图2所示，据结果可判断上述假设成立。 CRISPR中的“间隔序列”是细菌对这些外来入侵者的“记录”，怎么打击二次入侵者呢？当噬菌体再次入侵宿主菌时，会诱导相关CRISPR序列和附近的Cas基因表达。CRISPR序列的转录产物是一段记录病毒信息的RNA，Cas基因表达产物是具有内切核酸酶活性的Cas，二者形成复合物，找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。 正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，2012～2013年，CRISPR/Cas9技术（基因编辑技术）应运而生。CRISPR/Cas9系统由Cas9和人工设计的向导RNA构成。向导RNA是20个碱基左右的识别序列，在其引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后，细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，如果细胞中有DNA修复模板（由需插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因插入到指定位点。 CRISPR/Cas9技术在基因功能研究、医疗健康、家畜育种等领域的应用不断取得喜人的新成果。但是，基因编辑技术还存在编辑对象出错造成的“脱靶”，科研人员还需要继续对其进行优化。 （1）间隔序列中噬菌体的DNA片段，能与细菌自身的重复序列整合在一起，其结构基础是二者的DNA分子基本组成单位相同，脱氧核苷酸的连接方式相同，且________。 （2）据图2分析，________，因而可初步判断上述假设成立。 （3）病毒再次入侵细菌引起了记录________的CRISPR序列在________酶的催化下形成相应RNA，与附近的Cas基因表达的蛋白产物形成复合物，此RNA通过________原则结合外源DNA上的靶序列，并引导Cas9切割病毒DNA的靶序列。 （4）“基因魔剪”CRISPR/Cas9系统的优势是：可以通过对________的设计，定点敲除或插入目的基因。 （5）为预防遗传病的发生，有人提议使用CRISPRCas9系统对人受精卵进行基因编辑，你同意这种做法吗？为什么？________。 【答案】（1）二者的DNA均为双螺旋结构 （2）嗜热链球菌获得来自相应噬菌体的S序列，便对其敏感性低；没有获得相应NS序列，对其敏感性高 （3）病毒（噬菌体）信息的 RNA聚合 碱基互补配对 （4）向导RNA （5）不同意，CRISPR/Cas9技术目前还存在脱靶风险、有可能破坏正常基因的功能 【分析】切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式一黏性末端和平末端。 【解析】（1）间隔序列中噬菌体的DNA片段，能与细菌自身的重复序列整合在一起，其结构基础是二者的DNA分子基本组成单位相同，脱氧核苷酸的连接方式相同，且二者的DNA均为双螺旋结构。 （2）据图2分析，嗜热链球菌获得来自P1的S序列，对P1敏感性低，对P2敏感性高；嗜热链球菌获得来自P1和P2共有的S序列，对P1和P2敏感性均低；嗜热链球菌获得来自P2的S序列，对P2的敏感性低，对P1的敏感性高，说明间隔序列中噬菌体DNA片段与嗜热链球菌对噬菌体的抗性有关。 （3）病毒再次入侵细菌引起了记录病毒（噬菌体）信息的CRISPR序列在RNA聚合酶的催化下形成相应RNA，与附近的Cas基因表达的蛋白产物形成复合物，此RNA通过碱基互补配对原则结合外源DNA上的靶序列，并引导Cas9切割病毒DNA的靶序列。 （4）“基因魔剪”CRISPR/Cas9系统的优势是：可以通过对向导RNA的设计，定点敲除或插入目的基因。 （5）不同意，CRISPR/Cas9技术目前还存在脱靶风险、有可能破坏正常基因的功能，所以不同意为预防遗传病的发生，使用CRISPR/Cas9系统对人受精卵进行基因编辑。 11．(24-25高一下·北京市通州区·期中)请学习以下材料，回答问题。 酵母菌中的“鱼钩、鱼饵和鱼” 酵母菌中存在一种转录激活因子——GAL4，它由两个主要的功能结构域组成：DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）。BD能够识别并结合基因上游某段序列，AD可以启动该序列的下游基因进行转录。有趣的是，BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才可以激活转录。 利用酵母菌这套独特的基因表达调控系统的原理，科研人员构建重组质粒pBR与pGA，并将其导入不具有Trp（色氨酸）、Leu（亮氨酸）合成能力的GAL4缺陷型的酵母菌中，通过控制酵母培养基中Met（甲硫氨酸）的有无，可以检测报告基因是否表达，进而分析“鱼饵物质”Z对“鱼钩蛋白”X和“鱼蛋白”Y互作的影响（如下图所示）。 组别 导入基因 pBR质粒 pGA质粒 1 BD AD 2 X-BD AD 3 BD Y-AD 4 X-BD Y-AD 5 X-BD、Z Y-AD 注：Pmet25启动子（Met缺陷诱导型启动子）：只有在Met缺乏的情况下才能使下游蛋白表达，且缺乏Met不影响酵母细胞正常存活。 基于GAL4转录激活因子发展起来的酵母系统，不仅可以用于研究蛋白质的互作，也为研究RNA-蛋白质、小分子药物-蛋白质的相互作用提供了新的手段，但也存在部分局限性。 （1）结合所学知识与文中信息，在酵母菌中，转录激活因子GAL4通过识别并结合________，招募________以启动相关基因的转录。 （2）将1～5组酵母菌接种于三种培养基，部分培养结果如下表所示。由此可见，设置培养基Ⅰ的目的为________，同时，培养基Ⅱ和Ⅲ中还应添加________。若实验结果表明，Z抑制了X和Y的互作，请在表中空格处补全实验结果（“+”代表存在菌落，“-”代表不存在菌落）。 组别 培养基Ⅰ 培养基Ⅱ 培养基Ⅲ -Trp、-Leu -Trp、-Leu -Trp、-Leu、-Met 1 + - - 2 + - - 3 + - - 4 + ________ ________ 5 + ________ ________ （3）你认为这种基于GAL4转录激活因子发展起来的酵母系统，在研究蛋白质互作方面存在哪些局限性？________（答出一条即可） 【答案】（1）启动子 RNA聚合酶 （2）检测重组质粒pBR和pGA是否成功导入酵母菌 金担子素 + + + - （3）这种蛋白质互作的反应是在细胞核中进行，而细胞核并非许多反应发生的最佳场所；可能存在部分蛋白质定位到核时的错误折叠或空间结构改变，导致结果误差；对不能被转运到细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和分泌型蛋白，则无法使用这种方式等 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）结合题干信息可知，GAL4DNA有结合域（BD）和转录激活域（AD），BD能够识别并结合基因上游某段序列，AD可以启动该序列的下游基因进行转录。由此说明转录激活因子GAL4通过识别并结合启动子部位，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，招募RNA聚合酶以启动相关基因的转录。 （2）将pBR和pGA导入酵母细胞，若是能合成Leu和Trp，酵母菌就能在培养基上存活，说明导入酵母菌的质粒能正常表达，因此设置培养基Ⅰ的目的为检测重组质粒pBR和pGA是否成功导入酵母菌。 酵母菌细胞能正常表达蛋白质的情况下，仅有BD基因和AD基因表达的情况下，BD和AD不能激活转录；X-BD融合基因和Y-AD融合基因能正常表达出相应的产物X-BD和Y-AD，若Z抑制了X和Y的互作，BD和AD空间上有一定距离，不能激活转录，金担子抗性基因不能表达，该酵母细胞不能在含金担子素的培养基上存活；若无Z抑制X和Y的互作，X与Y结合，使BD和AD在空间上充分接近，激活转录，金担子素抗性基因正常表达，该酵母菌细胞就能在含金担子素的培养基上存活；若加入了Pmet25启动子（Met缺陷诱导型启动子），则可通过培养基是否加入Met来控制是否表达Z基因。因此培养基Ⅱ和培养基Ⅲ中应该添加金担子素。 培养基Ⅱ的第4组和第5组，由于培养基含Met，Pmet25启动子不能激活，不能合成Z，因此X能与Y结合，BD与AD充分接近，激活转录，表达金担子素抗性基因，两组的菌落均能在含金担子素的培养基上存活；培养基Ⅲ由于缺Met，激活了Pmet25启动子，第3组本身无Z基因，但第4组的Z基因正常表达，因此第3组能激活金担子素抗性基因表达，而第4组由于Z抑制了X和Y的互作，不能激活金担子素抗性基因的表达，故第3组菌落存活，第4组菌落死亡。 （3）由于GAL4的两个结构域BD部分要与DNA结合，AD激活转录，意味着这种蛋白质互作的反应是在细胞核中进行，而细胞核并非许多反应发生的最佳场所；可能存在部分蛋白质定位到核时的错误折叠或空间结构改变，导致结果误差；对不能被转运到细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和分泌型蛋白，则无法使用这种方式等。 12．(24-25高一下·北京市八一学校·期中)学习以下材料，回答（1）～（4）题。 蛋白相互作用的研究 蛋白相互作用是指蛋白质之间相互结合并发挥特定的生物学功能的现象，是生物分子之间交互作用的重要形式。IKK复合体由IKKα、IKKβ和NEMO三个亚基组成，细胞周期调控激酶PLK1是一种催化蛋白质磷酸化的酶。PLK1可通过磷酸化IKKβ抑制IKK复合体的活化，为研究PLK1与IKK的互作，进而确定IKK的作用机制，进行了如下实验。 研究人员通过免疫共沉淀技术进行研究。该技术的原理是，在细胞内如果A蛋白能够与B蛋白结合，若用预先固定在琼脂糖珠子上的蛋白A的抗体去沉淀A蛋白，则B也会一起沉淀下来。通过检测沉淀中是否存在B蛋白，即可确定A和B蛋白是否存在相互作用。研究人员向人胚肾H细胞中转入分别含有Flag—PLK1融合基因和Myc-NEMO融合基因的表达载体，将细胞裂解后，用含有抗Flag抗体的琼脂糖珠子进行沉淀。检测细胞裂解液和沉淀中蛋白情况，结果如图1。用同样方法研究了PLK1与IKKα、IKKβ相互作用的情况，结果如图2。 Pull-down实验也是研究蛋白质相互作用的方法。将细胞裂解，获得含有待测蛋白的细胞裂解液。在体外，利用一种带有特定蛋白标签（如GST）的纯化融合蛋白作为钓饵，与细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，利用抗体检测并鉴定沉淀中的蛋白。研究人员利用该技术验证了PLK1与NEMO的相互作用情况，结果见图3。 利用上述两种技术，研究人员初步确定了PLK1发挥作用的分子机制。 （1）Flag-PLK1融合基因在转录时，Flag基因和PLK1基因共用同一个_________和终止子，翻译时所用起始密码子和终止密码子_________。 （2）分析免疫共沉淀结果可知，研究人员通过_________技术检测相关蛋白互作情况，对细胞裂解液进行检测的目的是_________。免疫共沉淀实验结果表明_________。 （3）根据Pull-down实验结果推测PLK1不能与NEMO直接结合。请补充Pull-down实验的操作步骤（从下列选项中选择）：纯化_________蛋白→将含有_________基因的表达载体导入大肠杆菌中→将纯化的蛋白与大肠杆菌裂解液混合温育→用相应的琼脂糖凝胶沉淀→对裂解液和沉淀进行抗体检测和鉴定。 A．GST-PLK1 B．His-PLK1 C．GST-NEMO D．His-NEMOE.GST （4）依据免疫共沉淀和Pull-down实验的结果，请尝试解释PLK1蛋白作用于IKK复合体的机制_________。 【答案】（1）启动子 相同 （2）抗原抗体杂交 检测并鉴定导入的Flag-PLK1和Myc-NEMO基因是否正常表达 PLK1与NEMO存在相互作用，PLK1与IKKα、IKKβ不存在相互作用 （3）EA D （4）PLK1通过与IKK复合体之外的其他蛋白结合，间接与NEMO蛋白相互作用，从而催化IKKβ蛋白磷酸化，抑制IKK复合体活化 【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞，（4）目的基因的检测与鉴定。 2、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【解析】（1）Flag-PLK1融合基因在转录时，Flag基因和PLK1基因共用同一个启动子和终止子，进而保证融合基因在受体细胞中正常转录。基因的表达包括转录和翻译两个步骤，但由于两个基因融合成为一个基因，同时进行转录和翻译，因此在翻译时所用起始密码子和终止密码子相同。 （2）分析免疫共沉淀结果可知，由于蛋白质和抗体的结合具有特异性，因而研究人员通过抗原-抗体杂交技术检测相关蛋白互作情况，对细胞裂解液进行检测的目的是保证细胞裂解液中存在待检测蛋白质。根据沉淀蛋白与抗体结合情况显示沉淀蛋白中能同时检测到PLK1与NEMO，但不能同时检测到PLK1和IKKα、IKKβ，据此可推测PLK1与NEMO存在相互作用，PLK1与IKKα、IKKβ不存在相互作用。 （3）根据题意，His、GST是作为标签蛋白使用的，探究PLK1与NEMO的相互作用情况，His应与NEMO结合，用抗His抗体检测，细胞裂解液中可检测到His-NEMO融合蛋白，GST钓饵沉淀和GST-PLK1钓饵沉淀中未出现杂交带，说明PLK1不能与NEMO直接结合。据此推测其检测步骤为：纯化GST、GST-PLK1钓饵蛋白→将含有His-NEMO基因的表达载体导入大肠杆菌中→将纯化的蛋白与大肠杆菌裂解液混合温育→用相应的琼脂糖凝胶沉淀→对裂解液和沉淀进行抗体检测和鉴定，支持上述结论的实验结果是GST-PLK1钓饵沉淀中检测不到His-NEMO融合蛋白。 （4）题意显示，PLK1可通过磷酸化IKKβ抑制IKK复合体的活化，根据免疫共沉淀和Pull-down实验的结果可推测PLK1通过与IKK复合体之外的其他蛋白结合，间接与NEMO蛋白相互作用，从而催化IKKβ蛋白磷酸化，抑制IKK复合体活化。 13．(24-25高一下·北京市延庆区·期中)向细菌中导入一些特殊的DNA序列作为生物传感器，可制备出在特定环境中优先生长的工程菌，应用于生物治疗。 （1）研究者利用图1所示的原理分别设计氧气传感器和乳酸传感器。 ①利用基因工程技术构建含氧传感器的大肠杆菌工程菌时，需将含有________和特定基因的DNA片段与载体连接，构建表达载体，导入用________处理的大肠杆菌细胞内。 ②根据图1，氧气传感器在有氧的条件下________（促进/抑制）特定基因的表达；乳酸传感器在有乳酸的条件下________（促进/抑制）特定基因的表达。 （2）研究者用GFP（绿色荧光蛋白）基因作为特定基因制备出含乳酸传感器的试验性工程菌，发现在无乳酸状态下GFP基因的表达量偏高，传感器灵敏度低。请据图1提出改造重组质粒以提高灵敏度的一条措施：________。 （3）将不同的传感器导入同一细菌，可使工程菌同时感知多种环境因素。请选填下列字母到图2中，利用所给出的材料，构建下图所示的两种工程菌________。 传感器的类型：a.氧气传感器 b.乳酸传感器 可选择的特定基因：c.细菌生长必需的asd基 d.细菌生长必需glms基因 e.对细菌生长有毒性的T基因 受体菌类型：甲：普通细菌乙：asd基因缺失突变型细菌丙：asd基因与glms基因双缺失突变型细菌 【答案】（1）启动子A Ca2+ 抑制 促进 （2）修改启动子C以降低基因表达量；增强阻遏蛋白与启动子C的结合；修改启动子B以增强L基因的表达；增加L蛋白基因的拷贝数 （3）见下图（构建丙菌时，c与d位置可互换） 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）①启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可以驱动基因的转录，结合题意可知，构建基因表达载体时，需要将含有启动子A和特定基因的DNA片段与载体连接；将目的基因导入微生物细胞时，需要用Ca2＋处理微生物细胞，使其处于感受态。②根据图1，氧气传感器在有氧的条件下抑制转录因子与启动子A的结合，抑制表达；乳酸传感器在有乳酸的条件下会抑制L蛋白转变为阻遏蛋白，而阻遏蛋白抑制启动子C，因此乳酸传感器在有乳酸的条件下促进特定基因的表达。 （2）分析题意，用GFP（绿色荧光蛋白）基因作为特定基因制备出含乳酸传感器的试验性工程菌，发现在无乳酸状态下GFP基因的表达量偏高，传感器灵敏度低，结合题图可知，原因可能是启动子C过量表达或者L基因表达不足所致，故可修改启动子C以降低基因表达量；增强阻遏蛋白与启动子C的结合；修改启动子B以增强L基因的表达；增加L蛋白基因的拷贝数。 （3）结合图1可知，氧气传感器中特定基因在有氧气的情况下不表达，在无氧气的情况下表达，特定基因表达，乳酸传感器中特定基因在有乳酸的情况下特定基因表达，在无乳酸的情况下不表达，分析题意，该实验目的是构建在缺氧和高乳酸条件同时存在时才能增殖的工程菌及仅缺氧且无乳酸条件见下增殖的工程菌，两者的区别在于有无乳酸，因此不同的点在于乳酸传感器的不同，将不同的传感器导入同一细菌，可使工程菌同时感知多种环境因素，结合图1信息可知，在无氧和无乳酸情况下，可选择工程菌丙：asd基因与glms基因双缺失突变型细菌，传感器1加入c.细菌生长必需的asd基因，且该基因在无氧条件下表达，传感器2加入d.细菌生长必需glms基因，该基因在高乳酸的情况下表达，从而构建在无氧和高乳酸情况下才能增殖的工程菌，图示如下： ，且c与d的位置可以互换，因为在无氧和高乳酸的条件下两种基因均能表达。同理，在无氧和无乳酸情况下，可选择工程菌乙asd基因缺失突变型细菌，传感器1加入c.细菌生长必需的asd基因，且该基因在无氧条件下表达，传感器2加入对细菌生长有毒性的T基因，该基因在无乳酸的情况下不表达，从而构建在无氧和无乳酸情况下增殖的工程菌，图示如下：。 14．(24-25高一下·北京工业大学附属中学·期中)多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，猪肉是我国最主要的肉类消费品，提高其PUFAs含量对居民健康具有重要意义。为解决猪肉中PUFAs含量不足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs合成的必需酶基因fat1，培育转fat1基因猪，操作过程如图1。 （1）利用PCR技术扩增fat1基因时，应在两种引物的一端分别加上限制酶________和________识别与切割的序列。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体一般选用两种限制酶，选择的原则是________。 a、目的基因编码蛋白质的序列中有两种限制酶切割位点 b、表达载体内，每种限制酶只有一个切割位点 c、酶切后，目的基因两端的黏性末端序列相同 d、酶切后，载体形成的两个黏性末端序列不同 （2）图1中的连接产物需先导入大肠菌中的原因是________；所构建的重组基因表达载体中未标注出的必需元件还有________。 （3）将重组表达载体转染猪成纤维细胞，另设一组空白对照。48小时后于荧光显微镜下观察到________，说明转染成功。然后以转基因细胞为核供体构建克隆胚胎，最终获得转fat1基因猪。 （4）研究者提取转基因猪的基因组DNA，利用限制酶Dra Ⅲ将其完全酶切并电泳分离。然后用探针通过________的方法，检测fat1基因是否成功整合在猪基因组DNA中，酶切方式及检测结果如图2。 ①转基因猪1、2、3中分别被转入了________个fat1基因。 ②请解释图2检测结果中4条杂交带位置不同的原因：________。 ③该实验________（填“能”或“不能”）说明成功培育转基因猪，理由是________。 【答案】（1）EcoR Ⅰ BamH Ⅰ bd （2）连接产物为混合物，需先导入大肠菌筛选正确的重组表达载体，再导入猪成纤维细胞，以提高转基因的成功率 复制原点和标记基因 （3）转染重组表达载体的猪成纤维细胞有绿色荧光，而空白对照组无绿色荧光 （4）分子杂交 1、2、1 4个fat1基因插入在基因组中的位点不同，酶切得到的含fat1基因的DNA片段大小不同，电泳分离后，其分布在凝胶的不同位置 不能 没有检测fat1基因是否成功表达，没有在个体生物学水平鉴定转基因猪的PUFAs含量 【分析】1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【解析】（1）据题图可知，运载体有三种限制酶位点可供选择，fat1基因中存在Hind Ⅲ限制酶位点，所以不能选择Hind Ⅲ，应在两种引物的一端分别加上限制酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别与切割的序列。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是： a、目的基因编码蛋白质的序列中，不能有限制酶的切割位点，a错误； b、表达载体内，每种限制酶只有一个切割位点，b正确； c、酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同，否则会自身环化，c错误； d、酶切后，载体形成的两个黏性末端序列应该不同，否则会自身连接，d正确。 故选bd。 （2）由于图1中的连接产物为混合物，要提高转基因的成功率，需先导入大肠菌筛选正确的重组表达载体，再导入猪成纤维细胞。基因表达载体必需具备的元件有目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点；所构建的重组基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点和标记基因。 （3）由题图可知，重组表达载体有绿色荧光蛋白（GFP）基因，而空白对照组无绿色荧光蛋白（GFP）基因，48小时后于荧光显微镜下观察到转染重组表达载体的猪成纤维细胞有绿色荧光，而空白对照组无绿色荧光，则说明转染成功。 （4）用DNA分子杂交技术检测fat1基因是否成功整合在猪基因组DNA中：用放射性同位素标记的fat1基因DNA片段作探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就说明fat1基因已成功整合在猪基因组DNA中。 ①由电泳结果图示可知，转基因猪1、2、3中分别被转入了1、2、1个fat1基因。 ②电泳后杂交带的位置不同，代表进行电泳条带的长度不同；所以用同一种酶（限制酶Dra Ⅲ）将转基因猪的基因组DNA完全酶切后得到不同酶切结果，说明4个fat1基因插入在基因组中的位点不同，酶切得到的含fat1基因的DNA片段大小不同，电泳分离后，其分布在凝胶的不同位置，导致检测结果中4条杂交带位置不同。 ③转基因猪已经培育成功的标志是fat1基因在转基因猪体内成功表达，此时能够检测到转基因猪体内含有fat1基因表达的蛋白质，转基因猪体内具有较高的PUFAs含量，而该实验没有检测fat1基因是否成功表达，没有在个体生物学水平鉴定转基因猪的PUFAs含量，不能说明成功培育转基因猪。 15．(24-25高一下·北京市第五十七中学·期中)温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 （1）大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括________（写出2点）。 （2）为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了方案1，构建表达载体（见图1），将其导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖，当培养温度为30℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，________，因而大肠杆菌表达________荧光蛋白。 （3）为更精准调控荧光蛋白表达，将上述表达载体改造为方案2中载体（见图2）。与方案1相比，方案2的主要优势是________。 （4）为检测方案2，科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图3。依据方案2，每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带，请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色________。 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 （5）聚羟基脂肪酸酯（PHA）常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB和4HB随机聚合，或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5），其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5。请完善以下表格，通过改造方案2以实现应用工程菌大规模生产优质PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。 操作 目的 对方案2表达载体的改造为：________。将构建好的表达载体导入大肠杆菌，获得工程菌。 获得可以合成PHA的工程菌。 以葡萄糖为原料配制培养基，灭菌后加入上述工程菌。 配制培养基、接种。 控制发酵条件：________。 发酵48小时，获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。 【答案】（1）遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等 （2）抑制启动子R，F蛋白不表达，解除F蛋白对启动子N的抑制 绿色 （3）30℃条件下减弱红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且降低对绿色荧光蛋白表达的抑制 （4） 菌落环带 l 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 红、绿、红、绿 绿、红、绿 红、绿 绿 （5）将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因 30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）大肠杆菌是一种常见菌种，其结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，基因克隆表达系统成熟完善，转基因操作简单；大肠杆菌繁殖速度快，易于大规模培养等。 （2）据图1分析可知，当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。 （3）据图2分析可知，在N启动子之后增加了L蛋白基因，使其编码出L蛋白，进一步抑制启动子R，因此在30℃条件下，RFP基因无法表达出红色荧光蛋白，减弱因红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且进一步抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，降低对绿色荧光蛋白表达的抑制。 （4）据图分析可知，将工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制为37℃培养10小时，随后切换至30℃发酵14小时，每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带。培养温度为37℃时，C基因编码的C蛋白没有形成二聚体，启动子R正常启动转录，F基因表达出F蛋白对启动子N的抑制，使L蛋白基因、GFP基因表达受抑制，同时RFP基因表达出红色荧光蛋白，培养温度为30℃时，培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，所以菌落生长2天后出现4个不同的荧光环带颜色为：环带1：红、绿、红、绿，环带2：绿、红、绿，环带3：红、绿，环带4：绿。 （5）据图分析获知，4HB由D酶、E酶催化合成，3HB由A酶、B酶催化合成，再经X酶催化合成嵌段共聚物，要想发酵48小时，获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。对方案2表达载体的改造为：将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因构建表达载体并导入大肠杆菌，获得工程菌，以葡萄糖为原料配制培养基，灭菌后加入获得的工程菌，将接种后的培养基在30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时，最后分离获取代谢产物。 地 城 考点03 生物技术的安全性与伦理问题 一、单选题 1．(24-25高一下·北京市延庆区·期中)下列关于生物技术安全性与伦理问题的叙述，不正确的是（　　） A．加强对高风险实验室的监管，避免病原微生物的泄露 B．目的基因通过花粉的散布转移到其他植物体内，从而可能打破生态平衡 C．利用人体的成纤维细胞转变成iPS细胞，进而利用iPS细胞治疗阿尔茨海默病 D．利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期得到智力超群的“完美婴儿” 【答案】D 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）．对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是趋利避害，不能因噎废食。 【解析】A、高风险实验室的病原微生物若泄露可能引发公共安全问题，加强监管是必要的安全措施，符合生物安全原则，A正确； B、转基因植物的目的基因可能通过花粉传播到其他植物，导致基因污染，破坏生态平衡，属于转基因技术的潜在风险，B正确； C、iPS细胞由成纤维细胞诱导形成，可用于治疗阿尔茨海默病等疾病，属于治疗性克隆的合理应用，不涉及伦理争议，C正确； D、基因编辑设计试管婴儿以追求“完美婴儿”属于非医学目的的基因改造，违背伦理道德，且可能引发社会不公，D错误。 故选D。 2．(24-25高一下·北京市人大附中·期中)法律和法规是规范生物技术研究，防止生物技术滥用的有力武器。下列叙述与我国相关法规不符的是（　　） A．用农业转基因生物加工制成的产品需提供标识 B．不得将体外受精获得的人类胚胎植入人体生殖系统 C．在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器 D．禁止非医学需要的胎儿性别鉴定和选择性别人工终止妊娠 【答案】B 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）.对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是趋利避害，不能因噎废食。 【解析】A、用农业转基因生物加工制成的产品需提供标识，以确保消费者的知情权，A正确； B、生产试管婴儿需要将体外受精获得的人类胚胎植入人体生殖系统，B错误； C、生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，我国已申明在任何情况下，不发展、不生产、不储存生物武器，C正确； D、禁止非医学需要的胎儿性别鉴定和选择性别人工终止妊娠，以避免引发伦理问题等，D正确。 故选B。 3．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)虾酱是以虾为原料的传统发酵食品。在乳酸菌、芽孢杆菌等多种微生物共同作用下，原料中的蛋白质和脂肪发生水解，形成虾酱的特有风味。下列叙述错误的是（　　） A．虾酱特有风味的形成受发酵时间的影响 B．传统虾酱的制作过程需要严格执行无菌操作 C．原料中的蛋白质会被水解成小分子的肽和氨基酸 D．虾酱发酵过程微生物种类和数量的分析有助于改良风味 【答案】B 【分析】直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前子发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵制作食品的技术一般称为传统发酵技术。利用传统发酵技术制作的食品，还有酱、酱油、醋、泡菜和豆豉等。 【解析】A、虾酱是由微生物发酵形成的，虾酱特有风味的形成受发酵条件、发酵温度、发酵时间的影响，A正确； B、传统虾酱的制作过程利用原料中带有的微生物进行发酵，不需要经过严格无菌操作，B错误； C、原料中的蛋白质会被蛋白酶水解成小分子的肽和氨基酸，C正确； D、虾酱发酵由乳酸菌、芽孢杆菌等多种微生物共同参与，虾酱发酵过程微生物种类和数量的分析有助于改良风味，D正确。 故选B。 4．(24-25高一下·北京市丰台区·期中)生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风险。下列叙述与我国政府相关法规或主张不符的是（　　） A．禁止人的生殖性克隆和治疗性克隆 B．禁止非医学需要的胎儿性别鉴定 C．销售转基因农产品应有明确标注 D．全面禁止和彻底销毁生物武器 【答案】A 【分析】生物安全在农业领域中，指遗传修饰生物（如转基因作物）对人体及生态系统造成的安全性问题；在生态领域中，指外来有害生物的引进和扩散，对人类生产和健康造成不利影响的各种传染病、害虫、真菌、细菌、线虫、病毒和杂草等。除此之外，生物安全还包括生物遗传资源流失、实验室生物安全、微生物耐药性、生物恐怖袭击等。生物安全是人的健康、动植物健康、生态环境健康三者安全统一的概念。 【解析】A、我国禁止人人的生殖性克隆，但不反对治疗性克隆，A错误； B、我国禁止非医学需要的胎儿性别鉴定，以避免引发伦理问题等，B正确； C、销售转基因农产品应有明确标注，以确保消费者的知情权，C正确； D、生物武器又是生物制剂、载体和分散手段的综合利用。生物武器自诞生以来，给人类的生存安全构成了严重威胁，应全面禁止和彻底销毁生物武器，D正确。 故选A。 5．(24-25高一下·北京市第八十中·期中)下列关于生物技术与伦理问题的观点，正确的是（　　） A．利用体外受精技术筛选早期胚胎性别，设计试管婴儿 B．基于科学和理性讨论转基因作物的安全性问题 C．通过基因筛查禁止重大疾病基因携带者就业 D．大量引入国外转基因作物与本地近缘作物品种杂交 【答案】B 【分析】1、设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。 2、转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。 【解析】A、我国不允许利用体外受精技术筛选早期胚胎性别，A错误； B、转基因作物的安全性是人们最关心的问题，要基于科学和理性讨论转基因作物的安全性问题，B正确； C、通过基因筛查禁止重大疾病基因携带者就业，不符合伦理道德，C错误； D、大量引入国外转基因作物与本地近缘作物品种杂交，可能造成基因污染，D错误。 故选B。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 答案版 地 城 考点01 减数分裂的过程和基本概念辨析 一、单选题 1．B 2．A 3．D 4．D 5．B 6．A 7．A 8．B 9．C 10．B 11．D 12．C 13．D 14．A 15．D 16．B 17．C 18．B 19．D 20．D 二、非选择题 21．（1）Xho Ⅰ和Mun Ⅰ （2）逆转录 （3）CTCGAGCCTT （4）氨苄青霉素和X-gal 白 （5）蛋白质工程 DNA 22．（1）显微注射 （2）监测灵敏度更高 （3）② D （4）激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 （5）避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 23．（1）PCR 限制酶（Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ）DNA连接酶 （2）庆大霉素 1 因Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ两种限制酶切割后的黏性末端相同，故ELP序列可以反向连接入pGE—H质粒，总长度为3.7kb。但重组质粒构建完成后，两种酶的识别位点均消失，故重组质粒无法再被该两种酶重新切割，所以呈现3.7kb的条带。 （3）20℃、加NaCl 24．（1）催化 （2）DNA半保留复制 DNA连接 p质粒和插入片段（目的基因）乙和丙 目的基因反向连接 （3）工程菌株除氮效果优于野生菌 25．（1）I-Sec Ⅰ Kpn Ⅰ和DNA连接酶 农杆菌转化 筛选含重组T-DNA的水稻（细胞）启动子2 不同 abc （2）八氢番茄红素合成酶 对psy基因进行诱变取定向改造（从其他生物中筛选），获得表达产物活性更高的psy基因，进行转基因操作 26．（1）转录 核糖体 （2）基因组文库 Ava Ⅱ和Nco Ⅰ DNA连接酶 14个外显子和前6个内含子 （3）与天然HSA蛋白氨基酸序列和结构完全相同 体细胞核移植 地 城 考点02 基因工程的应用 一、单选题 1．D 2．A 二、非选择题 3．（1）分子 限制性内切核酸酶（限制酶） （2）核糖体合成的TALE-FokI蛋白带有CTP，CTP可以引导蛋白质向叶绿体内进行转运，将TALE-FokI蛋白带入到叶绿体中完成基因编辑 （3）大肠特异性启动子 核定位序列 BST114序列特异性TALE—FokI融合基因 （4）可用于线粒体疾病的基因治疗 4．（1）DNA连接酶 （2）农杆菌转化法或花粉管通道法 在常温下，转基因植株的果实产量低于野生型植株 仅在高温下提高LIN5的表达量 （3）常温下，荧光强度①②③组相似；高温下，②组荧光强度高于①组和③组，①和③类似 （4）假说：更多光合作用产物从叶片转移到了子房中，使得果实的产量上升。技术：14C同位素标记法 5．（1）感染和未感染时，红光处理组的SA含量均高于白光处理组，能有效抵御疫霉菌感染 （2）a、f、e b （3）实验一是植物体内实验，荧光强度的检测结果可反映H蛋白促进P基因的表达；实验二是体外实验，不能判断H蛋白对P基因的调控方向 （4）参考样例：给辣椒植株适当增加红光照射；向辣椒植株适时适量喷施SA溶液；培育H基因或P基因过表达的辣椒品种。 6．（1）C6H12O62C2H5OH（酒精）+2CO2+能量 （2）打靶DNA序列的导入 同源染色体的非姐妹染色单体交换片段 2和3、1和3、2和4 见图 （3）密闭 不影响酒精发酵能力，但絮凝能力提高 （4）无菌 R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，进而提高絮凝能力 （5）R基因敲除菌株的食用安全性/R基因敲除菌株的遗传稳定性 7．【答案】（1）胞吞 溶酶体 核糖体 （2）基因表达载体 受精卵 C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 （3） 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 8．（1）PCR BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 未转入T-DNA的植物细胞无法生长 再分化 （2）幼苗长势好、作物产量高 （3）确保免疫共沉淀前的样品中有靶蛋白A和待测蛋白B 3 抗PIP2 （4）高碱环境中AT1与PIP2相互作用抑制其磷酸化，从而抑制H2O2外排，导致植物细胞死亡；敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上升，促进H2O2外排，作物存活率提高。 9．（1）PCR （2）组成型表达 （3）左侧E基因：照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E蛋白，进而激活F基因表达 右侧E基因：使细胞中始终含有少量E蛋白，保持接受蓝光信号的能力 （4）①C ②A ③a ④b（或①A②C③a④b） （5） 第1步 黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适 第2步 红光照射至人β防御素在培养液中达到适宜浓度 第3步 蓝光照射至工程菌凝集，回收发酵产物 第4步 红光蓝光同时照射，杀死工程菌 10．（1）二者的DNA均为双螺旋结构 （2）嗜热链球菌获得来自相应噬菌体的S序列，便对其敏感性低；没有获得相应NS序列，对其敏感性高 （3）病毒（噬菌体）信息的 RNA聚合 碱基互补配对 （4）向导RNA （5）不同意，CRISPR/Cas9技术目前还存在脱靶风险、有可能破坏正常基因的功能 11．（1）启动子 RNA聚合酶 （2）检测重组质粒pBR和pGA是否成功导入酵母菌 金担子素 + + + - （3）这种蛋白质互作的反应是在细胞核中进行，而细胞核并非许多反应发生的最佳场所；可能存在部分蛋白质定位到核时的错误折叠或空间结构改变，导致结果误差；对不能被转运到细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和分泌型蛋白，则无法使用这种方式等 12．（1）启动子 相同 （2）抗原抗体杂交 检测并鉴定导入的Flag-PLK1和Myc-NEMO基因是否正常表达 PLK1与NEMO存在相互作用，PLK1与IKKα、IKKβ不存在相互作用 （3）EA D （4）PLK1通过与IKK复合体之外的其他蛋白结合，间接与NEMO蛋白相互作用，从而催化IKKβ蛋白磷酸化，抑制IKK复合体活化 13．（1）启动子A Ca2+ 抑制 促进 （2）修改启动子C以降低基因表达量；增强阻遏蛋白与启动子C的结合；修改启动子B以增强L基因的表达；增加L蛋白基因的拷贝数 （3）见下图（构建丙菌时，c与d位置可互换） 14．（1）EcoR Ⅰ BamH Ⅰ bd （2）连接产物为混合物，需先导入大肠菌筛选正确的重组表达载体，再导入猪成纤维细胞，以提高转基因的成功率 复制原点和标记基因 （3）转染重组表达载体的猪成纤维细胞有绿色荧光，而空白对照组无绿色荧光 （4）分子杂交 1、2、1 4个fat1基因插入在基因组中的位点不同，酶切得到的含fat1基因的DNA片段大小不同，电泳分离后，其分布在凝胶的不同位置 不能 没有检测fat1基因是否成功表达，没有在个体生物学水平鉴定转基因猪的PUFAs含量 15．（1）遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等 （2）抑制启动子R，F蛋白不表达，解除F蛋白对启动子N的抑制 绿色 （3）30℃条件下减弱红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且降低对绿色荧光蛋白表达的抑制 （4） 菌落环带 l 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 红、绿、红、绿 绿、红、绿 红、绿 绿 （5）将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因 30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时 地 城 考点03 生物技术的安全性与伦理问题 1．D 2．B 3．B 4．A 5．B 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $