专题05 基因工程（期中真题汇编，江苏专用）高二生物下学期

专题05 基因工程 4大模块高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是（    ） 限制酶 AluI BamHI SmaI Sau3AI 识别序列 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑ A．BamHI切割的是氢键，AluI切割的是磷酸二酯键 B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C．相同的DNA分子被Sau3AⅠ识别并切割的概率一般高于BamHI D．T4DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低 【答案】C 【分析】限制性内切核酸酶，简称限制酶：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来；（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；（3）结果：形成黏性末端或平末端。 【详解】A、BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误； B、BamHⅠ识别和切割G↓GATCC，Sau3AⅠ识别和切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连。连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ识别和切割，但是不一定存在GGATCC序列，所以BamHⅠ不一定能再识别和切割连接后的片段，B错误； C、与BamHI相比，Sau3AⅠ的识别序列更短，DNA中含有该酶识别位点的可能性更大。因此，相同的DNA分子被Sau3AⅠ识别并切割的概率一般高于BamHI，C正确； D、T4DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，②⑤是黏性末端，T4DNA连接酶连接平末端时效率较低，D错误。 故选C。 2．（24-25高二下·江苏扬州·期中）限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是（    ） A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．T4DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较高 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA 【答案】B 【分析】基因工程最基本的工具：①基因的"剪刀”---限制性核酸内切酶（简称限制酶）；②基因的"针线”--DNA连接酶；③基因的运载体---质粒、噬 菌体、动植物病毒等。 【详解】A、DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误； B、限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确； C、T4DNA连接酶是从T4噬菌体中分离得到的，既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低，C错误； D、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。 故选B。 3．（24-25高二下·江苏盐城·期中）1972年，伯格首先在体外进行了DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列叙述正确的是（　　） A．限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列 B．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA 分子 C．用限制酶酶切获得一个外源基因时，若得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开 D．DNA连接酶只能连接同种限制酶切开的两个DNA片段，重新形成磷酸二酯键 【答案】A 【分析】基因工程的工具：限制酶（能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条母链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂）、DNA连接酶（连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键）、运载体。 【详解】A、限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列，A正确； B、质粒不仅存在于细菌中，也可见于酵母菌等真菌以及某些放线菌中，B错误； C、每个切口处需断开双链DNA的两条链，因此每个切口会断裂2个磷酸二酯键（每条链1个）。若获得一个外源基因需要切割两个切口（如从DNA片段中切下目的基因），则断裂的磷酸二酯键总数为4个，C错误； D、若不同限制酶切割产生的末端互补，或均为平末端，DNA连接酶（尤其是T4DNA连接酶）也可连接，D错误。 故选A。 4．（24-25高二下·江苏无锡·期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（    ） A．将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟，DNA存在于沉淀 B．洋葱滤液中加入冷酒精，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C．DNA片段的PCR扩增实验中反应缓冲溶液中的Mg2+能够激活TaqDNA聚合酶 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中，A错误； B、洋葱滤液中加入冷酒精，用玻璃棒搅拌会使DNA的析出，因为DNA不溶于冷酒精，B错误； C、DNA片段的PCR扩增实验中反应缓冲溶液中的Mg2+能够激活TaqDNA聚合酶，即镁离子是DNA聚合酶的激活剂，C正确； D、DNA分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷，可用于电泳；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，在波长为300nm的紫外灯下可以被检测出来，D错误。 故选C。 5．（24-25高二下·江苏淮安·期中）南通某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。相关叙述不正确的是（　　） A．过程②过滤后应取滤液 B．过程⑤加入酒精后，也可将溶液倒入离心管离心后取沉淀物 C．过滤液放入4℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性 D．提取到的丝状物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热后变蓝 【答案】D 【分析】DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。 【详解】A、过程②过滤后，纱布为残留的组织和细胞结构，DNA在滤液中，应取滤液，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，过程⑤加入酒精后，蛋白质溶解，DNA析出，因此离心后弃上清取沉淀，B正确； C、酶活性的发挥需要适宜的温度等条件，将过滤液放入4℃冰箱或加入预冷的酒精的目的是抑制DNA酶的活性，避免DNA被水解，C正确； D、将析出的丝状物先溶于5ml的2mol/L的NaCl溶液中，然后加入4mL二苯胺试剂，混匀后沸水浴中加热可出现蓝色，D错误。 故选D。 6．（24-25高二下·江苏苏州·期中）关于基因工程的工具，下列叙述正确的是（   ） A．限制酶具有特异性，不同限制酶识别的核苷酸序列都不同 B．TaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物量增加 C．E．coli DNA连接酶只能连DNA片段互补的黏性末端，而不能连平末端 D．为使目的基因准确插入，可将天然质粒上重复的限制酶识别位点删除 【答案】D 【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：根据酶的来源不同分为两类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4 DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。（3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。 2、作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因）；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 【详解】A、限制酶具有特异性，不同的限制酶识别的核苷酸序列和切割位点一般不同，但也存在识别序列相同的限制酶，如不同的限制酶可能都识别相同的回文序列，A错误； B、Taq DNA聚合酶是PCR技术中常用的DNA聚合酶。在PCR反应中，引物的浓度过低会引起非特异性扩增产物量增加，而不是Taq DNA聚合酶的浓度过低。Taq DNA聚合酶浓度过低主要会影响扩增效率等，而不是导致非特异性扩增产物量增加，B错误； C、E.coli DNA连接酶能连接DNA片段互补的黏性末端，也能连接平末端，只是对于平末端连接效率极低，C错误； D、在质粒上引入含有多种限制酶切割位点的多克隆位点，以便外源基因的重组。一 般还要删除重复的限制酶切割位点，使环状的质粒经限制酶处理后只在一处断裂,从而保证外源基因的准确插入，D正确。 故选D。 7．（24-25高二下·江苏南京·期中）下列相关实验操作正确的是（    ） A．植物组织培养中，对外植体使用70%的酒精消毒30min，再用次氯酸钠消毒30s B．在DNA的粗提取与鉴定实验中，粗提取的DNA中可能含有蛋白质 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 【答案】B 【分析】PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。 【详解】A、植物组织培养中，对外植体使用 70%的酒精消毒30s左右，用无菌水清洗2-3次，再用次氯酸钠消毒30min，立即用无菌水清洗2-3次，A错误； B、在DNA的粗提取与鉴定实验中，粗提取的DNA中可能含有蛋白质等杂质，后续还需要进一步的提纯等操作，B正确； C、将配制的酵母培养基煮沸并冷却至50℃后，在酒精灯火焰旁倒平板，这样可以防止杂菌污染，C错误； D、将接种环烧红，待冷却后再蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，若烧红后迅速蘸取菌液，高温会杀死菌种，D错误。 故选B。 8．（24-25高二下·江苏无锡·期中）下列与DNA粗提取和鉴定有关的叙述，正确的是（    ） A．预冷的酒精可使DNA更容易析出 B．DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较低 C．鉴定粗提取的DNA时，对照组与实验组的区别是加不加二苯胺试剂 D．常温下DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 【答案】A 【分析】利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，选择适当的盐浓度能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 【详解】A、预冷酒精溶液的作用有：抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；降低分子运动，易于形成沉淀使DNA析出等，A正确； B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol·L-1的NaCl溶液中溶解度较高，B错误； C、鉴定粗提取的DNA时，对照组中不加入DNA，只加入2mol·L-1的NaCl和二苯胺试剂，C错误； D、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，D错误。 故选A。 9．（24-25高二下·江苏无锡·期中）DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（    ） A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C．E.coli DNA连接酶只能连接平末端 D．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 【答案】D 【详解】A、DNA连接酶连接的磷酸二酯键，A错误； B、DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误； C、E.coli DNA连接酶可以连接具有互补黏性末端的DNA片段，C错误； D、DNA连接酶能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键，D正确。 故选D。 10．（24-25高二下·江苏常州·期中）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（    ） A．取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA B．将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．DNA分子在凝胶中的迁移速率只与DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA结合，便于紫外灯下观察 【答案】A 【分析】DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，而某些蛋白质等杂质溶于酒精，洋葱研磨液的上清液中含有 DNA，加入等体积冷酒精后，DNA会析出从而得到粗提取的DNA，A正确； B、将白色丝状物溶解在2mol/L的NaCI溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴来鉴定 DNA，不能直接将白色丝状物加入二苯胺试剂中，B错误； C、DNA分子在凝胶中的迁移速率不仅与DNA分子的大小和构象有关，还与凝胶的浓度等因素有关，C错误； D、凝胶载样缓冲液中加入的指示剂是为了指示电泳的进程等，不是与DNA结合便于紫外灯下观察，D错误。 故选A。 二、多选题 11．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）CRISPR-Cas9基因编辑技术是一项可对DNA特定部位进行编辑的DNA操控技术。sgRNA起到向导的作用，与相应的DNA序列相结合，核酸酶Cas9可使DNA双链断裂，之后细胞再将断裂的DNA进行修复（如图）。下列说法不正确的是（    ） A．sgRNA识别过程中存在A-T、T-A、G-C、C-G的配对 B．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列通常相同或互补 C．sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 D．图中剪下一段DNA片段，可能导致染色体结构变异 【答案】ABC 【分析】1、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 2、分析题图：用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点并进行切割，进而将DNA片段Ⅱ切除，连接DNA片段Ⅰ和Ⅲ，形成新的DNA片段。 【详解】A、sgRNA 起到向导的作用，与相应的DNA 序列相结合，所以在sgRNA 识别过程中存在 A-T、U-A、G-C、C-G 的配对，A错误； B、图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2碱基序列结合的是不同的DNA区段，故二者一般情况下既不相同也不互补，B错误； C、CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA的序列越短，可识别的DNA上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，C错误； D、图中剪下一段DNA 片段Ⅱ，可能含有一个或多个基因，因此可能导致染色体结构变异，D正确。 故选ABC。 12．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中的选材或操作的叙述，不正确的是（    ） A．可选择鸡或者兔的成熟红细胞作为实验材料来获取DNA B．利用DNA溶于酒精，而某些蛋白质不溶于酒精的特性，可以初步分离DNA与蛋白质 C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，可提高DNA的提取量 D．将DNA用2moL/L的NaCl溶解后与二苯胺试剂混合均匀，进行沸水浴后，待其冷却观察颜色反应 【答案】ABC 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性；（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、兔的成熟红细胞无细胞核，无法作为提取DNA的实验材料，A错误； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利用此原理将DNA与蛋白质分离，B错误； C、用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，快速搅拌会破坏DNA分子的完整性，C错误； D、将DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，混匀后，在沸水浴条件下，呈蓝色，D正确。 故选ABC。 13．（24-25高二下·江苏徐州·期中）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶（切割位点相同或不同均可）。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述正确的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5′-G↓CGC-3′ GlaⅠ 5′-GC↓GC-3′ HhaⅠ 5′-GCG↓C-3′ HpaⅡ 5-′C↓CGG-3′ NarⅠ 5′-GG↓CGCC-3′ A．HinPII和HhaI为同裂酶，切出的黏性末端不同 B．HinPII和HpaII切割的产物连接后，其序列不能被GlaI切割 C．HinPII和NarI为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaI切割 D．某质粒仅含1个GlaI的识别位点，则该质粒能被NarI切割的概率为1/16 【答案】ABD 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。 【详解】A、同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HhaⅠ识别和切割位点是5'-GCG↓C-3'，二者识别序列均为GCGC，所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶。 判断黏性末端是否不同：HinPⅡ切割后产生的黏性末端是 -G和CGC- ，HhaⅠ切割后产生的黏性末端是 -GCG和C- ，二者黏性末端不同，A正确； B、HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HpaⅡ识别和切割位点是5'-C↓CGG-3'，二者切割产物连接后的序列为 -GCGG- 。GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，连接后的 -GCGG- 序列不能被GlaⅠ识别和切割，B正确； C、同尾酶是指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，二者切割后产生的黏性末端均为 -GCG和C- ，所以HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶。 分析连接后的序列能否被GlaⅠ切割：HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为 -GCGC- ，GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，该序列能被GlaⅠ识别和切割，C错误； D、GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，可以看出NarⅠ识别位点包含了GlaⅠ的识别位点。某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，由于DNA是双链结构，从概率角度看，随机出现GlaⅠ识别位点（GC↓GC）的概率为 (1/4) 4  =1/256，而NarⅠ识别位点（GG↓CGCC）包含GlaⅠ识别位点，在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16（因为在GlaⅠ识别位点基础上，前后各增加一个碱基，共16种可能情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点），D正确。 故选ABD。 三、非选择题 14．（24-25高二下·江苏扬州·期中）生物体的生命活动都有共同的物质和结构基础。图1中a、b、c分别代表三种有机化合物，d、e分别代表生物大分子甲、乙、丙的单体。回答下列问题： (1)生物体内的糖类绝大多数以_____的形式存在；能与溶液中的重金属离子有效结合，可用于废水处理的糖是_____。 (2)与物质b相比，a在元素组成上的特点是_____；图1中的物质c是_____，它还具有_____功能。 (3)e通过_____（填化学反应名称）形成丙，该过程发生的场所是_____。 (4)下图表示生物实验中通过研磨提取甲的操作过程，回答下列问题： ①图中实验材料A可以是下面的_____。（填字母） a.花菜     b.香蕉     c.猪肝     d.猪血 ②若选用植物组织，研磨前加入的B一般为洗涤剂和_____，后者的作用是_____。得到滤液C后，再向滤液C中加入_____，缓慢搅拌得到甲。 ③实验中，将含有一定杂质的甲分别放入2mL下表所示的3种溶液中，经搅拌后过滤，获得相应的3种滤液，含甲最少的是滤液_____。 溶液种类 滤液 1 2mol/L的NaCl溶液 e 2 0．14mol/L的NaCl溶液 f 3 0．014mol/L的NaCl溶液 g 【答案】(1) 多糖 几丁质 (2) 氧的含量远远低于糖类，而氢的含量更高 胆固醇 构成动物细胞膜的重要成分 (3) 脱水缩合 核糖体 (4) abc 食盐 溶解DNA 95%的冷酒精 f 【分析】1、脂肪可用苏丹Ⅲ染液鉴定，呈橘黄色； 2、DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精； （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】（1）生物体内的糖类绝大多数以多糖的形式存在，如淀粉是植物细胞中的储能多糖，糖原是动物细胞中的储能多糖等。几丁质能与溶液中的重金属离子有效结合，可用于废水处理。 （2）物质a是细胞内良好的储能物质，为脂肪;物质b是细胞内重要的能源物质，为糖类。与糖类相比，脂肪在元素组成上的特点是氧的含量远远少于糖类，而氢的含量更多。物质c能参与血液中脂质的运输，所以c是胆固醇。胆固醇还具有构成动物细胞膜的重要成分，在人体内还参与血液中脂质的运输等功能; （3）e是氨基酸脱水缩合形成丙，该过程发生的场所是脱水通过形成丙，该过程发生的场所是核糖体。 （4）①DNA的粗提取和鉴定实验中，原则上只要含有DNA的生物都可以作为实验材料，花菜、香蕉、猪肝都含有DNA，都可以作为该实验的材料，而猪为哺乳动物，其成熟的红细胞中不含细胞核和细胞器，即不含DNA，因此猪血不能作为该实验的材料，故选abc。 ②若选用植物组织，研磨前需加入洗涤剂和食盐，其中食盐能溶解DNA，洗涤剂能溶解细胞膜。得到滤液C后，先向滤液C中加入95%的冷酒精，缓慢搅拌得到甲。 ③DNA在2mol/L的NaCl溶液和0.014mol/L的NaCl溶液中的溶解度都较大，0．14mol/L的NaCl溶液中DNA的溶解度最低，含DNA最少的是滤液f。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．可以根据相同时间内DNA分子在凝胶中的迁移距离来判断其大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、可以根据相同时间内DNA分子在凝胶中的迁移距离来判断其大小，DNA片段越长，迁移速率越慢，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 2．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）精子载体法是以精子作为外源基因载体携带外源基因进入卵细胞，如图表示用该方法制备转基因鼠的基本流程。下列叙述错误的是（    ） A．精子载体法与显微注射法相比，对受精卵中核的影响更小 B．进行②过程前，精子需要在含有肝素或Ca2+载体的溶液中进行获能处理 C．③过程有一段时间是在透明带内进行分裂，这种受精卵的早期分裂称为孵化 D．在进行过程④之前要对代孕母鼠进行同期发情处理 【答案】C 【分析】分析题图：图示表示培育转基因鼠的基本流程，其中①是筛选获得导入外源基因的精子的过程，②是体外受精过程，③是早期胚胎培养过程，④是胚胎移植过程。 【详解】A、精子载体法借助精子和受精作用将外源基因导入受精卵，比显微镜下注射外源基因（载体），对受精卵中核的影响更小，A正确； B、②过程是体外受精，精子在体外受精前需要进行获能处理，利用含有肝素或载体的溶液，B正确； C、胚胎发育早期在透明带内进行的分裂过程称为‌卵裂期‌，而非孵化，C错误； D、代孕母鼠要接受移植过去的早期胚胎，必须在生理上处于与供体相同的生理状态，所以要对代孕母鼠进行同期发情处理，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·江苏连云港·期中）下列有关基因工程所需酶及载体的描述错误的是（　　） A．限制酶切割1个位点，破坏两个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 B．E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都可以连接黏性末端和平末端 C．DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 D．使用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解 【答案】B 【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制性内切核酸酶（简称限制酶），②基因的 “针线”---DNA连接酶，③基因的运载体---质粒、噬菌体、动植物病毒等。 【详解】A、限制酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，切割1个位点，会破坏两个磷酸二酯键，从而产生2个游离的磷酸基团，A正确； B、E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，B错误； C、DNA聚合酶在DNA复制过程中，能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上，通过形成磷酸二酯键将其连接起来，C正确； D、质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，使用质粒作为载体可以保护目的基因，避免目的基因在受体细胞内被分解，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·江苏扬州·期中）在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（    ） A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%~1.2%的琼脂糖溶液 B．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶 C．扩增得到的PCR产物与电泳缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 D．PCR体系中G-C碱基对含量将影响使DNA解链的所需温度 【答案】D 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、配制琼脂糖溶液时，应该用缓冲液而不是无菌水来配制，这样才能维持合适的离子强度和pH等条件，保证电泳效果，A错误； B、待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，B错误。 C、将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，以防样品飘散，C错误； D、G-C碱基对含有3个氢键，目的基因中G-C碱基对含量越多，使DNA解链的所需温度越高，因此PCR体系中G-C碱基对含量将影响使DNA解链的所需温度，D正确。 故选D。 5．（24-25高二下·江苏南京·期中）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体才能获得后代。下列叙述正确的是 （    ） A．①②③技术得到的个体均含只含有两个体（父母）的基因 B．①②③技术都体现了动物细胞核具有全能性 C．①③技术中需取滋养层细胞进行性别鉴定，方可获得相应的奶牛或山羊 D．①②③技术中需将胚胎培养到原肠胚方可进行胚胎移植 【答案】C 【分析】胚胎移植是指将通过体外受精及其 他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。 【详解】A、②通过无性繁殖的方式生产，不具有两个体（父母）的基因，A错误； B、③技术不能体现了动物细胞核具有全能性，B错误； C、滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，胚胎移植前可取滋养层的细胞鉴定性别，C正确； D、①②③技术中需将胚胎培养到桑葚胚或囊胚方可进行胚胎移植，D错误。 故选C。 6．（24-25高二下·江苏连云港·期中）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（　　） A．图示环节所需的温度比上一个环节的低 B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到5'端 C．TaqDNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成 D．经过1个循环后，获得的子代DNA的两条单链长短不同 【答案】B 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在体外复制特定的DNA的核酸合成技术。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Tag 酶）。 【详解】A、图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确； B、在PCR扩增中，脱氧核苷酸只能连接在3'端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端，B正确； C、Tag 酶催化形成磷酸二酯键，磷酸二酯键是相邻的两个脱氧核苷酸之间形成的，C正确； D、由于两个引物均不在该片段的端点，因此1个循环后，获得的子代DNA的两条单链长短不同，D正确。 故选B。 7．（24-25高二下·江苏盐城·期中）蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1~4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（　　） A．若用PCR 技术获取蛛丝蛋白基因，则设计的引物应分别结合在1、4部位 B．若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，则共消耗引物30个 C．对PCR 扩增得到的上述DNA 进行电泳后，需加入核酸染料在紫外灯下进行观察 D．粗提取上述DNA时，为获得更多白色丝状物，应用玻璃棒充分搅拌 【答案】B 【分析】1、基因工程的四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定； 2、PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 DNA复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因DNA 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链 DNA为模板，在 DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 【详解】A、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理体外合成DNA的技术，DNA复制延子链5′→3′进行，由于引物要延伸子链，子链和模板链反向平行，因此根据引物的延伸方向可知图中与引物结合的部位是2、3，A错误； B、若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，根据DNA半保留复制，共得到24=16个DNA分子，这些DNA分子共有32 条链。其中原来的模板链有 2 条，不需要引物，所以共消耗引物32- 2=30个，B正确； C、对PCR 扩增得到的 DNA 需加入核酸染料与核酸结合后再进行电泳后，才能在紫外灯下进行观察，C错误； D、粗提取上述DNA时，用玻璃棒搅拌容易使DNA断裂，不能获得更多白色丝状物，D错误。 故选B。 8．（24-25高二下·江苏扬州·期中）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，相关叙述正确的是（　　） A．DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 B．要尽量避免引物内部或引物之间存在碱基互补序列 C．PCR过程中使用的引物一般为单链RNA片段 D．引物中的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增 【答案】B 【分析】PCR是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。PCR合成的过程为变性、复性，延伸。 【详解】A、DNA子链是从5'向3'进行延伸，因此DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误； B、要尽量避免引物内部或引物之间存在碱基互补序列，防止因引物内部或引物之间碱基互补降低目标DNA扩增效率，B正确； C、PCR过程中使用的引物一般为单链DNA片段，C错误； D、引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。 故选B。 9．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（　　） A．构建该基因表达载体所用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶和运载体 B．将完成导入的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，含有重组质粒的细菌无法生长 D．可利用PCR技术检测人的生长激素基因是否在工程菌中转录和翻译 【答案】C 【分析】分析题图：图示表示将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的过程。质粒A上含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，构建基因表达载体后，质粒A的氨苄青霉素抗性基因被破坏，但四环素抗性基因正常，所以导入重组质粒或普通质粒的细菌都能抗四环素，但导入重组质粒的细菌不能抗氨苄青霉素。 【详解】A、构建该基因表达载体所用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，A错误； B、由于抗四环素基因未被被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入了重组质粒或普通质粒的细菌，B错误； C、由于基因表达载体上的氨苄青霉素抗性基因被破坏，所以在含有氨苄青霉素的培养基上，含有重组质粒的细菌无法生长，C正确； D、可利用PCR技术检测人的生长激素基因是否在工程菌中转录，但是不能检测是否翻译出相关蛋白质，D错误。 故选C。 10．（24-25高二下·江苏连云港·期中）双脱氧终止法常用来对DNA进行测序。其原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。相关叙述错误的是（　　） A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以胞嘧啶结尾 C．测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′ D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端 【答案】B 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；2、原理：DNA复制；3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)；5、过程：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR是一种体外扩增DNA的技术，与细胞内DNA复制相似，需要一定的条件，主要包括Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）、引物，dNTP、一定的（含Mg2+）缓冲液和DNA模板，A正确； B、电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤（G）结尾，B错误； C、由图可知：由下往上读出的序列是GATTCGAGCTGA，所以原来的互补序列是3’→5’：CTAAGCTCGACT，测得未知DNA的序列为5＇-TCAGCTCGAATC-3＇，C正确； D、DNA的延伸，是通过前一个dNTP的3位碳上的羟基官能团与后一位dNTP的5位碳上的磷酸基团反应形成磷酸二酯键来实现的。而ddNTPs的三位碳上没有羟基官能团，也就不能形成磷酸二酯键，从而终止DNA的合成。ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3’末端，D正确。 故选B。 11．（24-25高二下·江苏泰州·期中）斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。据此分析，下列说法正确的是（    ） A．p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同 B．放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置 C．p和q片段的杂交双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成 D．斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达 【答案】B 【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 【详解】A、p和q杂交是因为两单链的碱基可以互补配对，A错误； B、斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素或荧光进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记基因就会与其结合，通过放射性自显影就可以检测出整合有目的基因的受体细胞。所以该技术可以显示原培养基中含目的基因的菌落位置，B正确； C、在杂交过程中，双链区域会有氢键形成，但不会形成磷酸二酯键，C错误； D、斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，该技术可以检测目的基因的导入和转录，但无法用于检测目的基因是否在受体细胞中表达，目的基因是否在受体细胞中表达常用抗原-抗体杂交法，D错误。 故选B。 12．（24-25高二下·江苏连云港·期中）重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示（凸起处代表突变位点）。相关叙述错误的是（　　） A．过程①不能把两对引物同时加入一个扩增体系 B．突变引物FP2和突变引物RP1存在互补关系 C．过程②的产物都可以完成延伸过程 D．若过程④得到16个突变的基因则需要消耗15个通用引物RP2 【答案】C 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、由图可知，过程①需要把两对引物分别加入两个扩增体系中以提高扩增效率，A正确； B、突变引物FP2和突变引物RP1存在互补关系，从而保证基因能向两侧延申，B正确； C、过程②的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3’端开始延伸，C错误； D、若过程④得到16个突变的基因，由于模板链中不含有通用引物，则产生的16个突变基因中共需要消耗16×2-2＝30个通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15个，D正确。 故选C。 13．（24-25高二下·江苏连云港·期中）GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建含GDNF基因的重组载体，并导入到大鼠中用于干细胞基因治疗的研究。相关叙述错误的是（　　） A．获取目的基因和切割载体时，应选用限制酶XhoI切割 B．过程②应选择约为1300bp的重组载体导入受体细胞 C．b为滋养层，将来发育成胎盘和胎膜 D．过程⑥转基因鼠产生的后代并不都是转基因鼠 【答案】B 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。2、囊胚期，聚集在胚胎一端的细胞形成内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织；而沿透明带内壁扩展和排列的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。 【详解】A、形成图中重组载体所用的限制酶只能选择限制酶XhoⅠ，如果使用限制酶XhoⅠ和EcoRⅠ同时切割目的基因和载体，那么重组质粒中将丢失启动子，A正确； B、由图可知，限制酶XhoⅠ可将载体切割为100bp和500bp的片段，选择500bp的片段与长度为700bp的目的基因构建为基因表达载体，即基因表达载体长度为1200bp，B错误； C、图中a为囊胚中的内细胞团，将来发育为胎儿的各种组织，b为滋养层细胞，将来发育成胎盘和胎膜，C正确； D、因转基因生物的成功率并不是百分之百，如转基因小鼠的染色体的DNA上没有插入目的基因或目的基因不能稳定的表达等，导致过程⑥产生的小鼠并不都是转基因小鼠，D正确。 故选B。 14．（24-25高二下·江苏扬州·期中）基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述正确的是（　　）    A．若某基因是从人的细胞内提取RNA经逆转录形成的，则该基因中含有内含子序列 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C．利用DNA分子杂交技术可检测目的基因是否整合到植物受体细胞的染色体DNA上 D．为了让目的基因在乳腺细胞中特异性表达，需用绵羊的乳腺细胞作为受体细胞 【答案】C 【分析】将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】A、从人的细胞内提取RNA经逆转录形成的基因是cDNA，cDNA是去除了内含子等非编码序列的，所以该基因中不含有内含子序列，A错误； B、扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成，而不是DNA连接酶，DNA连接酶是连接DNA片段的，B错误； C、检测目的基因是否整合到植物受体细胞的染色体DNA上，常用DNA分子杂交技术，C正确； D、为了让目的基因在乳腺细胞中特异性表达，需将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，受体细胞应该是绵羊的受精卵，而不是乳腺细胞，因为乳腺细胞是高度分化的细胞，全能性低，受精卵全能性高，可发育为完整的个体，D错误。 故选C。 15．（24-25高二下·江苏盐城·期中）下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（    ） A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ D．通过PCR扩增出目的基因是基因工程的核心工作 【答案】C 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、由图可知，④链从L到R的方向为 3′→5′，DNA双链是反向平行的，与之配对的②链从L到R的方向为5′ →3′，A错误； B、PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误； C、以1个DNA 为模板经3次循环共需消耗23×2-2=14个引物，分别消耗③、④引物7个，C正确； D、基因工程的核心工作是构建重组表达载体，D错误。 故选C。 16．（24-25高二下·江苏连云港·期中）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，其中V5编码序列表达标签短肽V5。图乙表示重组质粒正确表达后用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白的结果。相关叙述正确的是（　　） A．若用PCR法确定J基因是否正确连接到质粒中，选择的引物组合只能为F2和R1 B．若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与J基因b链相应部分的序列相同 C．若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶对启动子的识别和结合 D．图乙条带1表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的 【答案】D 【分析】基因表达载体的结构：①启动子：RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动RNA转录；②终止子：使转录停止的“信号灯”；③标记基因：便于重组DNA分子的筛选；④目的基因；复制原点。 【详解】A、引物F2和R1或F1和R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此若用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，应选择的引物组合为F2和R1或F1与R2，A错误； B、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，B错误； C、启动子是转录时RNA聚合酶的识别和结合位点，因此若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制 RNA 聚合酶对启动子的识别和结合，C错误； D、图乙条带1可以和抗J蛋白抗体和抗 V5 抗体结合，表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2只能和抗J蛋白抗体结合，不能和抗 V5 抗体结合，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合基因表达的，D正确。 故选D。 17．（24-25高二下·江苏盐城·期中）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”、“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验叙述，错误的是（    ） A．洋葱切碎后加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱放置，DNA存在于沉淀物中 B．可以利用洋葱为实验材料，也可以选择鸡血、猪肝等作为DNA粗提取的实验材料，提取方法可能稍有不同 C．琼脂糖凝胶电泳实验中使用的微量离心管、枪头等需进行高压蒸汽灭菌 D．电泳鉴定DNA时，先将PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再加入加样孔中 【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、洋葱切碎后加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱放置，DNA存在于上清中，A错误； B、理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此洋葱、鸡血，猪肝等均可作为提取DNA的材料，B正确； C、PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，C正确； D、电泳鉴定DNA时，需要将PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合后再加入加样孔中‌，D正确。 故选A。 二、多选题 18．（24-25高二下·江苏连云港·期中）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　） A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．最终获得的种子一定含有目的基因 【答案】ABC 【分析】1、将目的基因导入植物细胞： （1）农杆菌转化法；（2）花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）。 2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射技术。（最有效一种方法）。 3、将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法（感受态细胞法）。 【详解】A、花粉管通道法是一种常用的植物基因转移方法，适用于多种植物，包括棉花，A正确； B、花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，故花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，B正确； C、授粉过程需要在雌蕊成熟后，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确； D、外源DNA进入胚囊，不一定能整合到染色体上，故采用花粉管通道法将目的基因导入植物细胞，最终获得的种子不一定含有目的基因，D错误。 故选ABC。 19．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下列关于PCR和电泳鉴定的说法，错误的是（    ） A．PCR反应体系中含有含Mg2+的扩增缓冲液、4种dNTP、两种引物、Taq酶和蒸馏水等 B．凝胶中的DNA分子通过溴化乙锭染色后可在紫外灯下被检测出来 C．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1cm为宜 D．DNA样品在电场中迁移的方向由正极向负极移动 【答案】ACD 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR反应体系中含有含Mg2+的扩增缓冲液、4种dNTP、两种引物、Taq酶和无菌水等，A错误； B、凝胶中的DNA分子通过溴化乙锭染色后可在300nm的紫外灯下被检测出来，B正确； C、将电泳样液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜，电泳缓冲液太多则电流加大，C错误； D、DNA样品在电场中一般负极向正极移动，D错误。 故选ACD。 20．（24-25高二下·江苏扬州·期中）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（　　） A．将含目的基因的重组质粒导入植物受体细胞可用农杆菌转化法 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸子链 C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞 D．基因表达载体的组成一般包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等 【答案】ACD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、将含目的基因的重组质粒导入植物受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和花粉管通道法，A正确； B、利用PCR技术扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶延伸子链，B错误； C、接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是受精卵，因为受精卵的全能性最高，C正确； D、一个基因表达载体的组成除了目的基因外，还需具备启动子、终止子（两者控制基因转录的开始和结束）、复制原点、标记基因等，D正确。 故选ACD。 21．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下图表示用荧光PCR法检测目的DNA的过程。在PCR反应体系中，加入足量与目的DNA部分序列互补的探针，探针包含一段脱氧核苷酸单链和发光基团，在完整的探针中发光基团不发光。在PCR过程中，当子链延伸到探针处时，TaqDNA聚合酶催化探针水解并释放发光基团，此时发光基团能发光。下列叙述正确的是（    ）    A．PCR的每一次循环包含变性、复性和延伸三步 B．探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同 C．TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化氢键的形成 D．经历相同的循环次数，起始目的DNA量越多荧光强度越强 【答案】ABD 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 【详解】A、PCR技术的基本过程包括变性、复性、延伸，每一次循环也都包含这三个步骤，A正确； B、根据题意可知在PCR过程中，当子链延伸到探针处时探针被TaqDNA聚合酶催化水解，说明探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同，B正确； C、TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化磷酸二酯键的形成，C错误； D、起始目的DNA量越多，探针与目标DNA结合就越多，经历相同的循环次数后，形成的游离的发光基团就越多，荧光强度越强，D正确。 故选ABD。 22．（24-25高二下·江苏泰州·期中）为获得Gata3-GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Cata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析错误的是（    ） A．据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2 B．分析图乙可知，4号小鼠为Gata3-GFP融合基因纯合小鼠 C．图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录 D．若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段：循环4次后，产物中等长片段所占的比例为3/8 【答案】BD 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、 Gata3-GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小。选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，没有整合，则片段较小，因此，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2，A正确； B、Gata3-GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小，选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以2号个体是Gata3-GFP融合基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，B错误； C、图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动Gata3和GFP基因的转录，进而可编码相应的蛋白质，C正确； D、若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，获得的DNA片段总数为24=16个，其中等长片段的数目为24-2×4=8个，可见其所占的比例为1/2，D错误； 故选BD。 23．（24-25高二下·江苏连云港·期中）有关PCR技术中引物的设计原则及设计目的的说法正确的是（　　） A．引物长度过短，特异性太差 B．引物GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增 C．常在引物3’端进行修饰，包括加酶切位点、加标记荧光、引入点突变等 D．退火温度应足够低以保证引物与目的序列有效退火，同时还要足够高以减少非特异性结合 【答案】AD 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、引物的碱基数量越少变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A正确； B、引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC过高，不利于退火 ，从而阻碍目标DNA的扩增，B错误； C、根据需要可在引物的5’端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，C错误； D、两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，D正确。 故选AD。 24．（24-25高二下·江苏连云港·期中）琼脂糖凝胶电泳常用来对PCR的产物进行鉴定，相关叙述正确的是（　　） A．开展电泳鉴定实验时，可采用凝胶成像仪或紫外投射仪观察和记录电泳结果 B．电泳缓冲液能增加电导率，维持电泳过程中合适的pH C．凝胶载样缓冲液中的指示剂能显示电泳的进程，以便适时终止电泳 D．电泳显示的大小符合预期的DNA就是目标DNA 【答案】ABC 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子被核酸染料染色后，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、在琼脂糖凝胶电泳鉴定实验中，由于PCR产物中的DNA在经过染色后，在紫外光下会发出荧光，所以可采用凝胶成像仪或紫外投射仪观察和记录电泳结果，A正确； B、电泳缓冲液中含有电解质，能够增加电导率，同时其具有一定的缓冲能力，可以维持电泳过程中合适的pH，保证DNA分子在适宜的环境中移动，B正确； C、凝胶载样缓冲液中的指示剂会随着DNA分子一起在凝胶中移动，通过观察指示剂的位置，能显示电泳的进程，从而适时终止电泳，C正确； D、电泳显示的大小符合预期的DNA不一定就是目标DNA，因为可能存在非特异性扩增等情况，导致出现大小符合预期但并非目标序列的DNA片段，还需要进一步的鉴定，如测序等，D错误。 故选ABC。 25．（24-25高二下·江苏泰州·期中）下列关于PCR和琼脂糖凝胶电泳实验的叙述，错误的是（　　） A．琼脂糖加热熔化待稍冷却后，加入适量核酸染料混匀 B．PCR产物和凝胶载样缓冲液混合后缓慢注入所有加样孔 C．要待指示剂的前沿越过凝胶边缘时再停止电泳 D．PCR反应中温度循环是为了DNA 聚合酶催化不同的反应 【答案】BCD 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、琼脂糖稍冷却后加入染料可避免高温破坏染料结构，A正确； B、PCR产物与缓冲液混合后需分别注入各加样孔（即特定的加样孔，而不是所有的），每个孔对应不同样品或重复，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当指示剂（如溴酚蓝）接近凝胶末端时应停止电泳，以防止DNA条带跑出凝胶，C错误； D、PCR的温度循环包括变性（90℃使DNA双链解开）、退火（50℃左右使引物与模板链结合）和延伸（72℃左右，在DNA聚合酶的作用下，合成新链），依次循环进行，其中延伸阶段依赖DNA聚合酶的催化作用，D错误。 故选BCD。 26．（24-25高二下·江苏扬州·期中）如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述错误的有（　　） A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活 B．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化 C．过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 D．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K 【答案】ABC 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。 【详解】A、转基因植物需要用到土壤农杆菌的Ti质粒的T-DNA片段，需要把目的基因插入T-DNA片段中，T-DNA能将目的基因带入受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，故①过程中T-DNA片段不会失活，A错误； B、若两种限制酶产生的黏性末端相同，则酶切产物仍可发生自身环化，B错误； C、过程②用Ca2+处理可改变细菌细胞膜的通透性，使农杆菌容易吸收周围的DNA分子，Ca2+处理不是改变细胞壁的通透性，C错误； D、报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，D正确。 故选ABC。 27．（24-25高二下·江苏南通·期中）离心技术是常用的分离、纯化或澄清的方法。相关技术叙述正确的是（    ） A．动物细胞核移植技术中可以采用梯度离心去核 B．体外受精时需将新鲜或者冷冻的精液离心处理后对其获能处理 C．DNA粗提取实验中将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，离心后取沉淀 D．PCR中将所有的组成成分加入微量离心管中离心，使反应液集中在管的底部 【答案】ABD 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法去核，A正确； B、体外受精时，要对新鲜或解冻的精液离心，除掉精浆中含有的抑制精子获能的物质，然后进行获能处理，才能用于体外受精，B正确； C、DNA粗提取实验中将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，离心后取上清液，C错误； D、用微量移液器按照配方或PCR试剂盒说明书向微量离心管中依次加入PCR反应的各组分，盖严离心管的盖子， 放在离心机里，离心约10s使反应液集中在管的底部，D正确。 故选ABD。 三、实验题 28．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢导致可溶性糖含量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、图2所示。    (1)强启动子能被_________识别并结合，驱动基因持续转录。在培育转基因甜玉米中T-DNA的作用是_________。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是_________。 (2)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养筛选，获得玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对四个株系的G蛋白表达量进行测定，发现a4株系的表达量与野生型相近，原因可能是_________。 (3)下图示淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸（RNA剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制提出两种假说。 假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切； 假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。    ①为验证上述假说，分别在受精卵发育后3天的胚细胞中从实验组和对照组提取总RNA，逆转录形成cDNA．若假说1成立，使用图示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为_________（目的条带的有无）。 ②若要证明假说2，需选择图示引物_________进行PCR。 ③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因是_________（至少写出两点）。 【答案】(1) RNA聚合酶 将强启动子和G基因带入甜玉米细胞并整合到甜玉米细胞染色体的DNA上 NotⅠ和SacⅠ (2)a4株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达 (3) 实验组有目的条带、对照组无目的条带 3和4 退火温度太高、引物自连或互连 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）强启动子驱动基因的持续转录，可知强启动子能被RNA聚合酶识别并结合。T-DNA在该实验中的作用是将强启动子和G基因带入甜玉米细胞并整合到甜玉米细胞染色体的DNA上。为使G基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和G基因不被破坏，故应优先选用NotⅠ和SacⅠ酶切割质粒，为保证强启动子和G基因能连在质粒上，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotⅠ和SacⅠ酶。 （2）蛋白质的表达量与基因的表达有关，故a4株系P蛋白表达量的表达量与野生型相近，即表达量较低的原因可能是其没有导入目的基因或者目的基因没有表达。 （3）①为验证上述假说，分别从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，逆转录形成cDNA。根据引物2和引物4在淀粉酶合成基因片段上的位置，通过PCR扩增能得到内含子2的序列，若假说1成立，即吗啉反义寡核苷酸导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切，故实验组中应含有内含子1的序列，而对照组的该片段被切除了，因此用引物2和引物4进行PCR反应，其结果为实验组有目的条带、对照组无目的条带。 ②若要证明假说2成立，即RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去，则可以选择图示引物3和引物4进行PCR，观察是否有杂交带出现，如果RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去，PCR后电泳不会出现杂交带。 ③PCR是通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合的。在PCR操作过程中，如果退火温度太高、引物自连或互连，均会导致电泳后的实验组和对照组没有任何条带出现。 29．（24-25高二下·江苏扬州·期中）肿瘤的发生、发展和转移都需要新生血管的支持，肿瘤抑素是由Tum基因编码的蛋白质，具有强效抑制肿瘤微血管密度，缩小肿瘤体积的作用。研究人员构建了转Turn基因的人神经胶质瘤细胞株U251，探究基因治疗神经胶质瘤的可行性。 (1)研究人员利用上图中的材料完成基因表达载体的构建。 ①图1载体上启动子是______识别和结合的位点，与起始密码子相比启动子特有的组成分子有______。 ②图1载体上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能______；有多个限制酶切位点，便于______。 ③构建重组载体前，利用PCR技术扩增Tum基因，应选用的引物组合为______，其中与Tum基因上游结合的引物设计的依据是______以及限制酶______的识别序列。与细胞内DNA复制相比，PCR技术通常不选择RNA片段作为引物，解释合理的有______。 A．RNA稳定性不高，体外易降解 B．RNA的3'端不能聚合脱氧核苷酸 C． 细胞内有切除RNA引物的酶 D．RNA引物的成本较高 (2)对目的基因进行PCR扩增后，需要采用______方法对目的基因产物进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率一般与______（答出两个）有关。凝胶中的DNA分子经过染色后，可以被______检测出。 (3)血管内皮细胞HRV可作为抑制血管生成效果的指示细胞，为研究Tum基因的抗神经胶质瘤的效果。研究人员设计了三组实验：组1为未转基因的U251，组2为转入空白载体的U251，组3为转Tum基因的U251，相关检测结果如图3、图4。 三组实验中属于对照组的是______，综合两图分析，说明U251细胞合成的肿瘤抑素通过促进HRV细胞凋亡发挥作用，图4中组2实验数据能否支持导入空白载体具有与组3相似作用的结论？______（填“能”或者“不能”） (4)为探究该体系在体内抗肿瘤的效果，还需将组3U251细胞分别接种于裸鼠腹部皮下，一定时间后检测______和______以证明转Tum基因治疗神经胶质瘤存在可行性。 【答案】(1) RNA聚合酶 脱氧核糖和胸腺嘧啶 复制并稳定保存 外源DNA片段插入 bc Tum基因上游序列 Nhe Ⅰ A (2) 琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度、DNA分子的大小和构象 （波长为300nm）的紫外灯 (3) 组 1、组2 不能 (4) 小鼠体内神经胶质瘤体积 肿瘤微血管密度 【分析】1、基因工程常用的载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 2、作为载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 3、天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 【详解】（1）①启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动转录过程。 启动子是 DNA 片段（含脱氧核苷酸），起始密码子在 mRNA 上（含核糖核苷酸 ），所以启动子特有的组成成分是脱氧核糖和胸腺嘧啶。 ②复制原点能保证质粒在受体细胞中自我复制并能稳定保存。载体上有多个限制酶切位点，便于外源DNA片段插入（目的基因 ），实现目的基因与载体的连接。 ③构建重组载体前，利用PCR技术扩增Tum基因，引物引导子链合成的方向是5′→3′，故为保证构建正确连接的基因表达载体，应选用的引物组合为bc。由图1可知，只有限制酶Not Ⅰ和Nhe Ⅰ位于启动子和终止子之间，因此在引物中分别加入Not Ⅰ和Nhe Ⅰ限制酶的识别序列，结合图示可知，与Tum基因上游结合的引物设计的依据是Tum基因上游序列，且需要在引物c的5’端添加限制酶Nhe Ⅰ的识别序列。 A、RNA稳定性不高，体外易降解，因而不宜作为引物，A正确； B、RNA的3´端能聚合脱氧核苷酸，这不是其不宜作为引物的原因，B错误； C、细胞内有切除RNA引物的酶，这不是RNA不宜作为引物得原因，PCR是在体外复制DNA的技术，C错误； D、RNA引物的制作成本未必比DNA高，不符合题意，D错误。 故选A。 （2）对目的基因进行 PCR 扩增后，常采用琼脂糖凝胶电泳方法对目的基因产物进行鉴定 ，通过电泳可分离不同大小的 DNA 片段。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率一般与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象。凝胶中的 DNA 分子经过染色后，可以被（波长为300nm）的紫外灯检测出。 （3）本实验的目的是研究 Tum 基因的抗神经胶质瘤的效果，则自变量为Tum 基因的有无，为了排除空载体对实验的影响，故以未转基因的U251（组 1）和转入空载体（不含Tum 基因的表达载体）的U251（组2）作为对照，转 Tum 基因 U251（组3）为实验组。由图3可知，只有组3上清液含有肿瘤抑素，说明肿瘤抑素可以被 U251分泌到细胞外，且由图3可知，相比组1和组2，组3HUV细胞凋亡率显著增高，故说明U251细胞合成的肿瘤抑素发挥作用的机理为：肿瘤抑素可以被 U251分泌到细胞外，并促进HUV细胞凋亡；同时也能说明组2实验数据不能支持导入空白载体具有与组3相似作用的结论。 （4）为探究该体系在体内抗肿瘤的效果，还需将组3U251细胞分别接种于裸鼠腋部皮下，一定时间后检测小鼠体内神经胶质瘤体积 肿瘤微血管密度以证明转Tum基因治疗神经胶质瘤存在可行性。因为肿瘤抑素具有强效抑制血管生成的功能，且只有组3细胞才能合成肿瘤抑素，因此若结果为接种组3的小鼠体内神经胶质瘤体积与肿瘤微血管密度比组1及组2都显著降低，表明转Tum 基因治疗神经胶质瘤存在可行性。 30．（24-25高二下·江苏扬州·期中）甘蔗是蔗糖的主要来源，甘蔗R具有高产高糖的优良特性但耐寒性差；甘蔗G是耐寒品种。科研人员利用植物体细胞杂交技术以期快速培育出耐寒性更强且性状更优良的甘蔗新品种。 (1)如图1，利用________酶去除细胞壁获得原生质体。分别加入IOA和R-6G钝化后诱导原生质体融合。仅有杂种原生质体可持续分裂形成再生细胞团，原因是_______。脱分化得到愈伤组织后，培养基中_______是影响该过程中植物细胞发育方向的关键因素。    (2)科研人员发现制备原生质体及原生质体融合后均会不同程度发生氧化褐变、细胞壁再生困难的现象。为解决这一问题，科研人员利用甘蔗杂种原生质体进行以下实验。    ①由图2可知，甘蔗杂种原生质体再生过程中最好使用_______。 ②科研人员推测激素通过促进果胶合成关键酶基因GAUT表达，从而促进细胞壁再生，请将下表补充完整，为该推测提供证据（“激素使用”栏选填下列字母）。 组别 激素使用 实验处理 检测指标 1 _______ 原生质体中转入过量表达GAUT基因载体 _______ 2 a 原生质体中转入抑制GAUT基因表达载体 3 _______ 不转入基因的原生质体 a.不使用激素 b.使用激素组合1 c.使用激素组合2 d.原生质体中2，4-D和6-BA的含量 ③上表实验是否能够达成完整验证推测的目的？________，请简述理由_______。 (3)为研究激素对GAUT基因表达量的变化，采用荧光定量PCR法检测实验组和对照组GAUT基因的转录水平。采集样本、提取总RNA，经________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，实验组Ct值为14，而对照组Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，实验组样品的目的产物大约是对照组的________倍。 【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 杂种原生质体生理互补，细胞呼吸正常，能正常分裂，而未融合或同种融合原生质体会在细胞呼吸不同阶段受到抑制从而无法正常分裂 生长素与细胞分裂素的浓度及比例 (2) 激素组合1 a 完成再生壁的细胞比例 a 否 还需进行实验验证使用激素组合对GAUT基因表达量的影响 (3) 逆转录 64 【分析】植物体细胞杂交技术：指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。操作步骤：先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁得到原生质体，再利用聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法或电融合法、离心法诱导原生质体融合，融合后的杂种细胞再经过诱导可形成愈伤组织，并可进一步发育成完整的杂种植株。 【详解】（1）分析题图1，植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，可利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体。诱导原生质体融合后，只有杂种原生质体可持续分裂形成再生细胞团，而未融合或同种融合原生质体不能分裂，因为杂种原生质体生理互补，细胞呼吸正常，能正常分裂，而未融合或同种融合原生质体会在细胞呼吸不同阶段受到抑制从而无法正常分裂。脱分化得到愈伤组织后，培养基中生长素与细胞分裂素的浓度及比例是影响该过程中植物细胞发育方向的关键因素。 （2）①分析题图2可知，与使用激素组合2相比，使用激素组合1的甘蔗杂种原生质体完成再生壁的细胞比例较高，故甘蔗杂种原生质体再生过程中最好使用激素组合1。 ②为验证激素通过促进果胶合成关键酶基因GAUT表达，从而促进细胞壁再生，可进行如下实验设计：将甘蔗杂种原生质体随机均分为1、2、3三组，1组不使用激素，原生质体中转入过量表达GAUT基因载体；2组不使用激素，原生质体中转入抑制GAUT基因表达载体；3组不使用激素，不转入基因的原生质体。在相同且适宜的条件下培养一段时间，检测各组完成再生壁的细胞比例。 ③但由于没有进行实验验证使用激素组合对GAUT基因表达量的影响，故上表实验不能够达成完整验证推测的目的。 （3）采用荧光定量PCR法检测实验组和对照组GAUT基因的转录水平，首先要采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA，再以cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，实验组Ct值为14，而对照组Ct值为20，说明对照组表达较弱。设实验组相应的cDNA数为x，对照组相应的cDNA数为y，则有x×214=y×220，x=26y，即从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，实验组样品的目的产物大约是对照组的26=64倍。 31．（24-25高二下·江苏南通·期中）实时荧光定量逆转录PCR（RT—qPCR）可用来检测基因的转录水平。TaqMan探针是该技术中一种常用探针，当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步，如图1.请回答下列问题。 (1)RT—qPCR试剂盒中除了含TaqMan探针、dNTP、Mg²⁺、缓冲剂外还应含有_______。TaqMan探针______端连接荧光基团（R）。 (2)采集样本、提取总RNA，经_______形成cDNA作为模板。PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，Ct值越_______，基因的转录水平越高。（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。 (3)miRNA是基因表达的重要调节因子，其长度通常为19~24个核苷酸，这与传统PCR引物的长度相当，因此常规RT—qPCR难以直接对miRNA进行检测。研究人员设计出加尾法和茎环法来检测miRNA的转录水平，其主要原理如图2、3. ①据图2分析，加尾酶可以将多个腺嘌呤核苷酸加在miRNA的3'端，在此过程中加尾酶催化______键的形成。为防止逆转录引物左右移动，可在引物的_______端加上_______。 ②据图3分析，茎环RT引物设计成发夹结构的优点有________。 A．减少了与其他非目标RNA的结合机会 B．为逆转录酶提供合适的逆转录起始位点 C．有助于抵抗限制酶的剪切作用 D．有助于抵抗其他核酸分子的竞争结合 ③为比较两种方法的灵敏度大小，同时比较小鼠体内三种RNA（let—7a、miR—21、miR—193a）的含量，研究人员对从小鼠脑中提取的总RNA分别用加尾法和茎环法测定了三种miRNA的Ct值，结果如下表。 　 加尾法 茎环法 let—7a 26.69 19.87 miR—21 28.92 23.36 miR—193a 35.95 31.13 根据实验结果可以得出的结论有_______（2分）。 【答案】(1) 逆转录酶、热稳定DNA聚合酶‌和引物 5， (2) 逆转录 小 (3) 磷酸二酯 5， 特异性互补序列 ABCD 茎环法测定的Ct值差别更大，更灵敏 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）‌RT—qPCR试剂盒中除了含TaqMan探针、dNTP、Mg²⁺、缓冲剂外，还应含有逆转录酶、热稳定DNA聚合酶‌和引物等，逆转录酶‌：用于将RNA逆转录成cDNA，热稳定DNA聚合酶‌通常使用Taq酶，它能够在高温下保持活性，催化PCR反应的进行‌，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始复制。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针，其5，末端连接荧光基团(R)，3，末端连接淬灭剂(Q)。 （2）RNA逆转录得到cDNA；Ct值是荧光定量PCR中荧光信号达到设定阈值时的循环次数，其大小反映了基因表达的起始模板量。起始模板量越多，Ct值越小，反之，起始模板量越少，Ct值越大‌ 1。因此，在总cDNA模板量相等的情况下，Ct值越小，说明基因的转录水平越高‌。 （3）①加尾酶可以将多个腺嘌呤核苷酸加在miRNA的3'端，催化磷酸二酯键的形成；引物的5，端加上特异性互补序列，可防止逆转录引物左右移动。 ②A、茎环RT引物设计成发夹结构，减少了与其他非目标RNA的结合机会，A正确； B、结合图示可知，逆转录酶从发夹结构处开始催化，发夹结构为逆转录酶提供合适的逆转录起始位点，B正确； C、发夹结构为模板扩增出来的双链DNA，不含限制酶识别序列，有助于抵抗限制酶的剪切作用，C正确； D、发夹结构与miRNA特异性结合，有助于抵抗其他核酸分子的竞争结合，D正确。 故选ABCD。 ③结合表格可知，加尾法三种RNA的Ct值差异小于茎环法，因此茎环法更灵敏。 32．（24-25高二下·江苏扬州·期中）人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，现可以用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）。下图甲为获取的含有目的基因（HSA基因）的DNA片段，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题： (1)三种限制酶中能产生相同黏性末端的是__________；为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用__________酶，所得重组质粒__________（填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。 (2)获取ISA基因还可以通过下列方式：首先采集人的血液，从中提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增ISA基因。与基因组文库获取的目的基因相比，利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其基因结构的特点是不含__________。 (3)生物技术的发展和应用使利用动物生产人的血清蛋白成为可能，下图是上海某研究所培育生产出血清蛋白奶牛的流程，请据图回答。 ①为了获得大量早期胚胎，可对囊胚进行分割，此时要注意将__________均等分割。胚胎移植的实质是__________。 ②在进行性别鉴定时，需要取囊胚的__________细胞做DNA分析。据图分析，小牛1、2、3的性别是__________性。 【答案】(1) BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 (2) mRNA 非编码区（启动子、终止子）、内含子 (3) 内细胞团 早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移 滋养层 雌 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。 （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）根据图乙分析可知，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ三种限制酶，产生相同黏性末端的是BamHⅠ和Sau3AⅠ，其黏性末端为(-GATC-)；结合图甲分析可知，Sau3AⅠ会破坏目的基因，应该选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割图甲所示DNA片段。质粒上含有EcoRⅠ、Sau3AⅠ的识别位点，Sau3AⅠ与BamHⅠ酶的识别序列不一定相同，故所得重组质粒后，不一定含有BamHⅠ的识别位点，所得重组质粒不一定能被BamHⅠ切割。 （2）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。首先采集人的血液，从中提取mRNA合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其特点是不含启动子（和终止子）、内含子等。 （3）①对囊胚分割时，要注意将内细胞团 均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 ，供体和受体需处于相同生理状态，便于胚胎存活发育。 ②进行性别鉴定时，可取囊胚的滋养层 细胞做DNA分析，因为滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，取其细胞不影响内细胞团发育成个体。分析流程可知，小牛1、2、3来自同一早期胚胎，遗传物质相同，而提供核的是雌性奶牛胚胎细胞（含XX性染色体 ），所以它们的性别是雌性。 33．（24-25高二下·江苏扬州·期中）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。 (1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增时预变性94℃5min的目的：_______，复性的目的是_______。引物的本质是_______，其作用是_______。 (2)图甲所示Y基因序列为转录的________（填“模板链”或“非模板链”）。已知EcoRI识别序列为5′-GAATTC-3′，BamHI识别序列为5′-GGATCC-3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应该为5′-_______-3′（包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基）。 (3)退火温度________就会导致非特异性产物增加。将初步构建的Y-GFP基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系________能成功表达出Y-GFP融合蛋白。 (4)为探究Y蛋白能否与S基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y蛋白与DNA序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y蛋白________（填“能”或“不能”）与S基因启动子序列结合，相比于a条带，b条带放射性低的原因是_________。 (5)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是________。 【答案】(1) 增加模板DNA彻底变性的概率（使模板DNA充分变性），以保证和引物顺利结合，使PCR过程顺利进行 在低温下，使引物能与相应互补DNA序列结合，为后续子链延伸做准备 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) 非模板链 GGATCCATGTTC (3) 过低 2 (4) 能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少 (5)Y蛋白(通过与S基因启动子序列结合)促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 (4)目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增绿色荧光蛋白基因过程每次循环分为3步，即变性、复性、延伸，PCR过程中需要进行94℃、5min预变性，是为了增加模板DNA彻底变性的概率（使模板DNA充分变性），以保证和引物顺利结合，使PCR过程顺利进行。PCR技术中复性的目的是在低温下，使引物能与相应互补DNA序列结合，为后续子链延伸做准备。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟信使RNA的起始位置是相同的，故图甲所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有那个EcoRI和BamHI的识别序列，所以要扩增Y基因的时，引物的5'端是要加上EcoRI和BamHI的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoRI的识别序列，Y基因的右端连接BamHI的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamHI的识别序列，再根据题干信息“在获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- GGATCCATGTTC -3'。 （3）若退火温度过低会导致引物与模板非特异性配对增多，导致非特异性扩增片段增多。将初步构建的Y-GFP基因表达载体转入大豆细胞后，需要对经潮霉素筛选得到的细胞系进行抗体检测以确认是否成功表达出Y-GFP融合蛋白。根据图乙的电泳结果可以看出，细胞系2在预期位置出现了明显的条带而细胞系1没有，因此可以判断细胞系2能成功表达出Y-GFP融合蛋白。 （4）根据图丙的实验结果和已知信息，可以看出Y蛋白与DNA序列结合后，可以在凝胶电泳中产生阻滞条带。而实验组（加入Y蛋白）的条带相对于对照组（未加入Y蛋白）产生了阻滞，说明Y蛋白能与S基因启动子序列结合。相比于a条带（对照组），b条带（实验组）放射性低的原因是100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少。 （5）根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆固醇类化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。 34．（24-25高二下·江苏扬州·期中）非洲猪瘟病毒（ASFV）可感染家猪及野猪，病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术，成功制备CP312R蛋白和相应单克隆抗体。请回答： (1)获取目的基因，设计引物与扩增目的基因。根据目的基因序列，设计和合成引物。据下表分析，引物1、引物2上分别添加了_______限制酶识别序列。 限制酶及识别序列 引物名称及序列（5′→3′） EcoRI 5′GAATTC3′ 引物1： CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACGCTG 引物2： AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGCGATTTGTTGGTG PstI 5′CTGCAG3′ Xbal 5′TCTAGA3′ (2)重组质粒的构建与鉴定。 ①经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过________键连接起来，能正确表示这个过程的图像是________（填写下图中的序号）。 ②重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现________个条带表明重组质粒构建成功。电泳时，琼脂糖凝胶作为介质起到________的作用，________起到电泳指示剂的作用。 ③若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，下列调整措施合理有哪些？________。 A．调整电泳的时间 B．调整指示剂上样量 C．调整加样孔朝向正极 D．调整电泳仪电压和温度E.调整凝胶中琼脂糖的浓度 (3)CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。 利用基因工程制备的CP312R蛋白作为________，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的________与骨髓瘤细胞融合；融合得到的杂交瘤细胞必需经过________和________，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比，从小鼠腹水中提取单抗的优点是________。 【答案】(1)Xbal 、PstI (2) 磷酸二酯 ② 2 分子筛 溴酚蓝 DE (3) 抗原 B淋巴细胞 筛选/抗体阳性筛选 克隆培养 操作简便、成本低、高产量 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 【详解】（1）EcoRⅠ的识别序列为回文结构，切割位点在DNA2条链相对称的位置，可排除；由表格可知：引物1中含有限制酶Xba1的识别序列，引物2中含有限制酶PstⅠ的识别序列，若引物1上添加了限制酶PstⅠ的识别序列，可会导致目的基因被单个限制酶PstⅠ切出，从而导致目的基因自身环化、目的基因反向连接到载体上等，因此引物1、引物2上分别添加了Xbal、PstI限制酶识别序列。 （2）①DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键。DNA分子具有两个末端，有一个游离的磷酸基团的一端和有一个羟基(一OH)的一端，DNA连接酶能将一个DNA片段的磷酸基团端与另一个DNA片段的羟基(一OH)端相连接，因此②正确。 ②重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现2个条带表明重组质粒构建成功。将SDS制成电泳所需的凝胶，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用，溴酚蓝起到电泳指示剂的作用。 ③指示剂过早迁移出凝胶可能是由于‌电泳电压过高或电泳时间过长。电泳电压过高会导致指示剂迁移速度过快，而电泳时间过长则会使指示剂在凝胶中移动的距离增加。若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，则应调整电泳仪电压和温度、调整凝胶中琼脂糖的浓度，DE正确。故选DE。 （3） CP312R 是ASFV 中最具免疫原性的蛋白之一，利用基因工程制备的CP312R 蛋白可作为抗原，诱导小鼠产生相应的B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，将获得的杂交瘤细胞经过抗体阳性筛选和克隆培养，获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。从小鼠腹水中提取单抗的优点是操作简便、成本低、高产量。 35．（24-25高二下·江苏无锡·期中）新霉素磷酸转移酶基因（neo）是转基因动物中常用的标记基因，但neo存在于动物细胞中会影响动物体生长和发育。为实现在敲除目的基因后，将neo基因从基因组中敲除，科研人员构建了Cre-loxP重组系统。图1为loxP序列的结构示意图，图2为Cre-loxP重组系统的作用机理示意图，图3为通用型基因打靶载体的构建及Flox鼠建立过程示意图。请回答下列问题： (1)loxP位点是一段长为34bp的序列，具有方向性，结合图1，推测其方向性由区段_____决定。Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段，并同时催化b区段箭头处___________键水解。 (2)据图2分析，若同一个DNA分子上具有2个同向的loxP位点，经Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子，从作用结果分析，Cre酶同时具有类似___________酶的作用。 (3)图3中，过程①可在限制酶和DNA连接酶等作用下，将同源臂1和同源臂2插入pAT质粒中的多克隆位点序列MCS中。作为通用型载体，pAT质粒的MCS中含有多个在基因组（待敲除基因所在DNA）中出现频率较低的酶切位点，其意义是____________。 (4)两段拥有相同/相似碱基序列（如同源臂）的DNA片段在重组酶的催化下，可发生同源重组，同源臂间的DNA序列可发生交换。为敲除特定基因，以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物，经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2，PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行的原因是__________；为将同源臂定向插入pAT的MCS中，设计引物时需要在引物的___________端添加相应的限制酶切位点。 (5)过程②为重组pAT质粒转染小鼠受精卵的过程，该过程通常采用___________法。过程③需将转染后的受精卵置于适宜培养液中，培养24h后，能存活的胚胎为成功转染并整合到染色体DNA上的胚胎，后续通过___________等技术获得Flox小鼠。 (6)Flox小鼠中存在的neo基因，其两侧的2个LoxP位点的方向是___________的，可利用Cre酶将其敲除，获得不含neo基因的基因敲除鼠。为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除，可在Cre基因的cDNA一段添加________________实现。 【答案】(1) b 磷酸二酯 (2)限制酶和DNA连接 (3)使目的基因准确连接到质粒的特定位点上 (4) PCR1和PCR2所用引物存在互补配对片段，至于同一反应系统时他们会发生相互结合而失去作用 5' (5) 显微注射 胚胎移植 (6) 相反 特异型启动子序列 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）Cre酶能识别loxP位点（特定的DNA序列），并使loxP位点间的基因序列被重组或删除，如图1中箭头表示Cre酶的作用位点，则说明b区域决定了loxP位点的方向性。Cre酶催化b区段箭头处磷酸二酯键的水解。 （2）Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子，说明能使loxP位点间的基因序列被重组或删除，则需要切割DNA序列并连接，说明Cre酶的功能类似于限制酶和DNA连接酶。 （3）pAT质粒的MCS中含有多个在基因组中出现频率较低的酶切位点，而同源臂1和同源臂2插入pAT质粒中的多克隆位点序列MCS中，如果MCS中的酶切位点在基因中出现频率较高，可能会使目的基因插入其他位点，因此pAT质粒的MCS中含有多个在基因组中出现频率较低的酶切位点的意义是使目的基因准确连接到质粒的特定位点上。 （4）为敲除特定基因，以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物，由于两段拥有相同/相似碱基序列（如同源臂）的DNA片段在重组酶的催化下，可发生同源重组，因此经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2，PCR1和PCR2所用引物存在互补配对片段，至于同一反应系统时他们会发生相互结合而失去作用，所以PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行。设计引物时需要在引物的5'端添加相应的限制酶切位点，因为3'端连接脱氧核苷酸。 （5）将重组质粒导入受体细胞通常选择显微注射法，为获得Flox小鼠，需要通过胚胎移植技术。 （6）Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段，根据图1中a段和c段的序列，可以推测neo基因其两侧的2个LoxP位点的方向是相反的，为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除，可在Cre基因的cDNA一段添加特异型启动子序列实现，实现基因选择性表达。 36．（24-25高二下·江苏无锡·期中）某植物蛋白酶抑制剂Ⅱ基因，转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR等技术扩增该基因，具体原理如下图所示，其中①∼③表示有关过程，Ⅰ∼Ⅲ表示有关物质。请回答： (1)过程反应体系中，生成杂合链物质Ⅰ需要加入____________种引物，一般来说所用的引物越短，引物特异性越__________（填“高”或“低”）；同时还需加入____________酶。 (2)利用DNA末端转移酶催化过程②，使DNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列 [AAA（A）n]，其目的是___________________， 进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ；据此推测③过程除了引物1的另一种引物富含_______碱基。 (3)在物质Ⅲ的两端通常还需要增加____________序列，以便与相应的载体重组，再利用_______处理大肠杆菌等，以利于将重组质粒导入细胞，构建c DNA文库。 (4)微滴式数字PCR（ddPCR）是一种检测RNA病毒等病原体的手段，正确的 A．RNA病毒样本在进行ddPCR检测时，需要先进行逆转录处理 B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq酶 C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸 D．相对于传统手段，ddPCR更加灵敏，更容易检测出微量病毒 【答案】(1) 1 低 逆转录 (2) 便于设计引物 T (3) 限制酶识别 Ca2+ (4)ACD 【分析】分析图解：图中过程①表示逆转录过程，即以RNA为模板合成cDNA单链的过程；过程②表示在末端转移酶的作用下在cDNA末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列；过程③表示在DNA聚合酶的作用下生成互补链。 【详解】（1）过程①表示逆转录过程，即以RNA为模板合成cDNA单链的过程，该过程需要逆转录酶的催化；由于该过程只生成了一条单链cDNA，因此反应体系中，只需要加入1种引物。一般来说所用的引物越短，引物特异性越低。其次RNA合成DNA需要逆转录酶催化，因此同时还需加入逆转录酶。 （2）利用DNA末段转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列 [AAA（A）n]，其目的是便于设计引物，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ。根据题图分析，同时结合碱基互补配对原则推测③过程除了引物1的另一种引物富含T碱基。 （3）获取目的基因是需要用限制酶切割获得，因此在物质Ⅲ的两端通常还需增加限制酶识别序列，以便与相应的载体重组；将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，以利于将重组质粒导入细胞。 （4）A、逆转录是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，因此RNA病毒样本在进行ddPCR检测时，需要先进行逆转录处理，A正确； B、多孔板中如果某个孔没有核酸分子，仍然需要加入引物和Taq酶，排除无关变量影响，B错误； C、检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明含有病毒核酸，证明原样本中有病毒核酸，C正确； D、传统手段检测抗原，要求抗原数量一定值，因此相对于传统手段，ddPCR更加灵敏，更容易检测出微量病毒，D正确。 故选ACD。 37．（24-25高二下·江苏扬州·期中）番茄在低温下运输、储存的过程中，容易出现冻伤，影响番茄的品质。科学家利用基因工程技术将抗冻基因AFPs转入番茄植株，培育抗冻番茄。操作过程如图所示，如表为三种限制酶及其识别序列。回答下列问题： 限制酶 识别序列（5'→3'） Bam HⅠ G↓GATCC Bgl Ⅱ A↓GATCT EcoR Ⅰ G↓AATTC (1)利用PCR扩增抗冻基因AFPs时，需要设计引物，引物的作用是_____，设计的引物序列不能过短，原因是_____。 (2)培育抗冻番茄时，在构建基因表达载体的过程中，为了提高重组DNA的形成效率，需要考虑的因素有_____。 A．载体与目的基因重组的时间 B．DNA聚合酶的活性 C．目的基因的质量与浓度 D．载体的质量与浓度 (3)经限制酶酶切后，目的基因和质粒存在_____种连接情况，为确定是哪种连接情况，可用限制酶_____对重组质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小，电泳结果出现长度为_____kb的片段的重组质粒即为所需的基因表达载体。由于载体上的启动子往往具有物种特异性，目的基因上游的启动子应选择_____启动子。 (4)步骤②中通常利用_____法将抗冻基因AFPs导入番茄愈伤组织。在培养基中添加_____以便筛选出含抗冻基因的番茄愈伤组织。将番茄愈伤组织转移到新的培养基上，主要通过调节培养基中的_____诱导形成再生植株。若要检测番茄是否产生了抗冻蛋白，一般采用_____技术。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 引物较短，特异性弱，导致同时扩增出目的基因和其他DNA片段 (2)ACD (3) 2/两/二 Bam HⅠ（BglⅡ）和EcoR Ⅰ 45（20） 番茄特异性 (4) 农杆菌转化 潮霉素 （营养物质及）植物激素的种类和配比 抗原—抗体杂交 【分析】1、基因工程操作主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术；扩增DNA片段时需设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸，如果引物的脱氧核苷酸的序列过短，其特异性较弱，导致同时扩增出目的基因和其他DNA片段。 （2）获得重组DNA的过程中需要将目的基因片段和质粒载体进行连接，需要用到DNA连接酶，该酶促反应需要适宜的温度和pH，因此目的基因和质粒的质量与浓度、载体与目的基因重组的时间、载体的质量与浓度、DNA连接酶的活性都是重组DNA形成效率的影响因素，ACD正确，B错误。 故选ACD。 （3）分析题图和题表信息，据图和表可知，三种限制酶的识别序列和酶切位点不同，但是BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切后产生的黏性末端相同；质粒用BamH Ⅰ酶切，目的基因两侧用BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切，在构建重组质粒的过程中存在两种情况，即 为了确定是哪种情况。可用BamH Ⅰ（BglⅡ）和EcoR Ⅰ限制酶对重组质粒进行切割。若为情况一，则产生45（20）kb片段；若为情况二，则产生20（45）kb片段。根据目的基因的转录方向和重组质粒中启动子和终止子的位置可确定，电泳结果出现长度为45（20）kb片段的即为所需基因表达载体。由于目的基因要在番茄细胞中表达，且启动子具有特异性，因此应选择番茄特异性启动子，便于目的基因的表达。 （4）步骤②表示重组质粒导入受体细胞，该过程通常利用农杆菌转化法将抗冻基因AFPS导入番茄愈伤组织。重组质粒的T-DNA中含有潮霉素抗性基因，因此在培养基中添加潮霉素以便筛选出含抗冻基因的番茄愈伤组织。将番茄愈伤组织转移到新的培养基上，主要通过调节培养基中的（营养物质及）植物激素的种类和配比诱导形成再生植株。可通过抗原一抗体杂交技术检测是否翻译出相应的蛋白质。 38．（24-25高二下·江苏泰州·期中）胆固醇O-酰基转移酶1（SOAT1）与肝癌的发生密切相关，可作为潜在的肝癌生物标志物。科研人员从肝癌细胞 Huh-7 中获取 SOAT 1基因，经原核表达、蛋白质纯化后免疫小鼠制备单克隆抗体。请结合研究过程回答下列问题： (1)从肝癌细胞Huh-7中提取____，通过____获得 SOAT 1的cDNA． (2)根据SOAT 1的编码序列设计的两个引物如下图1.引物F加入的 EcoR I酶切位点位于____端，引物R上添加的 Xho I 酶识别的回文序列的6个碱基是____。 (3)利用上述引物对SOAT 1基因进行PCR扩增，该实验设计的扩增程序中热循环次数为30次，一般PCR反应中设计的热循环次数不超过40次，原因是____。PCR反应结束后，将产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，对 PCR 产物进行____回收。 (4)将回收后的 PCR 产物和载体 pET -32a分别用 EcoR I 和 Xho I 双酶切，加入DNA连接酶后在冰面上过夜。在冰面上操作的目的是____。在将重组质粒转化至大肠杆菌前用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于____的生理状态，以提高转化效率。 (5)将测序正确的重组载体诱导表达并进行电泳，实验部分结果见下图2，SOAT 1重组蛋白的相对分子质量为50kD左右，下图中基本符合要求的条带包括____。 【答案】(1) 总RNA 逆转录 (2) 5′ CTCGAG (3) 40次循环后可能出现大量非特异性产物 切胶 (4) 降低酶活性，降低连接反应速率，减少非目标重组DNA的形成 感受态 (5)2、3、5 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）为获得SOAT1的cDNA，需要从肝癌细胞中获得总RNA，通过逆转录过程获得。 （2）EcoRⅠ酶特异性识别GAATTC序列，并在GC之间切割，从F引物看出，EcoR Ⅰ酶切位点位于5′，引物R上添加的XhoⅠ酶识别的回文序列的6个碱基是CTCGAG(或5′—CTCGAG—3′)。 （3）由于40次循环后可能出现大量非特异性产物(或40次循环是PCR反应的有效极限)，所以一般PCR反应中设计的热循环次数不超过40次，产物1%琼脂糖凝胶电泳后，对PCR产物进行切胶回收。 （4）将回收后的 PCR 产物和载体 pET -32a分别用 EcoR I 和 Xho I 双酶切，加入DNA连接酶后在冰面上过夜。冰面温度低，使酶的活性降低，所以该操作的目的是降低连接反应的速率，减少多联体(非目标重组DNA)的形成。将重组质粒转化至大肠杆菌前用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态，以提高转化效率。 （5）观察电泳图，在条带2、3、5中含有50KD的蛋白质分子，而SOAT 1重组蛋白的相对分子质量为50 kD左右，所以符合要求的条带包括2、3、5。 39．（24-25高二下·江苏南京·期中）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题： (1)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物_____（填序号）对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的_____端添加_____（“EcoRⅠ”或“BamHⅠ”或“MunⅠ”）识别序列。 (2)根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶_____切割Ti质粒，并通过_____酶进行连接。 (3)用_____处理农杆菌方能将重组质粒导入。在培养基中添加_____来筛选成功导入质粒的农杆菌。将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示。该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因，PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是_____（填字母）。 A．变性温度太低  B．复性温度太低    C．复性温度太高    D．引物特异性弱 (4)已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，将其放置在_____环境中检测拟南芥耐寒模型是否建立成功。成功转基因的拟南芥，通过自交产生的后代，_____（填“能”或“不能”）稳定遗传耐寒性状。 【答案】(1) ①④ 5' Mun I (2) EcoRⅠ和SphⅠ DNA连接（酶） (3) Ca2+ 氨苄青霉素 BD (4) 寒冷 不能 【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）PCR 扩增时，引物①（3'→5'）和④（5'→3'）与模板链互补，可扩增目标基因，故选①④。 为保证目的基因正确连接到载体，需在引物 5' 端添加限制酶识别序列。据表可知，EcoRⅠ和MunⅠ是同尾酶，EcoRⅠ能切割目的基因不能用，结合后续 Ti 质粒切割使用的酶（见第 2 问）及图示酶切位点分布，上游片段中EcoRⅠ靠近目的基因起始端，EcoRⅠ能切割目的基因不能用，则使用同尾酶MunⅠ，且不切割基因内部，因此上游引物的 5' 端 添加 MunⅠ 识别序列。 （2）BamHⅠ切割标记基因不能用，Sau3A的识别序列包含BamHⅠ的识别序列也不能用；Ti 质粒的 T-DNA 区域需保留完整以确保目的基因转移，图示中 EcoRⅠ和 SphⅠ位于 T-DNA 内且无重叠，切割后可产生互补末端便于连接，故选用 EcoRⅠ 和 SphⅠ。 切割后通过DNA连接酶将目的基因和切割后的Ti质粒进行连接。 （3）用Ca2+处理农杆菌可使其成为感受态细胞，能更好地吸收重组质粒。 在培养基中添加氨苄青霉素来筛选成功导入质粒的农杆菌，因为Ti质粒上有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。 PCR结果中显示出小分子目标条带，原因可能是复性温度太低，导致引物与模板的结合特异性降低；引物特异性弱也会出现非特异性扩增，产生小分子条带，BD正确。 故选BD。 （4）将成功转入CBF4基因的拟南芥植株放在寒冷环境中检测拟南芥耐寒模型是否建立成功。 转基因的拟南芥，通过自交产生的后代不能稳定遗传耐寒性状，因为导入的基因在后代中可能会发生性状分离，不一定都含有目的基因。 40．（24-25高二下·江苏淮安·期中）同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌tacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题： (1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入__________________，所加dNTP的作用有_________________________________________________________。 (2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需在引物______端添加限制酶________________（填种类）的识别序列；过程②需要限制酶和____________酶。 (3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为__________细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加____________。 (4)下图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由_______________________，过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5′端分别添加_________________基因两端的同源序列。 (5)过程⑦中，在含有四环素和___________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加_____________________。 【答案】(1) 引物（或P1、P2）和模板（或质粒1） 既作为原料又提供能量 (2) 5’ BamHⅠ、EcoRⅠ DNA连接 (3) 感受态 四环素 (4) 4、5、7的电泳结果接近（或大于）2071bp LacZ (5) X-gal 蔗糖和X-gal 【分析】PCR技术：1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2）原理：DNA复制。3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。故在PCR反应体系中，需加入引物（P1、P2）、模板、Taq酶、4种脱氧核苷酸（dNTP）、缓冲液、Mg2+等，引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，dNTP的作用除了能为反应提供原料，还能提供能量。 （2）HindⅢ会破坏tetr基因，XmaⅠ会破坏复制原点，为保证sacB基因和质粒2定向连接，应用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ切割目的基因和质粒，引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，因此设计引物P1、P2时，需在引物5'端添加限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，过程②为基因表达载体的构建，基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶。 （3）过程③为将目的基因导入受体细胞，导入目的基因时，首先用Ca2+处理大肠杆菌使其成为感受态细胞。重组质粒的标记基因为tetr（四环素抗性基因），筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加四环素。 （4）sacB基因是目的基因，sacB基因中含有2071bp，4、5、7的电泳结果接近（或大于）2071bp，说明4、5、7对应的菌株中含有目的基因，说明泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功。引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，目的基因（tetr-sacB）两端均为LacZ基因，因此需在引物5′端分别添加LacZ基因两端的同源序列。 （5）LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，过程⑦为筛选LacZ基因敲除菌株，因此，若LacZ基因被敲除，则在含有四环素和X-gal培养基中出现白色菌落。sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，则添加X-gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X-gal可筛选LacZ基因回补菌株。 41．（24-25高二下·江苏扬州·期中）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶（Luc）基因（无启动子）的载体（如图2）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图c中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光。请回答下列问题。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶_________切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1的碱基序列为_________。 A．5'-AACTAT-3'  B．5'-GAATTCAACTAT-3' C．5'-TTGATA-3'  D．5'-AAGCTTAACTAT-3' (2)通过PCR技术可获取vtg基因，PCR实验后应进行的步骤依次是_________。（排序） ①筛选和鉴定受体细胞 ②DNA连接酶拼接DNA片段 ③限制性内切核酸酶切割 ④PCR产物的凝胶电泳鉴定 ⑤将目的基因导入受体细胞 (3)为了获得更多的目的基因，可将“vtg-Luc基因重组载体”先导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含_________的培养基中；将基因表达载体导入斑马鱼受体细胞的最佳方式是_________。若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加_________进行检测。 (4)为鉴定筛选出的受体细胞中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如下图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是_________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一受体细胞的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_________。 (5)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子中的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到E蛋白在启动子上的结合位点，请完成设计思路： ①用限制酶将_________切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的_________游，形成多种重组载体。 ②将每种重组载体分别导入斑马鱼的_________中，待发育成熟后添加荧光素等进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中_________（填“含有”或“不含有”）能与E蛋白结合的序列。 ③将该片段继续切割成多个长度，重复上述操作，进一步缩小该特定序列的位点区域。 【答案】(1) EcoRI、HindⅢ B (2)④③②⑤① (3) 氨苄青霉素 显微注射法 雌激素、荧光素 (4) 乙、丙 目的基因反向连接 (5) 启动子 上 受精卵 含有 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、钙离子处理法）；（4）目的基因的检测与鉴定（分子水平和个体水平检测，前者包括DNA分子杂交、分子杂交和抗原抗体杂交；后者如抗虫抗病接种实验）。 【详解】（1）为降低“空载”概率,需要选用双酶切法，根据图2信息可知基因载体存在2个BamH Ⅰ酶切位点，不能使用，BsrG Ⅰ会把P2A序列切掉，因此也不能使用。所以使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ。 依据图1推测引物1是以3’-TTGATA-5’为模板的，并与其互补，所以引物1碱基序列中应该含有5’ -AACTAT-3 ’，以及EcoR Ⅰ的识别序列（5’ -GAATTC-3 ’），故引物1包含的碱基序列为5’ -GAATTCAACTAT-3 ’，B正确，ACD错误。 故选B。 （2）PCR实验后应进行的步骤是依次是PCR产物的凝胶电泳鉴定、限制性内切核酸酶切割、DNA连接酶拼接DNA片段、将目的基因导入受体细胞、筛选和鉴定受体细胞，即④③②⑤①。 （3）将“vtg-Luc基因重组载体”先导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基中。将基因表达载体导入斑马鱼受体细胞的最佳方式是显微注射法。若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素、荧光素进行检测。 （4）PCR鉴定时应选择的一对引物是乙、丙，若目的基因反向连接，则用图中另外一对引物从某一受体细胞的质粒中会扩增出400bp片段。 （5）①vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到 E蛋白在启动子上的结合位点，可以用限制酶将vtg基因启动子切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的上游（或ori与P2A序列之间），形成多种重组载体； ②将每种重组载体分别导入斑马鱼受精卵，待发育成熟后添加雌激素和荧光素后进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中含有能与E蛋白结合的序列。 42．（24-25高二下·江苏南京·期中）抗凝血酶Ⅲ是一种药用蛋白，对预防和治疗静脉血栓、心肌梗死、脑血管病变具有重要作用。为了提高抗凝血酶Ⅲ的产量，科研人员设计利用崂山奶山羊乳腺生物反应器制备抗凝血酶Ⅲ，并获得了成功。制作崂山奶山羊乳腺生物反应器的流程如图1所示。回答下列问题： (1)获取抗凝血酶Ⅲ基因后，需通过PCR技术对该基因进行扩增，该技术的原理主要是_________，前提是______________。PCR技术的过程一般包括_______、________、子链延伸三个阶段，需要在反应体系中加入________________（写出两种）等物质。 (2)获取重组质粒后，将重组质粒导入受精卵。从崂山奶山羊A的卵巢中获取卵子和从崂山奶山羊B的睾丸中获取精子，其中精子要进行________处理才具备受精的能力。图1中步骤⑤是指_________，还需要提前对崂山奶山羊A和代孕奶山羊C进行___________处理，该项技术的优势是____________。 (3)科研人员通过实验获得三只转基因奶山羊D（甲、乙、丙）。科研人员对甲、乙、丙三只奶山羊和非转基因奶山羊进行了基因检测。检测结果显示非转基因奶山羊体内无抗凝血酶Ⅲ基因，甲、乙、丙三只奶山羊体内均含有抗凝血酶Ⅲ基因。进一步检测抗凝血酶Ⅲ的表达情况，结果如图2所示。 注：图中黑色条带为抗原—抗体杂交带，表示相应蛋白质的存在。M泳道条带为相应标准蛋白所在位置。 根据以上信息分析，该检测结果说明___________。 【答案】(1) DNA的半保留复制 要有一段已知该基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 变性 复性 模板 DNA、引物、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）、dNTP（脱氧核苷酸）（任写两种） (2) 获能 胚胎移植 同期发情 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，大大缩短了供体本身的繁殖周期 (3) 乙、丙奶山羊体内的抗凝血酶Ⅲ基因能够表达，而甲奶山羊体内的抗凝血酶Ⅲ基因不能表达 【分析】结合题意分析图1：图中①卵母细胞的采集和培养，②表示精子的采集和获能，然后通过体外受精形成受精卵，③表示基因表达载体的构建，④表示目的基因导入受体细胞，图中受体细胞为受精卵，受精卵通过早期胚胎培养然后经过⑤胚胎移植技术移植到代孕奶山羊中，获得转基因羊。 【详解】（1）PCR是一项体外扩增DNA的技术，其原理是DNA的半保留复制，利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知该基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；PCR技术的过程一般包括变性、复性、延伸3个阶段；，需要在反应体系中加入模板 DNA、引物、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）、dNTP（脱氧核苷酸）。模板 DNA 是扩增的对象；引物引导 DNA 合成；热稳定 DNA 聚合酶（如 Taq 酶 ）能在高温下催化dNTP按照碱基互补配对原则合成新的 DNA 链； （2）体外受精时，精子需要获能之后才能受精；由图1可知，步骤⑤是将早期胚胎移植到代孕母羊子宫内，使其继续发育成新个体的过程；为了使供体（崂山奶山羊 A ）和受体（代孕奶山羊 C ）的生殖器官的生理变化相同，为供体的胚胎移入受体提供相同的生理环境，需要对它们进行同期发情处理；该项技术的优势是供体只提供优良的胚胎，而妊娠和繁殖的任务是由受体来承担，从而充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。 （3）由题干可知，图中黑色条带为抗原一抗体杂交带，表示相应蛋白质的存在，据图2可知，乙、丙奶山羊体内的抗凝血酶Ⅲ基因能够表达，而甲奶山羊体内的抗凝血酶Ⅲ基因不能表达。 43．（24-25高二下·江苏无锡·期中）黑水虻是重要的资源昆虫，体内H基因编码的抗菌肽HI-3具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员利用酵母菌生产抗菌肽HI-3，并避免基因污染。请回答下列问题： (1)H基因编码链的编码区序列是5′—CTCGAGATGCTGCAG……GGATCCTCTAGA—3′，扩增H基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是________（方向为5′→3′，写出5′端8个碱基序列）。获得H基因产物后需要进行________，将符合要求的条带切割回收以便提取纯化并进行测序。 (2)由于抗菌肽HI-3会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA中插入P和S基因，使质粒上H基因的表达受红光控制。红光调控H基因表达的原理如图1所示。 P和S基因表达应为_______（填“组成型表达”或“红光诱导型表达”）。红光调控H基因表达的原理是S基因指导合成的S蛋白直接与启动子Jub结合，P基因表达的P蛋白在红光调控下________，启动H基因的表达过程。启动子是________酶识别结合的位点。 (3)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E蛋白的基因（E1、E2），使F基因的表达受到蓝光控制如图3。 图3中E2基因持续性表达少量的E蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力，E1基因的作用是，蓝光照射后，_______。 (4)制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T和L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。 若图中①选用的启动子为Jub，②处选用的启动子为CYC，则③④处结合的阻遏蛋白分别为_______。 (5)请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽HI-3各阶段需控制的光照条件是Ⅰ菌种培养阶段________；Ⅱ菌种发酵阶段________；Ⅲ产物分离阶段________；Ⅳ安全处理阶段红光、蓝光同时照射。 【答案】(1) 5′-TCTAGAGG-3′ 琼脂糖凝胶电泳 (2) 组成型表达 与结合在启动子上的S蛋白结合 RNA聚合酶 (3)快速表达大量E蛋白，进而激活F基因的表达 (4)T蛋白、L蛋白 (5) 黑暗 红光照射 蓝光照射 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，已知H基因编码链的编码区序列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTCTAGA-3'，扩增H基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是5'-TCTAGAGG-3'。获得H基因产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳，将符合要求的条带切割和回收，以便提取纯化并进行测序。 （2）由图可知，P和S基因的表达不需要其他物诱导，因此属于组成型表达，H基因属于红光诱导型表达。由图可知，在没有红光诱导时，S基因指导合成的S蛋白直接与启动子Jub结合，红光调控下，P基因指导合成的P蛋白与结合在启动子上的S蛋白结合，启动H基因的表达（转录）过程。启动子是RNA聚合酶识别结合的位点。 （3）依据题意可知，科研人员引入蓝光激活系统目的是激活F基因表达产生F蛋白，使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部，分析图2和图3可知，与CYC相连的E1基因的作用是接受照射蓝光后，快速表达大量E蛋白，进而激活F基因的表达。 （4）依据题干可知，启动子Jub接受红光的诱导调控，启动子CYC接受蓝光的诱导调控，③和④为阻遏蛋白的结合位点，其与阻遏蛋白结合后会抑制相关基因的表达。致死基因N的表达会诱导工程菌死亡，若①选用的启动子为Jub，②处启动子为CYC，在红光和蓝光同时照射时，红光调控Jub启动子启动T基因表达出T蛋白，结合在③处，抑制了L基因的表达，④处无L阻遏蛋白与之结合，在蓝光调控下，CYC启动N基因的表达而使酵母菌死亡，故③④分别是T蛋白、L蛋白。 （5）根据题目信息，红光照射使产物增多，蓝光照射使产物凝集，红蓝光同时照射使工程菌死亡，I菌种培养阶段应在黑暗条件下培养至种群数量达到最适；Ⅱ菌种发酵阶段红光照射至抗菌肽HI-3在培养液中达到适宜浓度，Ⅱ产物分离阶段蓝光照射至工程菌凝集，回收发酵产物；Ⅳ安全处理阶段红光蓝光同时照射，杀死工程菌。 44．（24-25高二下·江苏南通·期中）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达。研究人员通过RT—PCR获得Y基因并与改造后的Ti质粒上的绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功表达的Y—GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究，请回答下列问题。 (1)逆转录得到的Y基因中_______（填“包括”或“不包括”）启动子和终止子序列。 (2)为将扩增后的产物定向插入载体，应该选择_______、_______酶切割Ti质粒。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y—GFP融合蛋白，PCR扩增Y基因时应通过设计引物去除_______对应的序列。因此扩增Y基因的上下游引物应分别选择_______、_______。 a5'—GAATTCATGCTGCACACCTGC—3'    b5'—CAATTGATGCTGCACACCTGC—3' c5'—GGATCCATGTTCTGTGGTGAT—3'    d5'—GGATCCCTAATGTTCTGTGGT—3' e5'—GATCATGTTCTGTGGTGAT—3' (3)将初步构建的Y—GFP基因表达载体转入大豆细胞后，对经_______（抗生素）筛选得到的三个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图2所示。其中细胞系_______最可能成功表达出Y—GFP融合蛋白。    (4)为探究Y—GFP蛋白能否与S基因启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的放射性探针进行相关实验，实验结果如图3所示。已知Y—GFP蛋白与探针结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带，丁组除了添加未标记探针外还应添加_______。据图分析，Y—GFP蛋白_______（填“能”或“不能”）与S基因启动子序列结合，相比于a条带，b条带放射性低的原因是_______。 【答案】(1)不包括 (2) Sau3AI EcoRI 终止密码子 b c (3) 潮霉素 1 (4) Y-GFP 蛋白 能 未标记探针竞争结合，减少标记探针与 Y-GFP 蛋白的结合 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）逆转录的模板是 mRNA，而 mRNA 是经过转录后加工的产物，仅包含编码区序列（外显子），不包含 DNA 中的启动子（转录起始调控序列）和终止子（转录终止调控序列）。因此，通过 RT-PCR 获得的 cDNA（Y 基因）中不包括启动子和终止子序列。 （2）为实现定向插入，需选择两种不同的限制酶，且 Ti 质粒中启动子下游的 EcoR I（识别序列 GAATTC）和 Sau3AI（识别序列 GATC）位点适合。则Y 基因上游含有黏性末端AATT，下游含有黏性末端GATC，避免载体自连并保证方向正确。 去除终止密码子：Y 基因编码链末端含 TAG（对应 mRNA 的 UAG，终止密码子），若保留会导致融合蛋白翻译提前终止，因此需通过引物设计去除该终止密码子对应的序列。因为Y基因中含有EcoR I，则不能用EcoR I切割Y基因,需要用同尾酶，即MunI 加入引物的5’端，所有上游引物应该选b；而同理下游引物应该选择Sau3AI的同尾酶，即BamHI，同时要考虑到不包含编码连“TAG”的序列，所以应该选c。 （3）Ti 质粒含潮霉素抗性基因（Hyg），因此需用潮霉素筛选成功转入载体的大豆细胞。 融合蛋白检测：Y-GFP 融合蛋白可被 Y 蛋白抗体和 GFP 抗体同时识别。从图 2 电泳结果看，只有细胞系1 同时出现了 能与Y 蛋白抗体和 GFP 抗体结合的分子量相对较大的阳性条带，说明该细胞系最有可能成功表达出 Y - GFP 融合蛋白（因为 Y - GFP 融合蛋白既有 Y 蛋白的部分又有 GFP 蛋白的部分，能同时与两种抗体反应）。 （4）实验设计：丁组需验证未标记探针的竞争效应，除添加未标记探针外，还需加入Y-GFP 蛋白，与丙组（标记探针 + Y-GFP 蛋白）对比。 结合能力判断：丙组出现阻滞条带，表明 Y-GFP 蛋白能与 S 基因启动子探针结合（阻滞条带因蛋白结合导致迁移率降低）。 放射性差异原因：丁组（标记探针 + 未标记探针 + Y-GFP蛋白）中，未标记探针浓度高（100 倍），竞争性结合 Y-GFP 蛋白，导致与标记探针结合的蛋白减少，因此 b 条带放射性低于 a 条带（标记探针结合量减少）。 45．（24-25高二下·江苏南通·期中）鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员研制人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如下图1。图1中引物已按照退火时与模板链结合位置画出，转录时a链为模板链。 限制酶 识别序列和 切割位点 Sca I 5'AGT↓ACT3' Xba I 5'A↓CTAGA3' Mbo I 5'GT↓AC3' (1)启动子的基本单位是______，复制原点中通常含A/T碱基对多，原因是______。 (2)pBCI载体中P1、P2两个启动子转录下游基因时模板链是否相同？______。 (3)已知融合基因的a链的序列为5’-CGCTACTCATTGCTGCG…CGGATGAGCGCGTAGAT-3’。利用PCR技术扩增融合基因时,某同学设计了如下的4种引物，引物1、2对应的序列分别为______、______。 A．5'-ACTAGACGCTACTCATTGCTGCG-3' B．5'-AGTACTATCTACGCGCTCATCCG-3' C．5'-AGTACTTAGATGCGCGAGTAGGC-3' D．5'-ACTAGAGCGATGAGTAACGACGC-3' (4)图1步骤②常用的物理转化方法为______。加入______后初步筛选出发______荧光的受精卵用于后续操作。 (5)图2为PCR扩增融合基因时的参数设定。步骤甲的作用______，步骤戊应设定跳转到步骤______。如果开始的融合基因只有1个，第3次循环至少需要引物______对。                                                           【答案】(1) 脱氧核苷酸 有利于解旋 (2)否 (3) B A (4) 显微注射法 四环素 红色 (5) 增大大分子DNA彻底变性概率 乙 4 【分析】PCR过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，其基本单位是脱氧核苷酸。 复制原点中常含A - T碱基对多，因为A - T之间是2个氢键，G - C之间是3个氢键，A - T碱基对多有利于解旋，解旋后才能进行DNA复制等后续过程。 （2）P1、P2是两个启动子，两者启动转录的方向不同，故对应的模板链也不同。 （3）已知融合基因的a链的序列为5’-CGCTACTCATTGCTGCG…CGGATGAGCGCGTAGAT-3’，a链与b链碱基互补，则b链的序列为5’-ATCTACGCGCTCATCCG…CGCAGCAATGAGTAGCG-3’，引物是与模板链的3'端结合，因此，引物1结合的单链是a链，部分序列与b链相同。同时在引物的5'端添加限制酶（即Sca I）酶切位点。根据给出的序列和PCR引物的设计原则，可以判断引物1的序列应为5'-AGTACTATCTACGCGCTCATCCG-3'，故选B。而引物2应为与a链5′端部分序列相同，同时在引物的5'端添加限制酶（Xba I），故可以判断引物2的序列应为5'-ACTAGACGCTACTCATTGCTGCG-3'，故选A。 （4）图中步骤③将重组质粒导入动物细胞（小鼠受精卵），常用的物理转化方法为显微注射法。 加入四环素后初步筛选出含重组质粒的细胞，因为重组质粒上有四环素抗性基因。 然后筛选出表达红色荧光的受精卵用于后续操作，因为重组质粒上有红色荧光蛋白基因，表达红色荧光说明重组质粒成功导入并表达。 （5）步骤甲是高温变性，作用是增大分子DNA链的变性概率，使DNA双链解开为单链。 PCR 一般包括变性、退火、延伸三个基本反应步骤，循环进行。步骤戊是延伸步骤，延伸之后应进行下一轮循环的变性，即跳转到步骤乙（98℃变性）。第3次循环以4个DNA分子为模板，形成8个DNA分子，需要合成8条新链，所以至少需要 4 对引物。 46．（24-25高二下·江苏常州·期中）研究表明，植物的WRKY13基因与缺铁胁迫耐受有关。为研究该基因的作用机制，研究者用拟南芥、大肠杆菌等材料进行了相关实验，部分流程如图所示。请回答下列问题： (1)扩增GUS时，选用的引物应是________；为保证WRKY13和GUS能融合，引物F2和引物R1的________（从“3’端”或“5’端”中选填）添加的部分序列必须能够________。 (2)将WRKY13-GUS融合基因片段与质粒连接时，通常采用________酶，为确保目的基因的正向连接，设计引物F1的依据有________。 (3)转化时，重组质粒需导入大肠杆菌中，目的是________，此过程常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于________。然后用含壮观霉素或庆大霉素且含X-Gluc的培养基筛选大肠杆菌，挑选________色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 (4)将上述重组质粒用农杆菌导入拟南芥花序中，可用含________的培养基初步获得阳性苗，培育后的植株自交后所得子代中，WRKY13基因纯合的植株占比为________。 【答案】(1) F2和R2 5’端 碱基互补配对 (2) DNA连接 应含有启动子序列，且F1的5'端序列能与质粒上的①互补配对，这样可以确保引物F1能够特异性地扩增WRKY13基因的部分序列，并与GUS基因正确融合 (3) 使目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达 一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 蓝 (4) 庆大霉素、X-Gluc 1/4 【分析】1、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； 2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；将目的基因导入植物细胞的常用方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是用钙离子处理。 【详解】（1）据题图分析可知，扩增GUS时，选用的引物应是F2和R2。为保证WRKY13和GUS能融合，引物F2和引物R1的5’端添加的部分序列必须能够互补配对，这样它们才能在DNA连接过程中形成正确的连接。 （2）连接基因片段与质粒通常使用的是DNA连接酶，因此将WRKY13-GUS融合基因片段与质粒连接时，通常采用DNA连接酶。由于质粒的①端没有启动子，而②端含有了NOS终止子，为确保目的基因的正向连接，同时保证融合基因在重组质粒中能表达，设计引物F1时应含有启动子序列，且F1的5'端序列能与质粒上的①互补配对，这样可以确保引物F1能够特异性地扩增WRKY13基因的部分序列，并与GUS基因正确融合。 （3）转化时，重组质粒需导入大肠杆菌中，目的是使目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达，此过程常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。据图分析可知，重组质粒上含有壮观霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、WRKY13-GUS融合基因，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌可在含壮观霉素或庆大霉素且含X-Gluc的平板上生存，其菌落呈现蓝色，故挑选蓝色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 （4）据图可知，T-DNA上含有庆大霉素抗性基因，因此可以用含庆大霉素、X-Gluc的培养基初步获得阳性苗。培育后的植株含有一个携带WRKY13基因的 DNA片段，因此可以把它看做是杂合子。理论上，自交后所得子代中，WRKY13基因纯合的植株占比为1/4。 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）下列有关生物技术的叙述，错误的是（    ） A．在动物细胞培养液中添加一定量的抗生素以防止杂菌污染 B．进行单个植物细胞培养必须先用酶水解细胞壁以获得原生质体 C．动物细胞融合与植物体细胞杂交都可用电融合法或PEG融合法诱导融合 D．可利用转基因“工程菌”修复被污染的土壤 【答案】B 【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配制、灭菌、种子扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。 【详解】A、抗生素可杀灭细菌，在动物细胞培养液中添加一定量的抗生素以防止杂菌污染，A正确； B、进行单个植物细胞培养时不需要用酶解法去除细胞壁，植物体细胞杂交过程中必须先用酶水解细胞壁以获得原生质体，B错误； C、动物细胞融合与植物体细胞杂交都可用电融合法或PEG融合法诱导融合，动物细胞融合还可利用灭火病毒诱导，C正确； D、工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系，故可利用转基因“工程菌”修复被污染的土壤，D正确。 故选B。 二、非选择题 2．（24-25高二下·江苏扬州·期中）果胶甲酯酶具有催化水解果胶的作用，为获得高产、高纯度的胞外果胶甲酯酶，下图表示某科研小组设计的黑曲霉工程菌的构建和发酵流程图。回答下列问题：    (1)科研小组从基因数据库中获得果胶甲酯酶基因序列后，通过设计引物扩增出大量果胶甲酯酶基因片段，在扩增过程中提供4种dNTP的作用是_______。在构建重组表达载体过程中，果胶甲酯酶基因应插入到质粒的_______之间才能进行表达，此过程缓冲液中加入Mg2+的目的是_______ 。 (2)可提取农杆菌的DNA进行PCR后再通过_______判断重组表达载体是否导入到农杆菌。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉_______判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶甲酯酶相似，造成提取产物纯度不高，所以科研小组通过一定的方法将这种蛋白质的基因_______，实现获得高纯度的果胶甲酯酶。 (3)发酵过程需保持_______（至少写两点）、适宜pH、充足的氧气等条件，保证发酵过程不受杂菌污染和菌体能正常生长。发酵结束后将发酵液进行离心处理，取________进行果胶甲酯酶的分离和纯化工作。在分离过程中使用一定浓度的硫酸铵处理发酵液后获得有活性的果胶甲酯酶沉淀物，原因是：在一定浓度的硫酸铵条件下_______、_______。 【答案】(1) 在PCR扩增过程中提供原料和能量 启动子和终止子 作为相关酶的激活剂 (2) 琼脂糖凝胶电泳（凝胶电泳） 单位时间催化水解的果胶量 敲除 (3) 无菌、营养供给充分、适宜温度 上清液 果胶酶溶解度低 不会破坏酶的空间结构 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）dNTP代表脱氧核糖核苷酸三磷酸。4种dNTP由磷酸基团，脱氧核糖和含氮碱基组成，可以为PCR（体外扩增DNA技术）提供原料和能量。质粒常作为运载体帮助目的基因复制及表达，基因表达必须有启动子和终止子，因此须插在启动子和终止子之间，缓冲液中加入Mg2+的目的是作为相关酶的激活剂。 （2）琼脂糖凝胶电泳可以检测DNA，通过与标准DNA对照，判断是否存在对应的DNA。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉单位时间催化水解的果胶量判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因苹果青霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶酶相似，造成提取产物纯度不高，可以将该蛋白对应的基因敲除，使得该蛋白无法合成，排除对果胶甲酯酶的干扰。 （3）发酵过程需保持无菌、营养供给充分、适宜温度、适宜pH、充足的氧气等条件，保证发酵过程不受杂菌污染和菌体能正常生长。发酵结束后将发酵液进行离心处理后，酶存在于上清液中，故取上清液进行果胶甲酯酶的分离和纯化工作。果胶甲酯酶在硫酸铵中溶解度低且不会破坏酶的空间结构，可以获得果胶酶沉淀物。 3．（24-25高二下·江苏苏州·期中）草莓果实采后难以保鲜是生产实践的难题。乙烯在调控果实成熟基因的协同表达中起着非常重要的作用。研究人员通过反义RNA技术抑制乙烯受体基因Ersl的表达，达到延长储藏期的效果。CTAB法提取草莓叶片DNA的部分实验步骤如图1。请回答下列问题：    (1)CTAB提取液中含有CTAB、EDTA、NaCl等物质，CTAB能破坏膜结构，使蛋白质变性，使核酸分离出来；EDTA是一种DNA酶抑制剂，加入其的目的是___________。氯仿、异戊醇密度均大于水且不溶于水，DNA不溶于氯仿、异戊醇，而蛋白质等杂质可溶，实验中加入氯仿、异戊醇离心后，应取①是___________(填“上清液”或“中层溶液”或“沉淀”)，该步骤重复1—2次，继续进行下面两个步骤就可得到DNA粗制品。 (2)通过上述方法获得DNA后，DNA经进一步提纯后，通过PCR技术扩增Ersl。在PCR体系中，加入的dNTP可提供___________，耐高温的DNA聚合酶需要___________激活，添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性___________(填“降低”或“升高”)。 (3)为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ersl时，需在引物的___________端添加限制酶Xho I的识别序列。经Xho I酶切后的载体和Ersl进行连接(如图2)，连接产物经筛选得到的载体主要有___________三种类型。为鉴定这些连接方式，选择Hpa I酶和BamH I酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析。若电泳结果出现长度为___________的片段，该重组质粒即为所需的基因表达载体。    (4)将筛选得到的重组质粒与用___________处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，在含___________的培养基中培养，筛选所需的植物细胞经过一系列处理，最终得到的转基因植株的乙烯受体的合成受阻，其原因___________。 【答案】(1) 减少 DNA 水解(，提高 DNA 的完整性和总量) 上清液 (2) 原料和能量 Mg2+ 降低 (3) 5， 载体自连、Ers1与载体正向连接、Ers1与载体反向连接 800 bp 和5900 bp (4) Ca2+(CaCl2） 潮霉素 反义 Ers1 的转录产物通过与草莓体内 Ers1的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸 【详解】（1）EDTA是一种DNA酶抑制剂，加入其目的是​​抑制DNA酶的活性，减少 DNA 水解(提高 DNA 的完整性和总量)。氯仿、异戊醇密度均大于水且不溶于水，DNA不溶于氯仿、异戊醇，而蛋白质等杂质可溶，实验中加入氯仿、异戊醇离心后，蛋白质等杂质溶解在下层，DNA存在于上清液。 （2）在PCR体系中，加入的dNTP可提供​​合成DNA的原料和能量​​。 耐高温的DNA聚合酶需要​​Mg²⁺​​激活。 添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性​​降低​​。 （3）为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ersl时，需在引物的​​5'​​端添加限制酶Xho I的识别序列。 经Xho I酶切后的载体和Ersl进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有载体自连、Ers1与载体正向连接、Ers1与载体反向连接三种类型。由图根据Ersl的转录方向，选择Hpa I酶和BamH I酶对筛选的载体进行双酶切，会产生200+（700-100）=800bp 和6000+700-800=5900 bp两个片段，则该重组质粒即为所需的基因表达载体。 （4）农杆菌是原核生物，需要Ca2+（CaCl2）处理，使其处于易于吸收外源DNA的状态，完成将基因表达载体导入受体细胞的过程。其中基因表达载体上含有潮霉素抗性基因，属于标记基因，故可在含潮霉素的培养基上培养、筛选农杆菌，筛选所需的植物细胞经过一系列处理，最终得到的转基因植株，反义 Ers1 的转录产物通过与草莓体内 Ers1的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻，使得到的植株的乙烯受体的合成受阻。 4．（24-25高二下·江苏徐州·期中）图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒的结构示意图，图中EcoRI、Smal、BamHI和HindIII为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题： (1)人工构建基因表达载体时，该载体除了含特定限制酶切割位点外，还要有__________（答出两点）等，切割质粒和目的基因通常使用两种限制酶，是为了防止_______________。 (2)采用PCR技术对图1中胰岛素基因进行扩增时，除了向反应体系中加入相应模板和引物外，还需要加入_________（至少答出2点），DNA新链的合成方向是_________，扩增过程中应该选择引物__________，其原因是_________。 (3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子，其作用是______________，若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素等分泌蛋白，与大肠杆菌相比，酵母菌的优势有__________。若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功表达，常用______________技术。 (4)为筛选出含有重组质粒的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“＋”代表生长，“-”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是____________。         菌落类型平板类型 A B C 无抗生素 + + + 氨苄青霉素 + + - 四环素 + - - 氨苄青霉素＋四环素 + - - 【答案】(1) 标记基因/复制原点/启动子/终止子 质粒和目的基因自身环化及反向连接 (2) 四种脱氧核苷酸、Taq酶 5‘→3’ 引物4和引物5 扩增所得的DNA片段需要BamHI和HingIII的切割位点 (3) 提供RNA聚合酶特异性识别和结合点位，驱动基因的转录 酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工 抗原-抗体杂交 (4) B A类菌落导入pBR322质粒、C类菌落没有导入质粒 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法（感受态细胞法）。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因表达载体的构件有：标记基因、复制原点、启动子、终止子、目的基因。构建载体时一般选用双酶切，优点是防止质粒和目的基因自身环化及反向连接。 （2）PCR反应体系中有：缓冲液（加Mg2+）、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等。在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，DNA新链的合成方向是5‘→3’。由于在目的基因和载体连接时，需要限制酶切割，所以目的基因两侧要有酶切位点，故选用引物4和引物5扩增。 （3）启动子的作用是：提供RNA聚合酶特异性识别和结合点位，驱动基因的转录。大肠杆菌是原核细胞，只有核糖体一种细胞器，而酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工。基因表达的产物是蛋白质，检测蛋白质用抗原-抗体杂交技术。 （4）酶切时会破坏四环素的抗性基因，氨苄青霉素抗性基因完整，导入了目的基因的受体细胞可以在氨苄青霉素的培养基上生存，在四环素的培养基上不能生存，应选择的菌落是B。C在抗生素的培养基上都不能生存，没有导入质粒。A都能生存，A类菌落导入pBR322质粒。 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏扬州·期中）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的是（    ） A．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构 B．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 C．EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质 D．蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需求。 【详解】A、对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，对蛋白质的空间结构进行设计，不是肽键的结构和氨基酸的物理性质与结构，A错误； B、当前限制蛋白质工程发展的关键因素是对大多数蛋白质的高级结构的了解还不够，B错误； C、新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，蛋白质工程仍需要基因修饰或基因合成等手段，EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将还需要借助基因工程手段改造蛋白质，使得产品更优良，C错误； D、蛋白质工程和基因工程的实质都是改造基因，操作对象都是基因，D正确。 故选D。 2．（24-25高二下·江苏南京·期中）戴米斯·哈萨比斯和约翰·江珀开发了预测蛋白质结构AI工具AlphaFold，该工具可通过输入的氨基酸序列信息生成蛋白质空间结构模型。下列说法正确的是 （    ） A．蛋白质工程中，难度最大的是设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列 B．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质 C．AI技术有助于科学家探索通过功能设计蛋白质结构，再逆向推导氨基酸序列 D．蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径与基因工程的途径相同 【答案】C 【分析】通过AI预测蛋白质结构，这为蛋白质工程提供了逆向设计的工具，即从功能需求出发设计结构，再推导基因序列。 【详解】A、蛋白质工程中最困难的环节是从氨基酸序列预测蛋白质的三维结构，而非“设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列”。后者可通过已知的蛋白质结构数据库和氨基酸序列反向推导，相对较易。A错误； B、蛋白质工程通过改造基因序列（即改变DNA编码的氨基酸序列）来制造新蛋白质，而非直接改变氨基酸的空间结构。氨基酸本身无独立空间结构，其排列顺序决定蛋白质的折叠方式。B错误； C、AI技术（如AlphaFold）可根据蛋白质的功能需求，预测可能的三维结构，再逆向推导出所需的氨基酸序列。这正是蛋白质工程的核心思路——从功能出发设计结构，再反推基因序列。C正确； D、蛋白质工程被称为“第二代基因工程”，但其基本途径与基因工程相反。基因工程是“从基因到蛋白质”（直接表达天然基因），而蛋白质工程是“从蛋白质到基因”（先设计蛋白质功能，再改造基因）。D错误。 故选C。 3．（24-25高二下·江苏苏州·期中）利用蛋白质工程对干扰素进行改造，可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是（   ） A．蛋白质工程与中心法则的信息流动方向是一致的 B．可用PCR技术检测改造后的干扰素基因是否转录出了相应的mRNA C．经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传 D．蛋白质工程对干扰素的改造遇到的最大难题是按人类需求对高级结构进行设计 【答案】A 【分析】蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至可以是细胞系统。 【详解】A、蛋白质工程包含逆向设计（蛋白质→基因），与中心法则的方向不完全一致，A错误； B、先以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，按照碱基互补配对原则合成cDNA（互补DNA）。因为mRNA是以DNA为模板转录而来的，所以逆转录得到的cDNA与转录它的模板DNA序列互补，以逆转录得到的cDNA为模板，进行常规的PCR扩增。如果在PCR扩增产物中能检测到预期大小的目的条带，说明改造后的干扰素基因转录出了相应的mRNA，B正确； C、经改造后的干扰素基因整合到工程菌的基因组中，随着工程菌的繁殖，基因会进行复制并传递给子代细胞，从而实现遗传，C正确； D蛋白质的高级结构非常复杂，受到多种因素的影响，目前人类对蛋白质高级结构的了解还很有限，很难按人类需求对高级结构进行设计，这是蛋白质工程对干扰素改造遇到的最大难题，D正确。 故选A。 二、多选题 4．（24-25高二下·江苏泰州·期中）天然胰岛素存在起效慢、半衰期短等问题，科研人员利用以下技术途径研发出了速效、长效胰岛素。下列相关叙述正确的是（　　） A．蛋白质工程可改造现有蛋白或制造新蛋白质 B．步骤A表示预期蛋白质的功能、B表示应有的氨基酸序列 C．当下市场上的人类胰岛素药物主要由该技术将猪胰岛素改造而来 D．通过该技术有效抑制胰岛素的聚合可研发出新型速效胰岛素 【答案】ABD 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 蛋白质工程的基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】A、蛋白质工程蛋白质工程可改造现有蛋白或制造新蛋白质，但最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成，A正确； B、蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），即步骤A表示预期蛋白质的功能、B表示应有的氨基酸序列，B正确； C、结合题意可知，当下市场上的人类胰岛素药物主要通过基因工程改造大肠杆菌获得的，C错误； D、通过该技术，即蛋白质工程有效抑制胰岛素的聚合可研发出新型速效胰岛素，因为该技术可以生产出自然界中不存在的蛋白质，D正确。 故选ABD。 5．（24-25高二下·江苏扬州·期中）大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的有（　　） A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组 C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 【答案】BC 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。5、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录后并翻译，A正确； B、单核苷酸的定点诱变改变了基因中的碱基序列，为基因突变，B错误； C、第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误； D、该过程通过改造基因最终改造生物性状，属于蛋白质工程技术范畴，D正确。 故选BC。 6．（24-25高二下·江苏连云港·期中）微生物体内积累的聚羟基脂肪酸（PHA）是一种可降解的生物塑料。嗜盐菌是在高盐环境中具备正常生长能力的极端微生物，利用其生产PHA可以降低灭菌的成本。科研人员利用一株好氧性嗜盐单胞菌H，并以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液）或餐厨垃圾为原料，发酵生产PHA等新型可降解材料，工艺流程如图1： 图1 (1)发酵过程中使用马达搅拌器的优点有_______。发酵罐中的糖蜜及餐厨垃圾等能为嗜盐单胞菌H提供_______等基本物质。 (2)图中采用分批发酵方式，在发酵过程中嗜盐单胞菌H在整个培养过程中主要经历了延滞期、_______、_______和衰亡期。其中_______期的菌可以作为生产的“种子”。 (3)为筛选出除嗜盐单胞菌H以外的其他高产PHA的菌株，科研人员将分离获得的6种嗜盐菌菌株接种在不同NaCl浓度条件下，一段时间后检测PHA含量，结果如图2，将挑选出的菌株在不同pH的液体培养基中培养，一段时间后检测PHA百分比和细胞干重，结果如图3：      ①据图2、3分析，生产时应选择菌株_______在_______的条件下进行培养，理由是_______。 ②该嗜盐菌可在非无菌环境下的发酵，理由是_______。 ③野生型嗜盐菌中有部分基因会影响PHA的合成，可采用_______技术改造野生型嗜盐菌，提高PHA的产量。 【答案】(1) 增加溶解氧和增大菌体与培养液的接触 碳源、氮源、无机盐 (2) 对数期 稳定期 对数 (3) I-4 pH=9，NaCl浓度为60g/L 在此条件下，I-4菌株生长良好且能产生较多PHA 该嗜盐菌在高盐环境中发酵，绝大多数微生物在此环境下难以生存 蛋白质工程 【分析】在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。 【详解】（1）发现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制，搅拌器能通过搅拌使氧气与培养液充分接触，增加培养液中的溶氧量，且使菌株H与培养液充分接触，提高原料利用率。微生物生长所需的营养物质由碳源、氮源、水、无机盐，发酵罐中的糖蜜及餐厨垃圾等能为嗜盐单胞菌H提供碳源、氮源、无机盐等基本物质。 （2）在发酵过程中嗜盐单胞菌H在整个培养过程中主要经历了延滞期、对数期、稳定期、和衰亡期。其中对数期的菌体可以作为生产的“种子”。 （3）①由图2、3可知，I-4在pH=9，NaCl浓度为60g/LPHA含量最高，且I-4菌株生长良好，因此生产时应选择菌株I-4在pH=9，NaCl浓度为60g/L的条件下进行培养。 ②嗜盐菌是在高盐环境中具备正常生长能力的极端微生物，利用其生产PHA可以降低灭菌的成本。嗜盐菌菌株I-4在高盐环境中发酵，绝大多数微生物在此环境下难以生存，因此可在非无菌环境下的发酵。 ③生型嗜盐菌中有部分基因会影响PHA的合成，可采用蛋白质工程技术改造野生型嗜盐菌，提高PHA的产量。 7．（24-25高二下·江苏苏州·期中）t-PA是人血液中天然纤溶系统激活剂，临床上常作为治疗急性心梗等血栓性疾病的特效药，但治疗中大剂量注射的天然t-PA会诱发颅内出血。为降低出血性副作用，研究人员用PCR技术将t-PA第84位的氨基酸由天然的半胱氨酸改为丝氨酸，其过程如图1。请回答下列问题： 图1 (1)天然t-PA第84位的半胱氨酸相对应的基因模板链(图1中①链)上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。在获取t-PA突变改良基因过程中需要以下几种引物： A．引物Ⅰ： B．引物Ⅱ： C．引物Ⅲ： D．大引物的③链 E．大引物的④链 引物Ⅰ中下划线上？代表的碱基是___________，第一次PCR操作中使用的引物___________(选填“A”、“B”、“C”、“D”、“E”)可获得大引物。第二次PCR操作中使用的引物是___________(选填“A”、“B”、“C”、“D”、“E”)。 (2)据图1，为使t-PA改良基因与质粒pCLY11高效连接，需用限制酶___________处理目的基因和质粒。 (3)将重组质粒导入大肠杆菌并涂布在含有___________的固体培养基上，对培养得到的菌落进行筛选，挑取___________色的菌落大量培养后提取大肠杆菌的DNA进行PCR扩增，结果如图2： ①PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因含___________而带负电荷，加样孔端应靠近电泳槽的___________(填“正极”或“负极”)，即图3中的___________(填“甲”或“乙”)端。 ②改良的t-PA基因约有1600个碱基。由图2可知，泳道1中的条带是长度约为1600个碱基的PCR产物，该PCR产物___________(填“是”或“不是”或“不一定是”)改良的t-PA基因，理由是___________，因此还需测序验证。 【答案】(1) G AB CE (2)BglⅡ和XmaI (3) 新霉素 白 磷酸基团 负极 甲 不一定是 电泳仅能分析待测 DNA 分子的大小，无法测序 【分析】蛋白质工程是指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）已知天然t - PA第84位的半胱氨酸相对应的基因模板链（图1中①链）上的碱基序列是ACA，根据碱基互补配对原则，转录形成的mRNA上的密码子为UGU，要将其突变为丝氨酸的密码子UCU，即模板链上的碱基ACA中的第二个碱基C应变更为G，所以引物Ⅰ中下划线上“？”代表的碱基是​​G​​，由图可知，突变上游引物（引物Ⅰ）是为引入突变碱基；已知图中t-PA基因的上链作为转录模板链，意味着目的基因片段的右侧要靠近启动子序列(图中质粒没有标明，我们只能把图中黑色小箭头当成是启动子)，第一次PCR右侧引物应该添加Xmal限制酶识别序列，选择引物Ⅱ，后来成为大引物④，也就是第二次PCR右侧的引物。目的基因片段的左侧要靠近终止子序列，第二次PCR左侧的引物添加BglⅡ限制酶识别序列(引物Ⅲ)。只有这样才能确保转录的时候是以t-PA基因的上链作为转录模板链。故第一次PCR操作中使用的引物是AB，第二次PCR操作中使用的引物是CE。 （2）根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaI和BgIⅡ切割质粒， 才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。 （3）由图1可知，质粒pCLY11上含有mlacZ基因，其表达产物会使细胞呈蓝色，否则细胞呈白色。将重组质粒导入大肠杆菌并涂布在含有​​新霉素​​的固体培养基上（因为重组质粒含有新霉素抗性基因neo⁺，能在含新霉素的培养基上生长），对培养得到的菌落进行筛选，挑取​​白​​色的菌落大量培养后提取大肠杆菌的DNA进行PCR扩增； ①扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含磷酸基团而带负电，凝胶加样孔应靠近电泳槽负极接口，在凝胶电泳时DNA分子会由负极向正极移动。即图3中的​​甲​​端； ②改良的t - PA基因约有1600个碱基。由图2可知，泳道1中的条带是长度约为1600个碱基的PCR产物，该PCR产物​​不一定是​​改良的t - PA基因，理由是​​PCR扩增出的片段长度符合要求，但不能确定其碱基序列是否正确​​，即电泳仅能分析待测 DNA 分子的大小，无法测序，因此还需测序验证。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 基因工程 4大模块高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是（    ） 限制酶 AluI BamHI SmaI Sau3AI 识别序列 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑ A．BamHI切割的是氢键，AluI切割的是磷酸二酯键 B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C．相同的DNA分子被Sau3AⅠ识别并切割的概率一般高于BamHI D．T4DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低 2．（24-25高二下·江苏扬州·期中）限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是（    ） A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．T4DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较高 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA 3．（24-25高二下·江苏盐城·期中）1972年，伯格首先在体外进行了DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列叙述正确的是（　　） A．限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列 B．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA 分子 C．用限制酶酶切获得一个外源基因时，若得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开 D．DNA连接酶只能连接同种限制酶切开的两个DNA片段，重新形成磷酸二酯键 4．（24-25高二下·江苏无锡·期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（    ） A．将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟，DNA存在于沉淀 B．洋葱滤液中加入冷酒精，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C．DNA片段的PCR扩增实验中反应缓冲溶液中的Mg2+能够激活TaqDNA聚合酶 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 5．（24-25高二下·江苏淮安·期中）南通某生物兴趣小组的同学用猪肝进行DNA的粗提取与鉴定实验，主要实验流程如下图。相关叙述不正确的是（　　） A．过程②过滤后应取滤液 B．过程⑤加入酒精后，也可将溶液倒入离心管离心后取沉淀物 C．过滤液放入4℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性 D．提取到的丝状物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热后变蓝 6．（24-25高二下·江苏苏州·期中）关于基因工程的工具，下列叙述正确的是（   ） A．限制酶具有特异性，不同限制酶识别的核苷酸序列都不同 B．TaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物量增加 C．E．coli DNA连接酶只能连DNA片段互补的黏性末端，而不能连平末端 D．为使目的基因准确插入，可将天然质粒上重复的限制酶识别位点删除 7．（24-25高二下·江苏南京·期中）下列相关实验操作正确的是（    ） A．植物组织培养中，对外植体使用70%的酒精消毒30min，再用次氯酸钠消毒30s B．在DNA的粗提取与鉴定实验中，粗提取的DNA中可能含有蛋白质 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 8．（24-25高二下·江苏无锡·期中）下列与DNA粗提取和鉴定有关的叙述，正确的是（    ） A．预冷的酒精可使DNA更容易析出 B．DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较低 C．鉴定粗提取的DNA时，对照组与实验组的区别是加不加二苯胺试剂 D．常温下DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 9．（24-25高二下·江苏无锡·期中）DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（    ） A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C．E.coli DNA连接酶只能连接平末端 D．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 10．（24-25高二下·江苏常州·期中）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（    ） A．取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA B．将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．DNA分子在凝胶中的迁移速率只与DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA结合，便于紫外灯下观察 二、多选题 11．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）CRISPR-Cas9基因编辑技术是一项可对DNA特定部位进行编辑的DNA操控技术。sgRNA起到向导的作用，与相应的DNA序列相结合，核酸酶Cas9可使DNA双链断裂，之后细胞再将断裂的DNA进行修复（如图）。下列说法不正确的是（    ） A．sgRNA识别过程中存在A-T、T-A、G-C、C-G的配对 B．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列通常相同或互补 C．sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 D．图中剪下一段DNA片段，可能导致染色体结构变异 12．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中的选材或操作的叙述，不正确的是（    ） A．可选择鸡或者兔的成熟红细胞作为实验材料来获取DNA B．利用DNA溶于酒精，而某些蛋白质不溶于酒精的特性，可以初步分离DNA与蛋白质 C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，可提高DNA的提取量 D．将DNA用2moL/L的NaCl溶解后与二苯胺试剂混合均匀，进行沸水浴后，待其冷却观察颜色反应 13．（24-25高二下·江苏徐州·期中）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶（切割位点相同或不同均可）。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述正确的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5′-G↓CGC-3′ GlaⅠ 5′-GC↓GC-3′ HhaⅠ 5′-GCG↓C-3′ HpaⅡ 5-′C↓CGG-3′ NarⅠ 5′-GG↓CGCC-3′ A．HinPII和HhaI为同裂酶，切出的黏性末端不同 B．HinPII和HpaII切割的产物连接后，其序列不能被GlaI切割 C．HinPII和NarI为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaI切割 D．某质粒仅含1个GlaI的识别位点，则该质粒能被NarI切割的概率为1/16 三、非选择题 14．（24-25高二下·江苏扬州·期中）生物体的生命活动都有共同的物质和结构基础。图1中a、b、c分别代表三种有机化合物，d、e分别代表生物大分子甲、乙、丙的单体。回答下列问题： (1)生物体内的糖类绝大多数以_____的形式存在；能与溶液中的重金属离子有效结合，可用于废水处理的糖是_____。 (2)与物质b相比，a在元素组成上的特点是_____；图1中的物质c是_____，它还具有_____功能。 (3)e通过_____（填化学反应名称）形成丙，该过程发生的场所是_____。 (4)下图表示生物实验中通过研磨提取甲的操作过程，回答下列问题： ①图中实验材料A可以是下面的_____。（填字母） a.花菜     b.香蕉     c.猪肝     d.猪血 ②若选用植物组织，研磨前加入的B一般为洗涤剂和_____，后者的作用是_____。得到滤液C后，再向滤液C中加入_____，缓慢搅拌得到甲。 ③实验中，将含有一定杂质的甲分别放入2mL下表所示的3种溶液中，经搅拌后过滤，获得相应的3种滤液，含甲最少的是滤液_____。 溶液种类 滤液 1 2mol/L的NaCl溶液 e 2 0．14mol/L的NaCl溶液 f 3 0．014mol/L的NaCl溶液 g 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．可以根据相同时间内DNA分子在凝胶中的迁移距离来判断其大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 2．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）精子载体法是以精子作为外源基因载体携带外源基因进入卵细胞，如图表示用该方法制备转基因鼠的基本流程。下列叙述错误的是（    ） A．精子载体法与显微注射法相比，对受精卵中核的影响更小 B．进行②过程前，精子需要在含有肝素或Ca2+载体的溶液中进行获能处理 C．③过程有一段时间是在透明带内进行分裂，这种受精卵的早期分裂称为孵化 D．在进行过程④之前要对代孕母鼠进行同期发情处理 3．（24-25高二下·江苏连云港·期中）下列有关基因工程所需酶及载体的描述错误的是（　　） A．限制酶切割1个位点，破坏两个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 B．E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都可以连接黏性末端和平末端 C．DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 D．使用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解 4．（24-25高二下·江苏扬州·期中）在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（    ） A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%~1.2%的琼脂糖溶液 B．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶 C．扩增得到的PCR产物与电泳缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 D．PCR体系中G-C碱基对含量将影响使DNA解链的所需温度 5．（24-25高二下·江苏南京·期中）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体才能获得后代。下列叙述正确的是 （    ） A．①②③技术得到的个体均含只含有两个体（父母）的基因 B．①②③技术都体现了动物细胞核具有全能性 C．①③技术中需取滋养层细胞进行性别鉴定，方可获得相应的奶牛或山羊 D．①②③技术中需将胚胎培养到原肠胚方可进行胚胎移植 6．（24-25高二下·江苏连云港·期中）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（　　） A．图示环节所需的温度比上一个环节的低 B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到5'端 C．TaqDNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成 D．经过1个循环后，获得的子代DNA的两条单链长短不同 7．（24-25高二下·江苏盐城·期中）蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1~4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（　　） A．若用PCR 技术获取蛛丝蛋白基因，则设计的引物应分别结合在1、4部位 B．若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，则共消耗引物30个 C．对PCR 扩增得到的上述DNA 进行电泳后，需加入核酸染料在紫外灯下进行观察 D．粗提取上述DNA时，为获得更多白色丝状物，应用玻璃棒充分搅拌 8．（24-25高二下·江苏扬州·期中）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，相关叙述正确的是（　　） A．DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 B．要尽量避免引物内部或引物之间存在碱基互补序列 C．PCR过程中使用的引物一般为单链RNA片段 D．引物中的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增 9．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（　　） A．构建该基因表达载体所用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶和运载体 B．将完成导入的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，含有重组质粒的细菌无法生长 D．可利用PCR技术检测人的生长激素基因是否在工程菌中转录和翻译 10．（24-25高二下·江苏连云港·期中）双脱氧终止法常用来对DNA进行测序。其原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。相关叙述错误的是（　　） A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以胞嘧啶结尾 C．测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′ D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端 11．（24-25高二下·江苏泰州·期中）斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。据此分析，下列说法正确的是（    ） A．p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同 B．放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置 C．p和q片段的杂交双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成 D．斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达 12．（24-25高二下·江苏连云港·期中）重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示（凸起处代表突变位点）。相关叙述错误的是（　　） A．过程①不能把两对引物同时加入一个扩增体系 B．突变引物FP2和突变引物RP1存在互补关系 C．过程②的产物都可以完成延伸过程 D．若过程④得到16个突变的基因则需要消耗15个通用引物RP2 13．（24-25高二下·江苏连云港·期中）GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建含GDNF基因的重组载体，并导入到大鼠中用于干细胞基因治疗的研究。相关叙述错误的是（　　） A．获取目的基因和切割载体时，应选用限制酶XhoI切割 B．过程②应选择约为1300bp的重组载体导入受体细胞 C．b为滋养层，将来发育成胎盘和胎膜 D．过程⑥转基因鼠产生的后代并不都是转基因鼠 14．（24-25高二下·江苏扬州·期中）基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述正确的是（　　）    A．若某基因是从人的细胞内提取RNA经逆转录形成的，则该基因中含有内含子序列 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C．利用DNA分子杂交技术可检测目的基因是否整合到植物受体细胞的染色体DNA上 D．为了让目的基因在乳腺细胞中特异性表达，需用绵羊的乳腺细胞作为受体细胞 15．（24-25高二下·江苏盐城·期中）下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（    ） A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ D．通过PCR扩增出目的基因是基因工程的核心工作 16．（24-25高二下·江苏连云港·期中）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，其中V5编码序列表达标签短肽V5。图乙表示重组质粒正确表达后用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白的结果。相关叙述正确的是（　　） A．若用PCR法确定J基因是否正确连接到质粒中，选择的引物组合只能为F2和R1 B．若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与J基因b链相应部分的序列相同 C．若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶对启动子的识别和结合 D．图乙条带1表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的 17．（24-25高二下·江苏盐城·期中）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”、“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验叙述，错误的是（    ） A．洋葱切碎后加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱放置，DNA存在于沉淀物中 B．可以利用洋葱为实验材料，也可以选择鸡血、猪肝等作为DNA粗提取的实验材料，提取方法可能稍有不同 C．琼脂糖凝胶电泳实验中使用的微量离心管、枪头等需进行高压蒸汽灭菌 D．电泳鉴定DNA时，先将PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再加入加样孔中 二、多选题 18．（24-25高二下·江苏连云港·期中）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　） A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．最终获得的种子一定含有目的基因 19．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下列关于PCR和电泳鉴定的说法，错误的是（    ） A．PCR反应体系中含有含Mg2+的扩增缓冲液、4种dNTP、两种引物、Taq酶和蒸馏水等 B．凝胶中的DNA分子通过溴化乙锭染色后可在紫外灯下被检测出来 C．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1cm为宜 D．DNA样品在电场中迁移的方向由正极向负极移动 20．（24-25高二下·江苏扬州·期中）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（　　） A．将含目的基因的重组质粒导入植物受体细胞可用农杆菌转化法 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸子链 C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞 D．基因表达载体的组成一般包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等 21．（24-25高二下·江苏扬州·期中）下图表示用荧光PCR法检测目的DNA的过程。在PCR反应体系中，加入足量与目的DNA部分序列互补的探针，探针包含一段脱氧核苷酸单链和发光基团，在完整的探针中发光基团不发光。在PCR过程中，当子链延伸到探针处时，TaqDNA聚合酶催化探针水解并释放发光基团，此时发光基团能发光。下列叙述正确的是（    ）    A．PCR的每一次循环包含变性、复性和延伸三步 B．探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同 C．TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化氢键的形成 D．经历相同的循环次数，起始目的DNA量越多荧光强度越强 22．（24-25高二下·江苏泰州·期中）为获得Gata3-GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Cata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析错误的是（    ） A．据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2 B．分析图乙可知，4号小鼠为Gata3-GFP融合基因纯合小鼠 C．图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录 D．若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段：循环4次后，产物中等长片段所占的比例为3/8 23．（24-25高二下·江苏连云港·期中）有关PCR技术中引物的设计原则及设计目的的说法正确的是（　　） A．引物长度过短，特异性太差 B．引物GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增 C．常在引物3’端进行修饰，包括加酶切位点、加标记荧光、引入点突变等 D．退火温度应足够低以保证引物与目的序列有效退火，同时还要足够高以减少非特异性结合 24．（24-25高二下·江苏连云港·期中）琼脂糖凝胶电泳常用来对PCR的产物进行鉴定，相关叙述正确的是（　　） A．开展电泳鉴定实验时，可采用凝胶成像仪或紫外投射仪观察和记录电泳结果 B．电泳缓冲液能增加电导率，维持电泳过程中合适的pH C．凝胶载样缓冲液中的指示剂能显示电泳的进程，以便适时终止电泳 D．电泳显示的大小符合预期的DNA就是目标DNA 25．（24-25高二下·江苏泰州·期中）下列关于PCR和琼脂糖凝胶电泳实验的叙述，错误的是（　　） A．琼脂糖加热熔化待稍冷却后，加入适量核酸染料混匀 B．PCR产物和凝胶载样缓冲液混合后缓慢注入所有加样孔 C．要待指示剂的前沿越过凝胶边缘时再停止电泳 D．PCR反应中温度循环是为了DNA 聚合酶催化不同的反应 26．（24-25高二下·江苏扬州·期中）如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述错误的有（　　） A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活 B．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化 C．过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 D．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K 27．（24-25高二下·江苏南通·期中）离心技术是常用的分离、纯化或澄清的方法。相关技术叙述正确的是（    ） A．动物细胞核移植技术中可以采用梯度离心去核 B．体外受精时需将新鲜或者冷冻的精液离心处理后对其获能处理 C．DNA粗提取实验中将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，离心后取沉淀 D．PCR中将所有的组成成分加入微量离心管中离心，使反应液集中在管的底部 三、实验题 28．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢导致可溶性糖含量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、图2所示。    (1)强启动子能被_________识别并结合，驱动基因持续转录。在培育转基因甜玉米中T-DNA的作用是_________。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是_________。 (2)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养筛选，获得玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对四个株系的G蛋白表达量进行测定，发现a4株系的表达量与野生型相近，原因可能是_________。 (3)下图示淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸（RNA剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制提出两种假说。 假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切； 假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。    ①为验证上述假说，分别在受精卵发育后3天的胚细胞中从实验组和对照组提取总RNA，逆转录形成cDNA．若假说1成立，使用图示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为_________（目的条带的有无）。 ②若要证明假说2，需选择图示引物_________进行PCR。 ③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因是_________（至少写出两点）。 29．（24-25高二下·江苏扬州·期中）肿瘤的发生、发展和转移都需要新生血管的支持，肿瘤抑素是由Tum基因编码的蛋白质，具有强效抑制肿瘤微血管密度，缩小肿瘤体积的作用。研究人员构建了转Turn基因的人神经胶质瘤细胞株U251，探究基因治疗神经胶质瘤的可行性。 (1)研究人员利用上图中的材料完成基因表达载体的构建。 ①图1载体上启动子是______识别和结合的位点，与起始密码子相比启动子特有的组成分子有______。 ②图1载体上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能______；有多个限制酶切位点，便于______。 ③构建重组载体前，利用PCR技术扩增Tum基因，应选用的引物组合为______，其中与Tum基因上游结合的引物设计的依据是______以及限制酶______的识别序列。与细胞内DNA复制相比，PCR技术通常不选择RNA片段作为引物，解释合理的有______。 A．RNA稳定性不高，体外易降解 B．RNA的3'端不能聚合脱氧核苷酸 C． 细胞内有切除RNA引物的酶 D．RNA引物的成本较高 (2)对目的基因进行PCR扩增后，需要采用______方法对目的基因产物进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率一般与______（答出两个）有关。凝胶中的DNA分子经过染色后，可以被______检测出。 (3)血管内皮细胞HRV可作为抑制血管生成效果的指示细胞，为研究Tum基因的抗神经胶质瘤的效果。研究人员设计了三组实验：组1为未转基因的U251，组2为转入空白载体的U251，组3为转Tum基因的U251，相关检测结果如图3、图4。 三组实验中属于对照组的是______，综合两图分析，说明U251细胞合成的肿瘤抑素通过促进HRV细胞凋亡发挥作用，图4中组2实验数据能否支持导入空白载体具有与组3相似作用的结论？______（填“能”或者“不能”） (4)为探究该体系在体内抗肿瘤的效果，还需将组3U251细胞分别接种于裸鼠腹部皮下，一定时间后检测______和______以证明转Tum基因治疗神经胶质瘤存在可行性。 30．（24-25高二下·江苏扬州·期中）甘蔗是蔗糖的主要来源，甘蔗R具有高产高糖的优良特性但耐寒性差；甘蔗G是耐寒品种。科研人员利用植物体细胞杂交技术以期快速培育出耐寒性更强且性状更优良的甘蔗新品种。 (1)如图1，利用________酶去除细胞壁获得原生质体。分别加入IOA和R-6G钝化后诱导原生质体融合。仅有杂种原生质体可持续分裂形成再生细胞团，原因是_______。脱分化得到愈伤组织后，培养基中_______是影响该过程中植物细胞发育方向的关键因素。    (2)科研人员发现制备原生质体及原生质体融合后均会不同程度发生氧化褐变、细胞壁再生困难的现象。为解决这一问题，科研人员利用甘蔗杂种原生质体进行以下实验。    ①由图2可知，甘蔗杂种原生质体再生过程中最好使用_______。 ②科研人员推测激素通过促进果胶合成关键酶基因GAUT表达，从而促进细胞壁再生，请将下表补充完整，为该推测提供证据（“激素使用”栏选填下列字母）。 组别 激素使用 实验处理 检测指标 1 _______ 原生质体中转入过量表达GAUT基因载体 _______ 2 a 原生质体中转入抑制GAUT基因表达载体 3 _______ 不转入基因的原生质体 a.不使用激素 b.使用激素组合1 c.使用激素组合2 d.原生质体中2，4-D和6-BA的含量 ③上表实验是否能够达成完整验证推测的目的？________，请简述理由_______。 (3)为研究激素对GAUT基因表达量的变化，采用荧光定量PCR法检测实验组和对照组GAUT基因的转录水平。采集样本、提取总RNA，经________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，实验组Ct值为14，而对照组Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，实验组样品的目的产物大约是对照组的________倍。 31．（24-25高二下·江苏南通·期中）实时荧光定量逆转录PCR（RT—qPCR）可用来检测基因的转录水平。TaqMan探针是该技术中一种常用探针，当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步，如图1.请回答下列问题。 (1)RT—qPCR试剂盒中除了含TaqMan探针、dNTP、Mg²⁺、缓冲剂外还应含有_______。TaqMan探针______端连接荧光基团（R）。 (2)采集样本、提取总RNA，经_______形成cDNA作为模板。PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，Ct值越_______，基因的转录水平越高。（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。 (3)miRNA是基因表达的重要调节因子，其长度通常为19~24个核苷酸，这与传统PCR引物的长度相当，因此常规RT—qPCR难以直接对miRNA进行检测。研究人员设计出加尾法和茎环法来检测miRNA的转录水平，其主要原理如图2、3. ①据图2分析，加尾酶可以将多个腺嘌呤核苷酸加在miRNA的3'端，在此过程中加尾酶催化______键的形成。为防止逆转录引物左右移动，可在引物的_______端加上_______。 ②据图3分析，茎环RT引物设计成发夹结构的优点有________。 A．减少了与其他非目标RNA的结合机会 B．为逆转录酶提供合适的逆转录起始位点 C．有助于抵抗限制酶的剪切作用 D．有助于抵抗其他核酸分子的竞争结合 ③为比较两种方法的灵敏度大小，同时比较小鼠体内三种RNA（let—7a、miR—21、miR—193a）的含量，研究人员对从小鼠脑中提取的总RNA分别用加尾法和茎环法测定了三种miRNA的Ct值，结果如下表。 　 加尾法 茎环法 let—7a 26.69 19.87 miR—21 28.92 23.36 miR—193a 35.95 31.13 根据实验结果可以得出的结论有_______（2分）。 32．（24-25高二下·江苏扬州·期中）人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，现可以用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）。下图甲为获取的含有目的基因（HSA基因）的DNA片段，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题： (1)三种限制酶中能产生相同黏性末端的是__________；为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用__________酶，所得重组质粒__________（填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。 (2)获取ISA基因还可以通过下列方式：首先采集人的血液，从中提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增ISA基因。与基因组文库获取的目的基因相比，利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其基因结构的特点是不含__________。 (3)生物技术的发展和应用使利用动物生产人的血清蛋白成为可能，下图是上海某研究所培育生产出血清蛋白奶牛的流程，请据图回答。 ①为了获得大量早期胚胎，可对囊胚进行分割，此时要注意将__________均等分割。胚胎移植的实质是__________。 ②在进行性别鉴定时，需要取囊胚的__________细胞做DNA分析。据图分析，小牛1、2、3的性别是__________性。 33．（24-25高二下·江苏扬州·期中）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。 (1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增时预变性94℃5min的目的：_______，复性的目的是_______。引物的本质是_______，其作用是_______。 (2)图甲所示Y基因序列为转录的________（填“模板链”或“非模板链”）。已知EcoRI识别序列为5′-GAATTC-3′，BamHI识别序列为5′-GGATCC-3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应该为5′-_______-3′（包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基）。 (3)退火温度________就会导致非特异性产物增加。将初步构建的Y-GFP基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系________能成功表达出Y-GFP融合蛋白。 (4)为探究Y蛋白能否与S基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y蛋白与DNA序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y蛋白________（填“能”或“不能”）与S基因启动子序列结合，相比于a条带，b条带放射性低的原因是_________。 (5)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是________。 34．（24-25高二下·江苏扬州·期中）非洲猪瘟病毒（ASFV）可感染家猪及野猪，病死率高达100%。抗原蛋白的选择和单克隆抗体的制备是相关疫苗研发的基础。CP312R是ASFV中最具免疫原性的蛋白之一。我国学者利用基因工程和细胞融合技术，成功制备CP312R蛋白和相应单克隆抗体。请回答： (1)获取目的基因，设计引物与扩增目的基因。根据目的基因序列，设计和合成引物。据下表分析，引物1、引物2上分别添加了_______限制酶识别序列。 限制酶及识别序列 引物名称及序列（5′→3′） EcoRI 5′GAATTC3′ 引物1： CTAGTCTAGAATGACTACCCACATCTTCCACGCTG 引物2： AAACTGCAGTTAGTGGTGATGGTGCGATTTGTTGGTG PstI 5′CTGCAG3′ Xbal 5′TCTAGA3′ (2)重组质粒的构建与鉴定。 ①经两种限制酶切割后的目的基因和质粒在DNA连接酶的作用下通过________键连接起来，能正确表示这个过程的图像是________（填写下图中的序号）。 ②重组质粒经双酶切、电泳分离后，若电泳结果出现________个条带表明重组质粒构建成功。电泳时，琼脂糖凝胶作为介质起到________的作用，________起到电泳指示剂的作用。 ③若电泳时指示剂过早迁移出凝胶，下列调整措施合理有哪些？________。 A．调整电泳的时间 B．调整指示剂上样量 C．调整加样孔朝向正极 D．调整电泳仪电压和温度E.调整凝胶中琼脂糖的浓度 (3)CP312R蛋白与单克隆抗体的制备。 利用基因工程制备的CP312R蛋白作为________，刺激小鼠使其发生免疫反应；诱导从小鼠脾脏分离的________与骨髓瘤细胞融合；融合得到的杂交瘤细胞必需经过________和________，才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞。与体外培养获得单克隆抗体相比，从小鼠腹水中提取单抗的优点是________。 35．（24-25高二下·江苏无锡·期中）新霉素磷酸转移酶基因（neo）是转基因动物中常用的标记基因，但neo存在于动物细胞中会影响动物体生长和发育。为实现在敲除目的基因后，将neo基因从基因组中敲除，科研人员构建了Cre-loxP重组系统。图1为loxP序列的结构示意图，图2为Cre-loxP重组系统的作用机理示意图，图3为通用型基因打靶载体的构建及Flox鼠建立过程示意图。请回答下列问题： (1)loxP位点是一段长为34bp的序列，具有方向性，结合图1，推测其方向性由区段_____决定。Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段，并同时催化b区段箭头处___________键水解。 (2)据图2分析，若同一个DNA分子上具有2个同向的loxP位点，经Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子，从作用结果分析，Cre酶同时具有类似___________酶的作用。 (3)图3中，过程①可在限制酶和DNA连接酶等作用下，将同源臂1和同源臂2插入pAT质粒中的多克隆位点序列MCS中。作为通用型载体，pAT质粒的MCS中含有多个在基因组（待敲除基因所在DNA）中出现频率较低的酶切位点，其意义是____________。 (4)两段拥有相同/相似碱基序列（如同源臂）的DNA片段在重组酶的催化下，可发生同源重组，同源臂间的DNA序列可发生交换。为敲除特定基因，以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物，经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2，PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行的原因是__________；为将同源臂定向插入pAT的MCS中，设计引物时需要在引物的___________端添加相应的限制酶切位点。 (5)过程②为重组pAT质粒转染小鼠受精卵的过程，该过程通常采用___________法。过程③需将转染后的受精卵置于适宜培养液中，培养24h后，能存活的胚胎为成功转染并整合到染色体DNA上的胚胎，后续通过___________等技术获得Flox小鼠。 (6)Flox小鼠中存在的neo基因，其两侧的2个LoxP位点的方向是___________的，可利用Cre酶将其敲除，获得不含neo基因的基因敲除鼠。为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除，可在Cre基因的cDNA一段添加________________实现。 36．（24-25高二下·江苏无锡·期中）某植物蛋白酶抑制剂Ⅱ基因，转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR等技术扩增该基因，具体原理如下图所示，其中①∼③表示有关过程，Ⅰ∼Ⅲ表示有关物质。请回答： (1)过程反应体系中，生成杂合链物质Ⅰ需要加入____________种引物，一般来说所用的引物越短，引物特异性越__________（填“高”或“低”）；同时还需加入____________酶。 (2)利用DNA末端转移酶催化过程②，使DNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列 [AAA（A）n]，其目的是___________________， 进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ；据此推测③过程除了引物1的另一种引物富含_______碱基。 (3)在物质Ⅲ的两端通常还需要增加____________序列，以便与相应的载体重组，再利用_______处理大肠杆菌等，以利于将重组质粒导入细胞，构建c DNA文库。 (4)微滴式数字PCR（ddPCR）是一种检测RNA病毒等病原体的手段，正确的 A．RNA病毒样本在进行ddPCR检测时，需要先进行逆转录处理 B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq酶 C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸 D．相对于传统手段，ddPCR更加灵敏，更容易检测出微量病毒 37．（24-25高二下·江苏扬州·期中）番茄在低温下运输、储存的过程中，容易出现冻伤，影响番茄的品质。科学家利用基因工程技术将抗冻基因AFPs转入番茄植株，培育抗冻番茄。操作过程如图所示，如表为三种限制酶及其识别序列。回答下列问题： 限制酶 识别序列（5'→3'） Bam HⅠ G↓GATCC Bgl Ⅱ A↓GATCT EcoR Ⅰ G↓AATTC (1)利用PCR扩增抗冻基因AFPs时，需要设计引物，引物的作用是_____，设计的引物序列不能过短，原因是_____。 (2)培育抗冻番茄时，在构建基因表达载体的过程中，为了提高重组DNA的形成效率，需要考虑的因素有_____。 A．载体与目的基因重组的时间 B．DNA聚合酶的活性 C．目的基因的质量与浓度 D．载体的质量与浓度 (3)经限制酶酶切后，目的基因和质粒存在_____种连接情况，为确定是哪种连接情况，可用限制酶_____对重组质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小，电泳结果出现长度为_____kb的片段的重组质粒即为所需的基因表达载体。由于载体上的启动子往往具有物种特异性，目的基因上游的启动子应选择_____启动子。 (4)步骤②中通常利用_____法将抗冻基因AFPs导入番茄愈伤组织。在培养基中添加_____以便筛选出含抗冻基因的番茄愈伤组织。将番茄愈伤组织转移到新的培养基上，主要通过调节培养基中的_____诱导形成再生植株。若要检测番茄是否产生了抗冻蛋白，一般采用_____技术。 38．（24-25高二下·江苏泰州·期中）胆固醇O-酰基转移酶1（SOAT1）与肝癌的发生密切相关，可作为潜在的肝癌生物标志物。科研人员从肝癌细胞 Huh-7 中获取 SOAT 1基因，经原核表达、蛋白质纯化后免疫小鼠制备单克隆抗体。请结合研究过程回答下列问题： (1)从肝癌细胞Huh-7中提取____，通过____获得 SOAT 1的cDNA． (2)根据SOAT 1的编码序列设计的两个引物如下图1.引物F加入的 EcoR I酶切位点位于____端，引物R上添加的 Xho I 酶识别的回文序列的6个碱基是____。 (3)利用上述引物对SOAT 1基因进行PCR扩增，该实验设计的扩增程序中热循环次数为30次，一般PCR反应中设计的热循环次数不超过40次，原因是____。PCR反应结束后，将产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，对 PCR 产物进行____回收。 (4)将回收后的 PCR 产物和载体 pET -32a分别用 EcoR I 和 Xho I 双酶切，加入DNA连接酶后在冰面上过夜。在冰面上操作的目的是____。在将重组质粒转化至大肠杆菌前用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于____的生理状态，以提高转化效率。 (5)将测序正确的重组载体诱导表达并进行电泳，实验部分结果见下图2，SOAT 1重组蛋白的相对分子质量为50kD左右，下图中基本符合要求的条带包括____。 39．（24-25高二下·江苏南京·期中）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题： (1)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物_____（填序号）对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的_____端添加_____（“EcoRⅠ”或“BamHⅠ”或“MunⅠ”）识别序列。 (2)根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶_____切割Ti质粒，并通过_____酶进行连接。 (3)用_____处理农杆菌方能将重组质粒导入。在培养基中添加_____来筛选成功导入质粒的农杆菌。将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示。该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因，PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是_____（填字母）。 A．变性温度太低  B．复性温度太低    C．复性温度太高    D．引物特异性弱 (4)已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，将其放置在_____环境中检测拟南芥耐寒模型是否建立成功。成功转基因的拟南芥，通过自交产生的后代，_____（填“能”或“不能”）稳定遗传耐寒性状。 40．（24-25高二下·江苏淮安·期中）同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌tacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题： (1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入__________________，所加dNTP的作用有_________________________________________________________。 (2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需在引物______端添加限制酶________________（填种类）的识别序列；过程②需要限制酶和____________酶。 (3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为__________细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加____________。 (4)下图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由_______________________，过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5′端分别添加_________________基因两端的同源序列。 (5)过程⑦中，在含有四环素和___________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加_____________________。 41．（24-25高二下·江苏扬州·期中）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶（Luc）基因（无启动子）的载体（如图2）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图c中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光。请回答下列问题。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶_________切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1的碱基序列为_________。 A．5'-AACTAT-3'  B．5'-GAATTCAACTAT-3' C．5'-TTGATA-3'  D．5'-AAGCTTAACTAT-3' (2)通过PCR技术可获取vtg基因，PCR实验后应进行的步骤依次是_________。（排序） ①筛选和鉴定受体细胞 ②DNA连接酶拼接DNA片段 ③限制性内切核酸酶切割 ④PCR产物的凝胶电泳鉴定 ⑤将目的基因导入受体细胞 (3)为了获得更多的目的基因，可将“vtg-Luc基因重组载体”先导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含_________的培养基中；将基因表达载体导入斑马鱼受体细胞的最佳方式是_________。若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加_________进行检测。 (4)为鉴定筛选出的受体细胞中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如下图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是_________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一受体细胞的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_________。 (5)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子中的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到E蛋白在启动子上的结合位点，请完成设计思路： ①用限制酶将_________切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的_________游，形成多种重组载体。 ②将每种重组载体分别导入斑马鱼的_________中，待发育成熟后添加荧光素等进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中_________（填“含有”或“不含有”）能与E蛋白结合的序列。 ③将该片段继续切割成多个长度，重复上述操作，进一步缩小该特定序列的位点区域。 42．（24-25高二下·江苏南京·期中）抗凝血酶Ⅲ是一种药用蛋白，对预防和治疗静脉血栓、心肌梗死、脑血管病变具有重要作用。为了提高抗凝血酶Ⅲ的产量，科研人员设计利用崂山奶山羊乳腺生物反应器制备抗凝血酶Ⅲ，并获得了成功。制作崂山奶山羊乳腺生物反应器的流程如图1所示。回答下列问题： (1)获取抗凝血酶Ⅲ基因后，需通过PCR技术对该基因进行扩增，该技术的原理主要是_________，前提是______________。PCR技术的过程一般包括_______、________、子链延伸三个阶段，需要在反应体系中加入________________（写出两种）等物质。 (2)获取重组质粒后，将重组质粒导入受精卵。从崂山奶山羊A的卵巢中获取卵子和从崂山奶山羊B的睾丸中获取精子，其中精子要进行________处理才具备受精的能力。图1中步骤⑤是指_________，还需要提前对崂山奶山羊A和代孕奶山羊C进行___________处理，该项技术的优势是____________。 (3)科研人员通过实验获得三只转基因奶山羊D（甲、乙、丙）。科研人员对甲、乙、丙三只奶山羊和非转基因奶山羊进行了基因检测。检测结果显示非转基因奶山羊体内无抗凝血酶Ⅲ基因，甲、乙、丙三只奶山羊体内均含有抗凝血酶Ⅲ基因。进一步检测抗凝血酶Ⅲ的表达情况，结果如图2所示。 注：图中黑色条带为抗原—抗体杂交带，表示相应蛋白质的存在。M泳道条带为相应标准蛋白所在位置。 根据以上信息分析，该检测结果说明___________。 43．（24-25高二下·江苏无锡·期中）黑水虻是重要的资源昆虫，体内H基因编码的抗菌肽HI-3具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员利用酵母菌生产抗菌肽HI-3，并避免基因污染。请回答下列问题： (1)H基因编码链的编码区序列是5′—CTCGAGATGCTGCAG……GGATCCTCTAGA—3′，扩增H基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是________（方向为5′→3′，写出5′端8个碱基序列）。获得H基因产物后需要进行________，将符合要求的条带切割回收以便提取纯化并进行测序。 (2)由于抗菌肽HI-3会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA中插入P和S基因，使质粒上H基因的表达受红光控制。红光调控H基因表达的原理如图1所示。 P和S基因表达应为_______（填“组成型表达”或“红光诱导型表达”）。红光调控H基因表达的原理是S基因指导合成的S蛋白直接与启动子Jub结合，P基因表达的P蛋白在红光调控下________，启动H基因的表达过程。启动子是________酶识别结合的位点。 (3)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E蛋白的基因（E1、E2），使F基因的表达受到蓝光控制如图3。 图3中E2基因持续性表达少量的E蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力，E1基因的作用是，蓝光照射后，_______。 (4)制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T和L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。 若图中①选用的启动子为Jub，②处选用的启动子为CYC，则③④处结合的阻遏蛋白分别为_______。 (5)请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽HI-3各阶段需控制的光照条件是Ⅰ菌种培养阶段________；Ⅱ菌种发酵阶段________；Ⅲ产物分离阶段________；Ⅳ安全处理阶段红光、蓝光同时照射。 44．（24-25高二下·江苏南通·期中）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达。研究人员通过RT—PCR获得Y基因并与改造后的Ti质粒上的绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功表达的Y—GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究，请回答下列问题。 (1)逆转录得到的Y基因中_______（填“包括”或“不包括”）启动子和终止子序列。 (2)为将扩增后的产物定向插入载体，应该选择_______、_______酶切割Ti质粒。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y—GFP融合蛋白，PCR扩增Y基因时应通过设计引物去除_______对应的序列。因此扩增Y基因的上下游引物应分别选择_______、_______。 a5'—GAATTCATGCTGCACACCTGC—3'    b5'—CAATTGATGCTGCACACCTGC—3' c5'—GGATCCATGTTCTGTGGTGAT—3'    d5'—GGATCCCTAATGTTCTGTGGT—3' e5'—GATCATGTTCTGTGGTGAT—3' (3)将初步构建的Y—GFP基因表达载体转入大豆细胞后，对经_______（抗生素）筛选得到的三个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图2所示。其中细胞系_______最可能成功表达出Y—GFP融合蛋白。    (4)为探究Y—GFP蛋白能否与S基因启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的放射性探针进行相关实验，实验结果如图3所示。已知Y—GFP蛋白与探针结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带，丁组除了添加未标记探针外还应添加_______。据图分析，Y—GFP蛋白_______（填“能”或“不能”）与S基因启动子序列结合，相比于a条带，b条带放射性低的原因是_______。 45．（24-25高二下·江苏南通·期中）鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员研制人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如下图1。图1中引物已按照退火时与模板链结合位置画出，转录时a链为模板链。 限制酶 识别序列和 切割位点 Sca I 5'AGT↓ACT3' Xba I 5'A↓CTAGA3' Mbo I 5'GT↓AC3' (1)启动子的基本单位是______，复制原点中通常含A/T碱基对多，原因是______。 (2)pBCI载体中P1、P2两个启动子转录下游基因时模板链是否相同？______。 (3)已知融合基因的a链的序列为5’-CGCTACTCATTGCTGCG…CGGATGAGCGCGTAGAT-3’。利用PCR技术扩增融合基因时,某同学设计了如下的4种引物，引物1、2对应的序列分别为______、______。 A．5'-ACTAGACGCTACTCATTGCTGCG-3' B．5'-AGTACTATCTACGCGCTCATCCG-3' C．5'-AGTACTTAGATGCGCGAGTAGGC-3' D．5'-ACTAGAGCGATGAGTAACGACGC-3' (4)图1步骤②常用的物理转化方法为______。加入______后初步筛选出发______荧光的受精卵用于后续操作。 (5)图2为PCR扩增融合基因时的参数设定。步骤甲的作用______，步骤戊应设定跳转到步骤______。如果开始的融合基因只有1个，第3次循环至少需要引物______对。                                                           46．（24-25高二下·江苏常州·期中）研究表明，植物的WRKY13基因与缺铁胁迫耐受有关。为研究该基因的作用机制，研究者用拟南芥、大肠杆菌等材料进行了相关实验，部分流程如图所示。请回答下列问题： (1)扩增GUS时，选用的引物应是________；为保证WRKY13和GUS能融合，引物F2和引物R1的________（从“3’端”或“5’端”中选填）添加的部分序列必须能够________。 (2)将WRKY13-GUS融合基因片段与质粒连接时，通常采用________酶，为确保目的基因的正向连接，设计引物F1的依据有________。 (3)转化时，重组质粒需导入大肠杆菌中，目的是________，此过程常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于________。然后用含壮观霉素或庆大霉素且含X-Gluc的培养基筛选大肠杆菌，挑选________色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 (4)将上述重组质粒用农杆菌导入拟南芥花序中，可用含________的培养基初步获得阳性苗，培育后的植株自交后所得子代中，WRKY13基因纯合的植株占比为________。 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏宿迁·期中）下列有关生物技术的叙述，错误的是（    ） A．在动物细胞培养液中添加一定量的抗生素以防止杂菌污染 B．进行单个植物细胞培养必须先用酶水解细胞壁以获得原生质体 C．动物细胞融合与植物体细胞杂交都可用电融合法或PEG融合法诱导融合 D．可利用转基因“工程菌”修复被污染的土壤 二、非选择题 2．（24-25高二下·江苏扬州·期中）果胶甲酯酶具有催化水解果胶的作用，为获得高产、高纯度的胞外果胶甲酯酶，下图表示某科研小组设计的黑曲霉工程菌的构建和发酵流程图。回答下列问题：    (1)科研小组从基因数据库中获得果胶甲酯酶基因序列后，通过设计引物扩增出大量果胶甲酯酶基因片段，在扩增过程中提供4种dNTP的作用是_______。在构建重组表达载体过程中，果胶甲酯酶基因应插入到质粒的_______之间才能进行表达，此过程缓冲液中加入Mg2+的目的是_______ 。 (2)可提取农杆菌的DNA进行PCR后再通过_______判断重组表达载体是否导入到农杆菌。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉_______判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶甲酯酶相似，造成提取产物纯度不高，所以科研小组通过一定的方法将这种蛋白质的基因_______，实现获得高纯度的果胶甲酯酶。 (3)发酵过程需保持_______（至少写两点）、适宜pH、充足的氧气等条件，保证发酵过程不受杂菌污染和菌体能正常生长。发酵结束后将发酵液进行离心处理，取________进行果胶甲酯酶的分离和纯化工作。在分离过程中使用一定浓度的硫酸铵处理发酵液后获得有活性的果胶甲酯酶沉淀物，原因是：在一定浓度的硫酸铵条件下_______、_______。 3．（24-25高二下·江苏苏州·期中）草莓果实采后难以保鲜是生产实践的难题。乙烯在调控果实成熟基因的协同表达中起着非常重要的作用。研究人员通过反义RNA技术抑制乙烯受体基因Ersl的表达，达到延长储藏期的效果。CTAB法提取草莓叶片DNA的部分实验步骤如图1。请回答下列问题：    (1)CTAB提取液中含有CTAB、EDTA、NaCl等物质，CTAB能破坏膜结构，使蛋白质变性，使核酸分离出来；EDTA是一种DNA酶抑制剂，加入其的目的是___________。氯仿、异戊醇密度均大于水且不溶于水，DNA不溶于氯仿、异戊醇，而蛋白质等杂质可溶，实验中加入氯仿、异戊醇离心后，应取①是___________(填“上清液”或“中层溶液”或“沉淀”)，该步骤重复1—2次，继续进行下面两个步骤就可得到DNA粗制品。 (2)通过上述方法获得DNA后，DNA经进一步提纯后，通过PCR技术扩增Ersl。在PCR体系中，加入的dNTP可提供___________，耐高温的DNA聚合酶需要___________激活，添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性___________(填“降低”或“升高”)。 (3)为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ersl时，需在引物的___________端添加限制酶Xho I的识别序列。经Xho I酶切后的载体和Ersl进行连接(如图2)，连接产物经筛选得到的载体主要有___________三种类型。为鉴定这些连接方式，选择Hpa I酶和BamH I酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析。若电泳结果出现长度为___________的片段，该重组质粒即为所需的基因表达载体。    (4)将筛选得到的重组质粒与用___________处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，在含___________的培养基中培养，筛选所需的植物细胞经过一系列处理，最终得到的转基因植株的乙烯受体的合成受阻，其原因___________。 4．（24-25高二下·江苏徐州·期中）图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒的结构示意图，图中EcoRI、Smal、BamHI和HindIII为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题： (1)人工构建基因表达载体时，该载体除了含特定限制酶切割位点外，还要有__________（答出两点）等，切割质粒和目的基因通常使用两种限制酶，是为了防止_______________。 (2)采用PCR技术对图1中胰岛素基因进行扩增时，除了向反应体系中加入相应模板和引物外，还需要加入_________（至少答出2点），DNA新链的合成方向是_________，扩增过程中应该选择引物__________，其原因是_________。 (3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子，其作用是______________，若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素等分泌蛋白，与大肠杆菌相比，酵母菌的优势有__________。若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功表达，常用______________技术。 (4)为筛选出含有重组质粒的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“＋”代表生长，“-”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是____________。         菌落类型平板类型 A B C 无抗生素 + + + 氨苄青霉素 + + - 四环素 + - - 氨苄青霉素＋四环素 + - - 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏扬州·期中）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的是（    ） A．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构 B．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 C．EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质 D．蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因 2．（24-25高二下·江苏南京·期中）戴米斯·哈萨比斯和约翰·江珀开发了预测蛋白质结构AI工具AlphaFold，该工具可通过输入的氨基酸序列信息生成蛋白质空间结构模型。下列说法正确的是 （    ） A．蛋白质工程中，难度最大的是设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列 B．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质 C．AI技术有助于科学家探索通过功能设计蛋白质结构，再逆向推导氨基酸序列 D．蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径与基因工程的途径相同 3．（24-25高二下·江苏苏州·期中）利用蛋白质工程对干扰素进行改造，可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是（   ） A．蛋白质工程与中心法则的信息流动方向是一致的 B．可用PCR技术检测改造后的干扰素基因是否转录出了相应的mRNA C．经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传 D．蛋白质工程对干扰素的改造遇到的最大难题是按人类需求对高级结构进行设计 二、多选题 4．（24-25高二下·江苏泰州·期中）天然胰岛素存在起效慢、半衰期短等问题，科研人员利用以下技术途径研发出了速效、长效胰岛素。下列相关叙述正确的是（　　） A．蛋白质工程可改造现有蛋白或制造新蛋白质 B．步骤A表示预期蛋白质的功能、B表示应有的氨基酸序列 C．当下市场上的人类胰岛素药物主要由该技术将猪胰岛素改造而来 D．通过该技术有效抑制胰岛素的聚合可研发出新型速效胰岛素 5．（24-25高二下·江苏扬州·期中）大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的有（　　） A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组 C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 6．（24-25高二下·江苏连云港·期中）微生物体内积累的聚羟基脂肪酸（PHA）是一种可降解的生物塑料。嗜盐菌是在高盐环境中具备正常生长能力的极端微生物，利用其生产PHA可以降低灭菌的成本。科研人员利用一株好氧性嗜盐单胞菌H，并以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液）或餐厨垃圾为原料，发酵生产PHA等新型可降解材料，工艺流程如图1： 图1 (1)发酵过程中使用马达搅拌器的优点有_______。发酵罐中的糖蜜及餐厨垃圾等能为嗜盐单胞菌H提供_______等基本物质。 (2)图中采用分批发酵方式，在发酵过程中嗜盐单胞菌H在整个培养过程中主要经历了延滞期、_______、_______和衰亡期。其中_______期的菌可以作为生产的“种子”。 (3)为筛选出除嗜盐单胞菌H以外的其他高产PHA的菌株，科研人员将分离获得的6种嗜盐菌菌株接种在不同NaCl浓度条件下，一段时间后检测PHA含量，结果如图2，将挑选出的菌株在不同pH的液体培养基中培养，一段时间后检测PHA百分比和细胞干重，结果如图3：      ①据图2、3分析，生产时应选择菌株_______在_______的条件下进行培养，理由是_______。 ②该嗜盐菌可在非无菌环境下的发酵，理由是_______。 ③野生型嗜盐菌中有部分基因会影响PHA的合成，可采用_______技术改造野生型嗜盐菌，提高PHA的产量。 7．（24-25高二下·江苏苏州·期中）t-PA是人血液中天然纤溶系统激活剂，临床上常作为治疗急性心梗等血栓性疾病的特效药，但治疗中大剂量注射的天然t-PA会诱发颅内出血。为降低出血性副作用，研究人员用PCR技术将t-PA第84位的氨基酸由天然的半胱氨酸改为丝氨酸，其过程如图1。请回答下列问题： 图1 (1)天然t-PA第84位的半胱氨酸相对应的基因模板链(图1中①链)上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。在获取t-PA突变改良基因过程中需要以下几种引物： A．引物Ⅰ： B．引物Ⅱ： C．引物Ⅲ： D．大引物的③链 E．大引物的④链 引物Ⅰ中下划线上？代表的碱基是___________，第一次PCR操作中使用的引物___________(选填“A”、“B”、“C”、“D”、“E”)可获得大引物。第二次PCR操作中使用的引物是___________(选填“A”、“B”、“C”、“D”、“E”)。 (2)据图1，为使t-PA改良基因与质粒pCLY11高效连接，需用限制酶___________处理目的基因和质粒。 (3)将重组质粒导入大肠杆菌并涂布在含有___________的固体培养基上，对培养得到的菌落进行筛选，挑取___________色的菌落大量培养后提取大肠杆菌的DNA进行PCR扩增，结果如图2： ①PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因含___________而带负电荷，加样孔端应靠近电泳槽的___________(填“正极”或“负极”)，即图3中的___________(填“甲”或“乙”)端。 ②改良的t-PA基因约有1600个碱基。由图2可知，泳道1中的条带是长度约为1600个碱基的PCR产物，该PCR产物___________(填“是”或“不是”或“不一定是”)改良的t-PA基因，理由是___________，因此还需测序验证。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 基因工程 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 C B A C D D B A D A 题号 11 12 13 答案 ABC ABC ABD 14．(1) 多糖 几丁质 (2) 氧的含量远远低于糖类，而氢的含量更高 胆固醇 构成动物细胞膜的重要成分 (3) 脱水缩合 核糖体 (4) abc 食盐 溶解DNA 95%的冷酒精 f 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A C B D C B B B C B 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 B C B C C D A ABC ACD ACD 题号 21 22 23 24 25 26 27 答案 ABD BD AD ABC BCD ABC ABD 28．(1) RNA聚合酶 将强启动子和G基因带入甜玉米细胞并整合到甜玉米细胞染色体的DNA上 NotⅠ和SacⅠ (2)a4株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达 (3) 实验组有目的条带、对照组无目的条带 3和4 退火温度太高、引物自连或互连 29．(1) RNA聚合酶 脱氧核糖和胸腺嘧啶 复制并稳定保存 外源DNA片段插入 bc Tum基因上游序列 Nhe Ⅰ A (2) 琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度、DNA分子的大小和构象 （波长为300nm）的紫外灯 (3) 组 1、组2 不能 (4) 小鼠体内神经胶质瘤体积 肿瘤微血管密度 30．(1) 纤维素酶和果胶酶 杂种原生质体生理互补，细胞呼吸正常，能正常分裂，而未融合或同种融合原生质体会在细胞呼吸不同阶段受到抑制从而无法正常分裂 生长素与细胞分裂素的浓度及比例 (2) 激素组合1 a 完成再生壁的细胞比例 a 否 还需进行实验验证使用激素组合对GAUT基因表达量的影响 (3) 逆转录 64 31．(1) 逆转录酶、热稳定DNA聚合酶‌和引物 5， (2) 逆转录 小 (3) 磷酸二酯 5， 特异性互补序列 ABCD 茎环法测定的Ct值差别更大，更灵敏 32．(1) BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 (2) mRNA 非编码区（启动子、终止子）、内含子 (3) 内细胞团 早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移 滋养层 雌 33．(1) 增加模板DNA彻底变性的概率（使模板DNA充分变性），以保证和引物顺利结合，使PCR过程顺利进行 在低温下，使引物能与相应互补DNA序列结合，为后续子链延伸做准备 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) 非模板链 GGATCCATGTTC (3) 过低 2 (4) 能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少 (5)Y蛋白(通过与S基因启动子序列结合)促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性 34．(1)Xbal 、PstI (2) 磷酸二酯 ② 2 分子筛 溴酚蓝 DE (3) 抗原 B淋巴细胞 筛选/抗体阳性筛选 克隆培养 操作简便、成本低、高产量 35．(1) b 磷酸二酯 (2)限制酶和DNA连接 (3)使目的基因准确连接到质粒的特定位点上 (4) PCR1和PCR2所用引物存在互补配对片段，至于同一反应系统时他们会发生相互结合而失去作用 5' (5) 显微注射 胚胎移植 (6) 相反 特异型启动子序列 36．(1) 1 低 逆转录 (2) 便于设计引物 T (3) 限制酶识别 Ca2+ (4)ACD 37．(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 引物较短，特异性弱，导致同时扩增出目的基因和其他DNA片段 (2)ACD (3) 2/两/二 Bam HⅠ（BglⅡ）和EcoR Ⅰ 45（20） 番茄特异性 (4) 农杆菌转化 潮霉素 （营养物质及）植物激素的种类和配比 抗原—抗体杂交 38．(1) 总RNA 逆转录 (2) 5′ CTCGAG (3) 40次循环后可能出现大量非特异性产物 切胶 (4) 降低酶活性，降低连接反应速率，减少非目标重组DNA的形成 感受态 (5)2、3、5 39．(1) ①④ 5' Mun I (2) EcoRⅠ和SphⅠ DNA连接（酶） (3) Ca2+ 氨苄青霉素 BD (4) 寒冷 不能 40．(1) 引物（或P1、P2）和模板（或质粒1） 既作为原料又提供能量 (2) 5’ BamHⅠ、EcoRⅠ DNA连接 (3) 感受态 四环素 (4) 4、5、7的电泳结果接近（或大于）2071bp LacZ (5) X-gal 蔗糖和X-gal 41．(1) EcoRI、HindⅢ B (2)④③②⑤① (3) 氨苄青霉素 显微注射法 雌激素、荧光素 (4) 乙、丙 目的基因反向连接 (5) 启动子 上 受精卵 含有 42．(1) DNA的半保留复制 要有一段已知该基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 变性 复性 模板 DNA、引物、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）、dNTP（脱氧核苷酸）（任写两种） (2) 获能 胚胎移植 同期发情 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，大大缩短了供体本身的繁殖周期 (3) 乙、丙奶山羊体内的抗凝血酶Ⅲ基因能够表达，而甲奶山羊体内的抗凝血酶Ⅲ基因不能表达 43．(1) 5′-TCTAGAGG-3′ 琼脂糖凝胶电泳 (2) 组成型表达 与结合在启动子上的S蛋白结合 RNA聚合酶 (3)快速表达大量E蛋白，进而激活F基因的表达 (4)T蛋白、L蛋白 (5) 黑暗 红光照射 蓝光照射 44．(1)不包括 (2) Sau3AI EcoRI 终止密码子 b c (3) 潮霉素 1 (4) Y-GFP 蛋白 能 未标记探针竞争结合，减少标记探针与 Y-GFP 蛋白的结合 45．(1) 脱氧核苷酸 有利于解旋 (2)否 (3) B A (4) 显微注射法 四环素 红色 (5) 增大大分子DNA彻底变性概率 乙 4 46．(1) F2和R2 5’端 碱基互补配对 (2) DNA连接 应含有启动子序列，且F1的5'端序列能与质粒上的①互补配对，这样可以确保引物F1能够特异性地扩增WRKY13基因的部分序列，并与GUS基因正确融合 (3) 使目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达 一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 蓝 (4) 庆大霉素、X-Gluc 1/4 地 城 考点03 基因工程的应用 题号 1 答案 B 1．B 2．(1) 在PCR扩增过程中提供原料和能量 启动子和终止子 作为相关酶的激活剂 (2) 琼脂糖凝胶电泳（凝胶电泳） 单位时间催化水解的果胶量 敲除 (3) 无菌、营养供给充分、适宜温度 上清液 果胶酶溶解度低 不会破坏酶的空间结构 3．(1) 减少 DNA 水解(，提高 DNA 的完整性和总量) 上清液 (2) 原料和能量 Mg2+ 降低 (3) 5， 载体自连、Ers1与载体正向连接、Ers1与载体反向连接 800 bp 和5900 bp (4) Ca2+(CaCl2） 潮霉素 反义 Ers1 的转录产物通过与草莓体内 Ers1的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻 4．(1) 标记基因/复制原点/启动子/终止子 质粒和目的基因自身环化及反向连接 (2) 四种脱氧核苷酸、Taq酶 5‘→3’ 引物4和引物5 扩增所得的DNA片段需要BamHI和HingIII的切割位点 (3) 提供RNA聚合酶特异性识别和结合点位，驱动基因的转录 酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工 抗原-抗体杂交 (4) B A类菌落导入pBR322质粒、C类菌落没有导入质粒 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 题号 1 2 3 4 5 答案 D C A ABD BC 6．(1) 增加溶解氧和增大菌体与培养液的接触 碳源、氮源、无机盐 (2) 对数期 稳定期 对数 (3) I-4 pH=9，NaCl浓度为60g/L 在此条件下，I-4菌株生长良好且能产生较多PHA 该嗜盐菌在高盐环境中发酵，绝大多数微生物在此环境下难以生存 蛋白质工程 7．(1) G AB CE (2)BglⅡ和XmaI (3) 新霉素 白 磷酸基团 负极 甲 不一定是 电泳仅能分析待测 DNA 分子的大小，无法测序 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $