18 大概念八 课时2 基因工程-（教师用书）【金版新学案】2026年高考生物大二轮专题复习与测试（单选）

课时2　基因工程 [自我校对]　①T4 DNA　②质粒　③半保留　④农杆菌　⑤显微注射　⑥Ca2＋　⑦PCR　　 1．判断关于基因工程的基本工具和流程的叙述的正误 (1)(2024·贵州卷)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。(√) (2)(2024·广东卷)RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明。(×) (3)(2024·湖南卷，改编)质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，可能是质粒DNA突变导致酶识别位点缺失。(√) (4)(2021·辽宁卷)利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现。(√) 2．判断有关DNA提取与鉴定、电泳叙述的正误 (1)(2024·山东卷)DNA鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变。(×) (2)(2024·辽宁卷)琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来。(×) (3)(2024·辽宁卷)同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。(×) (4)(2022·山东卷)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(√) 3．判断有关PCR实验叙述的正误 (1)(2024·河北卷)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(×) (2)(2022·辽宁卷)PCR技术中，预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制。(×) (3)(2021·湖北卷)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生。(√) 保分点　基因工程的原理及操作步骤 1．(2025·河南卷，节选)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是__________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (2)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是_______________________________________________________________ __________________________________________________________________， 随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 答案：(1)BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列　(2)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 解析：(1)E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率很低，因此切割质粒和目的基因时不宜选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ和SmaⅠ，而SpeⅠ与XbaⅠ切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ与XbaⅠ切割，会出现质粒和目的基因的自连、目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ与XbaⅠ中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′端→3′端，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′端应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可以连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。(2)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 2．(2025·黑吉辽内卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题： (1)可从____________________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)。假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是_______________________________________________________________ __________________________________________________________________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ b：5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′ c：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ d：5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的__________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案：(1)序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶　(2)外源DNA　1　实验中的重组质粒大小约为9.5 kb，而质粒pYL的大小为7.2 kb，因此目的基因的大小为2.3 kb左右　(3)GCC　(4)香树脂醇 解析：(1)可以从序列数据库中查询某基因的编码序列。为保证目的基因插入质粒的启动子与终止子之间，应用SpeⅠ和XhoⅠ对质粒进行切割，但由于基因N中存在SpeⅠ的切割位点，故在设计引物时不能引入SpeⅠ的识别序列，由图1可知，XbaⅠ、SpeⅠ切割产生的黏性末端相同，故可在引物中引入XbaⅠ的识别序列来替代。已知a链为转录模板链，引物与DNA链的3′端结合，故a链的转录方向为从右向左，因此，引物2的5′端应引入XbaⅠ的识别序列，引物1的5′端应引入XhoⅠ的识别序列。连接DNA片段需要DNA连接酶。(2)使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。因为实验中的重组质粒大小约为9.5 kb，而质粒pYL大小为7.2 kb，因此目的基因的大小约为2.3 kb，图2中实验组1的电泳条带数据符合目的基因的大小。(3)结合题中信息，仔细比较b、c、d与a序列(点拨：下图框中的序列一样)，只有c的配对模板与a相同，其中a中的GCA是诱变序列，c中的GCC是诱变序列，即GCC也是丙氨酸的密码子。 (4)转基因成功的酵母菌能表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇，因此进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 ◎(2025·湖北模拟)苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因D导入该病患者的细胞，以治疗该病。图1为A、B、C三种质粒，图2为含有目的基因D的DNA片段。AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ(0.6 kb)、PvuⅠ(0.8 kb)为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题： (1)基因工程操作的核心步骤是________________________________________。 图1中三种质粒适宜作为载体的是质粒________，与另外两种质粒相比，其作为载体的优点是_________________________________________________________ __________________________________________________________________。 (2)获取目的基因D时应选择________限制酶对其所在的DNA进行切割。将目的基因D和图1中相应质粒连接后，得到三种质粒，为选出正向连接的重组质粒，可使用________限制酶对重组质粒完全酶切后进行电泳分析，请在图3中画出正向连接、反向连接、载体自连条带的大体位置，并在条带上写出条带的大小。 (3)重组质粒导入大肠杆菌后，将大肠杆菌置于含有氨苄青霉素与X-gal的培养基上培养，含有正向连接的重组质粒应该在________色菌落中挑取，该种菌落仍然不能保证是所需类型，要进行验证，单酶切、酶连的质粒筛选除了用(2)中的酶切验证，还可以通过引物验证。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定，图4所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某同学尝试用图中另一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了4 500 bp片段，原因是_____________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 (4)相比于单酶切而言，双酶切的优势是___________________________________ __________________________________________________________________， 若用双酶切多个目的基因，随机连接________(填“能”或“不能”)避免两个目的基因连接成环。 答案：(1)基因表达载体的构建　B　B质粒具有标记基因，且复制原点不会被限制酶切割　(2)PvuⅠ　EcoRⅠ　 (3)白　乙和丙　目的基因与载体反向连接　(4)可使目的基因定向插入载体，提高连接的有效性　不能 解析：(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤，其中基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。图1中质粒A缺少标记基因，质粒C在用和切割目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，会影响重组质粒的自我复制，因此不能作为载体。质粒B中含有AmpR基因和LacZ基因，用和切割目的基因相同的限制酶切割时，LacZ基因遭到破坏，但保留了AmpR基因，复制原点也不受影响，故选质粒B。(2)分析图2，目的基因D上有两个PvuⅠ酶切位点和一个EcoRⅠ酶切位点，而EcoRⅠ酶切会破坏目的基因D，因此应选用PvuⅠ对其所在的DNA进行切割。在目的基因D上存在EcoRⅠ的酶切位点，因此在基因工程的操作过程中，选出正向连接的重组质粒，应使用该酶切割重组质粒。依题意和图1、2可知，由于目的基因D的长度为4.0 kb，因此用质粒B构建的重组质粒的长度为4.0 kb＋2.7 kb＝6.7 kb，重组质粒被EcoRⅠ完全酶切后，出现两个不同长度片段，若是正向连接(目的基因D上的EcoRⅠ酶切位点与质粒B上的EcoRⅠ酶切位点的距离最近)，会得到0.2 kb＋1.0 kb＝1.2 kb和2.7 kb＋4.0 kb－1.2 kb＝5.5 kb的两个片段，若是反向连接会产生3.2 kb与3.5 kb大小的两个片段，载体自连会出现2.7 kb大小的片段。(3)导入目的基因的重组质粒中LacZ基因被破坏，无法表达，即使加入X-gal，菌落依然为白色，因此应从白色菌落中挑取含正向连接的重组质粒。分析图4可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是500 bp＋4 000 bp＋700 bp＝5 200 bp，不符合要求，如果选择乙和丙这对引物，正向连接可以得到700 bp＋4 000 bp＝4 700 bp的扩增片段，反向连接后引物乙、丙均扩增质粒内侧链，凝胶电泳后，不会有条带，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果扩增出了4 500 bp(500 bp＋4 000 bp)片段，则说明扩增片段包含了引物甲扩增的500 bp以及目的基因的4 000 bp，要想扩增这样的片段，需选择引物甲和乙，且目的基因和载体反向连接。(4)相比于单酶切而言，双酶切的优势是可使目的基因定向插入载体，提高连接的有效性。用双限制酶切割多个目的基因，因多个目的基因片段具有的末端相同，随机连接后，无法避免两个目的基因连接成环。 1．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙)。 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) (3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 2．单酶切目的基因和质粒后正向连接与反向连接的检测 用EcoRⅤ对质粒和目的基因酶切后进行拼接，正向连接和反向连接如图所示，鉴定方法如下： (1)利用PCR进行检测 用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增，二者得到的扩增产物长度不同。选用引物a、b可扩增出1 100 bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 (2)利用电泳进行检测 用特定的限制酶对正向连接和反向连接的重组质粒进行切割，对产物进行电泳，二者得到的条带存在差异。用BglⅡ和HindⅢ进行双酶切，电泳后若出现1 100 bp条带，则为正向连接；电泳后若出现1 000 bp条带，则为反向连接。 争分点一　PCR技术及应用 ◎(2025·陕晋青宁卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题： (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、__________、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的____________步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-______________-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________________________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 答案：(1)dNTP(或4种脱氧核苷酸)　延伸　(2)5′端　AGATCT　BamHⅠ和EcoRⅠ　(3)马铃薯细胞的染色体DNA上　2　再分化 解析：(1)DNA复制所需的基本条件如下： 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 PCR过程分变性、复性和延伸三步，在延伸阶段，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(2)DNA复制时，子链的延伸方向为5′端→3′端，故通过PCR扩增S基因时，需在引物的5′端添加限制酶识别序列。结合质粒上限制酶切割位点以及S基因上的切割位点分析，可用BamHⅠ和EcoRⅠ切割载体，又因为BamHⅠ和BglⅡ为同尾酶(能切割产生相同的黏性末端)，因此需在S基因上游引物中添加BglⅡ的识别序列，即5′-AGATCT-3′。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染栽培马铃薯愈伤组织时，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。分析载体结构可知，抗性基因2位于T-DNA内部，上下游含有启动子和终止子，该基因可以正常表达，而抗性基因1位于T-DNA外部，故抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。愈伤组织能重新分化成芽、根等器官，该过程称为再分化。 1．实时荧光定量RT-PCR技术检测病毒核酸 病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某种病毒感染时，检测到的荧光强度变化(如图乙)，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。 2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图： 3．PCR定点突变——大引物PCR技术 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图： 4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图： 5．巢式PCR 首先将包含目的片段的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图： 1．(2025·山东青岛模拟)采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是(　　) A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要(220－2)个引物 答案：B 解析：若PCR的模板是mRNA，完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A错误；预变性温度较高，双链DNA在高温作用下，氢键断裂，形成单链DNA，B正确；复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加，温度太高会使引物与模板结合减少，C错误；合成1个DNA分子需要2个引物，一个模板完成第20轮循环会合成220－219个DNA，因此需要的引物为(220－219)×2＝220个，D错误。 2．(2025·山东济宁模拟)为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签(能特异性地与人和哺乳动物体内的IgG类抗体结合)形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题： 注：XhoⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ表示限制酶，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3.1－S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5′端外侧依次添加________________序列。PCR时新合成链的延伸方向是________(填“5′端→3′端”或“3′端→5′端”)。　 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与______________________________________有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1－S-TAP中，T7的作用是_____________________， 重组质粒中还应该有的结构有______________________________。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的____________稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 答案：(1)Kozak序列和SmaⅠ　5′端→3′端　(2)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象　(3)RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA　终止子、标记基因、复制原点　(4)IgG类抗体 解析：(1)依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5′端外侧添加Kozak序列；目的基因和质粒要连接构成基因表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoⅠ(S基因会被XhoⅠ酶切)，应该用SmaⅠ进行酶切，故F引物的5′端外侧还要添加SmaⅠ酶识别序列；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5′端→3′端，故PCR时新合成链的延伸方向是5′端→3′端。(2)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。(3)依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因，还应有的结构是终止子、标记基因、复制原点。(4)依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与人和哺乳动物体内的IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 争分点二　基因编辑与定点重组技术 ◎(2025·安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题： (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用_____________________________________________________________________ (填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示： 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________(填序号)，出现菌落④的可能原因是_________________________________________ _________________________________________________________________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。_______________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 答案：(1)稀释涂布平板法　筛选出不同条件下的内生放线菌　(2)扩增　②　重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起，形成了7 000 bp的DNA片段　(3)实验分三组进行，甲组是稻瘟病致病菌＋含铁离子培养基；乙组是内生放线菌＋稻瘟病致病菌＋含铁离子培养基；丙组是R基因敲除放线菌＋稻瘟病致病菌＋含Fe培养基，在相同且适宜条件下培养一段时间，观察致病菌的生长情况或测致病菌体内的铁含量(或设置两组实验：对照组用含低浓度铁离子培养基培养，实验组用含高浓度铁离子培养基培养，两组培养基均接种内生放线菌和稻瘟病致病菌，在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察稻瘟病致病菌的生长情况或测致病菌体内的铁含量。其他答案合理即可) 解析：(1)研磨液里含有内生放线菌，可用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基上进行筛选。经过一段时间培养后，在适宜的温度下，可以形成内生放线菌的菌落，从而分离纯化出内生放线菌。(2)PCR的原理是DNA半保留复制，可实现基因片段的大量扩增。结合图1和图2可知，菌落①③PCR产物长度都是3 000 bp，正好是R基因的长度，说明R基因没有敲除成功。菌落②PCR产物长度是1 000 bp，说明敲除了R基因中间序列，保留了两端序列，R基因敲除成功。菌落④PCR产物长度是7 000 bp，正好是重组质粒(4 000 bp)和R基因(3 000 bp)的总和，说明重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起，形成了7 000 bp的DNA片段。(3)科研小组推测该内生放线菌通过竞争性利用铁离子，从而抑制稻瘟病致病菌生长，欲设计实验进行验证，可以设置3组实验，一组是稻瘟病致病菌＋含铁离子培养基，再分别将野生型内生放线菌和R基因敲除株与稻瘟病致病菌混合接种于含铁离子培养基上，野生型内生放线菌能吸收利用铁离子，R基因敲除株不能吸收利用铁离子，观察稻瘟病致病菌生长情况。预期结果是接种野生型内生放线菌的稻瘟病致病菌生长被抑制，仅含稻瘟病致病菌、接种R基因敲除株的稻瘟病致病菌生长没有被抑制。 1．CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导限制性内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。原理如图： CRISPR复合体中sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 2．Cre/LoxP重组酶系统 Cre重组酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP序列来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (1)同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 (2)反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 3．In-Fusion技术 In-Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In-Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。具体原理如下： (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 1．(2024·泰安高三一模)Cre/LoxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是(　　) A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏4个磷酸二酯键 B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色 C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色 D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其一个脑组织细胞内可能随机出现两种颜色 答案：B 解析：DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏4个磷酸二酯键，A正确；据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；若小鼠细胞含一个表达载体(含Cre酶)，Cre酶可能敲除两个LoxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时细胞呈黄色，也有可能敲除两个LoxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时细胞为蓝色，也有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色，C正确；小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能随机出现两种颜色，D正确。 2．(2025·湖北武汉模拟)蚊子是多种疾病的传播媒介，阻止蚊子传播疾病一直是科学家研究的方向。基因编辑技术中CRISPR/Cas9系统的出现可实现该目标。该技术的发现源自细菌体内的一种防止外源DNA入侵的获得性免疫机制，如图所示。其中细菌CRISPR序列的间隔区负责储存入侵过细菌的外源DNA信息；sgRNA(引导RNA)能识别外源DNA的靶序列；Cas9能对外源DNA的靶序列进行切割。回答下列问题： (1)sgRNA依据________________原则识别外源DNA的靶序列。Cas9与基因工程中的基本工具________有相似的功能。据图推测，细菌间隔区储存的序列越多样，细菌的免疫能力越________(填“弱”或“强”)。 (2)降低蚊子种群数量是阻止疾病传播的一种思路。 方案1：用CRISPR/Cas9系统对雄蚊子进行基因编辑，获得不育个体。为呈现该方案的研究思路，将下列各项进行排序：__________。 ①将sgRNA和Cas9的编码序列插入到适当载体中 ②确定蚊子基因组中与生殖发育有关的目标基因 ③目的基因导入受体细胞，筛选出不育的雄蚊子 ④设计能识别目标基因靶序列的sgRNA ⑤将转基因蚊子释放到野外发挥作用 (3)让蚊子失去传播病原体的能力是阻止疾病传播的另一种思路。 方案2：将病原体的抗性基因A导入野生型蚊子，获得转基因个体。 方案3：将病原体的抗性基因A和CRISPR/Cas9系统等元件组成的遗传盒子导入野生型蚊子，获得转基因个体。 分别将方案2和3中的转基因个体与野生型(基因型aa)杂交，子代继续与野生型杂交多代，过程及结果如下图所示。 注：黑色为具有病原体抗性的个体，白色为野生型个体。 ①方案2中，连续杂交5代后，理论上F5中携带基因A的概率为________。 ②方案3中，经遗传盒子改造后，无论杂交多少代，子代均为病原体抗性个体。关于该遗传盒子的作用机制，提出一种合理的假说：_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 理论上讲，释放少量转基因蚊子最终会导致整个物种发生变异，但并不意味着产生了新物种，理由是____________________________________________________ _________________________________________________________________。 答案：(1)碱基互补配对　限制酶　强　(2)②④①③⑤　(3)①1/32　②遗传盒子可以在转基因子代体内自动实现基因型Aa转变为AA(个体层次)；使含a的配子失去活性/含a的配子死亡/只产生含A的配子(配子层次)；基因a替换为基因A(基因层次)　具有抗性基因的蚊子能与野生型杂交产生可育后代(具有抗性基因的蚊子与野生型之间未出现生殖隔离) 解析：(1)sgRNA通过与外源DNA的特定的碱基序列发生碱基互补配对，从而识别外源DNA，进而引导Cas9(Cas9蛋白)切割核苷酸之间的磷酸二酯键，进而实现了对外源DNA的切割。据此推测，Cas9与基因工程中的基本工具限制酶有相似的功能；据图分析，间隔区储存的序列越多样则转录出的sgRNA序列多样，则其识别的外源DNA种类多样，因而细菌免疫能力越强。(2)根据题意，编辑改造蚊子的步骤应为：②蚊子的基因组进行测序，确定与生殖发育有关的目标基因→④合成与目标基因能碱基互补配对的sgRNA→①合成Cas9/sgRNA复合物，对目标基因进行编辑→③实验室条件筛选出不育的转基因蚊子→⑤将转基因蚊子释放到野外发挥作用。即对蚊子进行改造的步骤为②④①③⑤。(3)①方案2将病原体的抗性基因A导入野生型蚊子，获得转基因个体，该转基因个体基因型是Aa，结合图示可知，每一代都是Aa×aa的类型，子代中会出现Aa，每一代中Aa的比例是1/2，则连续杂交5代后，理论上F5中携带基因A的概率为1/25＝1/32。②方案3中，经遗传盒子改造后，无论杂交多少代，子代均为病原体抗性个体。关于该遗传盒子的作用机制，提出一种合理的假说为：遗传盒子可以在转基因子代体内自动实现基因型Aa转变为AA(个体层次)；使含a的配子失去活性/含a的配子死亡/只产生含A的配子(配子层次)；基因a替换为基因A(基因层次)；生殖隔离是在自然状态下不能相互交配或交配后也不能产生可育后代的现象，具有抗性基因的蚊子能与野生型杂交产生可育后代(具有抗性基因的蚊子与野生型之间未出现生殖隔离)，理论上讲，释放少量转基因蚊子最终会导致整个物种发生变异，但并不意味着产生了新物种。 学科网（北京）股份有限公司 $